CN104450699B - 一种蜘蛛线粒体coiii基因全序列扩增引物及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蜘蛛的线粒体COIII基因全序列扩增引物，并利用其全序列测序信息快速鉴定蜘蛛种类的方法，包括蜘蛛基因组总DNA的提取，COIII基因全序列扩增引物的设计，PCR扩增，测序以及基于COIII基因全序列进行蜘蛛种类的快速鉴定。采用本发明的通用扩增引物可以快速高效地扩增多种蜘蛛的线粒体COIII基因的全序列，为蜘蛛种类的快速鉴定，种群多样性分析，种质资源保护利用等研究提供一种有力的工具，也为蜘蛛线粒体全基因组测序和不同分类阶元系统进化的分析研究奠定基础。

Description

一种蜘蛛线粒体COIII基因全序列扩增引物及鉴定方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蜘蛛线粒体细胞色素C氧化酶3(cytochrome oxidase subunits 3; COIII) 基因全序列的扩增引物及鉴别蜘蛛种类的方法。

背景技术

蜘蛛是一种重要的害虫捕食性天敌，在害虫综合防治过程中具有重要的作用和地位。注意保护种库，促进天敌群落重建，能有效的控制诸多农业害虫，诸如飞虱、叶蝉、螟虫、棉蚜等的发生和危害。快速而准确的物种鉴定是蜘蛛保护和利用的研究的必要前提和基础。然而，基于外观形态及解剖特征的传统分类鉴定方法不仅耗时耗力，而且对鉴定人员的专业知识要求较高，常受主观因素的干扰，极易混淆出错。另一方面，蜘蛛种类繁多，对其开展区系分类研究也极为重要，这对蜘蛛种质资源有效保护利用具有重要意义。

近年来，随着分子生物学技术的快速发展，利用DNA序列(分子标记)对物种进行分类鉴定和系统发育分析已经成为一种简单高效的方法。线粒体基因组DNA具有母系遗传，拷贝数多，重组率低，进化速度较快等优点，所以成为物种鉴定和研究物种进化关系的理想选择。包括蜘蛛在内的节肢动物线粒体基因组DNA一般由13个蛋白质基因，22个tRNA基因，2个rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA)共37个编码基因及一段非编码区(控制区)组成。其中细胞色素C氧化酶亚基I (COI)基因已作为公认的分子标记，广泛应用于节肢动物的群体遗传学，系统发生学及保护生物学等研究领域。COIII作为线粒体蛋白质编码基因中3个编码细胞色素C氧化酶复合体亚基基因之一，进化速率适中，亦可作为重要的遗传分子标记。然而，目前针对种类繁多，具有重要利用价值的蜘蛛的线粒体COIII基因的通用扩增引物则未曾报道。缺乏扩增效率高的通用引物严重阻碍了COIII基因作为分子标记的应用，因此设计特异性扩增蜘蛛线粒体COIII基因的通用引物，对利用分子方法快速鉴定蜘蛛物种和进行种类多样性调查分析具有重要的意义，同时也为蜘蛛线粒体全基因组序列测定和系统进化分析奠定了基础。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种一种蜘蛛线粒体COIII基因全序列扩增引物及鉴定方法。

为实现本发明的目的，发明人提供以下技术方案：

本发明首先提供了一对蜘蛛线粒体COIII基因全序列的通用扩增引物，这对引物是根据GenBank数据库中已经公布的蜘蛛线粒体全基因组序列设计的，正向引物 COIII-F如SEQ ID NO:1所示，反向引物 COIII-R如SEQ ID NO:2所示:

SEQ ID NO:1: 5′- ATGTTCTGAAATTTGTGGT -3′;

SEQ ID NO:2: 5′- TACTACATCTACAAAATGTC -3′。

利用上述一对蜘蛛线粒体COIII基因全序列扩增引物，PCR扩增测序后可实现对蜘蛛种类的快速鉴定。具体包括以下步骤：

(1) 采用DNA抽提试剂盒提取蜘蛛的总基因组DNA。为避免污染，舍去头腹部，只从腿部提取DNA。

(2) 利用上述的一对引物，以抽提好的蜘蛛基因组为模板，进行 PCR 扩增和测序（结果见图1）。PCR 反应体系为 50μ1，其中：2μl模板 DNA (约20ng)，5μl 10×PCR buffer，4μl 2.5mM MgCl₂, 1μl 10 mM dNTPs，各1μl 10 mM正、反向引物，0.5μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50μ1；PCR反应条件为：95°C预变性3分钟，94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸2分钟；35个循环后，72°C再延伸7分钟。

