BR112020016035A2 - Marcadores de folha para colonização de raiz por fungos micorrízicos arbusculares em plantas - Google Patents

Abstract

a invenção se refere a um método para determinar uma associação de uma primeira planta com um fungo micorrízico arbuscular (amf), sendo que o dito método compreende a comparação da quantidade de um blumenol em uma parte aérea da dita primeira planta com a quantidade do dito blumenol em uma parte aérea de uma segunda planta, em que a dita segunda planta pertence à mesma espécie que a dita primeira planta e em que uma quantidade aumentada é indicativa de associação aumentada na dita primeira planta, em comparação com a dita segunda planta, e uma quantidade diminuída é indicativa de associação diminuída.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MARCADORES DE FOLHA PARA

COLONIZAÇÃO DE RAIZ POR FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES EM PLANTAS”

[001] A presente invenção refere-se a um método para determinar uma associação de uma primeira planta com um fungo micorrízico arbuscular (AMF), sendo que o dito método compreende a comparação da quantidade de um blumenol em uma parte aérea da dita primeira planta com a quantidade do dito blumenol em uma parte aérea de uma segunda planta, em que a dita segunda planta pertence à mesma espécie que a dita primeira planta e em que uma quantidade aumentada é indicativa de associação aumentada na dita primeira planta, em comparação com a dita segunda planta, e uma quantidade diminuída é indicativa de associação diminuída.

[002] Neste relatório descritivo, um número de documentos inclui pedidos de patente e manuais do fabricante são citados. A revelação desses documentos, embora não considerada relevante para a patenteabilidade desta invenção, é incorporada à mesma a título de referência em sua totalidade. Mais especificamente, todos os documentos referidos são incorporados a título de referência como se cada documento individual tivesse sido específica e individualmente indicado para ser incorporado a título de referência.

[003] Pensa-se que as interações simbióticas entre fungos e plantas, chamadas micorrizas, sejam um dos fatores mais importantes que permitiram a colonização de habitats terrestres pelas plantas (Brundrett e Tedersoo (2018) Evolutionary history of mycorrhizal symbioses and global host plant diversity. New Phytologist doi:10.1111/nph.14976). Uma das formas mais proeminentes é a micorriza arbuscular (AM), que pode ser formada por muitas das plantas superiores, incluindo plantas de cultivo. AM é nomeado após estruturas hifais características formadas por um fungo micorrízico arbuscular (AMF) dentro das células corticais da raiz de planta colonizada. Esses chamados arbúsculos são os principais locais de troca de recursos entre a planta e o fungo. Enquanto o fungo facilita a absorção de nutrientes minerais, em particular fósforo (P) e nitrogênio, bem como água, a planta fornece ao fungo reservas de energia de carbono por meio de fotossintatos (Baier et al. (2010) Knockdown of the symbiotic sucrose synthase MtSucS1 affects arbuscule maturation and maintenance in mycorrhizal roots of Medicago truncatula. planta Physiology 152, 1.000 a 1.014; Doidy et al. (2012). The Medicago truncatula sucrose transporter family: characterization and implication of key members in carbon partitioning towards arbuscular mycorrhizal fungi.

Molecular planta 5, 1.346 a 1.358; Marschner e Dell (1994) Nutrient uptake e mycorrhizal symbiosis.

Plant and Soil 159, 89 a 102). P é um fator limitante importante para o crescimento de plantas em condições terrestres, de água doce e marinha (Elser et al. (2007) Global analysis of nitrogen and phosphorus limitation of primary producers in freshwater, marine and terrestrial ecosystems.

Ecology Letters 10, 1.135 a 1.142) e mesmo quando presente em quantidades suficientes no ambiente de uma planta, geralmente está em formas não disponíveis para as plantas (Bieleski (1973) Phosphate pools, phosphate transport, and phosphate availability.

Annual Review de planta Physiology 24, 225 a 252; Schachtman et al. (1998) Phosphorus uptake by plants: From soil to cell.

Plant Physiology 116, 447 a 453). Portanto, grandes quantidades de fertilizantes P são usados na agricultura de alta intensidade (MacDonald et al. (2011) Agronomic phosphorus imbalances across the world's croplands.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 3.086 a 3.091), o que contribui substancialmente para a eutrofização de nossas águas (Smith e Schindler (2009) Eutrophication science: where do we go from here? Trends in Ecology & Evolution 24, 201 a 207). Adicionalmente, o P usado para fertilizantes é derivado da rocha de fosfato - um recurso não renovável - e é previsto que essas reservas sejam esgotadas em breve (Cordell et al. (2009) The story of phosphorus: Global food security and food for thought.

Global Environmental Change 19, 292 a 305; Vaccari e Strigul (2011) Extrapolating phosphorus production to estimate resource reserves.

Chemosphere 84, 792 a 797). É bem conhecida que a AMF pode promover o crescimento das plantas em condições limitantes de P (Rooney et al. (2009) Mycorrhizas and biomass crops: opportunities for future sustainable development.

Trends in planta Science 14, 542 a

549; Adolfsson et al. (2015) Mycorrhiza symbiosis increases the surface for sunlight capture in Medicago truncatula for better photosynthetic production. PLoS ONE 10, e0115314; Nouri et al. (2014) Phosphorus and nitrogen regulate arbuscular mycorrhizal symbiosis in Petunia hybrida. PLoS One 9, e90841) e, portanto, um caminho a seguir é melhorar a eficiência de captação de P de nossas plantas cultivadas, melhorando as associações AMF (van de Wiel et al. (2016) Improving phosphorus use efficiency in agriculture: opportunities for breeding. Euphytica 207, 1 a 22). Embora a criação de associações aprimoradas de AMF não tenha sido uma prioridade durante o período de fertilizantes baratos à base de P, a domesticação levou até a rupturas na eficiência da simbiose de AMF em plantas cultivadas (Martin- Robles et al. (2017) Impacts of domestication on the arbuscular mycorrhizal symbiosis of 27 crop species. New Phytologist doi: 10.1111/nph.14962), isso é claramente modificado. Associações com AMF também são conhecidos para aumentar a resistência de uma planta contra doenças e tração abióticos, como salinidade, seca ou metais pesados, e, portanto, a criação de associações da AMF pode fornecer vários benefícios de alto valor para a produção agrícola (Whipps (2004) Prospects and limitations for mycorrhizas in biocontrol of root pathogens. Canadian Journal of Botany 82, 1.198 a 1.227; Nadeem et al. (2014) The role of mycorrhizae and plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) in improving crop productivity under stressful environments. Biotechnology Advances 32, 429 a 448; Hohmann e Messmer (2017) Breeding for mycorrhizal symbiosis: focus on disease resistance. Euphytica 213, 11). Para melhorar a implementação de AM em futuras estratégias agrícolas, será necessário desenvolver um método de triagem rápido e fácil de conduzir que forneça informações confiáveis sobre a interação planta-AMF.

[004] Infelizmente, a análise de colonização por AMF é um processo tedioso e destrutivo - por exemplo, é necessária uma análise microscópica ou de ácido nucleico dos tecidos radiculares (consulte, por exemplo, os pedidos de patente CN 106011256 e CN 106566869). Esses processos são trabalhosos, dispendiosos e demorados e não são compatíveis com os requisitos de alto rendimento (HTP) dos programas de melhoramento.

Portanto, o desenvolvimento de uma abordagem HTP eficiente para a caracterização de associações AMF- é um alvo de alto valor.

Para contornar a colheita tediosa e destrutiva e a análise do material radicular, vários estudos tentaram identificar marcadores adequados de associações de AMF nas partes aéreas das plantas mais facilmente acessadas.

Peipp et al. ((1997) Arbuscular mycorrhizal fungus- induced changes in the accumulation of secondary compounds in barley roots.

Phytochemistry 44, 581 a 587) analisaram metabólitos na raiz e brotam tecidos de plantas micorrizadas e não micorrizadas e relataram: “não foram observadas diferenças óbvias nos extratos dos brotos de plantas micorrizadas e não micorrizadas”. Estudos posteriores constataram várias mudanças metabólicas e transcricionais relacionadas ao metabolismo primário e secundário (Taylor e Harrier (2003) Expression studies of plant genes differentially expressed in leaf and root tissues of tomato colonised by the arbuscular mycorrhizal fungus Glomus mosseae.

Plant Molecular Biology 51, 619 a 629; Kogel et al. (2010) Transcriptome and metabolome profiling of field-grown transgenic barley lack induced differences but show cultivar-specific variances.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, 6.198 a 6.203; Adolfsson et al. (2017) Enhanced secondary- and hormone metabolism in leaves of arbuscular mycorrhizal Medicago truncatula.

Plant Physiology 175, 392 a 411). No entanto, sabe-se que os recursos de filmagem que foram regulados em resposta à interação com AMF também respondem a vários estímulos, o que torna os mesmos tornando inapropriados como marcadores específicos e confiáveis da colonização por AMF: por exemplo, jasmonato constatado por Aliferis et al. ((2015) Metabolic responses of willow (Salix purpurea L.) leaves to mycorrhization as revealed by mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy metabolite profiling.

Frontiers in Plant Science 6, 344) é um regulador de defesa clássico contra herbívoros.

Os resultados de Kogel et al. ((2010) Transcriptome and metabolome profiling of field- grown transgenic barley lack induced differences but show cultivar-specific variances.

Proceedings de the National Academy de Sciences de the United States de America 107, 61986203) indicam que a análise do metabólito é provavelmente mais adequada para analisar as mudanças mediadas pela AM em brotos de plantas do que as análises de transcrição. Uma revisão recente de Schweiger and Müller ((2015) Leaf metabolome in arbuscular mycorrhizal symbiosis. Current Opinion in planta Biology 26, 120 a 126) dos estudos que conduziram metabolômica de folhas de plantas com simbiose por AMF chegaram à seguinte conclusão: “Os efeitos mediados pela AM no metaboloma de folhas são altamente diversos, com uma infinidade de classes de metabólitos que são especificamente modificadas em inúmeras espécies de plantas em várias taxas. Mesmo dentro do metabolismo primário mais conservado, não foram encontrados padrões de resposta comuns à AM.” Como tal, até agora não foram identificados metabólitos da parte aérea ou marcadores moleculares com propriedades que permitissem uma detecção confiável e específica do grau de colonização de AMF.

[005] Foi constatado que os metabólitos do tipo blumenol se acumulam nas raízes das plantas colonizadas por AMF (Revisto por Strack e Fester (2006) Isoprenoid metabolism and plastid reorganization in arbuscular mycorrhizal roots. New Phytologist 172, 22 a 34). Relatórios anteriores indicam um nível constitutivo de alguns blumenóis nas partes aéreas das plantas e os compostos também foram constatados em famílias de plantas que são conhecidas perderam a capacidade de estabelecer interações com AMF (Brassicaceae: Cutillo et al. ((2005) C13 norisoprenoids from Brassica fruticulosa. Natural Products Research 19, 99 a 103); Urticaceae: Aishan et al. ((2010) The constituents of Urtica cannabina used in Uighur medicine. Pharmaceutical Biology 48, 577 a 583)). Adolfsson et al. ((2017) Enhanced secondary- and hormone metabolism in leaves of arbuscular mycorrhizal Medicago truncatula. Plant Physiology 175, 392 a 411) analisaram acúmulos de blumenol em conjunto com outros metabólitos em folhas de plantas com e sem colonização por AMF, mas não observaram regulação positiva específica de AMF de blumenóis ou transcritos específicos para sua biossíntese. Foi constatado até que alguns derivados de blumenol estavam desregulados com colonização por AMF.

[006] O problema técnico subjacente à presente invenção pode ser visto na provisão de meios e métodos aprimorados para determinar a colonização de raiz por AMFs nas plantas. Esse problema técnico é resolvido pela matéria das reivindicações anexas.

[007] Consequentemente, a presente invenção, em um primeiro aspecto, se refere a um método para determinar uma associação de uma primeira planta com um fungo micorrízico arbuscular (AMF), sendo que o dito método compreende a comparação da quantidade de um blumenol em uma parte aérea da dita primeira planta com a quantidade do dito blumenol em uma parte aérea de uma segunda planta, em que a dita segunda planta pertence à mesma espécie que a dita primeira planta e em que uma quantidade aumentada é indicativa de associação aumentada na dita primeira planta, em comparação com a dita segunda planta, e uma quantidade diminuída é indicativa de associação diminuída.

[008] É entendido que o termo “associação” se refere a uma associação funcional. É conhecido na técnica que os AMFs penetram nas células corticais das raízes das plantas vasculares. Durante a formação da associação funcional entre o fungo e a planta, as células corticais mudam sua morfologia. Isso inclui a aparência de estruturas conhecidas como arbúsculos. O termo "associação" inclui a formação de arbúsculos.

[009] Relacionado ao acima, o termo "colonização", que também é usado no presente relatório descritivo, designa o processo de formação da dita associação. A capacidade de um dado fungo colonizar uma dada planta implica que pode ser formada uma associação entre a dita planta e o dito fungo.

[010] A classe de compostos de acordo com a invenção, que é indicativa de uma associação, são blumenóis. Blumenóis são produtos de clivagem de carotenoides. Compreendem uma porção química que contém ciclo-hexenona que tem tipicamente treze átomos de carbono. Esta porção química pode ainda ser derivatizada, por exemplo, com sacarídeos, carboxilados e/ou hidroxilados. Na medida em que os blumenóis são glicosilados, a porção química que contém ciclo-hexenona acima mencionada é geralmente chamada de aglicon. Blumenóis preferidos de acordo com a invenção são blumenol C e blumenol B, bem como seus derivados, sendo que os derivados preferidos são glicosilados, carboxilados e/ou hidroxilados. Adicionalmente, uma ligação dupla pode ser introduzida na cadeia do lado butil do blumenol C. O blumenol C é conhecido na técnica (4- (3-hidroxibutil) -3,5,5-trimetilciclohex-2-en-1- ona). O blumenol B é conhecido na técnica (4-hidroxi-4- (3-hidroxibutil) -3,5,5- trimetilciclo-hex-2-en-1-ona). Blumenóis preferidos de acordo com a presente invenção são objeto de uma modalidade preferida revelada mais adiante. O Blumenol A e seus derivados são menos preferidos.

[011] O termo "determinação" inclui avaliações qualitativas e quantitativas da dita associação. Para dar um exemplo (exemplos adicionais e modalidades preferidas são apresentados abaixo), a segunda planta recitada pode ser uma planta que é conhecida por ser totalmente livre de qualquer associação com um AMF. Sob tais circunstâncias, uma quantidade aumentada determinada na primeira planta é indicativa da presença de uma associação. Se, por outro lado, a dita segunda planta tiver uma associação com um AMF, uma quantidade aumentada na primeira planta é indicativo de um maior grau de associação na dita primeira planta e uma quantidade diminuída na primeira planta é indicativa de um grau mais baixo de associação na dita primeira planta. A ausência ou não detectabilidade de um blumenol de acordo com a invenção será geralmente indicativa da ausência de uma associação.

[012] De acordo com o primeiro aspecto, a primeira e a segunda planta são da mesma espécie. A quantidade de blumenol na dita segunda planta normalmente serve para estabelecer um valor de linha de base ou estado de referência.

[013] De um modo geral, os termos “primeira planta” e “segunda planta” foram introduzidos por razões de clareza. É observado que a primeira e a segunda planta podem, mas não precisam ser o mesmo tipo, por exemplo, em diferentes momentos.

[014] O termo "fungo micorrízico arbuscular" tem seu significado estabelecido na técnica. Isso se refere a fungos capazes de formar os arbúsculos acima mencionados nas raízes das plantas vasculares. Pertencem ao filo Glomeromycota. AMFs preferidos são o objeto de uma modalidade preferida revelada mais abaixo.

[015] A "comparação" citada implica que os dois valores que devem ser comparados entre si são conhecidos. Como tal, o método, além da etapa de comparação, também pode compreender a etapa ou as etapas de determinação por meios experimentais de um ou ambos os valores a serem comparados entre si. Essa determinação, no entanto, não precisa necessariamente ser realizada quando se pratica o método do primeiro aspecto. Para explicar melhor, um ou ambos os valores a serem comparados entre si podem ser retirados, por exemplo, da literatura ou consultados em bancos de dados. Na medida em que ambos os valores a serem comparados são obtidos dessas fontes, é preferida uma implementação in silico do método do primeiro aspecto. Em outras palavras, o método pode ser um método implementado por computador. As implementações preferidas requerem a determinação da quantidade de blumenol na dita primeira planta e fazem uso de literatura ou bancos de dados ou outras fontes para procurar a quantidade do dito blumenol na dita segunda planta.

