CN1465227A - 色赤杨联合共生体的构建方法 - Google Patents
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Abstract
色赤杨联合共生体的构建方法，本发明以分离于色赤杨林下的Glomus属VA菌根真菌与外生菌根劣味乳菇菌或黑菇和宿主植物为色赤杨的弗兰克氏放线菌共同接种于色赤杨形成色赤杨联合共生体；选用菌种中VA菌根菌为：Glomus intraradices根内球囊霉和/或Glomus mosseae摩西球囊霉；外生菌根菌为Lactaria insulsus劣味乳菇和/或Russulaadusta黑菇；固氮菌为弗兰克氏放线菌：At4和/或Ahp1；最佳菌种组合为Glomus intraradices根内球囊霉，Lactaria insulsus劣味乳菇，弗兰克氏放线菌At4。本发明为生物耐贫瘠环境提供有效对策，增加了其对不良环境的适应能力；通过纯培养验证了色赤杨优良性状的发挥优劣与其同时受菌根侵染和结瘤有关，以联合共生生态效应为主干，创建出构建色赤杨联合共生体优化组合的应用技术。
Description
技术领域
本发明涉及非豆科固氮树木联合共生体，具体地说是色赤杨联合共生体的构建方法。
背景技术
氮素是组成蛋白质的主要元素，是植物生长所必需的大量营养元素。空气中虽含有近80％的氮气，但并不能被高等植物直接吸收利用，人工合成氮素化肥的能源耗费巨大，不合理的过量施用带来的环境污染问题也日趋严重，人们逐渐认识到农林业生产完全依赖化肥终非良策，因此生物固氮的研究倍受关注。在贫瘠的土壤中生物固氮的最经常的限制因素是磷元素，这是因为磷元素在参与生物界的物质循环中，只有在无机磷和有机磷之间的转化，而不发生氧化还原反应，而且磷元素在无人为活动参与的情况下总是单向流动的，生物体中的有机磷经分解后形成不溶性无机磷酸盐在土壤中沉积，在被河流带入海洋，不参与陆地上的磷循环。而与植物共生的菌根真菌可以通过根外菌丝的形成，增加植物与土壤的接触点，扩大吸收面积，缩短磷的扩散距离(文献1：Hattingh，M.J.，Gray，L.E.，Gerdemsnn，J.W.1973.Uptakeand translocation of 32 P-labelled phosphate to onion roots by endomycorrhizal fungi，Soil Sci.54：56～63；文献2：Nye P.H，Tinker，P.B.1977.Solute movement in thesoil-root system，Oxford：Blackwell Scientific Publications.；文献3：Rhode，L.H andJ.W.Gerdemann.1978.Translocation of calcium and phosphate by external hyphae ofVesicular-arbuscular mycorrhizae，Soil Sci.126：125～126)，从而提高宿主对磷素的吸收，改善植物营养状况，促进植物生长(文献4：Raju，P.S.，Clark，R.B.，Ellis，J.R..et al，1990.Effects of species of VAM fungi on growth and mineraluptake of sorghum at different temperatures，Plant Soil.121：165～170；文献5：Sieverding，E.T，1983.Influence of Soil moistre regime on VA-mycorrhiza.H.H.Effects of soil temperature and water regime on growth，nutrient uptake and waterutilization of Eupatorium odoratum L.Z.Acker and Pflanzenbau.152：56～57)。菌根真菌与植物形成的共生体菌根还可分泌生长素、抗生素及一些酶提高植物的抗逆性，使菌根植物在贫瘠土壤中生存。
由于Frankia具有对宿主的侵染范围宽，固氮活性比较强和对氧气不敏感等特性，在生物固氮研究中对Frankia菌的研究将更为重要；而且非豆科固氮植物几乎全部为木本，这些树种有很强的抗逆性，分布广、适应性强，因而在森林经营中应用这类植物的生物潜力是相当大的，非豆科树木共生固氮体系抗逆性强，具有耐干旱、耐盐碱、耐低PH、耐水湿等特点，且分布广，资源丰富，因此开展Frankia-非豆科树木联合共生体系的理论与应用研究，不仅对丰富和发展联合共生理论具有重要意义，而且在加速树木生长，解决农村资源短缺，减少水土流失，改良土壤和改善生态环境等方面将产生重大的经济和生态环境效益。
非豆科固氮树种-色赤杨，是桤木属的一个种，又称辽东桤木，它广泛分布于东北三省及山东等省份，可生长于海拔200-1500米的山坡林中，它具有生长快、耐瘠薄、萌蘖性强、更新快等特点，是三北地区重要垦荒先锋树种；而且它耐火性较强，是优良的防火树种，具有较高的应用价值。
已有研究表明联合共生体中菌根菌与共生固氮菌之间存在着相互促进作用，尤其是菌根菌对固氮菌的固氮作用具有明显的增效作用，菌根的存在促进了宿主植物的生长，改善了植物根际的微生态环境；但是这类研究基本上是限于VA菌之间或外生菌之间，并且多停留在现象的描述上，并未在纯培养条件下进行，就将其归功于双接种的增效作用，这种盲目性的结论必然导致不能最好地利用固氮植物资源和菌根技术，发挥固氮植物与微生物共生的优势作用效果不够理想，对脆弱地带的生态恢复效果欠佳；并且不同的固氮树种需要适宜的不同的菌根菌、不同的固氮菌，它们不同的组合其增效作用明显不同，那么选择出不同宿主树木适宜的不同菌根菌与共生固氮菌显得尤为重要；因为共生是一种双向选择过程，它们需要彼此相互适应，如果彼此间不能相互协调，反而会抑制植物生长。