(3) PCR产物测序，对测序结果进行处理分析，截取COIII基因全序列，使用ClustalX软件进行DNA序列比对。达到物种鉴定的目的。

作为优选，本发明所述的鉴定方法中，其中步骤(1)所述的蜘蛛种类包括但不限于下述：拟水狼蛛(Pirata subpiraticus)，三突花蛛(Ebrechtella tricuspidata)，横纹金蛛(Argiope bruennichi)，锥腹肖蛸(Tetragnatha maxillosa)，华丽肖蛸(Tetragnatha nitens)，茶色新圆蛛(Neoscona theisi)、脉娲蛛(Wadicosa venatrix)、黑色蝇虎(Plexippus paykulli)，大腹园蛛(Araneus ventricosus)、猫跳蛛(Carrhotus xanthogramma)。

本发明的优点是：

1. 本发明提供的蜘蛛线粒体COIII基因扩增引物，可以高效特异(条带单一)的扩增多种蜘蛛的线粒体COIII基因的全序列，而不仅仅是部分序列，能应用于蜘蛛不同分类阶元系统进化和分类研究；

2. 该方法所述的物种鉴定方法可以对多种蜘蛛进行准确鉴定，且不受发育阶段和个体残缺的限制，大大克服了形态鉴定的困难，缩短了鉴定的周期；该种蜘蛛的分子生物学鉴别方法对使用的仪器设备要求较低，且无需复杂的技术步骤和昂贵的试剂，一般的技术人员均可操作，比传统的形态学鉴别更准确可靠。

附图说明

图1为本发明中蜘蛛线粒体COIII基因扩增引物用以扩增不同种类蜘蛛线粒体COIII基因的电泳图谱。

其中，M: DNA分子量标准(Mark IV)；1-10泳道依次为拟水狼蛛，三突花蛛，横纹金蛛，锥腹肖蛸，华丽肖蛸，茶色新圆蛛、脉娲蛛、黑色蝇虎，大腹园蛛，猫跳蛛。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明

实施例1：

(1) 蜘蛛样品的采集，鉴定及保存

实施例中所用蜘蛛种类均用陷阱法采自浙江省余姚市或桐乡县农田。所采标本带回实验室进行信息登记，均用体视显微镜鉴定，以确定种类，蜘蛛标本用100%的酒精浸泡并保存于4°C冰箱备用。所采集的蜘蛛种类包括：拟水狼蛛，三花突蛛，横纹金蛛，锥腹肖蛸，华丽肖蛸，茶色新圆蛛、脉娲蛛、黑色蝇虎，大腹园蛛、猫跳蛛。

蜘蛛基因组总DNA的提取

采用DNA抽提试剂盒提取不同种类蜘蛛的总基因组DNA 。为避免污染，舍去头腹部，只从腿部提取DNA。DNA提取直接利用 DNA抽提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取。提取的总基因组–20°C保存备用。

设计合成蜘蛛线粒体COIII基因全序列的扩增引物

登陆NCBI网站中的GenBank数据库收索已公布的蜘蛛全线粒体基因组序列，经ClustalW软件同源比对，找出COIII基因上下游保守的序列，利用Premier primer 5.0 软件设计出蜘蛛线粒体COIII基因全序列扩增引物并送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。正向引物 COIII-F如SEQ ID NO:1所示，反向引物 COIII-R如SEQ ID NO:2所示:

SEQ ID NO:1: 5′- ATGTTCTGAAATTTGTGGT -3′;

SEQ ID NO:2: 5′- TACTACATCTACAAAATGTC -3′。

PCR扩增线粒体COIII基因全序列和序列测定

利用上述的一对引物，以抽提好的蜘蛛基因组为模板，进行 PCR 扩增。其中，PCR反应体系为 50μ1，其中：2μl模板 DNA (约20ng)，5μl 10×PCR buffer，4μl 2. 5mMMgCl₂, 1μl 10 mM dNTPs，各1μl 10 mM正、反向引物，0.5μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50μ1；

PCR反应条件为：95°C预变性3分钟，94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸2分钟；35个循环后，72°C再延伸7分钟。

PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测(结果见图1)，扩增片段用凝胶回收试剂盒(天根生化科技有限公司)割胶回收。回收产物送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