[016] É entendido que as ditas primeira e segunda plantas, na medida em que ambas estão associadas a um AMF, estão associadas à mesma espécie de AMF (preferencialmente a mesma cepa de AMF) ou à mesma mistura de espécies de AMF (preferencialmente as mesmas cepas de AMF).

[017] As quantidades recitadas (ou valores) podem ser medições únicas ou médias de múltiplas medições. No caso de múltiplas medições, é dada preferência à média ou mediana aritmética.

[018] Na medida em que haja referência a “quantidades aumentadas” e “quantidades diminuídas”, é entendido que é dada preferência a aumentos e diminuições estatisticamente significativos, respectivamente. Para fins de determinação da significância estatística, informações sobre a variação O 2 podem ser empregadas. No caso de medições únicas, a variação pode ser conhecida de outras fontes (como literatura e bancos de dados). Alternativamente, e no caso de múltiplas medições (sendo que as ditas múltiplas medições são realizadas durante a prática do método do primeiro aspecto ou obtidas de fontes como literatura e bancos de dados),

a média e a variância podem ser determinadas a partir da mesma série de dados sob consideração. Medidas exemplificativas ou preferenciais de significância estatística são a diferença da média expressa em múltiplos do desvio padrão o (como uma diferença de 2 ou mais o que é considerado significativo) ou um valor p de 0,05 ou menos.

[019] O termo "quantidade" tem seu significado estabelecido na técnica e abrange massa (por exemplo, em g), quantidade de substância (por exemplo, em mol) e concentração (a ser medida nas unidades estabelecidas na técnica, como mol/g de tecido vegetal e g/g de tecido vegetal). Adicionalmente, as medidas relativas de massa, quantidade de substância e concentração são consideradas se forem estabelecidas na técnica como indicadores diretos (por exemplo, intensidade de sinal de sistema de detecção usado).

[020] O termo "parte aérea" tem seu significado estabelecido na técnica e se refere às partes da planta que são expostas ao ar. Consequentemente, o termo não abrange partes da planta no solo ou no chão. As partes aéreas preferidas são reveladas mais abaixo.

[021] A primeira planta não é particularmente limitada. Pode, mas não precisa ser, uma planta capaz de estabelecer uma associação com um AMF.

[022] Por exemplo, se a segunda planta é livre de qualquer associação e a primeira planta, antes de aplicar o método de acordo com o primeiro aspecto, foi colocada em contato por tempo suficiente com um AMF capaz de colonizar, o a ausência de qualquer quantidade detectável de um blumenol seria indicativa de a primeira planta ter capacidade de formar uma associação que está abaixo de um limite determinado (incluindo não ser capaz de formar uma associação).

[023] Caso contrário, aplicações importantes do método do primeiro aspecto estão no campo de determinação do grau de associação naquelas plantas que já são conhecidas por serem capazes de estabelecer uma associação.

[024] Nos casos em que se deseja determinar antecipadamente se uma determinada planta é capaz de estabelecer uma associação com um AMF, isso pode ser feito por procedimentos estabelecidos na técnica que incluem detecção microscópica (consulte, por exemplo, Vierheilig et al. (2005) An overview of methods for the detection and observation of arbuscular mycorrhizal fungi in roots. Physiologia Plantarum 125, 393 a 494) ou detecção molecular (consulte, por exemplo, Park et al. (2015) Hyphal branching during arbuscule development requires reduced arbuscular mycorrhizal. Plant Physiology 169, 27742788; Alkan et al. (2006) Analysis of quantitative interactions between two species of arbuscular mycorrhizal fungi, Glomus mosseae and G. intraradices, by Real-Time PCR. Applied e Environmental Microbiology 72, 4192-4199; e Gutjahr et al. (2008) Arbuscular mycorrhiza- specific signaling in rice transcends the common symbiosis signaling pathway. Plant Cell 20,

2.989 a 3.005) de colorização de AMF nas raízes.

[025] Em vários casos, o conhecimento sobre a suscetibilidade à AMF está disponível na literatura.

[026] Na técnica anterior, a ocorrência de certos blumenóis nas raízes de plantas com uma associação AMF foi descrita. A técnica anterior, no entanto, não conseguiu estabelecer uma correlação positiva entre a associação de uma planta com um AMF e a presença de blumenóis nas folhas ou em outras partes aéreas. Pelo contrário, por exemplo, em Adolfsson et al. ((2017) Enhanced secondary- and hormone metabolism in leaves of arbuscular mycorrhizal Medicago truncatula. Plant Physiology 175, 392 a 411) é descrito que os níveis de certos blumenóis diminuem após a colonização por AMF.

[027] Geralmente, não se pode esperar que metabólitos e respostas de metabólitos que ocorram em uma parte da planta também possam ser encontrados em outras partes da planta (por exemplo, raízes versus partes aéreas). Em vez disso, a ocorrência de metabólitos específica da parte da planta é típica e bem conhecida; consulte, por exemplo Li et al. ((2016) Illuminating a plant's tissue-specific metabolic diversity using computational metabolomics and information theory. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 113, E7610 a E7618) and Lee et al. ((2017) What happens in the pith stays in the pith: tissue-

localized defense responses facilitate chemical niche differentiation between two spatially separated herbivores. The Plant Journal, 92, 414 a 425).

[028] Além disso, na técnica anterior, foram feitas tentativas para correlacionar a presença ou quantidade de metabólitos que ocorrem nas folhas das plantas com a colonização micorrízica. Essas tentativas, no entanto, falharam. Em particular, nenhuma indicação pode ser encontrada na técnica anterior de que os blumenóis se qualifiquem como marcadores de micorrização que ocorrem nas partes aéreas das plantas (consulte a revisão da técnica anterior na parte introdutória acima).

[029] Os presentes inventores, baseando-se, entre outros, em procedimentos analíticos de alto desempenho e métodos de análise de dados, podem estabelecer que os blumenóis, apesar dos achados negativos na técnica anterior, se qualifiquem como marcadores da associação micorrízica, em que a dita associação pode ser determinada com base nas amostras colhidas das partes aéreas das plantas.

[030] Isso fornece vantagens significativas, observando que os métodos estabelecidos para determinar de forma confiável as associações micorrízicas exigem a coleta de amostras das raízes das plantas. Isso é complicado e não é passível de análise rápida e de alto rendimento. As amostras das folhas estão disponíveis de maneira rápida e fácil e podem ser obtidas coletando-se diretamente as folhas ou usando-se meios como um furador. Adicionalmente, o método introduz apenas pequenos danos à planta respectiva, enquanto a amostragem de raízes é geralmente um processo altamente destrutivo.

[031] Outras vantagens do método do primeiro aspecto incluem que os blumenóis são moléculas orgânicas pequenas e estáveis que são passíveis de análise no espectrômetro de massa e por técnicas espectroscópicas, por um lado e por outro lado, de tamanho suficiente para serem especificamente detectadas por anticorpos. Os blumenóis podem ser separados de outros constituintes das partes aéreas das plantas por extração, por exemplo, com metanol.

[032] Em uma modalidade preferencial, (a) a primeira e a segunda plantas são traqueófitas, preferencialmente plantas monocotiledôneas, de preferência selecionadas a partir de Triticum incluindo Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Zea mays, Allium incluindo Allium porrum e Allium cepa, Phleum pratense, Bromus inermis, Brachypodium distachyon, Pennisetum glaucum, Oryza incluindo planta Oryza sativa, e Sorghum incluindo Sorghum bicolor e Sorghum drummondii, ou dicotyledonous, mais de preferência sendo selecionadas a partir de Helianthus annuus, Lactuca sativa, Cynara cardunculus, Cucumis sativus, Glycine max, Lathyrus sativus, Lens culinaris, Trifolium repens, Linum usitatissimum, Gossypium hirsutum, Sesamum indicum, Daucus carota, Phaseolus vulgaris, Vicia faba, Ribes nigrum, Capsicum annuum, Fragaria X ananassa, Nicotiana incluindo Nicotiana attenuata e Nicotiana tabacum, Medicago incluindo Medicago truncatula e Medicago sativa, e Solanum incluindo Solanum lycopersicum e Solanum tuberosum; e/ou (b) a dita primeira e a dita segunda planta pertencem à mesma subespécie, variedade, subvariedade, forma ou subforma.

[033] Os traqueófitos também são conhecidos como plantas vasculares. É considerado que cerca de 70 a 80% das plantas vasculares podem ser colonizadas por AMFs. Como observado acima, o conhecimento sobre a capacidade de formar uma associação não é um requisito para que uma planta seja submetida ao método do primeiro aspecto. Na medida em que isso for desejado, isso pode ser avaliado com métodos estabelecidos na técnica (descritos aqui acima) ou métodos da invenção revelados mais abaixo.

[034] A enumeração acima de gêneros e espécies é apenas exemplar e não limitativa. Como pode ser visto nos exemplos anexos, a presente invenção foi reduzida para a prática com uma pluralidade de plantas, bem como uma pluralidade de AMFs.

[035] No que diz respeito ao item (b) da modalidade preferida revelada acima, notamos que a presença de blumenóis em resposta à colonização por AMF é conservada em uma dada espécie e, portanto, também se estende a subespécies etc.

[036] Em uma outra modalidade preferida, (a) a dita parte aérea é selecionada de folha, broto, flor, caule, meristema, fruto, semente, cápsula, exsudato e néctar; e/ou (b) a parte aérea da dita primeira e a parte aérea da dita segunda planta são a mesma parte selecionada da lista de (a) e/ou compreendem ou consistem no mesmo tecido.

[037] As mesmas partes de acordo com o item (b) se referem às modalidades preferidas em que, por exemplo as folhas são retiradas da primeira e da segunda planta ou os caules são retirados da primeira e da segunda planta. Na medida em que as plantas apresentam uma pluralidade de partes aéreas específicas (como folhas mais jovens e mais velhas ou folhas da parte superior e da parte inferior da parte aérea), é dada preferência a colher amostras das partes correspondentes da primeira e da segunda plantas.

[038] Em uma outra modalidade preferida, o dito blumenol é um composto de fórmula (I) ou (II): em que cada um dentre R1 e R2 é selecionado independentemente de - CH3, -CH2OH, -COOH, e -CH2-O- Glyc; R3 é tanto -H, -OH quanto -O-Glyc; R4 é tanto -H quanto -Glyc; Glyc é uma porção química de açúcar.

[039] É preferencial que R4 seja Glyc.

[040] No caso da fórmula (I), são preferenciais tanto R1 ser -CH3, R2 ser -CH3, e R3 ser -H; R1 é -CH2OH, R2 é -CH3, e R3 é -H; R1 é -COOH, R2 é -CH3, e R3 é -H; R1 é -CH3, R2 é -COOH, e R3 é -H; ou R1 é -CH3, R2 é -CH3, e R3 é -OH. No caso da fórmula (II), é preferencial que R1 seja -CH3, e R2 seja -CH3. Glyc é, de preferência, selecionado a partir de -Glc, -Glc-Rha, -MalGlc-Api, -MalGlc, -Glc-Api, -Glc-(Glc)2, -HmgGlc, -Glc-Arb, -(Glc-GlcU)-Rha, -Hmg(MalGlc),- Glc-GlcU, -Glc-Glc, e -MalGlc-GlcU, em que Glc é glicose, Rha é ramnose, Mal é malonil, Api é apiose, Hmg é 3-hidroxi 3-metilglutaril, Arb é arabinose e GlcU é ácido glucurônico.

[041] A notação usada para porções preferidas de porções químicas de açúcar é adotada a partir de Strack e Fester ((2006) Isoprenoid metabolism and plastid reorganization in arbuscular mycorrhizal roots. New Phytologist 172, 22 a 34), Schliemann et al. ((2008) Accumulation of apocarotenoids in mycorrhizal roots of leek (Allium porrum). Phytochemistry 69, 1.680 a 1.688), e Hill et al. ((2018) Arbuscular mycorrhizal fungi and plant chemical defence: Effects of colonisation on aboveground and belowground metabolomes. Journal of Chemical Ecology https://doi.org/10.1007/s10886-017-0921-1). Os compostos como dados nessas publicações definem também blumenóis preferidos de acordo com a presente invenção.

[042] Em particular, são preferidos os compostos designados 1 a 19 na Tabela 1 abaixo (reproduzidos a partir de Strack e Fester ((2006) Isoprenoid metabolism and plastid reorganization in arbuscular mycorrhizal roots. New Phytologist 172, 22 a 34)), compostos designados 1 a 11 na Tabela 2 (reproduzidos a partir de Schliemann et al. ((2008) Accumulation of apocarotenoids in mycorrhizal roots of leek (Allium porrum). Phytochemistry 69, 1.680 a 1.688), e compostos designados 1 a 7 na Tabela 3 (reproduzidos a partir de Hill et al. ((2018) Arbuscular mycorrhizal fungi and plant chemical defence: effects of colonisation on aboveground and belowground metabolomes. Journal of Chemical Ecology https://doi.org/10.1007/s10886-017-0921- 1).

[043] Mais preferido é que a porção química glicosil (abreviada como Glyc) seja selecionada a partir de glicose; 6’-malonil glicose; glicose- (1'' → 4') - glicose; glicose- (1'' → 6') - glicose; ramnose- (1'' → 6') - glicose; arabinose- (1'' → 6') - glicose; ácido glucurônico- (1'' → 2') - glicose; ácido glucurônico- (1'' → 2') - (6’-malonil glicose); apiose- (1'' → 2') - glicose; apiose- (1'' → 2') - (6’-malonil glicose); glicose- (1'' → 2') - (glicose- (1'’ → 6') - glicose); ácido glucurônico- (1 '''→ 2') - (ramnose- (1'' → 6') - glicose); 3'- (3-hidroxi-3-metilglutaril) glicose; e 3'- (3-hidroxi-3-metilglutaril) 6'-malonil glicose.

É preferencial que o aglicon seja conectado como um O-glucósido à posição 1’ da primeira glicose.

TABELA 1 ESTRUTURAS DE DERIVADOS DE CICLO-HEXENONA C13 GLICOSILADOS ISOLADOS DE RAÍZES

MICORRÍZICAS DE VÁRIAS PLANTAS Compo R1 R2 R3 Ocorrênci Referência Esquema de estrutura sto a 1 Glc- CH3 CH3 Mta W. Schliemann (não publicado) 2 6'-MalGlc- CH3 CH3 Mt W. Schliemann (não publicado) 3 Glc(1" —> 6')Glc- CH3 CH3 Nt, Nr Maier et al. (2000) 4b Glc(1"—> 4')Glc- CH3 CH3 Zm Fester et al. (2002a), JL X 16/55 5 Rha(1" —> 6')Glc- CH3 CH3 Ou Schliemann et al. (2006) 6C GlcU(1" —> 2')Glc- CH3 CH3 Hv, Ta, Maier et al. (1995) Vierheilig et al. Sc, As (2000) Zm 7d GlcU(1''—> 2')Glc- CH3 CH3 Hv Peipp etal. (1997) 8 Glc(1" -» 6')(GIc1-> CH3 CH3 Nt, Nr Maier et al. (2000) 2')Glc- 9 Rha(1" -> 6')Glcü(1'" - CH3 CH3 Ou Schliemann etal. (2006)

> 20Glc- 10 Glc- CH2O CH3 Hv Peipp et al. (1997) H Hv, Ta, Maier et al. (1997) Sc, As Maier et al. (2000) Nt, Nr, Le Schliemann et al. (2006) Ou 11 6'-MalGlc- CH2OH CH3 Mt W. Schliemann (não publicado) 12 Glc(1"—»6')Glc- CH2O CH3 Nt, Nr Maier et al. (1999, 2000) 17/55 H Hv, Ta, Vierheilig et al. (2000) Walteretal. Zm (2000) Schliemann etal. (2006) Ou 13 Rha(1" —> 6')Glc- CH2O CH3 Ou Schliemann et al. (2006)

H 14 GlcUd" —> 2')Glc- CH2O CH3 Lj Fester et al. (2005)

H 15 Api(1" —» 2')Glc- CH2O CH3 Lj Fester et al. (2005)

H

16 6'-MalApi(1"-> 20Glc- CH2O CH3 Lj Fester et al. (2005)

H 17 Glc- COO CH3 Nt, Nr Maier et al. (2000) H Ou Schliemann et al. (2006) 18 Glc(1"—»6')Glc- COO CH3 Nt, Nr Maier et al. (2000) Vierheilig et al. H Hv, Ta, (2000) Zm 19 Glc- CH3 COO Le Maier et al. (2000) 18/55

H Em todos compostos listados: Api, p-apiose; Glc, p-glicose; Rha, ramnose; Glcll, p-glicuronato; Mal, malonil. aAs, Avena sativa; Hv, Hordeum vulgare; Le, Lycopersicon esculentum; Lj, Lotus iaponicus; Mt, Medicago truncatula; Nr, Nicotiana rústica' Nt, Nicotiana tabacum; Ou, Ornithogalum umbellatum; Sc, Secale cereale; Ta, Triticum aestivunr, Zm, Zea mays. bProduto de hidrólise de componentes da pigmentação amarela específica de AM de raízes. cBlumenina que também foi identificada em vários membros das Aveneae, Poeae e Triceae, em conjunto com o composto 10 e esporadicamente o composto 7 dA7-8 presente.