发明内容
本发明的目的在于提供一种相互协调的适宜的菌根菌、共生固氮菌与色赤杨联合共生体的构建方法。
为实现上述目的本发明所采用的技术方案为：联合共生体的构建方法，将菌根菌、固氮菌与共生固氮植物相结合，以共生固氮为核心，将纯培养条件下的观察测试与放大规模的田间模拟相结合，针对不同的固氮植物选取相应的菌种进行联合接种，以增强宿主植物与微生物间的亲合力；具体操作过程如下：
(1)共生菌种的选取：
a.在选定固氮树种色赤杨分布的贫瘠山区，随机选取至少3处不同地块的树龄在5年以上的树种根系样品进行外部形态观测和形态解剖学观察，确定其VA菌根菌和/或外生菌根菌的感染情况；
VA菌根菌为：Glomus intraradices根内球囊霉，Glomus macrocarpum大果球囊霉，Glomus mosseae摩西球囊霉，Glomus tortuosum扭形球囊霉，Gigaspora gigantea大巨孢囊霉，Gigaspora gregaria集生巨囊霉，Acaulosporascrobilata无梗囊霉；
外生菌根菌为Lactaria insulsus劣味乳菇，Hebeloma masophaeum毛边滑锈伞，Russula adusta黑菇，Hymenogaster alnicola赤杨须腹菌，Lactariusobscultatus暗色乳菇；；
b.依据菌根感染强度和固氮结瘤量，确定共生菌与色赤杨树种的亲合力，选定该树种根际中的发育状态较优的菌种类型，并在每一不同地块多点取样，于其根际中分离出VA菌根菌和/或外生菌根菌，弗兰克氏放线菌，进行菌种扩繁培养；
弗兰克氏放线菌：At4，Ahp1，Ahp3；
c.在纯培养条件下，将分离培养好的菌种单接和组合搭配接种，确定共生体形成效应的回接试验，进一步对上述发育状态较优的菌种类型进行验证，确定优势菌种和优势菌种组合；
(2)共生体构建：
用上述所选优势菌种组合对相同固氮树种色赤杨进行联合接种，构建成联合共生体，优势菌种组合为VA菌根菌、外生菌根菌及分离于固氮树种根际中的固氮菌。
本发明以分离于色赤杨林下的Glomus属VA菌根真菌与外生菌根劣味乳菇菌和宿主植物为色赤杨的弗兰克氏放线菌共同接种于色赤杨形成色赤杨联合共生体。
其中所述劣味乳菇可用黑菇代替。
本发明选取优势菌种中VA菌根菌为：Glomus intraradices根内球囊霉和/或Glomus mosseae摩西球囊霉；外生菌根菌为Lactaria insulsus劣味乳菇和/或Russula adusta黑菇；固氮菌为弗兰克氏放线菌：At4和/或Ahp1。
本发明选取优势菌种组合为Glomus intraradices根内球囊霉，Lactariainsulsus劣味乳菇，弗兰克氏放线菌At4。
本发明具有如下优点：
1.本发明接种VA菌根菌、外生菌根菌及分离于色赤杨根际中的固氮菌形成的色赤杨联合共生体效果优于双接种和单接种，以此为理论依据能更好地应用于造林生产实践，又能发挥它们之间的促生优势；非豆科固氮树木色赤杨有很强的抗逆性，而且在其感染VA菌和外生菌菌根后可极大限度地提高宿主的抗贫瘠、抗重金属毒害、抗极端湿度温度、抗极端PH值等能力；在森林经营中发挥色赤杨的生物潜力意义巨大。
2.本发明接种VA菌根菌、外生菌根菌及分离于色赤杨根际中的固氮菌形成的色赤杨联合共生体增强宿主植物色赤杨的适应性，能够较好地应用于今后的造林引种、育种、逆境条件下的造林与复垦；同时在促进植物生长，植物病虫害的防治等方面都有很好的应用前景；能更好地恢复和重建农林生态系统，发挥色赤杨的共生优势。
3.本发明丰富和发展联合共生理论，在森林生态系统中有较大的应用潜力，在加速树木生长，解决农村资源短缺(即木料、燃料、肥料等)，减少水土流失，改良土壤和改善生态环境等方面将产生重大的经济和生态环境效益。
4.本发明为生物适应贫瘠环境提供有效对策，增加其对不良环境的适应能力；本发明通过纯培养验证了色赤杨优良性状的发挥优劣与其同时受菌根侵染和结瘤有关，以联合共生生态效应为主干，创建出构建色赤杨联合共生体优化组合的应用技术。
具体实施方式
联合共生体的构建方法，将菌根菌、固氮菌与共生固氮植物相结合，以共生固氮为核心，将纯培养条件下的观察测试与放大规模的田间模拟相结合，针对不同的固氮植物选取相应的菌种进行混合接种，以增强宿主植物与微生物间的亲合力；
一.具体操作过程如下：
共生菌种的选取：在选定固氮树种分布的贫瘠山区，随机选取3处不同地块的树龄在5年以上的树种根系样品进行外部形态观测和形态解剖学观察，确定其VA菌根菌和/或外生菌根菌的感染情况；依据菌根感染强度和固氮结瘤量，确定共生菌与该树种的亲合力，选定该树种根际中的发育状态较优的菌种类型，并在每一不同地块多点取样，于其根际中分离出VA菌根菌和/或外生菌根菌，根瘤菌或弗兰克氏放线固氮菌，进行菌种扩繁培养；在纯培养条件下，将分离培养好的菌种单接和组合搭配接种，确定共生体形成效应的回接试验，进一步对上述发育状态较优的菌种类型进行验证，确定优势菌种和优势菌种组合；
(一)材料与方法
1.供试菌株
(1)VA菌根真菌：采用VA菌根真菌的孢子为接种菌剂。内生孢子分离于色赤杨林下根际土壤中(土深约10厘米)，主要为Glomus属，以三叶草为宿主植物进行盆载扩繁备用。
(2)外生菌根真菌：选用三种外生菌根真菌91#(E1)、94#(E2)、10#(E3)。
表1.
| 代号Strain | 菌种fungi | 菌种来源Geographical origin |
| 91# | 毛边华锈伞Hebeloma mesophaseum | 针叶林下 |
| 94# | 劣味乳菇Lactarius insulsus | 针阔混交林下 |
| 10# | 黑菇Russula adusta | 阔叶林下 |
(3)弗兰克氏放线菌：选用的三种弗兰克氏放线菌菌株：N1(At4)、N2(Ahp1)、N3(Ahp3)。
表2.