依据COIII全序列信息快速确定蜘蛛的种类。

对上一步测序结果进行处理分析，截取COIII序列，用ClustalX软件进行序列信息比对，进行物种鉴定。

蜘蛛的COIII基因全序列如下：

拟水狼蛛的COIII基因全序列如SEQ ID NO:3所示：

TTGGAAAAGCATTATCATCCTTTTCATATAGTAAATATATCACCTTGACCTTTAGTAACAGGATTTGGAGCATTATTTATAGTTATTGGAATAATTAAAATATTTATATTTTATGATGTTAGATTATTATTATTTTCTTTTGTTATATTATTTGTAGTAGCTATATTATGGTGACGAGATGTAATTCGAGAAAGAACCTTTCAGGGATTCCATTCAAGAATTGTATTAAAAGGGTTGATAGTAGGTATAGTTTTATTTATTGTAAGAGAAATTTTTTTCTTTTTTTCTTTTTTTTGGGCCTTTTTTCATTCTAGACTAAGACCTACAATTGAATTAGGGTCTTATTGACCTCCAATGGGAATTCATACTTTTAATCCTTTTCAGGTTCCTTTATTAAATACTGTAATTTTATTGTCCTCAGGGGTAAGAGTAACTTGGGCTCATCAGCTTATTTTAAGGGAAGATTGATATGGAGTTGAGATTTCTTTAATAATAACTTGATTGTTAGGATTATATTTTTTAATATTACAAGGGTTTGAATATTATATATCTTCTGTTAGAATTAGAGATTCTGTTTTTGGATCTACTTTTTTTATGTCTACTGGTTTTCATGGATTTCATGTTATTGTTGGTACTTTATTTTTGTTTATTATTTGAATTCGTTTTTTAAATAGACATTTTTCTGGGGGGCATCACTTTGGATTTGAGGCTGCTGTATGATATTGACATTTTGTAGATGTAGTATGATTATTTTTATTTTCTGTTGTTTACTGATGGGGGTCTTAA；

三花突蛛COIII基因全序列如SEQ ID NO:4所示：

TTGGAAAGGCATTATCATCCTTTTCATATAGTTAATATATCCCCTTGACCTTTAATAAGAGGGTTTACAGCTTTGGCTGTGGTTTCAGGTATAATTAAAATGTTTGCGTATTATGATTTTAATTTATTTTTATTTTCTTTTTTTGTGTTAATTTTGGTAGCTTTTTCTTGATGGCGAGATGTAGTACGGGAAAGAACTTATCAGGGATTTCATTCTAGAATAGTGTTAAATGGTTTGATTTGGGGTATGATTTTGTTTATTGTTAGAGAGATTTTTTTTTTCTTTTCTTTTTTTTGGGGATTTTTTCATTCTAGATTGAGACCTTCTATTGAATTAGGATCTCAATGACCTCCTATAGGGGTTTTTTCTTTAAATCCTTTTCAAGTTCCTCTTTTAAATACTATTATTTTATTATCTTCGGGAGTTAGAGTTACTTGGTGCCATCAAATAATTTTAAATGAAAATTGAGATAGAGCTAAATCTTCTTTAATATTAACTTGAATTTTAGGAATTTATTTTTTAATACTTCAAGGATTTGAATATTATATAAGATCTTTTAGAATTAGAGATTCTAGATTTGGTTCAGTTTTTTTTATAGCTACAGGATTTCATGGTTTTCATGTAATTGTAGGTACTTTATTTTTATTTGTAATTTGAACACGATTTAATAGGGAGCATTTTTCTAGAAGTCATCATTTTGGTTTTGAAGCTGCTGCTTGGTATTTGACATTTTGTAGATGTAGTATGATTATTTTTGTTTTCTGTAGTATATTGATGGGGAACT；

横纹金蛛COIII基因全序列如SEQ ID NO:5所示：

TTGGAAAAGACATTTCATCCATTTCATATTGTAACAATTTCTCCGTGGCCTTTATTAATAGGGTTTGGAGTTATATCAGGAGTAATTGGAATAGTAAAAATATTTATATTTATAAAGTTTGATTTGTTATTTTTATCATTTTTAATTGCTGGAATAGTAGCGTTTGGATGATGACGGGATGTAGTTCGTGAAAGAACATTTCAAGGATATCATTCTAGAAATGTTTTGAGAGGATTAATGTTAGGAATAATTTTATTTATTGTAAGTGAGGTTTTCTTTTTTTTATCTTTTTTCTGGGCATTTTTTCATGCGAGATTAAATCCTACTGTAGAGTTAGGCGTAATATGACCTCCCCAGGGAATTAAGGCTTTTAGACCATTTCAAGTTCCCTTATTAAATACAGTGATTTTGTTAGCATCTGGTGTGTCAGTTACTTGAGCTCATCAATCTATTTTAAATGAAAATTGAAAAATAGCAAATTATTCTTTAATAATAACTTGAATATTAGGAATTTATTTTTTATCTTTACAAGGCTTTGAATATTATATAGCAGAATTTAGAATTTCTGATTCTGTATTTGGTTCCGTATTTTTTATAGCAACAGGGTTTCATGGATTTCATGTAATTGTAGGAAGGCTATTTTTATTTTTTATATGAGTTCGTTTAACAAAGAGACATTTTAGAAGAAGCCATCATTTTGGGTTTGAATGTGCTGCTTGATATTGACATTTTGTTGATGTAGTGTGATTATTTTTATTTTCAGTAGTTTATTGATGAGGGACTTAA；