TABELA 2 TEMPO DE RETENÇÃO, HPLC-PDA E DADOS DE MS DOS DERIVADOS DE CICLO-HEXENONA DAS RAÍZES MICORRÍZICAS DE ALHO-PORÓ (A. PORRUM)

Compost R HPLC-PDAλ ESI-MS (m/z) Cessão estrutural o (min) (nm) [[M+H]+ [A+II]+a

1 9,8 225sh/243 551 227 13-Hidroxblumenol C di-9,13-O-β-glicopiranosídeo

2 13,1 225sh/245 389 227 13-hidroxblumenol C 9-O-β-glicopiranosídeo

3 20,1 215sh/225sh/24 533 227 13-hidroxiblumenol C 9-O-[3'-O-(3”-hidroxi-3"-metilglutaril)-β- 3 glicopiranosídeo]

4 23,0 230sh/244 533 227 Derivado de 13-hidroxiblumenol C

19/55 5 23,8 225sh/241 533 227 Mistura de 13-hidroxiblumenol C e derivados de blumenol C

6 27,2 230sh/244 505 211 Blumenol C 9-(7-(6f-O-a-arabinopiranosil-p-glicopiranosídeo)

7 27,2 230sh/244 535 211 Blumenol C 9-O-(4'-O-glicosil-β-glicopiranosídeo)

8 31,9 220sh/230sh/24 619 227 13-Hidroxiblumenol C 9-O-[3'-O-(3"-hidroxi-3"-metilglutaril)-6’-O-malonil-β- 2 glicopiranosídeo]

9 37,7 220sh/230sh/24 517 211 Blumenol C 9-O,-[3'-O-(3"-hidroxi-3"-metilglutaril)-β-glicopiranosídeo] 5

10 39,8 220sh/230sh/24 459 211 Blumenol C 9-O-(6’-O-malonil-β-glicopiranosídeo) 5

Compost R HPLC-PDAλ ESI-MS (m/z) Cessão estrutural o (min) (nm) [[M+H]+ [A+II]+a 11 51,0 230sh/245 517 211 Isômero de 9 Números de compostos correspondem aos números de pico na Figura 1 a A: aglicona.

TABELA3 METABÓLITOS IDENTIFICADOS NAS RAÍZES DE TASNA QUE AUMENTARAM SIGNIFICATIVAMENTE

APÓS A COLONIZAÇÃO POR RHIZOPHAGUS IRREGULARIS 20/55 Número de Íon observado UPLC- Fórmula Massa teórica Identidade putativa Mudanç Valor P b metabólito (m/z) TOFMS r.t. putativa de íon a de s¶ dobra a 1 389,2177 6,37 C19H33O8 389,2175 13-hidroxiblumenol C glicosídeo [M 1151,2* 6,65 x 10-9 + H]+ 1 387,2018 6,37 C19H31OS 387,2018 13-hidroxiblumenol C glicosídeo 746,6* 6,65 x 10-9 [M-H]- 2 373,2228 7,23 C19H33O7 373,2226 Blumenol C glicosídeo [M + H |* 8065,8 6,65 x 10-9 3 547,2389 7,30 C25H39O13 547,2391 Bluinenol C glicosil-glucuronido [M- 1553,3 6,65 x 10-9

Número de Íon observado UPLC- Fórmula Massa teórica Identidade putativa Mudanç Valor P b metabólito (m/z) TOFMS r.t. putativa de íon a de s¶ dobra a

H]-

4 475,2182 7,55 C22H35O11 475,2179 13-hidroxiblumenol C 489,7 2,99 x 10-7 malonilglicosídeo [M + H]+

5 373,2222 8,20 C19H33O7 373,2226 Blumenol C glicosídeo [M + H]' 5032,0 6,65 x 10-9

6 635,2551 8,24 C28H43O16 635,2551 Blumenol C malonilglicosil- 3101,3* 6,65 x 10-9

21/55 glucuronido [M + H]+

6 633,2396 8,24 C28H41O16 633,2395 Blumenol C malonilglicosil- 250,4* 6,65 x 10-9 glucuronido [M-H]-

7 459,2232 9,38 C22H35O10 459,2230 Blumenol C malonilglicosídeo [M + 1109,2 6,65 x 10-9 H]+

8 494,3247 14,20 C24H49NO7P 494,3247 hexadecenoil-glicero-fosfocolina 7,86 2,00 x 10-7c ¶ Estruturas determinadas na Figura 2 r.t. = tempo de retenção aMudança de dobra indica o aumento da concentração nas raízes colonizadas com AMF quando comparado às concentrações observadas nas plantas controle b Importância determinada com uso de testes t (c) ou testes Mann-Whitney U (sem marcação) após os ajustes de Bonferroni * Diferenças na estimativa de mudança de dobra entre os sinais [M + H] + e [M + H]- para o mesmo metabólito foram devidas à presença de um aduto Na que compete com o íon [M + H]+ no modo ESI positivo

22/55

[044] Blumenóis especialmente preferidos são 11-hidroxi-blumenol C 9-O-Glc, 11-carboxi blumenol C 9- O-Glc, blumenol B 9-O-glicosídeo, blumenol C 9-O- glicosídeo, hidroxiblumenol C diglicosídeo (que contém uma hexose e uma pentos), blumenol C 9-O-glicosídeo-glucuronido, 11- hidroxiblumenol C 9-O-glicosídeo- ramnosídeo, e blumenol C 9-O-glicosídeo-ramnosídeo.

[045] De um modo geral, pode ser encontrado que mais do que um dos blumenóis preferidos acima se correlaciona com a colonização micorrízica em uma dada planta. No entanto, em vários casos, blumenóis particularmente preferidos foram encontrados como marcadores de associação micorrízica em plantas específicas. Esses são dados abaixo.

[046] Nicotiana attenuata: 11-carboxiblumenol C 9-O-glicosídeo, 11- hidroxiblumenol C 9-O- glicosídeo; Solanum tuberosum: 11-carboxiblumenol C 9-O- glicosídeo; Solanum lycopersicum: 11-carboxiblumenol C 9-O-glicosídeo; Brachypodium distachyon: 11-carboxiblumenol C 9-O- glicosídeo, blumenol B 9-O- glicosídeo, blumenol C 9-O-glicosídeo; Medicago truncatula: hidroxiblumenol C diglycoside (que contém uma hexose e uma pentose), blumenol B 9-O- glicosídeo; Triticum aestivum: 11-carboxiblumenol C 9-O-glicosídeo, 11-hidroxiblumenol C 9-O- glicosídeo, blumenol C 9-O-glicosídeo-glucuronide; Hordeum vulgare: 11- carboxiblumenol C 9- O-glicosídeo, 11-hidroxiblumenol C 9-O-glicosídeo, 11- hidroxiblumenol C 9-O-glicosídeo- ramnosídeo, blumenol C 9-O-glicosídeo- ramnosídeo; Oryza sativa: 11-hidroxiblumenol C 9-O- glicosídeo, 11-carboxiblumenol C 9-O-glicosídeo.

[047] Em uma outra modalidade preferencial, o dito AMF é um fungo do filo Glomeromycota, e é, de preferência, selecionado a partir de Rhizophagus irregularis, Funneliformis mosseae, Glomus versiforme, Acaulospora sp., Archaeospora sp., Claroideoglomus etunicatum, Dentiscutata heterogama, Gigaspora albida e Gigaspora gigantea.

[048] Informações adicionais sobre AMFs, em particular os fungos do filo Glomeromycota, podem ser encontradas no banco de dados MaarjAM, banco de dados descrito na publicação Opik et al. ((2010) The online database MaarjAM reveals global and ecosystemic distribution patterns in arbuscular mycorrhizal fungi (Glomeromycota). New Phytologist 188, 223 a 241).

[049] Em uma outra modalidade preferencial, (i) a dita segunda planta é livre de qualquer associação com um AMF; (ii) a dita segunda planta tem uma associação com um AMF; (iii) a dita primeira e a dita segunda planta serem o mesmo tipo em diferentes momentos; (iv) sendo que o dito método compreende determinar a quantidade do dito blumenol na dita primeira planta; (v) sendo que o dito método compreende determinar a quantidade do dito blumenol na dita segunda planta; e/ou (vi) a dita comparação é eficaz de uma maneira implementada por computador.

[050] O item (i) da modalidade preferida acima define um valor de linha de base preferido para o método do primeiro aspecto que permite determinar a presença ou ausência (pelo menos abaixo de um limite determinado que é o limite de detecção do método analítico que é usado) de uma Associação AMF na primeira planta.

[051] O item (ii) se refere a um valor base preferido diferente, a saber, quando a segunda planta tem uma associação com um AMF. Além disso, esse tipo de comparação tem valor prático, especialmente quando se trata de otimização de associações planta-AMF. Por exemplo, a dita segunda planta pode ser associada a um AMF específico que está geralmente presente ou geralmente usado, por exemplo, por criadores ou no campo de agricultura. Com o propósito de teste, um novo tipo de AMF pode ser colocado em contato com a primeira planta (que pertence preferencialmente à mesma espécie, subespécie, variedade, subvariedade, forma ou subforma que a segunda planta) e, após decorrido tempo suficiente para a formação de uma associação funcional, o nível de um blumenol na dita primeira planta pode ser determinado e comparado ao da dita segunda planta. Se o novo tipo de AMF dá origem a níveis mais altos de blumenol, o novo tipo de AMF é candidato à substituição da AMF estabelecida ou ao fornecimento adicional do novo tipo de AMF. Essa substituição pode ser feita com o objetivo de aquisição melhorada de recursos, resistência melhorada à tração e/ou, sob certas circunstâncias, melhorar o rendimento da dita planta. Para mais detalhes de tais usos da invenção, é referido a outros aspectos da invenção revelados abaixo.

[052] O item (iii) se refere às modalidades preferidas em que a mesma planta individual é usada para definir o valor da linha de base.

[053] É entendido que o método de acordo com o primeiro aspecto pode ser aplicado repetidamente. Em outras palavras, as séries temporais podem ser registradas, em que a série temporal é indicativa do grau de associação ao longo do tempo. Em outras palavras, a invenção permite a monitorização da situação de micorrização de plantas.

[054] Os itens (iv) e (v) tornam obrigatória a determinação real do nível de blumenol na primeira e/ou na segunda planta. Os meios preferidos de determinação são apresentados abaixo.

[055] O item (vi) se refere à implementação por computador do método do primeiro aspecto. Basicamente, independentemente de os itens (iv) e/ou (v) serem combinados com o item (vi) ou não, o método pode ser implementado por computador. Na medida em que os valores da primeira e da segunda plantas são retirados de documentos, publicações ou bancos de dados, é dada preferência ao item (vi).

[056] Na medida em que tecnicamente significativo, dois ou mais dos itens (i) a (vi) podem ser combinados entre si. Combinações preferidas são a combinação do item (i) com o item (iv), bem como a combinação do item (ii) com o item (iv). Em qualquer um dos casos, de preferência o item (vi) pode ser adicionado a essas combinações particularmente preferidas. Também em ambos os casos, e também em conjunto com o item (vi), a quantidade na dita segunda planta é preferencialmente tomada de uma base de conhecimento, como publicação ou banco de dados.

[057] Em uma outra modalidade preferencial, a dita determinação da quantidade do dito blumenol é afetada por um método analítico selecionado a partir de espectrometria de massa, espectroscopia e métodos baseados em anticorpos.

[058] No campo da espectrometria de massa, é dada preferência particular à espectrometria de massa quadripolar, espectrometria de massa no tempo de voo,

espectrometria de massa com armadilha de íons, espectrometria de massa setorial de campo, bem como suas combinações. No campo da espectroscopia, é dada preferência à espectroscopia de absorção de UV, espectroscopia Raman bem como espectroscopia de dispersão de luz. Os métodos baseados em anticorpos preferidos incluem ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA).

[059] Especialmente preferida é a espectrometria de massa. Foi observado que os presentes inventores empregaram espectrometria de massa não apenas para fins do método de acordo com o primeiro aspecto, mas também para estabelecer que os blumenóis são marcadores adequados.

[060] Por uma questão de completude, foi observado que, no curso da análise por espectrometria de massa, não apenas blumenóis como tais, mas também adutos e/ou produtos de degradação dos mesmos podem ser detectados e quantificados.

[061] Em uma modalidade particularmente preferida, antes do dito método analítico, uma amostra retirada da dita parte aérea é extraída, concentrada e/ou purificada.

[062] Um método preferido de extração é a extração com metanol, etanol, isopropanol, acetonitrila, acetona, acetato de etila, clorofórmio, piridina, suas misturas, bem como misturas de um ou mais desses solventes com água, preferencialmente 80% de metanol com 20% de água.

[063] Um método preferido de purificação é a cromatografia, como cromatografia líquida (LC) e extração em fase sólida (SPE). A cromatografia pode ser acoplada à espectrometria de massa (MS), preferencialmente em linha, como LC/MS em linha.

[064] Em um segundo aspecto, e relacionado ao primeiro aspecto, a presente invenção fornece o uso de um blumenol como um marcador para associação de uma planta a um AMF.

[065] Modalidades preferenciais do primeiro aspecto definem modalidades preferidas após devidas mudanças do segundo aspecto. Apenas para dar um exemplo, os blumenóis preferidos são os das fórmulas (I) e (II), como revelado no presente documento acima. Da mesma forma, as partes aéreas preferidas são as reveladas acima. Além disso, plantas preferidas e AMFs preferenciais, respectivamente, são as reveladas acima.

[066] De um modo geral, modalidades preferidas do primeiro aspecto definem modalidades preferidas após devidas mudanças de todos os aspectos adicionais da invenção.

[067] Em um terceiro aspecto, a presente invenção se refere a um método para determinar a possibilidade de uma planta ter receptividade AMF, aquisição melhorada de recursos, ou resistência melhorada à tração;

[068] ou quantificar a dita receptividade, a dita aquisição melhorada ou a dita resistência melhorada; sendo que o dito método compreende: (a) colocar a dita planta em contato com um AMF conhecido por ter a capacidade de colonização; e (b) comparar uma quantidade de um blumenol e uma referência para obter uma diferença entre a dita quantidade e a dita referência; em que a dita quantidade é a quantia em uma parte aérea da dita planta em ou após um segundo momento que é o momento inicial após o dito contato, em que a dita associação se formou ou se formará; e a dita referência é a quantia do dito blumenol em uma parte aérea (i) da dita planta antes de um primeiro momento, que é o momento inicial em que uma associação pode se formar; ou (ii) de uma segunda planta que é livre de qualquer associação com um AMF; em que uma quantidade maior em comparação com a dita referência é indicativa da dita receptividade, da dita aquisição melhorada ou da dita resistência melhorada; e a dita diferença é uma medida da dita receptividade e/ou da melhoria da dita aquisição ou da dita resistência.

[069] O método do terceiro aspecto se refere à avaliação do comportamento de resposta de uma determinada planta ao contato com um AMF. O comportamento da resposta pode ser a receptividade da AMF, isto é, a capacidade da planta de estabelecer uma associação. O estabelecimento de uma associação acarreta benefícios para a planta, cujos benefícios incluem aquisição melhorada de recursos bem como resistência melhorada à tração. Os recursos incluem fósforo. Outros recursos preferenciais estão detalhados abaixo.