| 菌种代号 | 寄主植物Host plant | 来源Geographical origin |
| At4 | 色赤杨Alnus.tinctoria | 中国辽宁 |
| Ahp1 | 毛赤杨A.hirsute | 中国长白山 |
| Ahp3 | 毛赤杨A.hirsute | 中国长白山 |
(二)试验方法
1.色赤杨种子的处理
当年采集的色赤杨种(低温保存)，在清水中浸泡24小时，滤去漂浮在水面上的不成熟种子，用0.15％HgCl溶液消毒一分钟，再用无菌水反复冲洗干净。将种子均匀铺在湿润的沙布上，放入培养皿中，盖严。移入恒温箱(28℃)内催芽一周左右，待种子萌芽后进行播种。
2.基质配置及用量：
培养基质为珍珠岩、泥碳分别过2mm筛，珍珠岩取筛上大粒，泥碳取下面粒性均一的碎屑，珍珠岩：泥碳为按7∶1的质量比用M.M.N营养液拌料，基质与营养液固液比为1∶2.8，将上述拌好的基质用塑料布蒙2小时，待水分充分渗透后，将基质装入500毫升三角瓶，每瓶装400毫升，高压灭菌1.5小时。
3.接种过程
(1)接入外生菌根真菌：
采用固体菌剂，培养基质为麸皮和木屑(1∶4)；称取适量外生菌根真菌固体菌剂，均匀地铺开在基质表面，然后在覆盖2厘米厚的基质。
(2)接入VA菌根菌：
先将湿筛倾析法分离的内生孢子在消毒液中消毒，用无菌水清洗干净后转移到无菌的滤纸片(3厘米*3厘米)将孢子连同滤纸片一同接入基质内以保证孢子的集中分布，再覆盖2厘米基质。
(3)播种
挑选萌芽整齐生长良好的种子播入接菌的基质中，然后覆盖2厘米基质，于大三口瓶口盖上口径5厘米的塑料小杯，置于培养室中暗光室温条件培养，三至五天后小苗萌发，给予人工光照。
(4)接入弗兰克氏菌
弗兰克氏菌在BAP培养液28℃下摇瓶培养，繁殖足够的菌体，将菌体用无菌水离心洗涤(1000r/m，5-10min)，无菌匀浆后稀释制成菌悬液作为接种菌剂，每100株菌苗接种离心后菌体1毫升，小苗长出两片子叶后接入放线菌；接种时先将离心后菌体匀浆稀释，在小苗根部钻孔，将菌液接入小孔中以保证菌液分布在色赤杨小苗的根际，接种后用基质覆盖小孔。
其中以不接任何菌种的植株作为对照组→CK，其它生长条件与接菌组相同。
接菌组合见表3.
表3.
| 单接菌 | 单接VA菌根真菌 | I | ||
| 单接外生菌根真菌 | E1 | E2 | E3 | |
| 单接弗兰克氏菌 | N1 | N2 | N3 | |
| 双接菌 | 双接VA菌根真菌和外生菌根真菌 | IN1 | IN2 | IN3 |
| 双接VA菌根真菌和弗兰克氏菌 | IE1 | IE2 | IE3 | |
| 双接外生菌根真菌和弗兰克氏菌 | E1N1 | E1N2 | E1N3 | |
| E2N1 | E2N2 | E2N3 | ||
| E3N1 | E3N2 | E3N3 | ||
| 联合接菌 | 联合接种VA菌根真菌、外生菌根真菌和弗兰克氏菌 | IE1N1 | IE1N2 | IE1N3 |
| IE2N1 | IE2N2 | IE2N3 | ||
| IE3N1 | IE3N2 | IE3N3 |
两个月后将小苗置于自然光下，辅以人工光照，每月浇20-30毫升无菌水每瓶，在小苗长至瓶口时打开杯盖。
(5)培养6个月后进行数据调查；测试指标包括：株高、地径、生物量、主根长、侧根数、菌根侵染率和结瘤量等；其中菌根侵染率采用染色法计数统计(Philips & Hayman，1970)，根部菌根特征采用压片法进行显微观察。
(三)结果与分析
1.色赤杨联合共生的确认(在纯培养条件下，较单纯的根际环境，这种确认是确凿可信的)
(1)VA菌根真菌侵染的确认
通过染色的方法，植物被侵染后在根表面和根际周围可观察到的结构有：内生菌丝、孢子及孢子果；在根皮层组织中可观察到的结构有：泡囊、丛枝和内生菌丝。
本实验在接菌植株根际培养基质中筛出了VA菌根真菌孢子，证实侵染成功；采集色赤杨小根根样，将其染色后进行压片，在显微镜下进行镜检，在根皮细胞中发现大量着色的泡囊及内生菌丝，泡囊在皮层薄壁细胞内或在细胞间由菌丝体顶端膨大而形成，其形态为长椭圆形，观察结果确认在纯培养条件下色赤杨被VA菌根真菌侵染。
(2)外生菌根真菌侵染的确认
本实验中接种外生菌根真菌的植株根系均表现出根毛的退化，根的分枝明显多于不接菌植株，菌根外形为短的分枝侧根，呈树枝状，末端弯曲膨大，三种外生菌根真菌形成的菌丝在外形上无明显差异，颜色为褐黄色或深褐色；在显微镜下可以观察到缠绕在根外的无色菌丝，菌丝套较薄，类似絮状，取新鲜根样压片染色后镜检可观察到期根外皮层组织间由于菌丝的侵染而间隙增宽；通过以上形态学和解剖学观察可以确认外生菌根真菌在纯培养条件下成功侵染了色赤杨幼苗并形成菌根。
(3)弗兰克氏菌侵染的确认
接种弗兰克氏的色赤杨能够结瘤，其根瘤聚集成球状，观察结果证明色赤杨能够与弗兰克氏放线菌形成共生体进行结瘤固氮作用。
2.菌根对宿主植物养分吸收起重要作用，它能够促进植物对氮、磷、硫、锌和其它一些元素的摄取，同时消耗过剩糖类，维持健全的生理状态，从而促进宿主植物的生长。
表4.