锥腹肖蛸COIII基因全序列如SEQ ID NO:6所示：

TTGTCAAAAGTTTTTCATATATACCATATAGTAAATGTCTCTCCTTGACCATTTTTAATGGGGTCTGCTTCTTTAAGAGTAGTTCTAGGACTAGTTAAAATATTTGTTTTTTATAGATTTAAATCTTTTTTTTTCTCTCTTTTTTGTGTGGGTTTGGTGTTTCTTTTATGAGAAAAGGATGTGGTTCGAGAGAGAACTTTTCAAGGATTTCATTGTAGCCGAGTAGTAAGAGGATTAATTTATGGGATGATTTTATTTATTGTTAGAGAAGTATTTTTTTTTATTTCATTTTTCTGAACTTTTTTTCATTCTAGTTTAAACCCTGTAACAGATTTAGGGGCTGTTTGACCCCCCATAGGGATTTCCCCTTTAAATCCTTTTAGAGTTCCTTTGTTAAATACTGTAGTTTTATTAGCATCTGGGGTATCAATTACTTTATGTCATCAAGGTATTATCAATGAAGATTGAAAAAAAAGAATTTTGTCTTTAGGTATAACTTGGGGGTTAGGGTTATATTTTTTAATATTACAATATTTTGAGTATAAAATAGCAGGGTTTAGAATATCGGATTCTGTTTACGGATCTGTATTCTTTATATCAACAGGGTTTCATGGATTCCATGTATTAGTAGGAACTTTATTTTTAATAGTAATATTCTTTCGAATAATTAAGTCCCATTTTAGAATAAGACATCATTTAGGATTTGAATGTGCTGCTTGGTATTGACATTTTGTAGATGTAGTATGATTATTTTTATTTTCTGTTGTTTATTGATGGGGGTCTTAA；

华丽肖蛸COIII基因全序列如SEQ ID NO:7所示：

TTGATAAAAGTTTTTCATATATATCATATAGTTAATATATCCCCATGACCGTTTTTAATAGGATTCTCTGCCTTAAGAGTGGTTTTAGGATTAGTAAAGATATTCATTTTTAAAAATATAATCTCTTTTATCGCCAGAATTTGTTGTACAATTTTTATTTTCTTTTTATGGGAAAAAGATGTGGTTCGAGAGAGAACTTTTCAAGGAAATCATTGTAGACGTGTTGTTGAAGGTTTAATTTATGGTATAATTTTATTTATTGTTAGAGAAATTTTTTTTTTTCTCTCTTTTTTTTGAGCCTTTTTCCACTCAAGTTTAAATCCCGTAGTAGATTTAGGTTCAGATTGACCTCCTATAGGAATTTCCCCTCTAAACCCCTTTAGAGTTCCTTTGTTAAATACTGTGGTATTATTAGCTTCAGGGGTATCTATTACTTTTTGTCATCAGAGAATTTTAAACCAGGATTGAAAGAAAATAGTAACTTCGTTAATAGTAACTTGGGCACTTGGTCTATATTTCTTAACTTTGCAATATTTTGAATATAAAATAGCAGGATTCAGAATTTCTGATTCTGTATTTGGATCTGTATTTTTTATATCAACTGGATTTCATGGTTTCCATGTAATGGTAGGAACGGGATTTTTATTAATTATATTTATTCGAGGAATTAAGAGACATTTCAGAAGAAGTCATCATTTAGGATTTGAATGTGCTGCTTGGTATTGACATTTTGTAGATGTAGTATGGTTATTTCTATTTTCAGTAGTATATTGATGGGGTTGTTAATTTAAGTAA；

茶色新圆蛛COIII基因全序列如SEQ ID NO:8所示：

TTGGAAAAAACTTTTCATCCTTTTCATATTGTAACTATTTCACCATGGCCTTTATTAATAGGGTTTGGAGTTATATCTGGTGTTATTGGAATAATTAAGATATTTATATTTATAAAGTTTGATTTATTATCTATATCATTTTTAATTGTTGTTATAGTAGCTTTTGGGTGGTGACGAGATGTTGTTCGGGAAAGAACTTTTCAGGGATATCATTCAAGAAATGTATTAAGAGGATTAATACTAGGAATAATTTTATTCATTGTAAGAGAAGTATTTTTTTTTTTATCATTTTTTTGAGCTTTTTTTCATTCAAGATTAAATCCTACTGTAGAATTAGGTGTAATTTGACCTCCTCAGGGAATCAAGGCGTTTAGTCCATTTCAAATTCCTTTATTAAATACTATTATTTTATTAGCATCTGGGGTTTCTGTAACATGAGCTCATCAATCTATTTTAAATGAGAATTGAAAGATAGCAAATTATTCTTTAATATTAACGTGAATATTAGGCGTTTATTTTTTAGGGCTTCAAGGTTTCGAATATTATATAGCAGAATTCAGAATTTCTGATTCAGTTTTTGGATCAGTATTTTTTATAGCTACTGGATTTCATGGATTTCATGTAATTGTGGGAAGATTATTTTTATTTGTAATATGAATACGATTAACTAAGAGACATTTTAGAAGAAGTCATCACTTTGGATTTGAAAGAGCTGCTTGATACTGACATTTTGTAGATGTAGTATGGTTATTTTTATTTTCTGTAGTTTATTGATGAGGAACTTAA；