[070] Com o propósito do método de acordo com o terceiro aspecto, deve ser usado um AMF que é conhecido por ser capaz de colonização. A possibilidade de um AMF ser capaz de colonização é previamente conhecido ou pode ser determinado, por exemplo, com o método para determinar a possibilidade de um AMF ter capacidade de colonização de acordo com a presente invenção (revelada mais adiante) ou, como feito na técnica anterior, por colocar um candidato a AMF em contato com a planta capaz de estabelecer uma associação e subsequentemente analisar as raízes dessa planta.

[071] Em relação ao primeiro aspecto da invenção, também o método do terceiro aspecto pode ser usado de maneira qualitativa (no caso do terceiro aspecto chamado de "determinante") e quantitativa ("quantificadora").

[072] O dito contato pode ser feito, por exemplo, transferindo-se a planta para um solo que contém AMF (por exemplo, misturado antes com um inóculo comercial), molhando-se com uma solução que contém AMF (por exemplo, solução de esporos), adicionando-se uma planta auxiliar (planta infectada por AMF) ao solo, colocando-se esporos isolados nas raízes ou adicionando-se outro meio que contém AMF ao solo (por exemplo, um pedaço de ágar que contém AMF, pedaços de raiz que contém AMF).

[073] A diferença a ser determinada de acordo com a etapa (b) do método do terceiro aspecto é definida da seguinte forma: quantidade menos referência.

[074] É entendido que os termos "quantidade", "referência" e "quantia" se referem à mesma propriedade física, sendo que a dita propriedade, de preferência, é concentração, massa ou quantidade de substância (consulte mais adiante). Adicionalmente, as medidas relativas de massa, quantidade de substância e concentração são consideradas se forem estabelecidas na técnica como indicadores diretos (por exemplo, intensidade de sinal de sistema de detecção usado).

[075] O método do terceiro aspecto introduz a noção de dois momentos. O primeiro momento está associado ao estado de referência. Preferencialmente, e isso é revelado mais abaixo, o dito primeiro momento é anterior à realização da etapa (a) do contato. No entanto, e observando que o desenvolvimento de uma associação funcional leva tempo, o dito primeiro momento também pode ser posterior, a saber, após o contato de acordo com a etapa (a), mas antes daquele momento específico em que uma associação funcional pode ter formado. O período de tempo típico em que associações funcionais são detectadas é de duas a dez semanas, para interações fortes, de preferência entre seis e oito semanas. Oito semanas é geralmente um período de tempo em que uma associação se formou para os pares de plantas mais relevantes com os AMFs.

[076] Os primeiros sinais de associações funcionais podem ocorrer após alguns dias; por exemplo, Alexander et al. ((1985) A developmental study of the early stages in vesicular-arbuscular mycorrhiza formation. Canadian Journal of Botany 63 184 a 194) constatou a formação dos primeiros arbúsculos entre o terceiro e o quarto dia após o contato. O desenvolvimento da associação pode variar de acordo com a planta usada específica, o AMF, o tipo de inoculação e os parâmetros ambientais (por exemplo, temperatura, fertilização, teor de nutrientes do solo).

[077] Consequentemente, o dito segundo momento deve ser escolhido de modo que a associação tenha se formado (ou teria se formado). A alternativa expressa pela frase "teria formado" se refere aos casos em que tempo suficiente decorreu para uma associação se formar, mas nenhum foi formado, por exemplo, porque a planta que foi testada não tem receptividade AMF.

[078] Blumenóis preferidos são aqueles definidos mais acima.

[079] As partes aéreas preferidas são as definidas mais acima. Particularmente, as folhas são preferidas.

[080] O método do terceiro aspecto fornece duas alternativas para a referência. A mesma planta em um momento anterior pode ser usada como referência, ou uma segunda planta, preferencialmente da mesma espécie, que é livre de qualquer associação com um AMF.

[081] Semelhante ao método do primeiro aspecto, o valor de referência pode ser obtido de uma base de conhecimento, como uma publicação ou um banco de dados.

[082] Como observado acima, os métodos da presente invenção são particularmente passíveis de alto rendimento.

[083] Como tal, a presente invenção fornece, em um quarto aspecto, um método de triagem de plantas quanto à receptividade de AMF, aquisição melhorada de recursos ou resistência melhorada à tração; sendo que o dito método compreende aplicar o método do terceiro aspecto a uma pluralidade de plantas; ou (i) colocar cada uma de uma pluralidade de plantas em contato com um AMF conhecido por ter capacidade de colonização; e (ii) determinar a quantidade de blumenol em uma parte aérea de cada planta após um momento que é o momento inicial em que a dita associação se formou ou teria se formado; em que as ditas plantas pertencem à mesma espécie; em que quanto maior a quantidade do dito blumenol, maior é a receptividade, a dita aquisição de recursos ou a dita resistência à tração.

[084] O termo "pluralidade", conforme usado no presente documento, se refere a duas, três, quatro, cinco, dez, vinte, cem ou mais, nas plantas do presente caso.

[085] A alternativa (a) do método do quarto aspecto prevê o uso repetido do método do terceiro aspecto. Como é evidente na descrição do método do terceiro aspecto, isso requer um valor de referência em cada caso.

[086] Os valores de referência para cada comparação, no entanto, são dispensáveis nos casos em que várias plantas pertencentes à mesma espécie são avaliadas. Este é o objeto da alternativa (b) do método do quarto aspecto. Aqui é avaliada uma pluralidade de plantas da mesma espécie, as quantidades observadas podem, por exemplo, ser classificada e a planta com a maior quantidade de blumenol é a planta com a maior receptividade AMF, a maior aquisição de recursos e/ou a maior resistência à tração. É entendido que “superior” e “maior”, em seu sentido mais amplo, são termos relativos. Contudo, fornecem usos práticos, como classificação de plantas e/ou AMFs.

[087] Adicionalmente, informações quantitativas podem ser usadas para abordagens genéticas avançadas, por exemplo, mapeamento de loci de traços quantitativos (QTL) para encontrar as regiões genéticas associadas à receptividade de uma planta; consulte, por exemplo, Figura 4.

[088] Para os fins da presente invenção, um "maior grau de receptividade" e um "maior grau de associação" é caracterizado por um maior potencial de troca de metabólitos entre a planta e o AMF.

[089] Em um quinto aspecto, a presente invenção fornece um método de triagem de plantas para aquisição melhorada de recursos ou resistência melhorada à tração, sendo que o dito método compreende a comparação das quantidades de um blumenol em uma parte aérea de uma pluralidade de plantas, em que as ditas plantas pertencem à mesma espécie e em que quanto maior a quantidade do dito blumenol, maior é a aquisição de recursos ou a resistência à tração.

[090] De modo geral, o termo "pluralidade", conforme usado no presente documento, se refere a duas, três, quatro, cinco, dez, vinte, cem ou mais, nas plantas do presente caso.

[091] Comparado com o método do quarto aspecto, o método do quinto aspecto dispensa a exigência de uma etapa de contato. Embora o contato não seja excluído do método do quinto aspecto, o método do quinto aspecto também pode ser praticado com uso de valores obtidos a partir de, por exemplo, documentos, publicações ou bases de dados.

[092] Em modalidades preferidas do método do terceiro, quarto e quinto aspecto, os ditos métodos compreendem ainda selecionar a planta (ou plantas) com a quantidade (ou quantidades) mais alta ou (a) quantidade predefinida (ou quantidades predefinidas) do dito blumenol, ou a planta (ou plantas) com a maior diferença (ou diferenças) ou (a) diferença predefinida (diferenças predefinidas), respectivamente.

[093] No que diz respeito às diferenças predefinidas, é de notar que, dependendo das condições de crescimento, das espécies vegetais e dos AMFs envolvidos, os custos de manutenção do AM podem superar os benefícios. Portanto, às vezes, menor receptividade pode ser vantajosa.

[094] Os métodos acima do terceiro, quarto e quinto aspecto se referem ao teste de uma planta ou de uma pluralidade de plantas. Por analogia, a presente invenção também fornece métodos para testar um AMF ou uma pluralidade de AMFs.

[095] Consequentemente, a presente invenção, em um sexto aspecto, fornece um método para determinar a possibilidade de um AMF ter capacidade de colonização, capacidade de fornecer um recurso a uma planta ou de fornecer resistência à tração à dita planta; ou quantificar a dita capacidade/capacidades; sendo que o dito método compreende: (a) colocar o dito AMF em contato com uma planta conhecido por ser receptivo para colonização; e (b) comparar uma quantidade de um blumenol e uma referência para obter uma diferença entre a dita quantidade e a dita referência; em que a dita quantidade é a quantia em uma parte aérea da dita planta em ou após um segundo momento que é o momento inicial após o dito contato, em que a dita associação se formou ou se formará; e a dita referência é a quantia do dito blumenol em uma parte aérea da dita planta antes de um primeiro momento, que é o momento inicial em que uma associação pode se formar; ou de uma segunda planta que é livre de qualquer associação com um AMF; em que uma quantidade maior em comparação com a dita referência é indicativa da dita capacidade/capacidades e a dita diferença é uma medida da dita capacidade/capacidades.

[096] O método do sexto aspecto é a contrapartida do método do terceiro aspecto. Enquanto o método do terceiro aspecto é projetado para testar plantas, o método do sexto aspecto é para testar AMFs. As propriedades a serem testadas são a capacidade de colonização e, observando que a colonização oferece benefícios à planta, a capacidade de fornecer um recurso a uma planta, bem como a capacidade de fornecer resistência à tração a uma planta.

[097] Em um sétimo aspecto, a presente invenção fornece um método de triagem de AMFs para capacidade de colonização, capacidade de fornecer um recurso a uma planta ou de fornecer resistência à tração à dita planta; sendo que o dito método compreende (a) aplicar o método do sexto aspecto a uma pluralidade de AMFs; ou (b) (i) colocar cada um de um pluralidade de AMFs em contato com uma planta conhecido por ser receptivo para colonização; e (ii) determinar a quantidade de blumenol em uma parte aérea de cada planta após um momento que é o momento inicial em que a dita associação se formou ou teria se formado; em que as ditas plantas pertencem à mesma espécie; em que quanto maior a quantidade do dito blumenol, maior é/são a dita capacidade/as ditas capacidades.

[098] Explicações relacionadas aos métodos do quarto aspecto aplicam-se após devidas mudanças ao método do sétimo aspecto.

[099] Em um oitavo aspecto, a presente invenção fornece um método de triagem AMFs quanto à capacidade de fornecer um recurso a uma planta ou de fornecer resistência à tração à dita planta, sendo que o método compreende a comparação das quantidades de um blumenol em uma parte aérea de tipos da dita planta, cujos tipos estão associados a um AMF, em que quanto maior a quantidade do dito blumenol, maior é/são a dita capacidade/as ditas capacidades.

[0100] O método do oitavo é a contrapartida do método do quinto aspecto.

[0101] Em modalidades preferidas dos métodos do sexto, sétimo e oitavo aspectos, os ditos métodos compreendem ainda selecionar o AMF (ou AMFs) que originam a quantidade (quantidades) mais alta ou (a) quantidade predefinida (ou quantidades predefinidas) do dito blumenol, ou o AMF (ou AMFs) que originam a maior diferença (ou diferenças) ou (a) diferença predefinida (ou diferenças predefinidas), respectivamente.

[0102] Em uma outra modalidade preferencial, (a) o dito recurso é selecionado dentre fósforo, nitrogênio e água; ou (b) a dita tração é selecionado entre seca, exposição a metais pesados, infecção por patógenos e infestação por herbívoros.

[0103] Em muitos casos, otimizar associações entre plantas e AMFs também é um meio de otimizar o rendimento das plantas. Especialmente sob condições em que recursos como fósforo não são abundantes ou escassos, a planta se beneficiará significativamente da associação, não apenas em termos de aquisição de recursos e resistência à tração, mas também em termos de rendimento. Em outras palavras, os métodos revelados acima do terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo e oitavo aspectos também podem ser empregados para determinar se uma planta tem (ou terá) rendimento melhorado (métodos do terceiro, quarto e quinto aspecto), e se um AMF tem a capacidade de melhorar o rendimento das plantas (método do sexto, sétimo e oitavo aspectos da invenção). Preferencialmente, o dito rendimento melhorado ocorre ou é esperado que ocorra sob condições em que recursos como fósforo não são abundantes ou escassos.

[0104] Com relação a isso, é esperado que a situação de micorrização das plantas tenha influência sobre o sabor da planta e suas partes, incluindo as partes aéreas. Como consequência, os métodos e usos da invenção também podem ser empregados para modular ou otimizar o sabor das plantas.

[0105] De um modo geral, a produção de associações que compreendem uma planta e uma AMF associada é desejável no campo da criação e agricultura. A geração de tais associações, em particular associações de maior grau ou grau desejado, é facilitada pela presente invenção, dado que os níveis de blumenol nas partes aéreas das plantas são passíveis de determinação fácil e conveniente.

[0106] De acordo com as considerações acima, a presente invenção fornece, em um nono aspecto, um método para produzir uma associação de uma planta com uma

AMF, o dito método que compreende: (a) (i) colocar a dita planta em contato um AMF; (ii) comparar uma quantidade de um blumenol e uma referência para obter uma diferença entre a dita quantidade e a dita referência; em que a dita quantidade é a quantia em uma parte aérea da dita planta em ou após um segundo momento que é o momento inicial após o dito contato, em que a dita associação se formou ou se formará; e a a dita referência é a quantia do dito blumenol em uma parte aérea (1) da dita planta antes de um primeiro momento, que é o momento inicial em que uma associação pode se formar; ou (2) de uma segunda planta que é livre de qualquer associação com um AMF; e (iii) obter a dita associação se a dita quantidade for aumentada em comparação com a dita referência ou igual a cerca de uma quantidade predefinida do dito blumenol; (b) (i) colocar a dita planta em contato com cada um dentre uma pluralidade de AMFs; (ii) determinar no caso da quantidade de blumenol em uma parte aérea da dita planta após um momento que é o momento inicial em que a dita associação se formou ou teria se formado; e selecionar a associação que tem a maior quantidade ou uma quantidade predefinida do dito blumenol; ou (i) colocar uma pluralidade de plantas em contato com um AMF; (ii) determinar a quantidade de blumenol em uma parte aérea de cada planta após um momento que é o momento inicial em que a dita associação se formou ou teria se formado; e (iii) selecionar a associação que tem a maior quantidade ou uma quantidade predefinida do dito blumenol.

[0107] Itens (a), (b) e (c) cada um define um método separado para produzir uma associação.

[0108] Em modalidades preferenciais dos métodos do terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo e nono aspecto, (i) o dito primeiro momento é anterior ao dito contato; (ii) a dita planta (ou plantas), antes do

[0109] dito contato ou antes do dito primeiro momento, é/está livre da dita associação; (iii) o dito método compreende determinar a quantidade de blumenol no ou antes do dito primeiro momento; (iv) o dito método compreende determinar a quantidade de blumenol no ou após o dito segundo momento; e/ou (v) a dita comparação é efetuada de maneira implementada por computador.

[0110] Na medida em que isso seja tecnicamente significativo, dois ou mais dos itens (i) a (v) podem ser combinados.

[0111] As combinações são preferidas: (i), (ii) e (iv), em que, de preferência, a quantidade no dito primeiro momento é tomada a partir de uma base de conhecimento; e (i) e (iv), em que, de preferência, a dita planta (ou plantas), antes do dito contato ou antes do dito primeiro momento, tem/têm uma associação. O uso (adicional) do item (v) também é preferido.

[0112] O AMF a ser usada para colocar em contato com uma determinada planta é preferencialmente fornecida como (i) um único AMF; (ii) uma mistura de AMF; (iii) um isolado de esporos de raízes ou solo de uma planta micorrizada; e/ou (iv) solo não estéril. No caso de (iv) o solo era habitado preferencialmente por plantas com AMF antes. A espécie das ditas plantas não é particularmente limitada.

[0113] Em um décimo aspecto, a presente invenção fornece uma associação de uma planta com um AMF obtido pelo método do nono aspecto.

[0114] Em um décimo primeiro aspecto, a presente invenção fornece um espectrômetro de massa configurado para a análise quantitativa de um blumenol de fórmula (I) ou fórmula (II), como definido no presente documento acima. O dito espectrômetro pode ser equipado com um programa de computador que identifica e quantifica os blumenóis da presente invenção analisando íons parental, aduto e fragmento que são formados a partir dos blumenóis no decurso da análise espectrométrica de massa.

