CN116516049A - 一组大豆蛋白含量QTL位点qPRO_11_1及其分子标记和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子标记技术领域，本发明提供了一组大豆蛋白含量QTL位点qPRO_11_1及其分子标记和应用。本发明提供的一组大豆蛋白含量QTL位点qPRO_11_1，位于大豆11号染色体的两个SSR分子标记之间的物理区间，所述物理区间的长度为126.27kb，所述物理区间内包含5个基因，所述两个SSR分子标记分别为BARCSOYSSR_11_1087和BARCSOYSSR_11_1090。在此基础上，本发明开发了一种分子标记CAPS11，经研究发现，该分子标记CAPS11与大豆蛋白含量表型紧密连锁。本发明为大豆有关性状的基因挖掘和图位克隆提供了实验基础，为大豆分子标记辅助选育提供了可用标记。
Description
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一组大豆蛋白含量QTL位点qPRO_11_1及其分子标记和应用。
背景技术
大豆是世界上重要的粮食和经济作物，随着经济水平的发展，大豆的需求量逐年增加，对大豆品质要求也逐渐增加。大豆为人类提供了占世界植物蛋白供应市场70％左右的蛋白质资源。培育高蛋白大豆种质，是大豆分子育种的重要目标之一。根据GB 1352-2009的规定，粗蛋白质含量不低于40.0％的大豆，为高蛋白质大豆。
大豆蛋白质含量是受多基因控制的复杂数量性状，容易受到外界环境的影响。国内外对于大豆蛋白质QTL有过大量分析，但是高效稳定的位点较少，很难直接应用到大豆分子育种当中，并且可能出现主效位点的丢失。随着现代分子标记技术的发展，为大豆蛋白质含量数量性状研究提供了新的方法。利用分子标记定位数量性状QTL，其实质是分析分子标记与目标性状QTL之间的连锁关系。基于获得的标记基因型分离与数量性状的量之间的关系，可直接把握数量性状基因，并开发可应用于分子标记辅助选择(Molecular-assistedselection,MAS)育种的技术。
发明内容
本发明的目的在于利用分子标记技术进行大豆蛋白质含量QTL定位，提供一组大豆蛋白含量QTL位点qPRO_11_1，进而提供一种用于鉴定大豆蛋白含量性状的分子标记CAPS11及其应用，为培育大豆高蛋白新种质提供基础。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一组大豆蛋白含量QTL位点qPRO_11_1，所述qPRO_11_1位于大豆williams82参考基因组第11号染色体的两个SSR分子标记之间的物理区间，所述物理区间的长度为126.27kb，所述物理区间内包含5个基因，所述两个SSR分子标记分别为BARCSOYSSR_11_1087和BARCSOYSSR_11_1090。
本发明还提供了一种与上述大豆蛋白含量QTL位点qPRO_11_1紧密连锁的分子标记CAPS11，所述分子标记CAPS11位于大豆williams82参考基因组第11号染色体的15645746bp位置处，所述15645746bp位置处的核苷酸为C或A多态。
优选的，当所述15645746bp位置处的核苷酸为C时，表达低蛋白性状；当所述15645746bp位置处的核苷酸为A时，表达高蛋白性状。
本发明还提供了上述分子标记CAPS11在选育高蛋白大豆品种或种质中的应用。
本发明还提供了一种利用上述分子标记CAPS11选育高蛋白大豆品种或种质的方法，包括如下步骤：
(1)提取待测大豆品种或种质的基因组DNA，利用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR扩增产物采用限制性内切酶BasXI进行酶切，根据PCR扩增和酶切的结果判定待测大豆品种或种质是否为高蛋白大豆品种或种质；
(2)若PCR扩增产物为长度为322bp的DNA片段，且酶切产物为长度为188bp和134bp的DNA片段，则判定为是高蛋白大豆品种或种质，否则判定为不是高蛋白大豆品种或种质。
本发明还提供了一种用于鉴定大豆高蛋白性状的引物对，所述引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物对的下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明利用大豆低蛋白含量品种黑农84和高蛋白含量品种京河4号及其杂交后代的遗传群体进行QTL定位，结合SSR标记基因型数据和蛋白质含量表型数据进行连锁分析，获得一组蛋白质含量QTL，位于11号染色体，区间内包含5个基因。11号染色体上获得的区间内候选基因Glyma.11G164700，在15645746bp位置处有一个SNP变异位点，开发为CAPS标记进行亲本及后代群体鉴定，该标记与大豆蛋白含量表型紧密连锁。本发明为大豆有关性状的基因挖掘和图位克隆提供了实验基础，为大豆分子标记辅助选育提供了可用标记，有助于培育大豆高蛋白新种质。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中大豆低蛋白含量品种黑农84和高蛋白含量品种京河4号的遗传群体F2及F2:3家系蛋白质含量分布分析图(注：A表示F2群体；B表示F2:3群体)；
图2为本发明实施例1中11号染色体蛋白质含量QTL定位遗传图谱；
图3为本发明实施例2中qPRO_11_1精细定位结果；
图4为本发明实施例4中CAPS标记酶切鉴定及群体的蛋白质含量差异显著性分析(注：左图表示亲本间CAPS标记鉴定及酶切结果电泳胶图；右图表示鉴定群体的蛋白质含量差异显著性分析图，**表示0.001<p≤0.01))。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例中所用的大豆蛋白质含量相关研究材料由黑龙江省农业科学院大豆所提供。