脉娲蛛COIII基因全序列如SEQ ID NO:9所示：

TTGGAAAAGCATTTTCATCCTTTTCATATAGTAAATATATCTCCTTGACCATTAGTAGTAGGATTTGGGGCTTTATTTATAGTAGTTGGAATAATTAAAATGTTTATATTTTATGATGTAAGTTTATTAATATTGTCTTTTGTAATATTATTTGTGGTAGCTATATTATGGTGGCGAGATGTAATTCGAGAAAGAACCTTTCAGGGATTCCACTCAAGAGTGGTATTGAAGGGATTGATAGTTGGTATAATTTTATTTATTGTAAGAGAAATTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTTGAGCTTTTTTTCATTCTAGACTTAGTCCTACAATTGAATTAGGGTCTTATTGACCTCCTATAGGTATTCATCCTTTTAATCCTTTTCAAGTGCCTTTATTAAATACTGTAATTTTACTTTCTTCAGGTGTTAGAGTAACTTGGGCTCATCAGCTTATTTTAAGGGAAGATTGGTATGGGGTTAAGATTTCTTTAATGATGACTTGATTATTGGGATTATATTTTTTAATATTACAAGGATTTGAATATTATATATCTTCTACTGGAATTAGAGATTCTGTTTTTGGATCTACTTTTTTTATATCTACTGGTTTTCATGGGTTTCATGTTATTGTTGGTACTTTATTTTTATTTATTATTTGAATTCGTTTTTTAGGTGGGCATTTTTCTGGCAGACATCATTTTGGATTTGAAGCTGCGGTTTGATATTGACATTTTGTAGATGTAGTATGATTATTTTTATTTTCTGTTGTTTATTGGTGAGGTGGATAA；

黑色蝇虎COIII基因全序列如SEQ ID NO:10所示：

TTGGAAAAGTTTTTTCATCCTTATCATATAGTAAATATGTCTCCTTGACCTTTAGTTGTTGGATTTGGGGCTATAAGAGTAGTAATTGGACTAGTTAAAATGTTCTGTTTTTTTGAGACTGATTTATTGTTTGTATCTTTATATTTAGTAGCAATAGTGGCTTTATTATGATGGCGGGATGTAATTCGGGAGAGTACATTTCAAGGTCTTCATTCTAGAATAGTTTTAAGAGGATTAATAGTAGGGATAATCTTATTTATTGTAAGAGAGGTATTTTTTTTTATTTCTTTTTTTTGAGCTTTTTTTCATTCTAGTTTAAGTCCAACTATTGAGCTAGGATCATTTTGGCCTCCATGTGGTATTTTCCCCTTTAATCCTTTTCAAGTTCCTTTACTAAATACTGTAATTTTATTGGCTTCTGGGGTAACTGTAACTTGAGCCCATCAATTAATATTAAATAATAATTGAAATGGAGCTAAAAGAGCTTTATTAATAACTTGAATGTTGGGTTTATATTTTTTGATATTACAAGGATTTGAATATTATATAGCATCTTTTAGAATTTCAGATTCTGTATATGGATCAACATTTTTTATAGCTACGGGATTTCATGGATTTCATGTAATTGTTGGTACTTTATTTTTATTTTTTATTTGAACCCGATTAGTTAAAAATCAATTAACGAGAGGACATCATTTTGGGTTTGAAGCTGCTGCTTGATATTGACATTTTGTAGATGTGGTTTGGTTATTTTTGTTTTCTGTAGTTTATTGGTGAGGTACTTAA；