[0115] Em um décimo segundo aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo específico para um blumenol de fórmula (I) ou (II).

[0116] Em um décimo terceiro aspecto, a presente invenção fornece um kit que compreende ou consiste em um, mais ou todos os seguintes itens: (a) uma ampola que contém um solvente adequado para extrair blumenol de uma parte aérea de uma planta, sendo que o dito solvente é preferencialmente metanol, etanol, isopropanol, acetonitrila, acetona, acetato de etila, clorofórmio, piridina, misturas dos mesmos, bem como misturas de um ou mais desses solventes com água; (b) o anticorpo do décimo segundo aspecto; (c) uma enzima que é ligada ao dito anticorpo ou a um anticorpo secundário direcionado contra o anticorpo do décimo segundo aspecto; um substrato da dita enzima; (e) o espectrômetro de massa do décimo primeiro aspecto; e/ou (f) um manual para realizar o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

[0117] Os kits preferidos compreendem ou consistem em (b) e (c); (a), (e) e (f); ou (a), (b), (c), (d) e (f).

[0118] No que diz respeito às modalidades caracterizadas neste relatório descritivo, em particular nas reivindicações, pretende-se que cada modalidade mencionada em uma reivindicação dependente seja combinada com cada modalidade de cada reivindicação (independente ou dependente), a dita reivindicação dependente dependa. Por exemplo, no caso de uma reivindicação independente 1 que recitam 3 alternativas A, B e C, uma reivindicação dependente 2 que recita 3 alternativas D, E e F e uma reivindicação 3 dependente, as reivindicações 1 e 2 e que recitam 3 alternativas G, H e I, deve ser entendido que a especificação revela sem ambiguidade modalidades que correspondem às combinações A, D, G; A, D, H; A, D, I; A, E, G; A, E, H; A, E, I; A, F, G; A, F, H; A, F, I; B, D, G; B, D, H; B, D, I; B, E, G; B, E, H; B, E, I; B, F, G; B, F, H; B, F, I; C, D, G; C, D, H; C, D, I; C, E, G; C, E, H; C, E, I; C, F, G; C, F, H; C, F, I, salvo indicação em contrário.

[0119] De modo similar, e também nos casos em que reivindicações independentes e/ou dependentes não recitam alternativas, é entendido que, se reivindicações dependentes se referem a uma pluralidade de reivindicações anteriores, qualquer combinação da matéria coberto por isso é considerada explicitamente revelada. Por exemplo, no caso de uma reivindicação independente 1, uma reivindicação dependente 2 referente à reivindicação 1 e uma reivindicação dependente 3 referente às reivindicações 2 e 1, segue-se que a combinação da matéria das reivindicações 3 e 1 é revelada de forma clara e inequívoca, assim como a combinação da matéria das reivindicações 3, 2 e 1. No caso de estar presente uma reivindicação 4 dependente adicional que se refere a qualquer uma das reivindicações 1 a 3, segue-se que a combinação do objeto das reivindicações 4 e 1, das reivindicações 4, 2 e 1, das reivindicações 4, 3 e 1, bem como das reivindicações 4, 3, 2 e 1, é clara e inequivocamente revelada.

[0120] As Figuras mostram: A Figura 1 A metabolômica combinada, direcionada e não direcionada, identificou os derivados do blumenol como impressões digitais em-indicativas de AMF nas raízes e folhas das plantas de Nicotiana attenuata. A Configuração experimental. As plantas EV e irCCaMK foram cocultivadas e inoculadas com ou sem Rhizophagus irregularis. Seis semanas após a inoculação (wpi), amostras de raízes foram colhidas para o perfil de metabólitos. B Rede de covariância que visualiza recursos m/z da análise não direcionada UHPLC-qTOF-MS (n = 8). Compostos conhecidos, incluindo nicotina, fenilalanina e vários fenólicos, e desconhecidos (Unk.) são anotados por elipses tracejadas. C Os recursos m/z com pontuação Z normalizada foram agrupados com uso do Aglomerações de caule; 5 de 8 grupos significativos são mostrados em diferentes níveis de cinza e mapeados na rede de covariância. A variação de intensidade (média + SE) de 2 características selecionadas (Compostos 1 e 2) é mostrada em gráficos de barras (n.d, não detectado). D Cromatogramas representativos dos Compostos 1 e 2 em raízes e folhas de plantas com e sem inoculação de AMF, como analisado pela metabolômica alvo de UHPLC-triplo quadrupolo-MS.

A Figura 2 Os compostos 1 e 2 são marcadores de folha de colonização por AMF nas raízes de N. attenuata.

A Acumulações de lapso de tempo dos Compostos 1 e 2 em folhas de plantas EV com (EV+) ou sem inoculação (EV-) AMF e de plantas irCCaMK com inoculação AMF (irCCaMK+)(médias ± SE, n> 6). B Abundância de folhas dos Compostos 1 e 2 (5 wpi) de plantas inoculadas com diferentes concentrações de inóculo (médias + SE, n = 8); letras diferentes indicam diferenças significativas (p <0,05, ANOVA unidirecional seguida pelo LSD de Fisher). C Compostos 1 e 2 em amostras de folhas de plantas EV e irCCaMK inoculadas com (+) ou sem (-) inóculo AMF isolado do habitat nativo da planta (6 wpi); letras diferentes indicam diferenças significativas (p <m0,05, ANOVA unidirecional seguida pelo HSD de Tukey, n = 10). D Experiência de campo (Great Basin Desert, Utah, EUA): Os compostos 1 e 2 em amostras de folhas de plantas EV (n = 20) e irCCaMK (n = 19) amostraram 8 semanas após o plantio. (Teste t de Student: ***, p <0,001). E Imagens representativas das raízes de plantas coradas com WGA-488 mostradas em B (bar = 100 µm). F Compostos foliares 1 e 2 relativos à porcentagem de colonização de raiz por hifas, arbúsculos, vesículas e colonização total do comprimento radicular das mesmas plantas (modelo de regressão linear). G Compostos 1 e 2 em 17 tecidos diferentes de plantas com (+AMF, n=3, barras alinhadas à esquerda) ou sem (-AMF, n=1, barras alinhadas à direita) inoculação de AMF colhida a 6 wpi.

A Figura 3 As acumulações indicativas de AMF dos Compostos 1 e 2 em rebentos são originárias das raízes.

A Análise hierárquica por agrupamento da abundância de transcritos do RNA-seq dos genes biossintéticos do metileritritol-4- fosfato (MEP) e (apo) carotenoide.

B Compostos 1, 2 e 6 (não específicos para AMF) em plantas i-irPDS e EV inoculadas com AMF.

Em cada planta, uma única folha de caule (folha 0) foi obtida com 100 μM de pasta que contém DEX por 3 semanas; folhas de controle tratadas e adjacentes, não tratadas (folha -1 e folha +1) foram colhidas.

Folhas representativas são mostradas (o branqueamento indica silenciamento do PDS); (significa + SE, n =

9). As mesmas posições de folha nas plantas i-irPDS e EV foram comparadas pelos testes t de Student.

C Teor dos compostos 1, 2 e 6 nas raízes e brotos de mudas cujas raízes foram mergulhadas por 1 dia em uma solução aquosa com ou sem blumenóis indicativos de AMF.

D Modelo da distribuição do blumenol em plantas com (painel direito) e sem colonização por AMF (painel esquerdo). O modelo ilustra blumenóis constitutivos (por exemplo, Composto 6 em N. attenuata) e indicativos de AMF (por exemplo, Compostos 1 e 2 em N. attenuata) e seu transporte inferido.

A Figura 4 Mudanças indicativas de AMF nos blumenóis nas partes aéreas das plantas são ferramentas valiosas de pesquisa que fornecem avaliações precisas das associações funcionais de AMF em exames de alto rendimento de várias plantas e espécies de AMF.

A Análise de colonização da raiz entre dois acessos de N. attenuata (UT/AZ). H: hifas; A: arbúsculos; V: vesículas; T: colonização total (n=8; teste t de Student, *, p <0,05, **, p <0,01, ***, p <0,001). B Imagens representativas de raízes coradas com azul de tripano (6 wpi; bar = 100 µm). C Composto 2 em raízes e folhas de plantas UT e AZ com e sem inoculação de AMF (média + SE, n = 8). D Mapa de calor da abundância normalizada de compostos foliares 2 de plantas de uma população UT-AZ RIL (728 plantas) em um terreno de 7.200 m 2 . E A análise de mapeamento de QTL dos dados do locus de D.

QTL no grupo de ligação 3 contém NaNOPE1, um gene associado ao AMF, além de outros.

LOD, logaritmo da razão de probabilidade.

F Teor de blumenol de diferentes plantas com e sem inoculação de AMF.

Diferentes espécies de plantas e AMF foram usadas conforme indicado (médias + SE; n.d, não detectadas). A Figura 5 Mudanças indicativas de AMF nos blumenóis nas partes aéreas das plantas são ferramentas valiosas de pesquisa que fornecem avaliações precisas das associações funcionais de AMF de várias espécies de plantas e AMF (continuação da Figura 4F). Teor de blumenol de diferentes plantas com e sem inoculação de AMF.

Diferentes espécies de plantas e AMF foram utilizadas, conforme indicado; significa +

SE, n.d, não detectado. A Figura 6 Comparação de sinais de 11-hidroxiblumenol C glicosídeo (Composto 1) em plantas mutantes de tipo selvagem Nipponbare (NB) e ccamk-2 sem (simulado) ou com inoculação com Rhizophagus irregularis inoculum de cultura pura ou bruto (placa). A Figura 7 Comparação de sinais de 11-carboxiflumenol C glicosídeo (Composto 2) em plantas mutantes de tipo selvagem Nipponbare (NB) e ccamk-2 sem (simulado) ou com inoculação com Rhizophagus irregularis inoculum de cultura pura ou bruto (placa). A Figura 8 Compostos 1 e 2 são marcadores de folhas da colonização por AMF nas raízes em O. sativa.

[0121] As abundâncias de folha dos compostos marcadores de AMF foram quantificadas em plantas mutantes de arroz do tipo selvagem Nipponbare (NB), ccamk-1 e ccamk-2 sem (simulado) ou com inoculação com Rhizophagus irregularis inoculum de cultura pura ou bruta (placa).

[0122] Os exemplos ilustram a invenção: EXEMPLO 1

MATERIAIS E MÉTODOS CRESCIMENTO DE PLANTAS E INOCULAÇÃO DE AMF

[0123] Para os experimentos com Nicotiana attenuata (Torr. Ex S. Wats.), foi usado plantas da 31a geração da linhagem ‘UT ', irCCaMK (A-09-1212-1; Groten et al. (2015) Silencing a key gene of the common symbiosis pathway in Nicotiana attenuata specifically impairs arbuscular mycorrhizal infection without influencing the root- associated microbiome or plant growth. Plant, Cell & Environment 38, 2.398 a 2.416) plantas que são silenciadas de forma estável em CCaMK via RNAi, as plantas i-irPDS (A-11-92-4 x A-11-325-4; Schafer et al. (2013) “Real time” genetic manipulation: A new tool for ecological field studies. The planta Journal 76, 506 a 518) que abriga o sistema LhGR/pOp6 para silenciamento de genes mediado por RNAi quimicamente induzível por fitoene dessaturase (PDS) e as respectivas plantas transformadas de vetor vazio

(EV) (A-04-266-3; Bubner et al. (2006) Occurrence of tetraploidy in Nicotiana attenuata plants after Agrobacterium-mediated transformation is genotype specific but independent of polysomaty of explant tissue. Plant Cell Reports 25, 668 a 675) como controle. Detalhes sobre a transformação e triagem das plantas irCCaMK são descritos por Groten, et al. (2015) Silencing a key gene of the common symbiosis pathway in Nicotiana attenuata specifically impairs arbuscular mycorrhizal infection without influencing the root-associated microbiome or plant growth. Plant, Cell & Environment 38, 2.398 a 2.416 e para as plantas i-irPDS por Schafer et al. ((2013) “Real time” genetic manipulation: A new tool for ecological field studies. The Plant Journal 76, 506518). Sementes são germinadas em Gamborg B5 como descrito por Krügel et al. ((2002) Agrobacterium-mediated transformation of Nicotiana attenuata, a model ecological expression system. Chemoecology 12, 177 a 183). A população de linhagem recombinante avançada intercruzada (RIL) avançada foi desenvolvida cruzando duas linhagens de N. attenuata originárias de acessos coletados no Arizona (AZ) e Utah (UT), EUA (Glawe et al. (2003) Ecological costs and benefits correlated with trypsin protease inhibitor production in Nicotiana attenuata. Ecology 84, 79 a 90, Zhou et al. (2017) Tissue-specific emission of (E)-alpha-bergamotene helps resolve the dilemma when pollinators are also herbivores. Current Biology 27, 1.336 a 1.341). Adicionalmente, foram utilizadas as plantas de Solanum lycopersicum ‘Moneymaker', Hordeum vulgare ‘Elbany' e Triticum aestivum ‘Primavera chinesa'.

[0124] Para experimentos em estufa, as plantas foram tratadas de acordo com Groten et al. ((2015) Silencing a key gene of the common symbiosis pathway in Nicotiana attenuata specifically impairs arbuscular mycorrhizal infection without influencing the root-associated microbiome or plant growth. Plant, Cell & Environment 38, 2.398 a 2.416). ,. Em resumo, foram transferidos para mortos (autoclavados duas vezes a 121 °C por 30 min; controles não inoculados) ou inóculo vivo (R. irregularis, Biomyc Vital, www.biomyc.de, plantas inoculadas) diluído 1:10 com argila expandida (tamanho: 2 a 4 mm). Os vasos foram cobertos com uma fina camada de areia. As plantas foram regadas com água destilada por 7 dias e subsequentemente fertilizadas a cada segundo dia com uma solução hidropônica de força total (por 1 l: 0,1292 g de CaSO4 x 2H2O, 0,1232 g de MgSO4 x 7H2O, 0,0479 g de K2HPO4, 0,0306 g de KH2PO4, 2 ml de KNO3 (1 M), 0,5 ml de micronutrientes, 0,5 ml de micronutrientes, 0,5 ml de Fe dietileno triamina penta-acético) ou com uma solução de hidroponia de baixo P que contém apenas 1/10 da concentração regular de P (0,05 mM). As plantas foram cultivadas separadamente em vasos de 1 l, se não indicado de outra forma. No projeto emparelhado (Figura 1), as plantas irCCaMK foram cultivadas em conjunto com plantas EV em vasos de 2 l e o regime de rega foi alterado para % da concentração regular de P após iniciar o alongamento das plantas. Experimentos em estufa com inóculo natural (Figura 2C) foram realizados em um sistema de mesocosmo (4 caixas, cada 2 pares de plantas EV e irCCaMK). As plantas foram mantidas em condições padrão de estufa (16 h de luz, 24 a 28 °C e 8 h de escuridão, 20 a 24 °C e 45 a 55% de umidade) com luz suplementar fornecida por lâmpadas de sódio de alta pressão (Son-T-Agro).

[0125] Os experimentos de campo foram conduzidas como descrito por Schuman et al. ((2012) Herbivory- induced volatiles function as defenses increasing fitness of the native plant Nicotiana attenuata in nature. Elife 1, e00007). As mudas foram transferidas para vasos Jiffy e plantadas em uma parcela de campo na Lytle Ranch Preserve no deserto de Great Basin (Utah, EUA: N 37.1412, W 114.0275). Temporada de campo 2016 (Figura 2D): experimentos de campo foram conduzidos sob os números de permissão de importação do Serviço de Inspeção de Sanidade Animal e Vegetal do Departamento de Agricultura dos EUA (APHIS) 10- 004-105 m (irCCaMK) e 07-341-101n (EV) e o número de permissão de liberação APHIS 16-013-102r. Plantas EV e irCCaMK foram plantadas em comunidades de seis plantas, do mesmo genótipo ou com ambos os genótipos em número igual.

[0126] Amostras preparadas em outras instalações de laboratório: As amostras de Medicago truncatula (Figura 4 e 5) e Brachypodium distachyon (Figura 4 e 5) foram preparadas no laboratório da Prof. Maria Harrison do Instituto Boyce Thompson de Pesquisa de Plantas (Ithaca, NY, EUA).