实施例1
大豆蛋白质含量QTL定位分析：
(1)群体构建
利用黑龙江省高产优质品种黑农84为母本，蛋白质含量43.26％，为黑龙江省农业科学院大豆所培育的多抗、高产的种质；高蛋白品系京河4号为父本，蛋白质含量为45.7％，为黑龙江省农业科学院黑河分院培育。杂交构建包含880个家系的F2群体。
(2)表型数据测定
选择表面干净、无裂纹、菌斑、颗粒完整的大豆种子样品，利用德国Bruker公司生产的傅立叶变换近红外光谱仪对群体样品扫描，采集样品的近红外吸收光谱信息，用已构建好的大豆蛋白质干基模型在软件OPUS中分析样品光谱数据得到蛋白质含量数据，每个株系取5个单株，每株进行3次重复，5个单株的平均值代表该样品的蛋白质含量。
(3)DNA提取、PCR扩增及凝胶电泳
F2群体880个家系分别取不同单株叶片等量混合，采取CTAB法提取基因组DNA，同时提取亲本的基因组DNA。
PCR反应采用10μL反应体系，反应液组成为2μL的DNA模板(20ng/μL)，5μL 10xEasyTaqMix，2μL的ddH2O，1μL 2μmol/L SSR引物(正反向引物混合)。其中，用到的SSR引物如表1所示。
表1SSR引物序列
PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环34次，最后72℃延伸5min，12℃保存。扩增产物中加入3μL6×loadingbuffer(0.125g的溴酚蓝，0.125g的二甲苯青，49mL的甲酚胺，1mL0.5mol/L，pH8.0的EDTA)，取出后产物迅速置于4℃冰箱保存。
通过6％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR标记的群体扩增产物，取1μLPCR产物点样，恒定功率100W，电泳1h，最后进行银染显色。其中与母本黑农84条带相同的记为“A”，与父本京河4条带相同的记为“B”，杂合带型记为“H”，缺失或模糊的带型记为“-”。
利用MicrosoftExcel 2019和Minitab17分析群体蛋白质含量平均数、标准差、偏度、峰度、变异系数和相关系数，结果如表2所示。
表2F2和F2:3群体蛋白质含量基本数据分析
由表2结果可知，蛋白质含量变异丰富且世代间呈现显著的正相关。
大豆F2和F2:3群体蛋白质含量分布分析如图1所示。由图1可知，F2和F2:3群体的蛋白质含量分布呈现正态分布。
(4)蛋白质含量QTL定位
选用大豆williams82参考基因组第11号染色体34对SSR分子标记扩增母本黑农84和父本京河4号的DNA进行引物多态性筛选，检测到10对多态性SSR标记。
以筛选出的多态性SSR标记鉴定群体基因型，结合F2与F2:3群体的表型数据，利用QTL IciMapping4.2构建遗传图谱，设定QTL显著水平为0.05，进行1000次模拟运算获得QTL显著的LOD阈值，利用完备区间作图法定位蛋白质含量QTL，结果如图2、表3所示。
表311号染色体蛋白质含量QTL数据统计表
由表3可知，qPRO_11_1的区间长度为126.27kb，LOD值为4.51，遗传贡献率为4.05％，加性效应为0.74，说明控制高蛋白值含量的基因效应来自母本黑农84，区间内包含5个基因。
实施例2
qPRO_11_1精细定位：
为了缩小qPRO_11_1区间，对初定位区间进行加密标记，在BARCSOYSSR_11_1087和BARCSOYSSR_11_1090之间的物理区间开发Indel标记。
根据黑农84和京河4重测序序列比对，在15611399bp位置的41bp大小的缺失，设计一对Indel标记引物，Indel-2序列为：
上游引物如SEQ ID NO.3所示：5’-CACGCTAGATCTCGTAAGTCCT-3’；
下游引物如SEQ ID NO.4所示：5’-AAGAGTCCCGTTGCTGGTT-3’。
根据黑农84和京河4重测序序列比对，在15643996bp位置的6bp大小的缺失，设计一对Indel标记引物，Indel-5序列为：
上游引物如SEQ ID NO.5所示：5’-TAAGCCCAATACAAGATGCACA-3’；
下游引物如SEQ ID NO.6所示：5’-ATAACCCAAATGGTAGAGG-3’。
利用开发的Indel标记，对黑农84×京河4群体亲本及F4群体进行基因型鉴定。
将F4群体家系利用Indel标记进行PCR扩增(同实施例1(3)中的PCR反应体系和反应程序)以及非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，获得基因型，结合群体家系表型数据进行精细定位。
最后，将qPRO_11_1区间缩小在BARCSOYSSR_11_1087和indel-5之间，区间内包含1个基因，为Glyma.11G164700。结果如图3所示。
实施例3
CAPS标记的开发：
(1)开发：实施例2获得的区间内候选基因Glyma.11G164700，在15645746bp位置处有一个SNP变异位点，开发为CAPS标记。将所述CAPS标记命名为CAPS11，CAPS11位于大豆williams82参考基因组第11号染色体的15645746bp位置处，该位置的核苷酸为C/A多态。
(2)通过phytozome网站获得上述SNP位点所在位置上下游500bp的大豆参考基因组序列，并利用dcaps网站查询SNP位点位于的酶切位点及限制性内切酶，并设计引物序列为：
上游引物如SEQ ID NO.1所示：5’-GTCTTTCCAATTTATTCCCTGC-3’；