| 接菌 | 宿主植物生长情况 | 菌根菌发育状况 | 结瘤量g | ||||
| 株高cm | 地径cm | 鲜重g | 主根长cm | 侧根数(条) | 侵染率％ | ||
| I | 7.15 | 0.184 | 0.93 | 14.28 | 18.30 | 70 | |
| E1 | 6.40 | 0.145 | 0.80 | 10.90 | 16.00 | 67.5 | |
| E2 | 7.88 | 0.203 | 1.02 | 15.90 | 24.00 | 77.5 | |
| E3 | 7.10 | 0.168 | 0.86 | 9.87 | 18.00 | 68.3 | |
| IE1 | 8.00 | 0.208 | 1.06 | 22.00 | 16.80 | ||
| IE2 | 9.70 | 0.229 | 1.18 | 26.40 | 18.00 | ||
| IE3 | 7.87 | 0.206 | 1.02 | 21.00 | 15.97 | ||
| N1 | 7.83 | 0.204 | 0.95 | 13.03 | 22.50 | 0.004 | |
| N2 | 6.83 | 0.154 | 0.77 | 10.03 | 15.00 | 0.002 | |
| N3 | 6.25 | 0.157 | 0.85 | 10.63 | 19.50 | 0.003 | |
| IN1 | 9.23 | 0.284 | 12.5 | 18.60 | 26.30 | ||
| IN2 | 7.95 | 0.220 | 1.19 | 16.25 | 22.00 | ||
| IN3 | 8.80 | 0.210 | 1.28 | 16.48 | 23.00 | ||
| CK | 5.37 | 0.130 | 0.65 | 8.70 | 11.00 | 0 | 0 |
(1)VA菌根真菌对于色赤杨生长的作用，见表4
本实验在无菌条件下对色赤杨接种菌根真菌，无其它菌的干扰，VA菌侵染效果较好，植株表现较好的生长状况，是因为VA菌促进植株根系的分枝发育，帮助植物水份的吸收，提高植物在胁迫状态下的耐受性以及促进植物激素的产生，并能引起植物细胞尤其是根细胞膜透性根系分泌物和渗透物数量和质量的改变，从而促进宿主植物的生长。
(2)菌根真菌对于色赤杨生长的作用，见表4
本实验所选取的三种外生菌根真菌具有较广谱的宿主范围，但它们对宿主的促进作用效果不同；从各项生长指标综合分析来看E2：劣味乳菇(Lactarius insulsus)对色赤杨作用效果最好，E3：黑菇(Russula adusta)次之，E1：毛边华锈伞(Hebeloma mesophaseum)与其它两者相比作用效果最差。
(3)混合接种内、外生菌根菌对色赤杨生长的作用，见表4
本实验结果证实接种VA菌和外生菌根真菌以及单接菌根真菌的情况，可以看出，不同内、外生菌根菌对宿主植物的生长都有促进作用，但促生效果差异较大；三种菌种组合中以劣味乳菇与VA菌促生效果最好，其双接比单接效果各项指标都有所增长；IE1虽无IE2生长效果好，但比单接菌E1共生优势是比较明显的，IE3的增生效益不太明显，但也有一定的促进作用。
3.弗兰克氏放线菌对色赤杨生长的作用，见表4
本实验所选取三种弗兰克氏放线菌它们对宿主的促进作用效果不同；从各项生长指标综合分析来看N1对色赤杨作用效果最好，N2、N3次之；从反应固氮能力的指标结瘤量看N1效果最好；植物株高、地径和鲜重的增长与结瘤量的增加成正比，这充分证明了宿主植物色赤杨良好的生长状况与弗兰克氏放线菌的作用是紧密相关的。
4.菌根真菌和弗兰克氏菌的联合增效作用，见表4
双接VA菌根真菌、弗兰克氏放线菌对色赤杨生长的作用本实验结果证实接种VA菌和弗兰克氏放线菌的情况，可以看出，不同菌种组合对宿主植物的生长都有促进作用，但促生效果差异较大；三种菌种组合中以VA菌与N1促生效果最好，是较好的组合；另两种组合也有一定的促进作用，但效果稍差一些，但对植物的生长、根系的发育还是极有帮助的；与单接效果比，体现了较好的联合共生效益，各项生长指标都有较好的增长。
(1)双接外生菌根真菌、弗兰克氏放线菌对色赤杨生长的作用，见表5
表5.
| 接菌 | 株高cm | 地径cm | 鲜重g | 主根长cm | 侧根数(条) | 结瘤量g |
| E1N1 | 9.00 | 0.222 | 1.25 | 14.13 | 25.00 | 0.006 |
| E1N2 | 7.85 | 0.182 | 0.90 | 12.15 | 18.00 | 0.003 |
| E1N3 | 7.00 | 0.215 | 1.10 | 11.83 | 22.50 | 0.005 |
| E2N1 | 12.00 | 0.238 | 1.60 | 19.00 | 28.00 | 0.007 |
| E2N2 | 9.65 | 0.225 | 1.34 | 17.20 | 26.50 | 0.005 |
| E2N3 | 9.30 | 0.228 | 1.30 | 16.80 | 25.50 | 0.006 |
| E3N1 | 8.50 | 0.235 | 1.30 | 14.60 | 25.00 | 0.006 |
| E3N2 | 7.85 | 0.221 | 1.06 | 11.02 | 21.00 | 0.004 |
| E3N3 | 7.97 | 0.200 | 1.02 | 11.80 | 22.00 | 0.005 |
| CK | 8.50 | 0.235 | 1.30 | 14.60 | 25.00 | 0 |
我们的实验结果有力地证实了双接外生菌根真菌和弗兰克氏菌对宿主植物的生长起到了良好地促进作用，接种植株的生长状况均好于相对应的单接菌情形；其中同时接种E2和弗兰克氏菌的植株均表现出较好的长势，比其它对照组E2、E3都高，其中E2N1比其它双接菌的组合都好；N1和外生菌根菌也有较好的表现，比其它对照组N2、N3都高。
(2)同时接种VA菌根真菌、外生菌根真菌和弗兰克氏放线菌的增效作用，见表6
表6.