大腹园蛛COIII基因全序列如SEQ ID NO:11所示：

TTGGAAAAGACTTTTCACCCATTTCATATTGTTACTATCTCTCCTTGACCTTTATTAATAGGATTTGGTGTAATATCTGGGGTGATTGGAATAATTAAAATGTTTATATTTATAAAGTTAGATTTATTATTTATATCTTTTTTTATCGCTGTTTTAGTAGCCATTGGTTGGTGACGAGATGTGGTTCGTGAAAGAACTTTTCAAGGTTTTCATTCTAGAAATGTTTTAAGTGGTTTAATATTAGGAATAATCTTGTTCATTGTAAGAGAAATTTTTTTTTTTTTATCTTTTTTTTGGGCCTTTTTTCACTCTAGGTTGAATCCCACAGTTGAGTTAGGTGTAGTATGACCCCCCGAGGGGATTAGTGCTTTTAGTCCGTTTCAAATTCCATTATTAAATACTGTAATTCTTTTGGCTTCGGGAGTTTCTGTTACTTGAGCTCATCAATCTATTTTGAATGAAAATTGAAAATTAGCTGGTCAATCTTTAATAATAACATGAATGCTAGGAATCTATTTTTTGGGTCTTCAAGGGTTTGAATATTATATAGCGGAGTTTAGAATTTCAGATTCAGTATTTGGATCTGTTTTTTTTATGGCTACTGGTTTTCATGGGTTTCATGTAATTGTTGGAAGATTATTTCTTATTGTAATATGATTACGATTGATCAAGGGTCATTTTAGGAGAAGACATCATTTTGGGTTTGAATGTGCAGCTTGATATTGACATTTTGTAGATGTAGTATGATTATTTTTATTCTCGGTAGTATATTGATGGGGAACTTGA；

猫跳蛛COIII基因全序列如SEQ ID NO:12所示：

ATGGAAAAGTTTTTTCATCCTTATCATATAGTTAACATGTCTCCTTGACCTTTAATAGCAGGGTTTGGCGGATTAAGAGTGGTTATTGGAATAATTAATATATTTGTATTTTTTGATTTTACAATGTTATATACTTCTTTATTATTAATATTTGTTATTTCTTTTATGTGATGGCGGGATGTAATTCGGGAAAGAACGTATATAGGATATCATTCTAGAACAGTATTAAGTGGCTTAATATTAGGAATAATTTTATTTATTGTAAGAGAGGTATTTTTTTTTATTTCATTTTTTTGAGCTTTTTTCCATTCTAGATTGAGACCAACACTTGAATTAGGATCAGTATGACCTCCTTGCGGTATTTTGCCTTTTAATCCATTTCAGGTTCCACTTTTGAATACTGTTATCTTATTAGCTTCTGGAGTAACAGTTACATGAGCTCATCAATTTATATTAAATAATAATTGAGAAGGATCGAAGAGGGCTTTAATAATTACATGAATGTTAGGTTTATATTTTTTAATATTACAAGGGTTTGAATATTTTACAGCATCGTTTGGAATTTCTGATTCTGTATATGGATCAACTTTTTTTATAGCGACTGGATTTCATGGCTTTCATGTAATTGTTGGAACTTTATTTTTATTATTTATTTGAATGCGTTTAATTAAAAATCAATTAACAAATAGACATCATTTTGGGTTTGAAGCTGCTGCTTGATATTGACATTTTGTAGATGTAGTATGATTATTTTTATTTTCTGTGGTATATTGATGAGGAACTTAA。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国计量学院

<120> 一种蜘蛛线粒体COIII基因全序列扩增引物及鉴定方法

<130> 123456

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgttctgaa atttgtggt 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tactacatct acaaaatgtc 20

<210> 3

<211> 786

<212> DNA

<213> 拟水狼蛛

<400> 3

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<210> 4

<211> 784

<212> DNA

<213> 三花突蛛

<400> 4

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<210> 5

<211> 786

<212> DNA

<213> 横纹金蛛

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<212> DNA

<213> 锥腹肖蛸

<400> 6

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<210> 7

<211> 795

<212> DNA

<213> 华丽肖蛸

<400> 7

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atctctttta tcgccagaat ttgttgtaca atttttattt tctttttatg ggaaaaagat 180

