CN113265484A - 一种利用分子标记同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54的方法 - Google Patents

一种利用分子标记同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用分子标记同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54的方法，本发明设计了引物组合物，针对Pi40和Pi54，利用双标记检测法，在同一PCR反应中扩增Z4794和Pi54，能快速检测出材料的标记基因型。通过用分子标记检测亲本和后代分离群体，可以同时判断其是否携带抗病基因Pi40和Pi54，提高选择效率，缩短育种进程，培育广谱持久稻瘟病抗性材料。

Description

一种利用分子标记同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54的方法
技术领域
本发明涉及水稻育种技术领域，尤其涉及一种利用分子标记同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54的方法。
背景技术
由稻瘟菌Magnaporthe oryzae引发的稻瘟病是水稻主要病害之一，在全球广泛发生，给稻谷产量造成严重损失。我国水稻生产中，稻瘟病每年发病面积达400万hm2以上,导致的产量损失在20亿kg以上,是粮食安全生产的重要威胁之一。2010年以来,稻瘟病在四川省每年发生面积均超过40万hm2,导致稻谷减产至少1.5亿kg以上，东北三省也是稻瘟病经常流行的主要地区,近几年稻瘟病在该地区的为害面积超过66.67万hm2,造成的损失可能超过总产的10％。
利用抗病基因培育抗病水稻新品种是防治稻瘟病最为经济有效的途径。到目前为止已鉴定了100多个稻瘟病抗性基因，其中有24个主效抗病基因(Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、Pid3、Pi25、Pi36、Pi37、Pi54、Pi64、Pia、Pi-Co39、Pib、Pid2、Pii、Pikh、Pikm、Pikp、Pik、Pish、Pit、Pita、Pizt、Pigm)及5个抗病QTL(pi21、Pi35、Pi63、Pb1、bsr-d1)被成功克隆。抗病育种中十分重视利用抗谱广、抗性持久的基因资源，现有10个基因被认为具有广谱抗性，包括Pi1、Pi2、Pi5、Piz、Pi9、Pi40、Pizt、Pi33、Pigm和bsr-d1等，其中6个基因(Pi2、Piz、Pi9、Pi40、Pizt和Pigm)位于第6染色体短臂近着丝粒附近的Piz基因座。
利用水稻第6染色体广谱稻瘟病抗性基因，聚合其他染色体位点的抗性基因可培育具有广谱持久稻瘟病抗性的水稻品种(Xiao,et al.Strategy for use of rice blastresistance genes in rice molecular breeding.Rice Science,2020,27(4):263-277)。Pi40候选基因的物理位置在第6染色体10,387643～10389,281bp，分子标记Z4794在第6染色体上的物理位置是10,022,552～10022691bp，Z4794与Pi40紧密连锁(Jeung，et al.Anovel gene,Pi40(t)，linked to the DNA markers derived from NBS-LRR motifscinfers broad spectrum of blast resistance in rice.Theor Appl Genet,2007,115:1163-1177)。Pi54位于水稻第11染色体，编码一个由330个氨基酸组成的NBS-LRR类抗病蛋白(Rai,et al.Functional complementation of rice blast resistance gene Pi-kh(Pi54)conferring resistance to diverse strains of Magnaporthe oryzae,J.PlantBiochem Biotechnol,2011,20(1):55-65)；基因功能标记Pi54是共显性标记，可用于标记辅助选择(范方军,等.Pi-b、Pi-ta、Pikm和Pi54对水稻穗颈瘟的抗性评价,华北农学报,2014,29(3)：221-226)。吴云雨的研究表明，在江苏粳稻07GY31背景下，Pi40对苗瘟和穗瘟的抗性频率分别为91.74％和67.86％，Pi54对苗瘟和穗瘟的抗性频率分别为42.20％和35.71％，Pi40和Pi54的双基因聚合系对苗瘟和穗瘟的抗性频率为91.74％和75％(吴云雨,等.长江下游粳稻稻瘟病广谱抗性基因组合模式分析,中国农业科学,2021,54(9):1881-1893)。在粳稻育种中，更注重选育穗瘟抗性好的品种，Pi40和Pi54的双基因组合可以用于江苏粳稻育种，培育广谱持久抗性的粳稻品种。在对Pi40和Pi54的分子标记辅助选择中，通常是分别对2个基因进行标记选择，根据标记基因型确定候选单株，效率较低。本发明同时对2个目标基因进行标记选择，可大大提高选择效率，加速育种进程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54的引物组合物。