| 接菌 | 株高cm | 地径cm | 鲜重g | 主根长cm | 侧根数(条) | 结瘤量g |
| IE1N1 | 11.95 | 0.256 | 1.55 | 21.40 | 28.50 | 0.008 |
| IE1N2 | 8.57 | 0.230 | 1.43 | 17.60 | 23.00 | 0.005 |
| IE1N3 | 9.32 | 0.227 | 1.40 | 17.04 | 24.00 | 0.007 |
| IE2N1 | 13.67 | 0.270 | 1.87 | 23.00 | 31.00 | 0.012 |
| IE2N2 | 12.33 | 0.255 | 1.54 | 18.60 | 27.60 | 0.010 |
| IE2N3 | 10.20 | 0.247 | 1.44 | 18.80 | 26.80 | 0.009 |
| IE3N1 | 11.87 | 0.262 | 1.60 | 21.00 | 28.00 | 0.010 |
| IE3N2 | 8.60 | 0.250 | 1.38 | 18.00 | 25.60 | 0.008 |
| IE3N3 | 9.65 | 0.238 | 1.45 | 17.30 | 25.50 | 0.007 |
| CK | 5.37 | 0.130 | 0.65 | 8.70 | 11.00 | 0 |
菌根真菌和弗兰克氏菌都能促进宿主植物的生长，但其作用机理不同，菌根真菌促进宿主植物吸磷，促进宿主植物根系的生长，弗兰克氏菌能促进宿主植物吸氮，促进宿主植物地上部分的生长。同时接种VA菌根真菌、外生菌根真菌和弗兰克氏放线菌的色赤杨，生长指标明显高出对照，且增长率都比单接和双接都好，这充分证明促进作用是它们综合作用的结果；其中IE2N1是最好的组合，共生优势最为显著，体现出较好的生长结果。其它菌根真菌和弗兰克氏菌联合接种也都促进了宿主植物的生长。
(3)菌根菌与弗兰克氏菌的相互作用
实验证明它们间有相互促进作用，混合接菌不但提高了弗兰克氏菌的结瘤量，而且也同时促进了菌根菌的发育状况。其中尤其是外生菌根真菌对弗兰克氏菌的作用效果较为明显，见表7。
表7
| 接菌 | 主根长(cm) | 侧根数(条) | 侵染率(％) | 结瘤量(g) |
| I | 14.28 | 18.30 | 70.0 | |
| E1 | 10.90 | 17.00 | 70.0 | |
| E2 | 15.90 | 20.00 | 77.5 | |
| E3 | 9.87 | 18.00 | 68.3 |
| N1 | 13.03 | 16.50 | 0.004 | |
| N2 | 10.03 | 15.00 | 0.002 | |
| N3 | 10.63 | 19.50 | 0.001 | |
| IN1 | 18.60 | 26.30 | 80.0 | 0.006 |
| IN2 | 16.25 | 22.00 | 75.0 | 0.004 |
| IN3 | 16.48 | 23.00 | 72.0 | 0.002 |
| IE1 | 16.80 | 22.00 | 75.0 | |
| IE2 | 18.00 | 26.40 | 85.0 | |
| IE3 | 15.97 | 21.00 | 73.0 | |
| E1N1 | 14.13 | 25.00 | 82.30 | 0.006 |
| E1N2 | 12.15 | 18.00 | 85.00 | 0.003 |
| E1N3 | 11.83 | 22.50 | 80.00 | 0.003 |
| E2N1 | 19.00 | 28.00 | 89.50 | 0.007 |
| E2N2 | 17.20 | 26.50 | 86.70 | 0.005 |
| E2N3 | 16.80 | 25.50 | 87.50 | 0.004 |
| E3N1 | 14.60 | 25.00 | 81.25 | 0.005 |
| E3N2 | 11.02 | 21.00 | 77.67 | 0.004 |
| E3N3 | 11.80 | 22.00 | 76.67 | 0.002 |
| IE1N1 | 21.40 | 28.50 | 87.50 | 0.008 |
| IE1N2 | 17.60 | 23.00 | 89.30 | 0.005 |
| IE1N3 | 17.04 | 24.00 | 88.33 | 0.005 |
| IE2N1 | 23.00 | 31.00 | 97.00 | 0.010 |
| IE2N2 | 18.60 | 27.60 | 92.00 | 0.006 |
| IE2N3 | 17.80 | 26.80 | 95.00 | 0.005 |
| IE3N1 | 21.00 | 28.00 | 86.67 | 0.007 |
| IE3N2 | 18.00 | 25.60 | 85.00 | 0.006 |
| IE3N3 | 17.30 | 25.50 | 82.50 | 0.004 |
菌根真菌对弗兰克氏菌的作用：
菌根真菌对色赤杨结瘤固氮能力的促进作用，同时接种菌根真菌和弗兰克氏菌后，植株的结瘤量比只单接弗兰克氏菌的植株分别都有所增加，综上所述数据可看出，外生菌根真菌E2与不同弗兰克氏菌组合后对其结瘤能力的促进程度比其它真菌都要好，它与VA菌联合对N1的作用最好，对E2较优良的菌种，能较好促进色赤杨的生长，宿主植物良好的生长状况为弗兰克氏菌的生长提供了较好的营生条件，而且菌根菌可以促进分泌磷酸酶等促进植物对磷元素的吸收，充足的磷素供给也是弗兰克氏菌良好的结瘤作用的基础，因此E2对弗兰克氏菌结瘤能力的促进作用也是其菌种的优良特性的表现。
弗兰克氏菌对菌根真菌的作用：
弗兰克氏菌不仅能通过改善宿主植物的生长状况来间接影响菌根菌，还可通过根系分泌物来改变根际的微生态环境从而影响菌根的发育；实验表明弗兰克氏菌提高了菌根菌的侵染率，随着菌根菌侵染率的提高，植株根系的发育也明显改善，同时接种外生菌与弗兰克氏菌的植株主根长和侧根数均比相应的单接种菌根真菌的植株高，但不同的弗兰克氏对菌根真菌的作用不同。
再将双接VA菌根真菌和外生菌根真菌的植株与同时接种VA菌根真菌、外生菌根真菌和弗兰克氏菌的植株相比，三种弗兰克氏菌中，N1对菌根的促进作用最好，这再一次表明，优良菌种在联合共生体系中对共生效益的提高具有重要意义。
二.色赤杨联合共生的盆栽实验
盆栽是半开放的，相对于纯培养条件来说，接近自然条件，因此它是纯培养的进一步扩展，能为更大面积的应用联合共生技术植树造林提供基础，并形成一套可行的人工接种方法。
用上述所选优势菌种组合对相同固氮树种进行混合接种，构建成联合共生体，优势菌种组合为VA菌根菌、外生菌根菌及分离于非豆科固氮树种根际中的固氮菌。
(一)材料与方法
1.供试土壤来自树木园林内40厘米以下的生土，过筛，在阳光下晒二天，加干燥灭菌的河沙，沙土比为2∶1，混匀后装入直径为15厘米的泥盆中，每盆2公斤；
土壤理化性质，见表8。
表8.