As amostras de Solanum lycopersicum ‘Moneymaker' (Figura 5) e Solanum tuberosum (Figura 4) foram preparadas no laboratório do Prof. Philipp Franken pelo Dr. Michael Bitterlich do Leibniz- Instituto de Culturas Vegetais e Ornamentais (IGZ, GroBbeeren/Erfurt) Alemanha).

SILENCIAMENTO INDUZÍVEL DE PDS

[0127] Para a restrição temporal e espacial do silenciamento do gene PDS, tratamos o pecíolo da segunda folha de caule mais antiga de plantas i-irPDS inoculadas com AMF e não inoculadas com AMF e EV com uma pasta de lanolina que contém 100 μM de dexametasona (1% v/v DMSO). A pasta de lanolina foi preparada e aplicada como descrito por Schafer et al. ((2013) “Real time” genetic manipulation: A new tool for ecological field studies. The Plant Journal 76, 506 a 518). O tratamento começou 3 semanas após o envasamento e foi realizado por 3 semanas. A pasta de lanolina foi atualizada duas vezes por semana. Em cada planta, a folha tratada e as folhas adjacentes não tratadas foram colhidas para análise.

COLETA DE AMOSTRAS

[0128] Durante as colheitas, as raízes foram lavadas e secas brevemente com uma toalha de papel. Subsequentemente, foram cortados em pedaços de 1 cm e misturados. Os tecidos das plantas foram congelados em nitrogênio líquido imediatamente após a coleta, moídos em pó fino e armazenados a -20 °C (armazenamento de curto prazo)/- 80 °C (armazenamento de longo prazo) até a extração. A partir das amostras de raízes, uma alíquota foi armazenada em solução de armazenamento de raízes (25% de etanol e 15% de ácido acético em água) a 4 °C para análise microscópica. Amostras de S. lycopersicum e S. tuberosum da IGZ foram fornecidas como material seco.

[0129] Para a coleta da seiva do caule, os ramos das plantas de N. attenuata foram cortados em pedaços de 1,5 cm de comprimento e colocados em pequenos tubos de reação de 0,5 ml com um pequeno orifício na ponta, que foram colocados em um tubo de reação maior de 1,5 ml. Os tubos foram centrifugados por 15 min a 10.000 x g. A seiva de caule dos tubos de reação maiores foi coletada e armazenada a -20 °C.

TRATAMENTOS DE TRAÇÃO

[0130] Os tratamentos de herbivoria foram conduzidos com a colocação de neonatos Manduca sexta, originários de uma colônia interna, nas plantas. Após fornecimento por 2 semanas, as folhas de roseta foram colhidas. Como controle, folhas de plantas não tratadas são colhidas.

[0131] Para infecção por bactérias e vírus, as plantas foram inoculadas com Agrobacterium tumefaciens que transporta o vírus do chocalho do tabaco. A inoculação foi realizada infiltrando-se as folhas com uma solução bacteriana com uso de uma seringa. O tratamento foi conduzido como descrito para o silenciamento de genes induzido por vírus descrito por Ratcliff et al. ((2001) Technical Advance. Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing. The planta Journal 25, 237 a 245) e por Saedler e Baldwin ((2004) Virus-induced gene silencing of jasmonate-induced direct defences, nicotine and trypsin proteinase-inhibitors in Nicotiana attenuata. Journal of Experimental Botany 55, 151 a 157). Após incubação por 3 semanas, foram colhidas folhas de caule das plantas tratadas e plantas de controle não tratadas.

[0132] A infecção fúngica foi realizada com Botrytis cinerea. Em cada planta, três folhas foram tratadas aplicando-se 6 gotículas cada uma contendo 10 µl de suspensão de esporos de B. cinerea (106 esporos/ml em Caldo de Glicose de Extrato de Batata, Carl Roth GmbH) na superfície de folha. Como controle, as plantas foram tratadas com caldo sem esporos da mesma maneira. As amostras foram coletadas após 4 dias de incubação.

[0133] O estresse de seca foi induzido pela interrupção da rega por 4 d. Subsequentemente, foram colhidas folhas de caule das plantas sob estresse de seca e das plantas controle continuamente regadas. Em contraste com as outras amostras do experimento de tração, as folhas foram secas antes da análise para compensar as diferenças de peso causadas por alterações no teor de água. PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS - EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO

[0134] Para extração, as amostras foram divididas em alíquotas em tubos de reação, que contêm duas esferas de aço. Os pesos foram registrados para posterior normalização. Por 100 mg de tecidos vegetais, aproximadamente 1 ml de 80% de MeOH foi adicionado às amostras antes de ser agitado em um GenoGrinder 2000 (SPEX SamplePrep) por 60 s a 1.150 golpes min -1. Após centrifugação, o sobrenadante foi coletado e analisado. Para quantificação de MS com triplo quadrupolo, o tampão de extração foi aumentado com ácido abscísico marcado com isótopo estável de 10 ng (D6-ABA, HPC Standards GmbH) como padrão interno.

[0135] A seiva de caule foi diluída 1:1 com MeOH enriquecido com D6-ABA como padrão interno. Após centrifugação, o sobrenadante foi coletado e analisado.

[0136] A purificação dos extratos de folhas de N. attenuata para MS de alta resolução foi realizada por extração em fase sólida (SPE) com uso das colunas de troca catiônica de ácido benzensulfônico de Chromabond HR-XC 45 µm (Machery- Nagel) para remover constituintes abundantes, como nicotina e fenolamidas. Após a purificação, as amostras foram evaporadas até à secura e reconstituídas em 80% de metanol.

[0137] A identificação do composto foi realizada por RMN com frações purificadas de extratos de raiz e folha. Os compostos 1, 3 e 4 foram extraídos dos tecidos de raízes de N. attenuata e purificados por HPLC (série Agilent-HPLC 1100; Grom-Sil 120 ODS-4 HE, C18, 250 x 8 mm, 5 µm; equipado com um Gilson 206 Coletor de fração Abimed). Os compostos 2 e 7 foram extraídos de uma mistura de tecidos de folhas de diferentes espécies vegetais (M. truncatula, Z. mays, S. lypersicum e N. attenuata). A primeira etapa de purificação foi conduzida por SPE com uso das colunas de troca catiônica de ácido benzensulfônico de Chromabond HR-XC 45 µm (Machery-Nagel) para remover os constituintes hidrofílicos e catiônicos. Etapas de purificação adicionais foram realizadas via HPLC (série Agilent-HPLC 1100; Phenomenex Luna C18 (2), 250 x 10 mm, 5 µm; equipado com um coletor de amostras Foxy Jr.) e UHPLC (Dionex UltiMate 3000; Thermo Acclaim RSLC 120 C18, 150 x 2,1 mm, 2,2 µm; com uso do amostrador automático para coleta de frações).

ANÁLISES NÃO DIRECIONADAS COM BASE EM MS

[0138] Para espectrometria de massa de alta resolução (MS), espectrometria de massa tandem indiscriminada (idMS/MS), MS tandem (MS2) e pseudo-MS3 , desenvolvemos um método cromatográfico com uso de uma mistura de solvente A: água (Milli-Q, Merck, http: //www.emdmillipore.com) com 0,1% de acetonitrila e 0,05% de ácido fórmico e solvente B: acetonitrila com 0,05% de ácido fórmico. A cromatografia líquida de ultra-alto desempenho (UHPLC) foi realizada com uso de um sistema LC de separação rápida Dionex UltiMate 3000 (Thermo Fisher, http://www.thermofisher.com), combinado com um Thermo Acclaim RSLC 120 C18, 150 x 2,1 mm, coluna de 2,2 µm. A composição do solvente mudou de uma alta % A em um gradiente linear para uma alta % B seguido de etapas de equilíbrio de coluna e o retorno às condições iniciais. A taxa de fluxo foi ajustada para 0,3 ml/min. A detecção de MS foi realizada com uso de um sistema micrOTOF-Q II MS (Bruker Daltonics, http://www.bruker.com), equipado com uma fonte de ionização por eletropulverização (ESI) que opera no modo de íons positivos. As condições ESI para o sistema micrOTOF-Q II foram desviadas da placa final de 500 V, tensão capilar

4.500 V, saída capilar 130 V, temperatura seca 180 °C e fluxo de gás seco de 10l min-

1. A calibração em massa foi realizada com uso de formiato de sódio (250 ml de isopropanol, 1 ml de ácido fórmico, 5 ml de 1 M NaOH em 500 ml de água). Os arquivos de dados foram calibrados com uso do algoritmo de calibração de alta precisão Bruker. O controle do instrumento, a aquisição e o reprocessamento dos dados foram realizados no HyStar 3.1 (Bruker Daltonics).

[0139] O idMS/MS foi realizado para obter informações estruturais sobre o perfil metabólico detectável geral. Para isso, as amostras foram analisadas primeiro por UHPLC-ESI/qTOF-MS com uso do modo MS único (produzindo baixas fragmentações resultantes da fragmentação na fonte), digitalizando-se de m/z 50 a 1.400 a uma taxa de 5.000 varreduras/s. As análises de MS/MS foram conduzidas com uso de nitrogênio como gás de colisão e que envolve medições independentes nas quatro tensões diferentes de dissociação induzida por colisão (CID) a seguir: 20, 30, 40 e 50 eV. O quadrupolo foi operado durante toda a medição com a maior janela de isolamento de massa, de m/z 50 a 1.400. Os fragmentos de massa foram varridos entre m/z 50 a 1.400 a uma taxa de 5.000 varreduras/s. Para a montagem idMS/MS, foi usado uma tubulação de atribuição de precursor a produto previamente projetado (Li et al. (2015) Navigating natural variation in herbivory-induced secondary metabolism in coyote tobacco populations using MS/MS structural analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences 112, E4147-E4155, Li et al. (2016) Illuminating a plant's tissue-specific metabolic diversity using computational metabolomics and information theory. Proceedings of the National Academy of Sciences 113, E7610-E7618) com uso dos resultados de saída para processamento com os pacotes R XCMS e CAMERA.

[0140] Experiências adicionais de MS/MS foram realizadas no íon molecular em várias tensões CID. Para a fragmentação dos agliconas propostos via pseudo-MS3, foi aplicado uma energia de transferência CID de 60 eV na fonte que produzia espectros refletindo a perda de todas as porções químicas de açúcar.

ELUCIDAÇÃO DE ESTRUTURA POR NMR

[0141] As frações purificadas foram completamente secas e reconstituídas em MeOH-d3 antes da análise por espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) em um espectrômetro Avance AV700 MD NMR (Bruker-Biospin, Karlsruhe, Alemanha) a 298 K com uso de um TCI CryoProbeTM de 1,7 mm. Os valores dos desvios químicos (δ) são dados em relação aos picos de solvente residual em ΔH 3,31 e δc 49,05, respectivamente. Os desvios de carbono foram determinados indiretamente a partir dos espectros 1H-13C HSQC e HMBC.

ANÁLISE METABÓLICA DIRECIONADA

[0142] Para separações cromatográficas, foi usado um UHPLC (Dionex UltiMate 3000) para fornecer um máximo de separação com curtos tempos de execução. Isso reduziu a perturbação por outros componentes do extrato (efeitos de matriz), aumentou a especificidade do método e atendeu aos requisitos de uma análise HTP. O auto-amostrador foi resfriado a 10 °C. Como fase estacionária, foi usada uma coluna de fase reversa (Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18, 50 x 3,0 mm, 1,8 µm) adequada para a separação de compostos moderadamente polares.

A temperatura da coluna foi ajustada para 42 °C.

Como fases móveis, foi usado: A, 0,05% de HCOOH, 0,1% de ACN em H2O e B, MeOH, cuja composição foi otimizada para uma separação eficiente de compostos do tipo blumenol em um curto período de tempo.

Incluímos no método um segmento de limpeza a 100% B e um segmento de equilíbrio, que permite resultados reproduzíveis em grandes conjuntos de amostras.

O programa de gradiente foi o seguinte: 0 a 1 min, 10% de B; 1 a 1,2 min, 10 a 35% de B; 1,2 a 5 min, 35 a 50% de B; 5 a 5,5 min, 50 a 100% de B; 5,5 a a6,5 min, 100% de B; 6,5 a 6,6 min, 100 10% de B e 6,6-7,6 min, 10% de B.

A taxa de fluxo foi ajustada para 500 µl 1min-1. A análise foi realizada em um MS triplo quadrupolo Bruker Elite EvoQ equipado com uma fonte de íons HESI (ionização por eletropulverização a quente). Os parâmetros de fonte foram os seguintes: tensão de pulverização (+), 4.500 V; tensão de pulverização (-), 4.500 V; temperatura do cone, 350 °C; fluxo de gás cone, 35; temperatura de sonda aquecida, 300 °C; fluxo de gás da sonda, 55 e fluxo de gás do nebulizador, 60. As amostras foram analisadas no modo de monitoramento de reação múltipla (MRM) (Tabela 4).

TABELA 4 CONFIGURAÇÕES DE MRM USADAS PARA ANÁLISE DIRECIONADA DE BLUMENOL

Nú Nome de composto RT Q1 [m/z] a, b Q3 [m/z] c, d (CE [V]) mer o

1 11-hidroxiblumenol C-Glc f, g 2,82 + 389,22 227,16 (-2,5), 209,15 (-7,5), 191,14 (-12,5), 163,10 (-15), 149,10 (- 17,5)

2 11-carboxiblumenol C-Glc f, g 3,22 + 403,22 241,16 (-2,5), 223,15 (-7,5), 177,10 (-15), 195,14 (-12,5)

+ 241.16 e 223,15 (-5), 177,10 (-15), 195,14 (-10)

50/55 3 11-hidroxiblumenol C-Glc-Glc f, g 2,5 + 551,27 (-2,5), 227,16 (-7,5), 209,15 (-10), 191,14 (-15), 149,10 (-20) (-2,5), 211,00 (-10), 193,10 (-17,5), 135,00 (-22,5),

4 Blumenol C - Glc-Glc f, g 3,47 + 535,27 109,00, (-22,5)

5 Blumenol C - Glc f, h 4,18 + 373,22 211,20 (-6), 193,16 (-9), 175,10 (-15), 135,12 (-16), 109,10 (-20)

7 Blumenol B - Glc f, g 2,5 + 389,22 227,16 (-5), 209,15 (-7,5), 191,14 (-12,5), 153,10 (-17,5), 149,10 (- 17,5) 373,22 (-2,5), 211,00 (-10), 193,10 (-17,5), 135,00 (-22,5),

8 Blumenol C - Glc-GlcU i 3,25 + 549,27 109,00, (-22,5)

Nú Nome de composto RT Q1 [m/z] a, b Q3 [m/z] c, d (CE [V]) mer o

& 3,38

9 11-hidroxilumenol C - Glc-Rha i 2,8 + 535,27 (-2,5), 227,16 (-7,5), 209,15 (-10), 191,14 (-15), 149,10 (-20) (-2,5), 211,00 (-10), 193,10 (-17,5), 135,00 (-22,5),

10 Blumenol C - Glc-Rha i 4,1 + 519,27 109,00, (-22,5)

11 hidroxiblumenol C-Hex-Pen i 2,5 + 521,27 389,22 (-2,5), 227,16 (-7,5), 209,15 (-10), 191,14 (-15), 149,10 (-20)

51/55 D6-ABA h 4,5 - 269,17 159,00, (10)

RT: tempo de retenção CE: energia de colisão Glc: glicose GlcU: ácido glucurônico Rha: ramnose Hex: hexose Pen: pentose a Resolução: 0,7 b [M+H]+ ou [M-H]- se não for declarado diferente c Resolução: 2 d Quantificadores são representados em negrito e [M+H-Glc]+ f Verificado por MS de alta resolução g Verificado por NMR h Otimizado com padrões comerciais disponíveis i Transições previstas com base em compostos estruturais semelhantes e informações de literatura

52/55

MÉTODO AJUSTADO PARA ANÁLISE DIRECIONADA DE BLUMENOL EM N. ATTENUATA

[0143] Os marcadores indicativos AMF em N. attenuata, Compostos 1 e 2, e o padrão interno (D6-ABA) foram analisados. Consequentemente, o programa de gradiente foi ajustado da seguinte forma: 0 a 1 min, 10% de B; 1 a 1,2 min, 10 a 35% de B; 1,2 a 3 min, 35 a 42% de B; 3 a 3,4 min, 42 a 100% de B; 3,4 a 4,4 min, 100%

[0144] B; 4,4 a 4,5 min, 100 a 10% B e 4,5 a 5,5 min, 10% B. As configurações de MRM são mostradas na Tabela 5.