本发明的另一目的是一种利用分子标记同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54的方法,提高选择效率，培育抗病品种，可有效用于长江下游粳稻稻瘟病抗性改良。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种用于同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54的引物组合物，其特征在于，由与Pi40紧密连锁的分子标记Z4794的引物和与Pi54紧密连锁的分子标记Z4794的引物和分子标记Pi54的引物的引物组成；所述的分子标记Z4794的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，分子标记Pi54的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
本发明所述的组合物在同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54中的应用。
一种利用分子标记同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54的方法，在一个PCR扩增系统中利用本发明所述的引物组合物对稻瘟病抗性基因Pi40和Pi54同时进行选择，分子标记Z4794的预期扩增产物大小为334bp，分子标记Pi54的预期扩增产物大小为216bp；通过是否扩增出预期扩增产物条带判断是否含有抗稻瘟病基因Pi40和Pi54。
作为本发明的一种优选实施方式，PCR扩增体系总体积为30ul：0.2μmol L-1的双标记Z4794和Pi54正、反向引物各1.5μL，200μmol L-1的dNTPs 3μL，10×PCR buffer 3μL，50～100ng的DNA模板3μL，1UμL-1的Tag酶0.4μL，ddH2O 14.6μL。
作为本发明的一种优选实施方式，所述的方法包含以下步骤：
(1)提取待测亲本或后代分离群体的DNA；
(2)以权利要求1所述的引物组合物在一个PCR系统中利用双标记检测法PCR对亲本或后代分离群体的DNA进行PCR扩增；
(3)利用凝胶成像对PCR产物进行分析，分子标记Z4794的预期扩增产物大小为334bp，分子标记Pi54的预期扩增产物大小为216bp，根据标记基因型判断是否携带目标基因。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)利用双标记(Z4794和Pi54)检测法，可以对亲本材料、分离群体同时进行PCR扩增，根据凝胶成像分析，同时确定目标基因Pi40和Pi54的标记基因型，与单标记检测法相比，对标记基因型分型的效果是相同的，但减少了PCR次数，缩短了分析时间，大大提高了标记基因型分析效率。
(2)对2个目标基因Pi40和Pi54同时进行选择，相比对单个基因分别选择后再进行聚合，可以缩短育种进程，提高育种效率。
附图说明
图1 22个亲本中稻瘟病抗性基因Pi40连锁标记Z4794检测示意图M：标准分子量标记DL2000，1：IR65482(Pi40)，2：Tetep(Pi54)，3：阳光800，4：圣稻22，5：圣香粳1号，6：阳光958，7：津稻9618，8：扬粳113，9：金粳18，10：徐稻3号，11：泗稻18号，12：徐稻9号，13：金粳818，14：润扬优香粳，15：红光粳1号，16：连粳16号，17：早香粳1号，18：南粳58，19：南粳5718，20：精华3号，21：润稻118，22：中种香糯。
图2 22个亲本中稻瘟病抗性基因Pi54功能性标记Pi54检测示意图
M：标准分子量标记DL2000，1：IR65482(Pi40)，2：Tetep(Pi54)，3：阳光800，4：圣稻22，5：圣香粳1号，6：阳光958，7：津稻9618，8：扬粳113，9：金粳18，10：徐稻3号，11：泗稻18号，12：徐稻9号，13：金粳818，14：润扬优香粳，15：红光粳1号，16：连粳16号，17：早香粳1号，18：南粳58，19：南粳5718，20：精华3号，21：润稻118，22：中种香糯。
图3 22个亲本中双标记Z4794和Pi54检测示意图