| 有机质含量(％) | 速效有机质(mg/kg) | PH | ||||
| N | P2O5 | K2O | N | P | K | 6.66 |
| 0.119 | 0.290 | 2.608 | 87.08 | 60.74 | 129.98 | |
2.菌剂的制备
(1)VA菌根菌菌剂：在中国科学院应用生态所的树木园的色赤杨树下采集土样(土深10厘米)，通过湿筛倾析法获得内生菌根真菌的孢子，主要为Glomus属；于温室内以三叶草为宿主植物进行盆栽扩繁，基质为河沙与土壤2∶1(重量比)混合物，其中河沙160℃干燥2小时，土壤高压蒸气灭菌1小时，施入底肥过磷酸钙0.5％、磷酸二氢钾0.5％，先向盆中装好基质，浇透水后放入载有孢子的滤纸片，其上覆盖1～2厘米的土，浇水播种三叶草种子，再覆土1～2厘米；
以富含孢子的扩繁土和被侵染的三叶草根段的混合物为菌剂，每盆接种60克。
(2)外生菌根真菌菌剂
将三种真菌E1、E2、E3采用斜面培养液体固体培养成三级扩大培养方法制备固体菌剂：
将菌种接种在斜面培养基(PDMA)上28℃培养10天；取斜面菌切小块，接种在盛100毫升培养基的500毫升三角瓶中28℃振荡培养15天；将杂木屑70％，麸皮30％按比例配好拌匀，用M.M.N.营养液拌料，制成固体培养基，装料到罐头瓶中，封口，1气压下1小时灭菌，每瓶接种15-20毫升种子液，置25～28℃遮光培养30天；
以长满菌丝体的固体培养基为外生菌根真菌菌剂，每盆接种30克；对照接入等量灭菌的基质。
(3)弗兰克氏放线菌
选取用三种菌株N1、N2、N3在BAP培养液28℃摇瓶培养，繁殖菌体离心(1000r/m，5-10min)匀浆稀释制成菌悬液作为菌剂，每100株菌苗接种离心菌体1毫升。
3.实验方法
(1)色赤杨种子处理：播种前先将种子在冰箱中低温处理，挑选取饱满种子灭菌恒温催芽。
(2)接种过程
接入外生菌根真菌：将固体菌剂均匀铺在土壤表面，然后再覆2厘米土壤；接入VA菌根菌；播种：挑选萌芽整齐生长良好的种子播入接菌土中，覆2厘米土壤，浇足水分，室温，每盆保5株苗；接入弗兰克氏菌：小苗长出一周后，在小苗根部钻孔，用吸液管将菌液滴入小孔，接种后用土壤覆盖小孔；N15示踪：小苗定植后土壤中施入N15标记的硫酸二氨，按2g/m2的量施入。每二个月浇营养液一次，其组成为硝酸钙10％、磷酸二氢钾2.5％、7水硫酸镁2.5％、氯化钾1.25％和氯化铁0.125％、余量水。
4.生长指标和生理指标的测定
6个月后进行各项指标测试，其中叶绿素含量采用ANON法进行测量；净光和效率采用CL-301P光合测定仪进行测定；菌根侵染率采用压片染色法进行计数统计；含氮量、N15含于中国农业科学院原子能所质谱室测定，分析仪器为菲尼根MAT-251超精度气体同位素质谱仪；
(二)结果与分析
1.联合共生的确认：
(1)VA菌根真菌的确认：在接种VA菌的植株根系剪取幼根，剪成1厘米长的片段在10％氢氧化钾液中浸泡，90℃水浴1～1.5小时后，放入双氧水中浸泡20～30分钟，洗净1％盐酸酸化，加入乳酸酚棉兰染色液90℃水浴30～45分钟，将已染色的根段用乳酸甘油浸泡脱色，根段中多余的染料清除，而VA菌根菌的各种结构则可保持染色状态，将脱色后的根段在载玻片上轻轻压碎，在显微镜下观察，在根皮层细胞间可以看到被染成兰色的菌丝体和大量与菌丝相连的泡囊；另外在根际土壤中通过湿筛倾析蔗糖离心法获得大量孢子和孢子果，可确认侵染成功。
(2)外生菌根真菌的确认：与对照相比，接种外生菌根真菌的植株根系发达，分枝密集，，根毛退化，小根增长受到抑制，侧根末梢末端稍弯曲膨大；菌根为珊瑚状，偶有二叉分枝，三种外生菌根真菌侵染形成的菌根在外形上无明显差异，颜色为褐黄色或深褐色；通过切片观察，可发现色赤杨根细胞外皮层细胞间隙由于菌丝的生长而加宽，充分证实色赤杨能形成外生菌根。
(3)弗兰克氏菌侵染的确认
接种弗兰克氏菌的植株根系生长比较粗壮，侧根数有所增加，并能形成根瘤，根瘤为淡棕色，近球形，证实弗兰克氏菌侵染了色赤杨根系。
2.单接菌对色赤杨生长的促进作用
(1)VA菌根菌对色赤杨生长的促进作用：(见表9)侵染后其外生菌丝能刺激土壤细菌的生长繁殖，增加磷酸酶分泌量，同时，VA菌丝也具有碱性和酸性磷酸酶脂并可分泌到根际，可提高根系表面酸性磷酸脂酶的活性，增加了植物对土壤有机磷的利用，从而改善植物的生长状况，促进生长发育，其作用大小应看植物对VA菌的依赖性大小；本实验中对照组自然侵染率为15％，人工接种为70％，其根系发育比对照组好，各项生理指标也比对照组有明显提高，证实了其促进作用。
表9.