TABELA 5 CONFIGURAÇÕES DE MRM PARA A ANÁLISE DE BLUMENÓIS SELECIONADOS EM N.

ATTENUATA

Nú Nome de composto RT Q1 [m/z] a, b Q3 [m/z] c, d (CE [V]) mer o

1 11-hidroxiblumenol C-Glc f, g 2,82 + 389,22 227,16 (-2,5), 209,15 (-7,5), 191,14 (-12,5), 163,10 (-15), 149,10 (-17,5)

2 11-carboxiblumenol C-Glc f, 3,22 + 403,22 241,16 (-2,5), 223,15 (-7,5), 177,10 (-15), 195,14 (-12,5) g

+ 241.16 e 223,15 (-5), 177,10 (-15), 195,14 (-10)

54/55 D6-ABA h 4,0 - 269,17 159,00, (10)

RT: tempo de retenção CE: energia de colisão Glc: glicose Hex: hexose Pen: pentose a Resolução: 0,7 b [M+H]+ ou [M-H]- se não for declarado diferente c Resolução: 2 d Quantificadores são representados em negrito e [M+H-Glc]+ f Verificado por MS de alta resolução g Verificado por NMR h Otimizado com padrões comerciais disponíveis

55/55

DETERMINAÇÃO DA TAXA DE COLORIZAÇÃO DE AMF

[0145] Para determinar as taxas de colonização fúngica e estruturas micorrízicas, amostras de raízes foram coradas e analisadas por microscopia. Para a coloração WGA-Alexa Fluor 488, as raízes foram primeiro lavadas com água destilada e depois embebidas em etanol a 50% (v/v) durante a noite. As raízes foram então fervidas em uma solução de KOH a 10% (p/v) por 10 minutos. Após lavagem com água, as raízes foram fervidas em solução de HCl 0,1 M por 5 minutos. Após lavagem com água e subsequentemente com 1x solução salina tamponada com fosfato, as raízes foram coradas em 1x solução salina tamponada com fosfato contendo 0,2 mg ml -1 WGA- 56/55 Alexa Fluor 488 durante a noite no escuro. A microscopia confocal Zeiss (LSM 510 META) foi usada para detectar o sinal WGA-Alexa Fluor 488 (máximos de excitação/emissão a aproximadamente 495/519 nm). A coloração com azul de tripano foi realizada como descrito por Brundrett et al. ((1984) A new method for observing the morphology of vesicular-arbuscular mycorrhizae. Canadian Journal of Botany 62,

2.128 a 2.134) para visualizar estruturas micorrízicas. Para a contagem de micorrização, 15 fragmentos de raiz, cada um com cerca de 1 cm de comprimento, foram corados com azul de tripano ou WGA-488, seguido de montagem em lâmina. Mais de 150 campos de visão por lâmina foram pesquisados com aumento de 20x de objetos e classificados em 5 grupos: sem colonização, apenas hifas (H), hifas com arbúsculos (H + A), hifas com vesículas (V + H) e hifas com arbúsculos e vesículas (A + V + H). As proporções de cada grupo foram calculadas pelo número de cada grupo dividido pelo total de visualizações.

[0146] Para a análise biológica molecular das taxas de colonização, o RNA foi extraído das raízes com uso do RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) ou NucleoSpin® RNA Plant (Macherey-Nagel) de acordo com as instruções do fabricante e o cDNA foi sintetizado por transcrição reversa com uso do PrimeScript RT Kit -qPCR (TaKaRa). O (q)PCR quantitativo foi realizado em uma máquina Stratagene Mx3005P qPCR com uso de uma mistura de reação que contém SYBR Green (Eurogentec, http://www.eurogentec.com/; kit qPCR Core para SYBR Green I No ROX). Foi analizado o gene específico de limpeza de R. irregularis, Ri-tub (GenBank: EXX64097.1), bem como os transcritos dos genes marcadores de plantas induzidos por RAM1, Vapyrin, STR1 e PT4. A abundância de sinal foi normalizada para NaIF-5a (NCBI Sequência de Referência: XP_019246749.1).

ANÁLISE DA TRANSCRIÇÃO DA VIA APOCAROTENOIDE

[0147] A análise da transcrição da via do metileritritol 4-fosfato (MEP) e (apo) carotenoide foi realizada com base no RNA-seq usando raízes de N. attenuata com ou sem inoculações de R. irregularis . Os métodos de análise de dados tem por base na tubulação publicada anteriormente por Ling et al. ((2015) Insect herbivory elicits 57/55 genome-wide alternative splicing responses in Nicotiana attenuata. The Plant Journal 84, 228 a 243). Os valores representativos da abundância de transcrições são TPM (transcrições por kilobase do modelo exon por milhão de leituras mapeadas).

EXPERIÊNCIA DE TRANSFERÊNCIA DE BLUMENOL

[0148] Para analisar o potencial de transferência raiz-para-broto dos blumenóis, foram colocadas três mudas de N. attenuata , previamente germinadas em placas de Petri com ágar GB5 por aproximadamente 10 dias, em tubos de reação de 0,5 ml. As raízes foram colocadas no tubo, enquanto a parte projetada fora do tubo. Os tubos foram cuidadosamente cobertos com parafilme, que mantinha as mudas no lugar e as raízes isoladas dos brotos (consulte a Figura 3C). Os tubos foram preenchidos com água da torneira suplementada com extratos vegetais a 0,5% v/v enriquecidos nos Compostos 1 ou 2 (concentração desconhecida; frações purificadas) ou um padrão comercial disponível do Composto 6 (concentração final de 25 ng µl -1 ; Roseoside; Wuhan ChemFaces Bioquímico Co., Ltd.). Os compostos 1 ou 2 foram preparados a partir de uma mistura de tecidos de folhas de diferentes espécies vegetais (M. truncatula, Z. mays, S. lypersicum e N. attenuata) por extração de metanol seguida de purificação por SPE (coluna Chromabond HR-XC) e HPLC (Agilent-HPLC série 1100; Phenomenex Luna C18 (2), 250 x 10 mm, 5 µm; equipado com um coletor de frações Foxy Jr.). Como controle, foi usado água da torneira suplementada com as respectivas quantidades de MeOH. As mudas foram incubadas por 1 d em câmara climática

Percival (16 h de luz a 28 °C e 8 h de escuridão a 26 °C). Durante a coleta das amostras, as raízes e os brotos foram separados e as raízes foram enxaguadas em água (para reduzir a contaminação da superfície com o meio de incubação). Enquanto os brotos foram analisados separadamente, as raízes de todas as mudas do mesmo tratamento foram agrupadas. A extração de amostra foi realizada como descrito acima.

ANÁLISE DE QTL

[0149] Para o mapeamento quantitativo de características (QTL), foi usado a população AZ-UT RIL descrita por Zhou et al. ((2017) Tissue-specific emission of (E)- 58/55 alpha-bergamotene helps resolve the dilemma when pollinators are also herbivores. Current Biology 27, 1.336 a 1.341). As experiências de campo foram realizadas em

2017. As amostras de folhas coletadas foram extraídas como descrito com 80% de MeOH enriquecido comD6-ABA como padrão interno e analisadas com o método descrito em "Método ajustado para análise direcionada de blumenol em N. attenuata". As áreas de pico do Composto 2 foram normalizadas pela quantidade de tecido extraído, padrão interno e transformado em log. Amostras com informações ausentes sobre genótipo ou fenótipo foram removidas. No total, 728 amostras foram usadas para análise de mapeamento de QTL. A análise de QTL foi realizada de acordo com Zhou et al. ((2017) Tissue-specific emission of (E)-alpha-bergamotene helps resolve the dilemma when pollinators are also herbivores. Current Biology 27, 1.336 a 1.341).

ESTATÍSTICAS

[0150] A análise estatística dos dados foi realizada com o R versão 3.0.3 (http://www.R-project.org/). Os métodos estatísticos usados e o número de repetições são indicados nas legendas das Figuras. EXEMPLO 2

RESULTADOS

[0151] Realizamos uma análise metabolômica não direcionada dos tecidos radiculares em uma linha transgênica de Nicotiana attenuata, silenciada na proteína quinase dependente de cálcio e calmodulina (irCCaMK) e plantas de vetor vazio (EV)

cocultivadas com ou sem Rhizophagus irregularis (Figura 1A). Ao usar plantas irCCaMK, incapaz de estabelecer uma associação funcional de AMF (Groten et al. (2015) Silencing a key gene of the common symbiosis pathway in Nicotiana attenuata specifically impairs arbuscular mycorrhizal infection without influencing the root- associated microbiome or plant growth.

Plant, Cell & Environment 38, 2. 398 a 2.416), com a capacidade de dissecar as respostas metabólicas específicas da associação AMF daquelas modificações que resultam de interações planta-fungo mais gerais.

O perfil do metaboloma não direcionado das raízes com uso da espectrometria de massa de tempo de vôo acoplada por cromatografia líquida (LC) (qTOF-MS) resultou em uma

59/55 matriz de dados concatenada composta por 943 recursos de massa (sinais de m/z detectados em determinados tempos de retenção). Foi realizada uma análise de rede de coexpressão, na qual os nós representam características e bordas m/z conectam características de massa de metabólitos derivadas de origens de fragmentação na fonte semelhantes e compartilham relações bioquímicas (Li et al. (2015) Navigating natural variation in herbivory-induced secondary metabolism in coyote tobacco populations using MS/MS structural analysis.

Proceedings of the National Academy of Sciences 112, E4147 a E4155, Li et al. (2016) Illuminating a plant's tissue-specific metabolic diversity using computational metabolomics and information theory.

Proceedings of the National Academy of Sciences 113, E7610-E7618). Por exemplo, características de compostos bem conhecidos, como nicotina e fenilalanina, estavam fortemente conectadas (Figura 1B). Uma tubulação de aglomerações de caule foi realizado para reconhecer padrões de acumulações metabólicas na matriz de dados de tratamento de genótipos x tratamento [(EV/irCCaMK) x (-/+ inoculação de AMF), respectivamente]. Como resultado, 5 de 8 padrões de expressão distintos computados foram mapeados na rede de covariância na Figura1B (mostrada em diferentes níveis de cinza). Um agrupamento fortemente agrupado de metabólitos desconhecidos (Figura 1B, canto superior esquerdo) ocupava um espaço metabólico distinto.

Os metabólitos agrupados nessa aglomeração foram altamente elicitados por micorrização em EV, mas não em plantas de irCCaMK (Figura 1C). Também é digno de nota que este grupo de compostos pareceu ser sintetizado de novo, pois nenhum foi detectado em plantas não inoculadas (Figura 1C). As estruturas dos compostos dessa aglomeração foram anotadas com base em dados de tandem-MS e RMN. Cinco metabolitos foram anotados como blumenóis: 11- hidroxiblumenol-C-9-O-Glc (Figura 1C; composto 1), 11-carboxiblumenol-C-9-O-Glc (Figura 1C; composto 2), 11- hidroxiblumenol-C-9-O-Glc-Glc (composto 3), blumenol-C-9-O-Glc-Glc (composto 4) e blumenol-C-9-O-Glc (composto 5).

[0152] Para rastrear esses compostos em toda a planta, foi usado uma abordagem metabolômica mais sensível e direcionada especificamente com base em LC-triplo- 60/55 quadrupolo-MS. A abundância dos cinco blumenol-C-glicosídeos aumentou continuamente com o desenvolvimento de micorrizas e foi altamente correlacionada com a taxa de micorrização determinada com base na abundância transcrita de genes marcadores clássicos (gene de manutenção de fungos, Ri-tubuline; genes marcadores in-planta, Vapyrin, RAM1, STR1 e PT4; Park et al. (2015) Hyphal branching during arbuscule development requires Reduced Arbuscular Mycorrhiza1. Plant Physiology 169, 2.774 a 2.788).

[0153] Os compostos 1 e 2 mostraram um acúmulo específico de AMF nas folhas, como observado nas raízes (Figura 1D). Os outros blumenóis analisados não foram detectados nas folhas (Compostos 3 e 4) ou mostraram um acúmulo específico de AMF menos consistente (Composto 5; devido ao seu nível constitutivo de fundo). A identidade dos Compostos 1 e 2 nas folhas foi verificada por qTOF-MS de alta resolução em um procedimento que exigiu etapas adicionais de purificação e concentração de amostras devido à sua baixa abundância e altos efeitos de matriz nas folhas, as prováveis razões pelas quais a metabolômica anterior não direcionada tentativas falharam em detectar essas assinaturas. Em seguida, foi determinado as correlações entre o teor dos compostos de folhas indicativos de AMF 1 e 2 e as taxas de colonização das raízes. Em um experimento cinético, ambos os compostos aumentaram seu acúmulo nas folhas de plantas inoculadas com R. irregularis (Figura 2A). Em contraste, os genes marcadores clássicos de AMF, que geralmente são analisados nas raízes, não responderam nas folhas. Em uma experiência de gradiente de inóculo com uso de concentrações crescentes de inóculo, foram observados níveis proporcionalmente mais altos de Composto 1 e 2 (Figura 2B), que reflete com precisão a colonização diferencial das raízes entre os tratamentos (Figura 2E). Além de inoculações com espécies únicas de AMF (R. irregularis), também foi testado o inóculo micorrízico coletado originalmente no habitat nativo da planta, o Deserto da Grande Bacia em Utah, EUA, que consiste principalmente de Funneliformis mosseae e R. irregularis. As plantas EV inoculadas com esse ‘inoculo natural’ também acumularam os compostos 1 e 2 nas folhas, enquanto as plantas irCCaMK não (Figura 2C).

61/55 Quando plantadas no ambiente natural da planta em Utah, as plantas EV e irCCaMK podiam ser claramente distinguidas pelo teor das folhas dos compostos 1 e 2. A assinatura do Composto 2 forneceu um marcador de melhor qualidade nessas plantas cultivadas em campo (Figura 2D). O teor foliar desses dois compostos foi altamente correlacionado com a porcentagem de arbúsculos nas raízes, a estrutura central das interações da AMF (Figura 2F). Em contraste, outros estresses bióticos ou abióticos, incluindo herbivoria, infecção por patógenos e estresse hídrico, não induziram as acumulações foliares dos compostos 1 e 2, conforme descrito para as raízes (Maier et al. (1997) Accumulation of sesquiterpenoid cyclohexenone derivatives induced by an arbuscular mycorrhizal fungus in members of the Poaceae. Plant 202, 36 a 42). Uma análise de vários tecidos vegetais, incluindo diferentes posições das folhas, pedaços de caule, flores e cápsulas, revelou que essas assinaturas específicas da AMF se acumularam durante a sessão (Figura 2G). Tomados em conjunto, concluímos que o teor de blumenóis específicos nas partes aéreas das plantas reflete de maneira robusta o grau de micorrização nas plantas de N. attenuata.

[0154] Blumenóis são apocarotenoides originários de um ramo lateral da via carotenoide (Hou et al. (2016) Synthesis and function of apocarotenoid signals in plants. Trends in Plant Science 21, 792 a 803). A maioria dos genes provavelmente associados à biossíntese de blumenol foi aumentada nas raízes, mas não nas folhas das plantas de N. attenuata em resposta à micorrização (Figura 3A). Foi inferido que os apocarotenoides de folha indicativos de AMF são transportados de seu local de síntese nas raízes colonizadas para outras partes de planta. Isso é consistente com a ocorrência de blumenóis na seiva de caule, que foi coletada por centrifugação de pequenos pedaços de caule. Para esclarecer as origens (biossíntese local versus transporte) desses blumenóis foliares indicativos de AMF, foi manipulado geneticamente a biossíntese carotenoide de plantas de N. attenuata. Para minimizar os efeitos de uma biossíntese de carotenoides alterada na interação AMF-planta, foi usado o sistema pOp6/LhGR induzível por dexametasona (DEX) - para silenciar a expressão de fitoeno dessaturase (PDS) em uma única posição de folha tratada com 62/55 DEX (Schafer et al. (2013) “Real time” genetic manipulation: A new tool for ecological field studies. The Plant Journal 76, 506 a 518). As folhas tratadas mostraram sinais claros de branqueamento indicando silenciamento de PDS (Figura 3B), mas os níveis dos compostos indicativos de AMF 1 e 2 não foram afetados, consistente com o transporte de outros tecidos, provavelmente as raízes altamente acumuladas. Como controle, analisamos o composto não induzível por AMF 6, mostrando níveis constitutivos nos tecidos aéreos. Nas folhas tratadas com DEX, as concentrações do Composto 6 foram reduzidas em quase 40%, consistentes com a produção local (Figura 3B). Para confirmar o potencial de transporte intravegetal dos blumenóis, foram mergulhadas as raízes das mudas em soluções aquosas dos compostos 1 ou

2. Após a incubação durante a noite, os derivados do blumenol foram claramente detectados não apenas nas raízes, mas também nas brotações (Figura 3C). Foi proposto que os blumenóis indicativos de AMF (por exemplo, compostos 1 e 2) sejam produzidos em raízes colonizadas e transportados para a parte aérea, enquanto outros blumenóis independentes de AMF (por exemplo, composto 6) são originários da produção local e do transporte dentro da parte aérea (Figura 3D).