M：标准分子量标记DL2000，1：IR65482(Pi40)，2：Tetep(Pi54)，3：阳光800，4：圣稻22，5：圣香粳1号，6：阳光958，7：津稻9618，8：扬粳113，9：金粳18，10：徐稻3号，11：泗稻18号，12：徐稻9号，13：金粳818，14：润扬优香粳，15：红光粳1号，16：连粳16号，17：早香粳1号，18：南粳58，19：南粳5718，20：精华3号，21：润稻118，22：中种香糯。
图4分离群体中Z4794的标记基因型示意图
M：标准分子量标记DL2000，1：IR65482，2：Tetep，3：扬粳113，4～23：扬粳113//扬粳113/07GY31(Pi40+Pi54)回交群体后代BC1F2单株。
图5分离群体中Pi54的标记基因型示意图
M：标准分子量标记DL2000，1：IR65482，2：Tetep，3：扬粳113，4～23：扬粳113//扬粳113/07GY31(Pi40+Pi54)回交群体后代BC1F2单株。
图6分离群体中Z4794和Pi54的标记基因型示意图
M：标准分子量标记DL2000，1：IR65482，2：Tetep，3：扬粳113，4～23：扬粳113//扬粳113/07GY31(Pi40+Pi54)回交群体后代BC1F2单株。
具体实施方式
实施例1
DNA的提取采用常规的CTAB法(Murray&Thompson,1980Rapid isolation ofhigh-molecular-weight plant DNA.Nucleic Acids Res 8:4321-4325)。
PCR反应在EPPENDORF梯度PCR仪(型号：Mastercycler Pro)上进行，扩增产物在2％的琼脂糖凝胶中电泳分离，溴化乙淀(EB)染色后，BIO-RAD凝胶成像仪(型号：Gel DocXR)紫外灯下扫描拍照和分析。
单标记检测法PCR扩增体系(20ul)为：0.2μmol L-1的正、反向引物各1.5μL，200μmol L-1的dNTPs 2μL，10×PCR buffer 2μL，50～100ng的DNA模板2μL，1UμL-1的Tag酶0.3μL，ddH2O 10.7μL。
双标记检测法PCR扩增体系(30ul)为：0.2μmol L-1的双标记(Z4794和Pi54)正、反向引物各1.5μL，200μmol L-1的dNTPs 3μL，10×PCR buffer 3μL，50～100ng的DNA模板3μL，1UμL-1的Tag酶0.4μL，ddH2O 14.6μL。
用于选择Pi40的紧密连锁分子标记Z4794，正向引物序列：5’-TGAATGTGAGAGGTTGACTGTGG-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物序列:5’-CACGCCACCCTTCAATGGAGACT-3’(SEQ ID NO.2),预期扩增产物大小为334bp；用于选择Pi54的基因功能标记Pi54，正向引引物序列：5’-CAATCTCCAAAGTTTTCAGG-3’(SEQ ID NO.3)，反向引物序列：5’-GCTTCAATCACTGCTAGACC-3’(SEQ ID NO.4)，预期扩增产物大小为216bp。
上述PCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，55℃复性45秒，72℃延伸1分钟，32个循环，72℃延伸5分钟。
多态性检测测试品种顺序和名称为，1：IR65482(Pi40)，2：Tetep(Pi54)，3：阳光800，4：圣稻22，5：圣香粳1号，6：阳光958，7：津稻9618，8：扬粳113，9：金粳18，10：徐稻3号，11：泗稻18号，12：徐稻9号，13：金粳818，14：润扬优香粳，15：红光粳1号，16：连粳16号，17：早香粳1号，18：南粳58，19：南粳5718，20：精华3号，21：润稻118，22：中种香糯。于幼苗期取以上品种嫩叶，利用CTAB法提取基因组DNA，用标记引物Z4794和Pi54分别进行PCR反应和凝胶成像分析(图1和图2)，再用双标记检测法(Z4794和Pi54)对以上亲本进行PCR反应和凝胶成像分析(图3)。图1显示有13个亲本与供体亲本IR65482在标记Z4794上存在多态性，多态率65％，图2显示有9个亲本与供体亲本Tetep在标记Pi54上存在多态性，多态率45％，图3显示有13个亲本与供体亲本IR65482在标记Z4794上存在多态性，有9个亲本与供体亲本Tetep在标记Pi54上存在多态性，与单标记检测的结果完全一致，其中阳光800、扬粳113、早香粳1号、南粳58与2个供体亲本同时存在多态性。