下游引物如SEQ ID NO.2所示：5’-ACGACTGTGTGAGAGAGAGG-3’。
CAPS11标记的SNP位点位于限制性内切酶BasXI的酶切位点处，BasXI的酶切识别序列为ACNNNNNCTCC。
实施例4
CAPS标记在F2遗传群体中的应用：
利用实施例3开发的CAPS11标记，检测群体亲本及后代个体，检测方法为：
(1)利用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对对亲本黑农84和京河4号基因组DNA进行PCR扩增，同实施例1(3)中的PCR反应体系和反应程序，获得PCR扩增产物；
(2)对亲本PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切，反应体系为：PCR扩增产物1μL，10×NEBuffer 1μL，BasXI 0.2μL，Nuclease-free Water 7.8μL，37℃酶切5h；
(3)利用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对对F2群体880个家系基因组DNA进行PCR扩增，同实施例1(3)中的PCR反应体系和反应程序，获得PCR扩增产物；
(4)对F2群体880个家系的PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切，反应体系为：PCR产物1μL，10×NEBuffer 1μL，BasXI 0.2μL，Nuclease-free Water 7.8μL，37℃酶切5h。
结果表明，亲本PCR扩增产物大小为322bp，BASXI酶切识别京河4号PCR扩增产物，酶切后片段大小为188bp和134bp。
对群体880个家系PCR扩增产物进行酶切，统计群体酶切数量结合表型进行差异显著性分析，结果如图4所示。由图4可知，蛋白质含量间存在极显著差异(**：0.001<p≤0.01)，说明该CAPS11标记与表型紧密连锁。本发明为大豆高蛋白分子标记辅助选择育种和基因挖掘提供了可靠材料和依据。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一组大豆蛋白含量QTL位点qPRO_11_1，其特征在于，所述qPRO_11_1位于大豆williams82参考基因组第11号染色体的两个SSR分子标记之间的物理区间，所述物理区间的长度为126.27kb，所述物理区间内包含5个基因，所述两个SSR分子标记分别为BARCSOYSSR_11_1087和BARCSOYSSR_11_1090。
2.一种与权利要求1所述大豆蛋白含量QTL位点qPRO_11_1紧密连锁的分子标记CAPS11，其特征在于，所述分子标记CAPS11位于大豆williams82参考基因组第11号染色体的15645746bp位置处，所述15645746bp位置处的核苷酸为C或A多态。
3.根据权利要求2所述的分子标记CAPS11，其特征在于，当所述15645746bp位置处的核苷酸为C时，表达低蛋白性状；当所述15645746bp位置处的核苷酸为A时，表达高蛋白性状。
4.权利要求2或3所述的分子标记CAPS11在选育高蛋白大豆品种或种质中的应用。
5.一种利用权利要求2或3所述的分子标记CAPS11选育高蛋白大豆品种或种质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待测大豆品种或种质的基因组DNA，利用如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR扩增产物采用限制性内切酶BasXI进行酶切，根据PCR扩增和酶切的结果判定待测大豆品种或种质是否为高蛋白大豆品种或种质；
(2)若PCR扩增产物为长度为322bp的DNA片段，且酶切产物为长度为188bp和134bp的DNA片段，则判定为是高蛋白大豆品种或种质，否则判定为不是高蛋白大豆品种或种质。
6.一种用于鉴定大豆高蛋白性状的引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述引物对的下游引物序列如SEQ ID NO.2所示。
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| CN117512173A (zh) * | 2023-11-24 | 2024-02-06 | 安徽农业大学 | 一种与大豆蛋白含量相关的caps分子标记、引物、试剂盒及应用 |
| CN118291673A (zh) * | 2024-06-05 | 2024-07-05 | 吉林省农业科学院(中国农业科技东北创新中心) | 与大豆耐老化相关的qtl、分子标记、引物及应用 |
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2023
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Cited By (3)
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| CN117512173B (zh) * | 2023-11-24 | 2024-05-17 | 安徽农业大学 | 一种与大豆蛋白含量相关的caps分子标记、引物、试剂盒及应用 |
| CN118291673A (zh) * | 2024-06-05 | 2024-07-05 | 吉林省农业科学院(中国农业科技东北创新中心) | 与大豆耐老化相关的qtl、分子标记、引物及应用 |
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