| 接菌 | 色赤杨生物量指标 | 色赤杨生理指标 | 菌根发育状况 | |||||
| 株高(cm) | 地径(cm) | 鲜重(g) | 叶绿素含量(mg/g) | 净光和效率(mg CO2·dm-2.h-1) | 主根长(cm) | 侧根数(个) | 侵染率(％) | |
| I | 5.02 | 0.219 | 1.002 | 1.012 | 2.862 | 16.0 | 15.0 | 70 |
| E1 | 6.51 | 0.271 | 1.280 | 1.194 | 4.354 | 18.6 | 20.2 | 75.5 |
| E2 | 7.43 | 0.275 | 14.00 | 12.15 | 4.560 | 21.4 | 23.0 | 80.5 |
| E3 | 7.00 | 0.248 | 1.098 | 1.046 | 3.726 | 15.2 | 17.0 | 70.0 |
| E1E2E3 | 8.6 | 0.269 | 2.006 | 1.432 | 4.766 | 18.6 | 25.0 | 87.0 |
| N1 | 5.71 | 0.215 | 1.225 | 1.169 | 3.787 | 17.1 | 15.5 | 3.0 |
| N2 | 5.01 | 0.208 | 0.956 | 1.079 | 3.500 | 16.4 | 14.0 | 2.5 |
| N3 | 4.89 | 0.198 | 1.066 | 0.993 | 3.260 | 14.5 | 12.5 | 1.0 |
| CK | 4.5 | 0.180 | 0.808 | 0.782 | 2.363 | 13.1 | 9.4 | 10-或35 |
(2)外生菌根菌对色赤杨生长的促进作用：(见表9)其受影响因素较多，从实验中接外生菌根真菌植株均表现了很好的长势，植株粗壮，根系发达，比对照组都有所提高，其中E2的促生效果最好，侵染率也最高，这也说明接菌植株的良好长势与外生菌根菌的侵染密切相关。菌根真菌与植物之间生长互有选择性，从为项指标来看三种菌种混合接种也是较好的组合，它们可将不同的根系植物联成一体。
(3).接种弗兰克菌对色赤杨生长的促进作用：(见表9)从表中可以看出，弗兰克氏菌不仅增加植株地上部分的生物量，对植株的根系生长情况也有促进作用。其中N1的促生效果最好。
从上几种单接菌的促进作用可看出，菌根菌好于弗兰克氏菌，除实验条件和实验时间有一定影响外，可能是色赤杨对菌根菌的依赖性大于弗兰克氏菌。
3.联合接菌对色赤杨生长的增效作用作用
(1).双接VA菌根菌和外生菌根菌对色赤杨生长的促进作用：(见表10)
表10.
| 接菌 | 色赤杨生物量指标 | 色赤杨生理指标 | 菌根发育状况 | |||||
| 株高(cm) | 地径(cm) | 鲜重(g) | 叶绿素含量(mg/g) | 净光和效率(mg CO2·dm-2.h-1) | 主根长(cm) | 侧根数(个) | 侵染率(％) | |
| IE1 | 7.88 | 0.228 | 1.135 | 1.193 | 3.421 | 20.20 | 24.6 | 80.0 |
| IE2 | 8.30 | 0.300 | 1.650 | 1.541 | 5.280 | 25.60 | 28.5 | 85.0 |
| IE3 | 7.58 | 0.219 | 1.095 | 1.219 | 3.486 | 19.79 | 19.0 | 90.0 |
| 平均值 | 7.92 | 0.249 | 1.293 | 1.318 | 4.062 | 21.86 | 24.0 | 85.0 |
| CK | 4.5 | 0.180 | 0.808 | 0.782 | 2.363 | 13.1 | 9.4 | 35 |
结果表明共同接种后菌根的侵染能力增强，各项指标的增长率均高于单接菌组，IE2与IE3效果相对较差，共生优势不太明显。
(2)双接弗兰克氏菌和外生菌根菌对色赤杨生长的促进作用：它们间效果较明显，因为它们之间能形成一个良性循环体，增效显著。
(3)双接VA菌根菌和弗兰克氏菌对色赤杨生长的促进作用：其中较好组合为IN1。
菌根真菌与弗兰克氏菌的相互作用：(见表11)
表11.