[0155] Para testar o potencial desses metabólitos foliares como uma ferramenta de triagem, foram quantificados em um experimento genético avançado, um experimento que seria desafiador com as ferramentas de triagem clássicas de coloração radicular ou análise de ácido nucleico. A análise foi focada no Composto 2 devido à qualidade superior de sua assinatura nas folhas de plantas cultivadas em campo. O experimento consistiu em uma população de linhagem recombinante de duas acessões de N. attenuata (Utah, UT e Arizona, AZ) (Zhou et al. (2017) Tissue- specific emission of (E)-alpha-bergamotene helps resolve the dilemma when pollinators are also herbivores. Current Biology 27, 1.336 a 1.341) que diferem em micorrização (Figura 4A-B) e acumulações de Composto foliar 2 na estufa (Figura 4C). Uma análise QTL de 728 plantas cultivadas em um terreno de 7.200 m 2 (Figura 4D) revelou que a abundância do Composto 2 foi mapeada para um único locus no grupo de ligação 3 (Figura 4E), que abrigava um homólogo de NOPE1, anteriormente 63/55 mostrado para necessário para o início de simbioses de AMF em milho e arroz (Nadal et al. (2017) An N-acetylglucosamine transporter required for arbuscular mycorrhizal symbioses in rice and maize. Nature plants 3, 1707317073). Embora exija claramente um trabalho adicional de acompanhamento, esses resultados destacam o valor desses metabólitos de assinatura nos exames de HTP, que formam a base da maioria dos programas de melhoramento de culturas.

[0156] O acúmulo específico de AMF de derivados de blumenol-C nas raízes é um fenômeno generalizado nas plantas superiores (Strack e Fester (2006) Isoprenoid metabolism and plastid reorganization in arbuscular mycorrhizal roots. New Phytologist 172, 22 a 34); no entanto, quão gerais são as alterações observadas no blumenol nas partes aéreas em diferentes combinações de plantas e espécies de AMF? Foram analisadas as plantas de Solanum lycopersicum, Triticum aestivum e Hordeum vulgare com e sem inoculação de AMF e novamente encontramos uma sobreposição nas respostas blumenol específicas de AMF nas raízes e folhas, consistente com a hipótese de transporte. Análises posteriores levam à identificação de blumenóis indicativos de AMF adicionais nas folhas de Medicago truncatula, S. tuberosum e Brachypodium distachyon. Foi identificado vários tipos de blumenóis que mostraram um acúmulo específico de AMF na parte aérea, incluindo blumenol-B (Composto 7), que não havia sido relatado anteriormente em um contexto dependente de AMF (Figura 4F). Conforme relatado para as raízes, os tipos específicos de blumenol eram dependentes das espécies, mas o padrão geral foi difundido entre monocotiledôneas e dicotiledôneas em experimentos realizados em diferentes instalações de pesquisa. Em testes com diferentes espécies de fungos Rhizophagus irregularis, Funneliformis mosseae e Glomus versiforme), os efeitos observados não foram encontrados restritos a taxas específicas de AMF (Figura 4F e 5). Em suma, o método é robusto. EXEMPLO 3

OTIMIZAÇÃO DE ANÁLISE DO MARCADOR AMF PARA PLANTAS DE ARROZ (ORYZA SATIVA) 64/55

[0157] Marcadores de blumenol em (i) Nipponbare de arroz de tipo selvagem (NB) e (ii) dois genótipos mutantes deficientes na proteína quinase dependente de cálcio e calmodulina (CCaMK) que são incapazes de formar uma associação funcional de AMF (ccamk-1 e ccamk-2) foram analisados.

[0158] As amostras foram colhidas de duas posições foliares, folha 4 (L4) e folha 5 (L5), de plantas tratadas com três tratamentos diferentes de inoculação de AMF: sem AMF (simulação), com um inóculo de Rhizophagus irregularis preparado a partir de raízes de Tagetes colonizadas (brutas) ou um inóculo de R. irregularis de uma cultura pura em raízes estéreis de cenoura (placa). As amostras de tecido congelado (100 mg) foram trituradas e extraídas com 0,8 ml de tampão de extração (80% de metanol) que contém 10 ng de D6-ABA como padrão interno.

[0159] Após uma triagem inicial para compostos relacionados ao blumenol, identificamos marcadores adequados indicando a colonização de plantas de arroz com R. irregularis (Figura 6 e 7).

[0160] Os compostos marcadores AMF identificados foram quantificados com uso de monitoramento de reação múltipla específica de composto (MRM, Tabela A) em um UPLC-MSMS triplo quadrupolo, como descrito em Wang et al. 2018. TABELA A. CONFIGURAÇÕES DE MRM USADAS PARA A

QUANTIFICAÇÃO DE DERIVADOS ESPECÍFICOS DE BLUMENOL EM FOLHAS DE ARROZ.

Nome de composto RT Quantificador m/z Qualificador m/z [CE] [min] [CE] 11-hidroxiblumenol C- 2,81 (+) 389,2 >209,2 [7,5 227,2 [2,5 V], 191,1 [12,5 Glc V] V], 163,1 [15,0 V], 149,1 [17,5 V] 11-carboxiblumenol C- 3,17 (+) 241,2 > 195,1 [10,0 223,2 [5,0 V], 177,1 Glc V] [15,0V] 65/55 11-carboxiblumenol- 3,60 (+) 489,2 > 195,1 241,2 [2,5 V], 223,2 [7,5V], MalGlc [12,5V] 177,1 [15,0 V] D6-ácido abscísico (IS) 4,01 (-) 269,2 > 159,0 [10,0 V] RT: tempo de retenção [min]; CE: energia de colisão; IS: padrão interno

[0161] De modo similar a outros sistemas planta-AMF (isto é, Nicotiana attenuata), as abundâncias de 1-carboxi- e 11-hidroxiblumenol C glicosídeo foram indicativas de colonização por AMF. Adicionalmente, um derivado malonilado do carboxiblumenol glicosídeo mostrou um padrão semelhante de acumulação induzida por AMF em plantas de arroz NB de tipo selvagem que é abolida nos dois mutantes ccamk (Figura 8).

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para determinar uma associação de uma primeira planta com um fungo micorrízico arbuscular (AMF), sendo que o dito método é caracterizado por compreender a comparação da quantidade de um blumenol em uma parte aérea da dita primeira planta com a quantidade do dito blumenol em uma parte aérea de uma segunda planta, em que a dita segunda planta pertence à mesma espécie que a dita primeira planta e em que uma quantidade aumentada é indicativa de associação aumentada na dita primeira planta, em comparação com a dita segunda planta, e uma quantidade diminuída é indicativa de associação diminuída.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito blumenol ser um composto de fórmula (I) ou (II): em que cada um dentre R1 e R2 é selecionado independentemente de -CH3, - CH2OH, -COOH, e -CH2-O- Glyc; R3 é tanto -H, -OH quanto -O-Glyc; R4 é tanto H quanto Glyc; Glyc é uma porção química de açúcar, de preferência, selecionada a partir de -Glc, -Glc-Rha, -MalGlc-Api, -MalGlc, -Glc-Api, -Glc-(Glc)2, -HmgGlc, -Glc-Arb, - (Glc-GlcU)-Rha, -Hmg(MalGlc),-Glc-GlcU, -Glc-Glc, e -MalGlc-GlcU, em que Glc é glicose, Rha é ramnose, Mal é malonil, Api é apiose, Hmg é 3-hidroxi 3-metilglutaril, Arb é arabinose e GlcU é ácido glucurônico.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por (i) a dita segunda planta ser livre de qualquer associação com um AMF;

(ii) a dita segunda planta ter uma associação com um AMF; (iii) a dita primeira e a dita segunda planta serem o mesmo tipo em diferentes momentos; (iv) sendo que o dito método compreende determinar a quantidade do dito blumenol na dita primeira planta; (v) sendo que o dito método compreende determinar a quantidade do dito blumenol na dita segunda planta; e/ou (vi) a dita comparação é eficaz de uma maneira implementada por computador.

4. Uso de um blumenol como marcador caracterizado por se destinar a associação de uma planta a um AMF.

5. Método para determinar a possibilidade de uma planta ter receptividade AMF, aquisição melhorada de recursos, ou resistência melhorada à tração; ou quantificar a dita receptividade, a dita aquisição melhorada ou a dita resistência melhorada; sendo que o dito método é caracterizado por compreender: (a) colocar a dita planta em contato com um AMF conhecido por ter a capacidade de colonização; e (b) comparar uma quantidade de um blumenol e uma referência para obter uma diferença entre a dita quantidade e a dita referência; em que a dita quantidade é a quantia em uma parte aérea da dita planta em ou após um segundo momento que é o momento inicial após o dito contato, em que a dita associação se formou ou se formará; e a dita referência é a quantia do dito blumenol em uma parte aérea (i) da dita planta antes de um primeiro momento, que é o momento inicial em que uma associação pode se formar; ou (ii) de uma segunda planta que é livre de qualquer associação com um AMF; em que uma quantidade maior em comparação com a dita referência é indicativa da dita receptividade, da dita aquisição melhorada ou da dita resistência melhorada; e a dita diferença é uma medida da dita receptividade e/ou da melhoria da dita aquisição ou da dita resistência.

6. Método de triagem de plantas para receptividade da AMF, aquisição melhorada de recursos, ou resistência melhorada à tração; sendo que o dito método é caracterizado por compreender (a) aplicar o método, de acordo com a reivindicação 5, a uma pluralidade de plantas; ou (b) (i) colocar cada uma de uma pluralidade de plantas em contato com um AMF conhecido por ter capacidade de colonização; e (ii) determinar a quantidade de blumenol em uma parte aérea de cada planta após um momento que é o momento inicial em que a dita associação se formou ou teria se formado; em que as ditas plantas pertencem à mesma espécie; em que quanto maior a quantidade do dito blumenol, maior é a receptividade, a dita aquisição de recursos ou a dita resistência à tração.

7. Método de triagem de plantas para aquisição melhorada de recursos ou resistência melhorada à tração, sendo que o dito método é caracterizado por compreender a comparação das quantidades de um blumenol em uma parte aérea de uma pluralidade de plantas, em que as ditas plantas pertencem à mesma espécie e em que quanto maior a quantidade do dito blumenol, maior é a aquisição de recursos ou a resistência à tração.

8. Método para determinar a possibilidade de um AMF ter capacidade de colonização, capacidade de fornecer um recurso a uma planta ou de fornecer resistência à tração à dita planta; ou quantificar a dita capacidade/capacidades; sendo que o dito método é caracterizado por compreender: (a) colocar o dito AMF em contato com uma planta conhecido por ser receptivo para colonização; e

(b) comparar uma quantidade de um blumenol e uma referência para obter uma diferença entre a dita quantidade e a dita referência; em que a dita quantidade é a quantia em uma parte aérea da dita planta em ou após um segundo momento que é o momento inicial após o dito contato, em que a dita associação se formou ou se formará; e a dita referência é a quantia do dito blumenol em uma parte aérea (i) da dita planta antes de um primeiro momento, que é o momento inicial em que uma associação pode se formar; ou (ii) de uma segunda planta que é livre de qualquer associação com um AMF; em que uma quantidade maior em comparação com a dita referência é indicativa da dita capacidade/capacidades e a dita diferença é uma medida da dita capacidade/capacidades.

9. Método de triagem de AMFs para capacidade de colonização, capacidade de fornecer um recurso a uma planta ou de fornecer resistência à tração à dita planta; sendo que o dito método é caracterizado por compreender (a) aplicar o método, de acordo com a reivindicação 8, a uma pluralidade de AMFs; ou (b) (i) colocar cada um de um pluralidade de AMFs em contato com uma planta conhecido por ser receptivo para colonização; e (ii) determinar a quantidade de blumenol em uma parte aérea de cada planta após um momento que é o momento inicial em que a dita associação se formou ou teria se formado; em que as ditas plantas pertencem à mesma espécie; em que quanto maior a quantidade do dito blumenol, maior é/são a dita capacidade/as ditas capacidades.

10. Método de triagem AMFs quanto à capacidade de fornecer um recurso a uma planta ou de fornecer resistência à tração à dita planta, sendo que o método é caracterizado por compreender a comparação das quantidades de um blumenol em uma parte aérea de tipos da dita planta, cujos tipos estão associados a um AMF, em que quanto maior a quantidade do dito blumenol, maior é/são a dita capacidade/as ditas capacidades.

11. Método para produzir uma associação de uma planta com um AMF, sendo que o dito método é caracterizado por compreender: (a) (i) colocar a dita planta em contato um AMF; (ii) comparar uma quantidade de um blumenol e uma referência para obter uma diferença entre a dita quantidade e a dita referência; em que a dita quantidade é a quantia em uma parte aérea da dita planta em ou após um segundo momento que é o momento inicial após o dito contato, em que a dita associação se formou ou se formará; e a dita referência é a quantia do dito blumenol em uma parte aérea (1) da dita planta antes de um primeiro momento, que é o momento inicial em que uma associação pode se formar; ou (2) de uma segunda planta que é livre de qualquer associação com um AMF; e (iii) obter a dita associação se a dita quantidade for aumentada em comparação com a dita referência ou igual a cerca de uma quantidade predefinida do dito blumenol; (b) (i) colocar a dita planta em contato com cada um dentre uma pluralidade de AMFs; (ii) determinar no caso da quantidade de blumenol em uma parte aérea da dita planta após um momento que é o momento inicial em que a dita associação se formou ou teria se formado; e (iii) selecionar a associação que tem a maior quantidade ou uma quantidade predefinida do dito blumenol; ou (c) (i) colocar uma pluralidade de plantas em contato com um AMF; (ii) determinar a quantidade de blumenol em uma parte aérea de cada planta após um momento que é o momento inicial em que a dita associação se formou ou teria se formado; e (iii) selecionar a associação que tem a maior quantidade ou uma quantidade predefinida do dito blumenol.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado por (i) o dito primeiro momento ser anterior ao dito contato; (ii) a dita planta (ou plantas), antes do dito contato ou antes do primeiro momento, estar livre da dita associação; (iii) o dito método compreender determinar a quantidade de blumenol no ou antes do dito primeiro momento; (iv) o dito método compreender determinar a quantidade de blumenol no ou após o dito segundo momento; e/ou (v) a dita comparação ser efetuada de maneira implementada por computador.

13. Associação de uma planta a um AMF caracterizada por ser obtida pelo método, de acordo com a reivindicação 11 ou 12.

14. Espectrômetro de massa caracterizado por ser configurado para a análise quantitativa de um blumenol, de acordo com a reivindicação 2.

15. Anticorpo caracterizado por ser específico para um blumenol, de acordo com a reivindicação 2.

16. Kit caracterizado por compreender ou consistir em um, mais ou todos os seguintes: (a) uma ampola que contém um solvente adequado para extrair blumenol de uma parte aérea de uma planta, sendo que o dito solvente é preferencialmente metanol, etanol, isopropanol, acetonitrila, acetona, acetato de etila, clorofórmio, piridina, misturas dos mesmos, bem como misturas de um ou mais desses solventes com água; (b) o anticorpo, de acordo com a reivindicação 15;

(c) uma enzima que é ligada ao dito anticorpo ou a um anticorpo secundário direcionado contra o anticorpo, de acordo com a reivindicação 15 (d) um substrato da dita enzima (e) o espectrômetro de massa, de acordo com a reivindicação 14; e/ou (f) um manual para realizar o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15.