gtggttcgag agagaacttt tcaaggaaat cattgtagac gtgttgttga aggtttaatt 240

tatggtataa ttttatttat tgttagagaa attttttttt ttctctcttt tttttgagcc 300

tttttccact caagtttaaa tcccgtagta gatttaggtt cagattgacc tcctatagga 360

atttcccctc taaacccctt tagagttcct ttgttaaata ctgtggtatt attagcttca 420

ggggtatcta ttactttttg tcatcagaga attttaaacc aggattgaaa gaaaatagta 480

acttcgttaa tagtaacttg ggcacttggt ctatatttct taactttgca atattttgaa 540

tataaaatag caggattcag aatttctgat tctgtatttg gatctgtatt ttttatatca 600

actggatttc atggtttcca tgtaatggta ggaacgggat ttttattaat tatatttatt 660

cgaggaatta agagacattt cagaagaagt catcatttag gatttgaatg tgctgcttgg 720

tattgacatt ttgtagatgt agtatggtta tttctatttt cagtagtata ttgatggggt 780

tgttaattta agtaa 795

<210> 8

<211> 786

<212> DNA

<213> 茶色新圆蛛

<400> 8

ttggaaaaaa cttttcatcc ttttcatatt gtaactattt caccatggcc tttattaata 60

gggtttggag ttatatctgg tgttattgga ataattaaga tatttatatt tataaagttt 120

gatttattat ctatatcatt tttaattgtt gttatagtag cttttgggtg gtgacgagat 180

gttgttcggg aaagaacttt tcagggatat cattcaagaa atgtattaag aggattaata 240

ctaggaataa ttttattcat tgtaagagaa gtattttttt ttttatcatt tttttgagct 300

ttttttcatt caagattaaa tcctactgta gaattaggtg taatttgacc tcctcaggga 360

atcaaggcgt ttagtccatt tcaaattcct ttattaaata ctattatttt attagcatct 420

ggggtttctg taacatgagc tcatcaatct attttaaatg agaattgaaa gatagcaaat 480

tattctttaa tattaacgtg aatattaggc gtttattttt tagggcttca aggtttcgaa 540

tattatatag cagaattcag aatttctgat tcagtttttg gatcagtatt ttttatagct 600

actggatttc atggatttca tgtaattgtg ggaagattat ttttatttgt aatatgaata 660

cgattaacta agagacattt tagaagaagt catcactttg gatttgaaag agctgcttga 720

tactgacatt ttgtagatgt agtatggtta tttttatttt ctgtagttta ttgatgagga 780

acttaa 786

<210> 9

<211> 786

<212> DNA

<213> 脉娲蛛

<400> 9

ttggaaaagc attttcatcc ttttcatata gtaaatatat ctccttgacc attagtagta 60

ggatttgggg ctttatttat agtagttgga ataattaaaa tgtttatatt ttatgatgta 120

agtttattaa tattgtcttt tgtaatatta tttgtggtag ctatattatg gtggcgagat 180

gtaattcgag aaagaacctt tcagggattc cactcaagag tggtattgaa gggattgata 240

gttggtataa ttttatttat tgtaagagaa attttttttt ttttttcttt tttttgagct 300

ttttttcatt ctagacttag tcctacaatt gaattagggt cttattgacc tcctataggt 360

attcatcctt ttaatccttt tcaagtgcct ttattaaata ctgtaatttt actttcttca 420

ggtgttagag taacttgggc tcatcagctt attttaaggg aagattggta tggggttaag 480

atttctttaa tgatgacttg attattggga ttatattttt taatattaca aggatttgaa 540

tattatatat cttctactgg aattagagat tctgtttttg gatctacttt ttttatatct 600

actggttttc atgggtttca tgttattgtt ggtactttat ttttatttat tatttgaatt 660

cgttttttag gtgggcattt ttctggcaga catcattttg gatttgaagc tgcggtttga 720

tattgacatt ttgtagatgt agtatgatta tttttatttt ctgttgttta ttggtgaggt 780

ggataa 786

<210> 10

<211> 786

<212> DNA

<213> 黑色蝇虎

<400> 10

ttggaaaagt tttttcatcc ttatcatata gtaaatatgt ctccttgacc tttagttgtt 60

ggatttgggg ctataagagt agtaattgga ctagttaaaa tgttctgttt ttttgagact 120

gatttattgt ttgtatcttt atatttagta gcaatagtgg ctttattatg atggcgggat 180

gtaattcggg agagtacatt tcaaggtctt cattctagaa tagttttaag aggattaata 240

gtagggataa tcttatttat tgtaagagag gtattttttt ttatttcttt tttttgagct 300

ttttttcatt ctagtttaag tccaactatt gagctaggat cattttggcc tccatgtggt 360

attttcccct ttaatccttt tcaagttcct ttactaaata ctgtaatttt attggcttct 420

ggggtaactg taacttgagc ccatcaatta atattaaata ataattgaaa tggagctaaa 480

agagctttat taataacttg aatgttgggt ttatattttt tgatattaca aggatttgaa 540

tattatatag catcttttag aatttcagat tctgtatatg gatcaacatt ttttatagct 600

