CN116250478B - 一种促进羊肚菌果实化的培育方法 - Google Patents

一种促进羊肚菌果实化的培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种促进羊肚菌果实化的培育方法，属于食用菌栽培技术领域，包括以下步骤：(1)使用原生质体融合技术对羊肚菌进行种间杂交，得到杂交菌种；(2)将种植土壤进行表面火处理；(3)使用改良琼脂培养基对杂交菌种进行培养；(4)在表面火处理后的土壤上进行播种，子囊果盖网完全打开后采收，即得羊肚菌。使用原生质体融合技术完成羊肚菌的种间杂交，随后置于使用植物提取物改良的琼脂培养基进行培育。将种植土地使用松枝进行火处理后，再对羊肚菌进行种植，使用改良堆肥配方制作外源营养袋，促进羊肚菌的生长发育。具有生长速度快、出菇稳定的特点。

Description

一种促进羊肚菌果实化的培育方法
技术领域
本发明属于食用菌栽培技术领域，具体地，涉及一种促进羊肚菌果实化的培育方法。
背景技术
羊肚菌是一种广受推崇的烹饪美食，富含多种人体需要的氨基酸和有机，具补肾、壮阳、补脑、提神等功效。含抑制肿瘤的多糖，抗菌、抗病毒的活性成分，具有增强机体免疫力、抗疲劳、抗病毒、抑制肿瘤等作用。所含丰富的硒是人体红细胞谷胱甘肤过氧化酶的组成成分，可运输大量氧分子来抑制恶性肿瘤，使癌细胞失活。且含有色素、皂昔类、呲喃酮抗生素和黑色素形成抑制剂等成分，能有效地防治心脑血管疾病。
羊肚菌曾经是一种无法耕种的土壤腐养子囊菌蘑菇，现在可以在农田土壤中常规种植。但在户外的栽培过程中，羊肚菌种植第一阶段生长速度的巨大变化，受到真菌物种、分离株和培养条件等多方面的影响，使得羊肚菌户外种植产量低，出菇不稳定，加剧了羊肚菌价格高，菌种贵的现象。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进羊肚菌果实化的培育方法，通过使用原生质体融合技术完成羊肚菌的种间杂交，随后至于使用植物提取物改良的琼脂培养基进行培育。将种植土地使用松枝进行火处理后，再对羊肚菌进行种植，使用改良堆肥配方制作外源营养袋，促进羊肚菌的生长发育。具有生长速度快、出菇稳定的特点。
本发明要解决的技术问题：
本发明解决了羊肚菌户外种植产量低，出菇不稳定的问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种促进羊肚菌果实化的培育方法，包括以下步骤：
(1)使用原生质体融合技术对羊肚菌进行种间杂交，得到杂交菌种；
(2)将种植土壤进行表面火处理；
(3)使用改良琼脂培养基对杂交菌种进行培养；
(4)在表面火处理后的土壤上进行播种，铺设黑地膜，待菌丝出土后放置外源营养袋，待菌体出土后，保持空气湿度在85％-90％，土壤含水量在20％-23％，环境温度在10-15℃；
菌种果实化后，保持环境温度在5-20℃，二氧化碳含量在400-600ppm，当发育的子囊果长至2cm后，控制土壤含水量保持在18％-23％，空气湿度为85％-95％，子囊果盖网完全打开后采收，即得羊肚菌。
进一步地，杂交菌种由以下步骤制得：
在无菌操作台上，将M.importuna和M.sextelata羊肚菌使用75％乙醇溶液洗涤，随后取柄盖交界处组织，分别使用完全酵母提取物培养基(以下称CYM培养基)培养1天，并在4℃下保存；
分别将菌丝依次使用无菌蒸馏水和0.6mol/L甘露醇溶液洗涤3次后，加入酶解液中，以50rpm速率摇动，并在30℃下孵育3小时，随后过滤，使用0.6mol/L甘露醇溶液洗涤，将滤液在室温下以2000rpm速率离心，收集沉淀，即得M.importuna和M.sextelata羊肚菌原生质体；
将M.importuna羊肚菌原生质体在45℃下加热20分钟进行灭活处理；再将M.sextelata羊肚菌原生质体使用30w紫外线照射5分钟，照射距离30cm，得到灭活的M.importuna和M.sextelata羊肚菌原生质体；
向8.7mL CYM培养基中加入1.3mL 0.6mol/L甘露醇溶液，得到洗涤液，备用；
将灭活的M.importuna和M.sextelata羊肚菌原生质体加入含有0.05mol/LCaCl2的PEG溶液中，静置10分钟后，间隔5分钟依次加入0.5mL、1mL和2mL洗涤液洗涤，过滤后转移到新鲜的CYM斜面上进行培养1-2天，随后收集生长的菌丝放置在CYM板的中心，在25℃和黑暗条件下孵育14天，得到杂交菌种。
进一步地，所述酶解液由真菌溶壁酶和蜗牛酶在0.6mo l/L甘露醇溶液中混合制得，酶解液与菌丝的质量体积比为1g:5mL。
进一步地，所述PEG溶液为25％浓度的PEG-4000溶液。
进一步地，将种植土壤进行表面火处理的具体操作为：