利用携带Pi40和Pi54的粳稻材料07GY31(Pi40+Pi54)，Pi40来源于IR65482，Pi54来源于Tetep，利用分子标记同时选择Pi40和Pi54进行聚合，来提高扬粳113的稻瘟病抗性，分离群体为扬粳113//扬粳113/07GY31(Pi40+Pi54)BC1F2代，DNA样品顺序，1：IR65482，2：Tetep，3：扬粳113，4～23：扬粳113//扬粳113/07GY31(Pi40+Pi54)回交群体后代单株。于幼苗期取以上群体嫩叶，利用CTAB法提取基因组DNA，用标记引物Z4794和Pi54分别进行PCR反应和凝胶成像分析(图4和图5)，再用双标记检测法(Z4794和Pi54)对以上群体进行PCR反应和凝胶成像分析(图6)。图4显示携带纯合Pi40基因型的单株有6个，分别为4、6、10、12、18、21，杂合基因型的单株有9个，分别为5、7、9、11、13、14、16、17、22。图5显示携带纯合Pi54基因型的单株有7个，分别为4、6、10、11、13、17、21，携带杂合Pi54基因型的单株有8个，分别为5、7、9、14、18、19、22、23。图6显示显示携带纯合Pi40基因型的单株有6个，分别为4、6、10、12、18、21，杂合Pi40基因型的单株有9个，分别为5、7、9、11、13、14、16、17、22，携带纯合Pi54基因型的单株有7个，分别为4、6、10、11、13、17、21，杂合Pi54基因型的单株有8个，分别为5、7、9、14、18、19、22、23，与单标记检测的结果完全相同，其中4个单株(4、6、10、21)携带纯合Pi40和Pi54基因型。
序列表
<110> 江苏里下河地区农业科学研究所
<120> 一种利用分子标记同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgaatgtgag aggttgactg tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacgccaccc ttcaatggag act 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caatctccaa agttttcagg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcttcaatca ctgctagacc 20

Claims (5)

1.一种用于同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54的引物组合物，其特征在于，由与Pi40紧密连锁的分子标记Z4794的引物和与Pi54紧密连锁的分子标记Z4794的引物和分子标记Pi54的引物的引物组成；所述的分子标记Z4794的引物如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，分子标记Pi54的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述的组合物在同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54中的应用。
3.一种利用分子标记同时选择抗稻瘟病基因Pi40和Pi54的方法，其特征在于，在一个PCR扩增系统中利用权利要求1所述的引物组合物对稻瘟病抗性基因Pi40和Pi54同时进行选择，分子标记Z4794的预期扩增产物大小为334bp，分子标记Pi54的预期扩增产物大小为216bp；通过是否扩增出预期扩增产物条带判断是否含有抗稻瘟病基因Pi40和Pi54。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR扩增体系总体积为30ul：0.2μmol L-1的双标记Z4794和Pi54正、反向引物各1.5μL，200μmol L-1的dNTPs 3μL，10×PCR buffer 3μL，50～100ng的DNA模板3μL，1UμL-1的Tag酶0.4μL，ddH2O 14.6μL。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)提取待测亲本或后代分离群体的DNA；
(2)以权利要求1所述的引物组合物在一个PCR系统中利用双标记检测法PCR对亲本或后代分离群体的DNA进行PCR扩增；
(3)利用凝胶成像对PCR产物进行分析，分子标记Z4794的预期扩增产物大小为334bp，分子标记Pi54的预期扩增产物大小为216bp，根据标记基因型判断是否携带目标基因。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114292937A (zh) * 2021-10-12 2022-04-08 华南农业大学 一组二套具包容性且精准鉴别挖掘并克隆稻瘟病Pit及Pi54抗病基因家族的技术体系
CN114292937B (zh) * 2021-10-12 2022-12-16 华南农业大学 一组二套具包容性且精准鉴别挖掘并克隆稻瘟病Pit及Pi54抗病基因家族的技术体系

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