| 接菌 | 色赤杨生物量指标 | 色赤杨生理指标 | 菌根发育状况 | 结瘤数(个) | |||||
| 株高(cm) | 地径(cm) | 鲜重(g) | 叶绿素含量(mg/g) | 净光和效率(mgCO2·dm-2.h-1) | 主根长(cm) | 侧根数(个) | 侵染率(％) | ||
| IN1 | 6.40 | 0.226 | 1.398 | 1.322 | 4.766 | 18.57 | 23.7 | 85 | 3.5 |
| IN2 | 5.36 | 0.231 | 1.155 | 1.139 | 3.940 | 18.05 | 22.7 | 80 | 3.0 |
| IN3 | 5.30 | 0.201 | 1.198 | 1.240 | 4.294 | 20.00 | 20.5 | 82 | 2.0 |
| E1N1 | 7.52 | 0.304 | 1.650 | 1.364 | 5.081 | 21.50 | 22.0 | 88.0 | 3.2 |
| E1N2 | 7.08 | 0.285 | 1.580 | 1.254 | 4.539 | 22.80 | 25.6 | 80.0 | 3.5 |
| E1N3 | 6.78 | 0.250 | 1.500 | 1.241 | 4.028 | 21.00 | 23.6 | 85.4 | 3.6 |
| E2N1 | 8.79 | 0.294 | 1.957 | 1.595 | 5.379 | 22.90 | 26.5 | 88.2 | 4.0 |
| E2N2 | 7.80 | 0.289 | 1.657 | 1.391 | 4.554 | 22.50 | 22.6 | 85.0 | 3.8 |
| E2N3 | 8.40 | 0.280 | 1.622 | 1.226 | 4.366 | 22.50 | 24.5 | 84.0 | 3.0 |
| E3N1 | 7.70 | 0.290 | 1.486 | 1.220 | 5.089 | 20.10 | 22.8 | 80.6 | 3.6 |
| E3N2 | 8.25 | 0.255 | 1.567 | 1.463 | 5.241 | 20.30 | 20.5 | 83.4 | 3.2 |
| E3N3 | 8.08 | 0.268 | 1.372 | 1.324 | 4.858 | 18.50 | 18.0 | 78.0 | 2.8 |
| 平均 | 7.82 | 0.279 | 1.599 | 1.342 | 4.793 | 21.34 | 22.90 | 83.3 | 3.3 |
| IE1N1 | 10.6 | 0.320 | 1.784 | 1.422 | 5.643 | 22.50 | 28.0 | 94.4 | 4.0 |
| IE1N2 | 9.00 | 0.320 | 1.880 | 1.329 | 4.683 | 23.00 | 26.2 | 88.0 | 3.7 |
| IE1N3 | 8.67 | 0.300 | 1.607 | 1.268 | 4.544 | 25.00 | 23.6 | 90.0 | 4.2 |
| IE2N1 | 11.5 | 0.363 | 1.982 | 1.630 | 6.250 | 24.00 | 34.0 | 95.0 | 5.5 |
| IE2N2 | 9.80 | 0.300 | 1.885 | 1.444 | 5.246 | 23.50 | 28.0 | 92.0 | 4.0 |
| IE2N3 | 8.75 | 0.298 | 1.752 | 1.621 | 5.927 | 23.00 | 30.0 | 90.0 | 3.8 |
| IE3N1 | 9.20 | 0.287 | 1.792 | 1.575 | 6.157 | 23.67 | 27.3 | 84.0 | 4.0 |
| IE3N2 | 8.76 | 0.285 | 1.657 | 1.530 | 5.498 | 22.50 | 23.2 | 87.0 | 4.2 |
| IE3N3 | 8.59 | 0.281 | 1.563 | 1.357 | 4.980 | 21.73 | 21.9 | 85.0 | 3.5 |
| 平均 | 9.43 | 0.306 | 1.767 | 1.464 | 5.436 | 23.21 | 26.91 | 89.8 | 4.1 |
| CK | 4.5 | 0.180 | 0.808 | 0.782 | 2.363 | 13.1 | 9.4 | 35 | 0 |
综上所述，三接菌(即联合接种)比单接菌、双接菌的生长情况都好，是它们联合作用的结果；该结果与纯培养相同。
本实施例所用各类菌株都为非特异性的菌株体，而各菌株体所在的菌种于自然界普遍存在，分布较广，各菌种在微生物学杂志、生态学报、土壤学报、林业科学研究、应用生态学报上1989～2000年间发表的论文中均有提及和刊用，依据N.C.SCHEWCK and YVONNE PEREZ 1988.1Mannual for theidentification of VA mycorrizal fungi(second edition published)进行分类鉴定；色赤杨下的弗兰克氏放线菌分离于1982年，此后，先后在微生物学报、微生物学杂志、应用生态学报上1984～1994年间发表的论文中均有提及和刊用。
Claims (5)
1.色赤杨联合共生体的构建方法，其特征在于：以分离于色赤杨林下的Glomus属VA菌根真菌与外生菌根劣味乳菇菌和宿主植物为色赤杨的弗兰克氏放线菌共同接种于色赤杨形成色赤杨联合共生体。
2.根据权利要求1所述色赤杨联合共生体的构建方法，其特征在于：其中所述劣味乳菇可用黑菇代替。
3.根据权利要求1所述色赤杨联合共生体的构建方法，其特征在于：其中所述VA菌根真菌、外生菌根及弗兰克氏放线菌菌株的分离选取过程如下：
a.在选定色赤杨树种分布的贫瘠山区，随机选取至少3处不同地块的树龄在5年以上的树种根系样品进行外部形态观测和形态解剖学观察，确定其VA菌根菌和/或外生菌根菌的感染情况；
b.依据菌根感染强度和固氮结瘤量，确定共生菌与该树种的亲合力，选定色赤杨树种根际中的发育状态较优的菌种类型，并在每一不同地块多点取样，于其根际中分离出VA菌根菌和/或外生菌根菌，弗兰克氏放线菌，进行菌种扩繁培养；
c.在纯培养条件下，将分离培养好的菌种单接和组合搭配接种，确定共生体形成效应的回接试验，进一步对上述发育状态较优的菌种类型进行验证，确定优势菌种和优势菌种组合。
4.按照权利要求3所述固氮植物联合共生体的构建方法，其特征在于：所述优势菌种中VA菌根菌为：Glomus intraradices根内球囊霉和/或Glomusmosseae摩西球囊霉；外生菌根菌为Lactaria insulsus劣味乳菇和/或Russulaadusta黑菇；固氮菌为弗兰克氏放线菌：At4和/或Ahp1。
5.按照权利要求3所述固氮植物联合共生体的构建方法，其特征在于：优势菌种组合为Glomus intraradices根内球囊霉，Lactaria insulsus劣味乳菇，弗兰克氏放线菌At4。
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- 2002-06-21 CN CNA021324255A patent/CN1465227A/zh active Pending
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