acgggatttc atggatttca tgtaattgtt ggtactttat ttttattttt tatttgaacc 660

cgattagtta aaaatcaatt aacgagagga catcattttg ggtttgaagc tgctgcttga 720

tattgacatt ttgtagatgt ggtttggtta tttttgtttt ctgtagttta ttggtgaggt 780

acttaa 786

<210> 11

<211> 786

<212> DNA

<213> 大腹园蛛

<400> 11

ttggaaaaga cttttcaccc atttcatatt gttactatct ctccttgacc tttattaata 60

ggatttggtg taatatctgg ggtgattgga ataattaaaa tgtttatatt tataaagtta 120

gatttattat ttatatcttt ttttatcgct gttttagtag ccattggttg gtgacgagat 180

gtggttcgtg aaagaacttt tcaaggtttt cattctagaa atgttttaag tggtttaata 240

ttaggaataa tcttgttcat tgtaagagaa attttttttt ttttatcttt tttttgggcc 300

ttttttcact ctaggttgaa tcccacagtt gagttaggtg tagtatgacc ccccgagggg 360

attagtgctt ttagtccgtt tcaaattcca ttattaaata ctgtaattct tttggcttcg 420

ggagtttctg ttacttgagc tcatcaatct attttgaatg aaaattgaaa attagctggt 480

caatctttaa taataacatg aatgctagga atctattttt tgggtcttca agggtttgaa 540

tattatatag cggagtttag aatttcagat tcagtatttg gatctgtttt ttttatggct 600

actggttttc atgggtttca tgtaattgtt ggaagattat ttcttattgt aatatgatta 660

cgattgatca agggtcattt taggagaaga catcattttg ggtttgaatg tgcagcttga 720

tattgacatt ttgtagatgt agtatgatta tttttattct cggtagtata ttgatgggga 780

acttga 786

<210> 12

<211> 786

<212> DNA

<213> 猫跳蛛

<400> 12

atggaaaagt tttttcatcc ttatcatata gttaacatgt ctccttgacc tttaatagca 60

gggtttggcg gattaagagt ggttattgga ataattaata tatttgtatt ttttgatttt 120

acaatgttat atacttcttt attattaata tttgttattt cttttatgtg atggcgggat 180

gtaattcggg aaagaacgta tataggatat cattctagaa cagtattaag tggcttaata 240

ttaggaataa ttttatttat tgtaagagag gtattttttt ttatttcatt tttttgagct 300

tttttccatt ctagattgag accaacactt gaattaggat cagtatgacc tccttgcggt 360

attttgcctt ttaatccatt tcaggttcca cttttgaata ctgttatctt attagcttct 420

ggagtaacag ttacatgagc tcatcaattt atattaaata ataattgaga aggatcgaag 480

agggctttaa taattacatg aatgttaggt ttatattttt taatattaca agggtttgaa 540

tattttacag catcgtttgg aatttctgat tctgtatatg gatcaacttt ttttatagcg 600

actggatttc atggctttca tgtaattgtt ggaactttat ttttattatt tatttgaatg 660

cgtttaatta aaaatcaatt aacaaataga catcattttg ggtttgaagc tgctgcttga 720

tattgacatt ttgtagatgt agtatgatta tttttatttt ctgtggtata ttgatgagga 780

acttaa 786

Claims (6)

1.一种蜘蛛线粒体COIII基因全序列扩增引物，其特征在于: 正向引物COIII-F如SEQID NO:1所示，反向引物COIII -R如SEQ ID NO:2所示，

SEQ ID NO:1: 5′- ATGTTCTGAAATTTGTGGT -3′;

SEQ ID NO:2: 5′- TACTACATCTACAAAATGTC -3′。

2.根据权利要求1所述的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的设计方法为：登陆NCBI网站中的GenBank数据库搜索已测定的蜘蛛线粒体全基因组序列，经ClustalX同源比对，在COIII基因上下游找出保守的序列，利用Premier primer 5.0 软件设计出蜘蛛线粒体COIII基因全序列扩增引物。

3.一种基于如权利要求1所述扩增引物的蜘蛛种类鉴定方法，其特征在于该方法按以下述步骤进行：(1) DNA抽提试剂盒法提取待鉴定蜘蛛的总DNA；(2) 设计蜘蛛线粒体COIII基因全序列的扩增引物；所述步骤(2)的扩增引物为：正向引物 COIII-F如SEQ NO: 1所示，反向引物 COIII-R如SEQ NO: 2所示；

(3)以蜘蛛总基因组DNA为模板，进行PCR扩增；所述步骤(3)的 PCR 反应体系为 50μ1，其中：2μl模板 DNA，5μl 10×PCR buffer, 4μl 2.5 mM MgCl₂，1μl 10 mM dNTPs，各1μl10 mM正、反向引物，0.5μl 5U/μl TaqDNA聚合酶，加去离子水调至终体积50μ1；PCR反应条件如下：95°C预变性5分钟，94°C变性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸2分钟；35个循环后，72°C再延伸7分钟； (4) 扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，试剂盒法割胶回收COIII扩增片段，测序；依据COIII全序列信息快速确定蜘蛛的种类。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中为避免蜘蛛肠道内容物的污染，舍去头腹部，只从其腿部提取 DNA。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中蜘蛛种类包括：拟水狼蛛，三突花蛛，横纹金蛛，锥腹肖蛸，华丽肖蛸，茶色新圆蛛、脉娲蛛、黑色蝇虎，大腹园蛛，猫跳蛛。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中凝胶电泳采用1.5％琼脂糖凝胶电泳；根据COIII全基因序列碱基信息进行蜘蛛种类鉴定。