选择一片矩形沙壤土作为种植土壤，使用干燥的松科树枝，均匀的覆盖在地面上，选择矩形的四角作为着火点进行点火，直至火焰自然熄灭，静置350天。
进一步地，干燥的松科树枝的覆盖密度为1-2.7kg/m2。
进一步地，所述改良琼脂培养基的配方为：
琼脂培养基20g/L、琼脂椰子水20g/L、琼脂植物提取物20g/L、琼脂乳糖20g/L。
进一步地，所述植物提取物由山毛榉木的水提取物、麦芽的无水丙酮提取物和石榴皮提取物以10：10：2-4的质量比混合得到。
进一步地，石榴皮提取物由以下步骤制得：
选用植物品种编号为20200304的“赤艳”石榴，使用去离子水洗涤后，晾干去皮；将果皮冷冻干燥后在-80℃下保存，将冻干的果皮在研钵中研磨成粉末，将4g粉末置于20mL蒸馏水中进行高压灭菌，随后在4000×g下离心15分钟，弃去沉淀，将上清液通过0.45μm滤膜进行过滤，冷冻干燥后即得石榴皮提取物。
进一步地，外源营养袋由以下步骤制得：
将成分为47.65％2cm长的小麦秸秆，47.65％的鸡粪，1.50％的菜籽粕，0.50％的尿素，0.80％的磷酸氢钙，1.00％的石灰，0.60％的石膏制成起始堆肥，0.15％硫酸镁和0.15％硫酸钾的堆肥原料在搅拌机中充分混合，随后填充至固体发酵罐中，每天翻转发酵罐，堆肥发酵30天，得到堆肥混合物；
将堆肥混合物装入曝气池中，在恒定通气条件下发酵12天，通风速率为10m3/分钟，随后在第二天将温度升至70℃，维持一周，然后自然下降到40℃，再使用挖掘机将堆肥混合物搅拌混合，并重新填充到充气池中，每小时曝气10分钟，温度再次升高到60℃，继续发酵18天，随后自然下降到30℃，将堆肥混合物干燥至水分含量低于10％，均质并过50目筛后装入袋中，即得外源营养袋。
本发明的有益效果：
(1)本发明技术方案中，通过原生质体融合的方法对M.importuna和M.sextelata羊肚菌进行种间杂交，其灭活的原生质体功能互补，具有各自的优势且没有明显缺点的融合，获得的杂交种在接种恢复时间、菌丝生长速率、培养产量和总氨基酸含量方面都有所改善，有利于促进羊肚菌种植产业的进一步商业化。
(2)本发明技术方案中，通过对种植土壤使用干松树枝进行火处理，火加速有机物分解，提供更多可用的氮、磷和钾，草木灰含有大量植物所需要的营养元素和微量元素，土壤养分条件得到改善，而且经过火烧之后的土壤也会变得疏松，变得比较透气，更加接近壤土；此外，羊肚菌在地下代谢活跃，地下菌丝体可能会迅速从陆地生态系统中捕获营养物质，积聚在地上的子囊果中，促进子囊果的发育过程，更快的果实化。
(3)本发明技术方案中，使用多种植物提取物改良的琼脂培养基对杂交菌种进行培养，可以增加菌种培育的速度，减少生长周期。山毛榉木的水提取物和麦芽提取物都具有促进羊肚菌菌丝产生的作用，石榴皮提取物中含有大量的酚类物质，对于大多数菌种都具有杀灭作用，但石榴皮提取物具有促进羊肚菌菌丝中漆酶活性的作用，在适宜的提取物浓度下，可以克服毒酚类物质的毒性还可以大幅增强菌丝漆酶的活性，以促进子囊果的形成。
(4)本发明技术方案中，对堆肥进行优化处理，提供了适宜的C和N营养物质阵列，驱动基质中微生物群落演替和营养代谢的模式，使得基质中的营养物质更好的被菌种转化和利用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
杂交菌种由以下步骤制得：
在无菌操作台上，将M.importuna和M.sextelata羊肚菌使用75％乙醇溶液洗涤，随后取柄盖交界处组织，分别使用完全酵母提取物培养基(CYM培养基)培养1天，并在4℃下保存；
将2g真菌溶壁酶和1g蜗牛酶置于100mL 0.6mol/L甘露醇溶液中，搅拌均匀，得到酶解液，在4℃下储存，备用；
分别将5g菌丝依次使用无菌蒸馏水和0.6mol/L甘露醇溶液洗涤3次后，加入25mL酶解液中，以50rpm速率摇动，并在30℃下孵育3小时，随后过滤，使用0.6mol/L甘露醇溶液洗涤，将滤液在室温下以2000rpm速率离心，收集沉淀，即得M.importuna和M.sextelata羊肚菌原生质体；
将M.importuna羊肚菌原生质体在45℃下加热20分钟进行灭活处理；再将M.sextelata羊肚菌原生质体使用30w紫外线照射5分钟，照射距离30cm，得到灭活的M.importuna和M.sextelata羊肚菌原生质体；
向8.7mL CYM培养基中加入1.3mL 0.6mol/L甘露醇溶液，得到洗涤液，备用；
将25gPEG-4000溶于100mL无菌蒸馏水中，搅拌15分钟，得到PEG溶液备用；
将灭活的M.importuna和M.sextelata羊肚菌原生质体加入含有0.05mol/LCaCl2的PEG溶液中，静置10分钟后，间隔5分钟依次加入0.5mL、1mL和2mL洗涤液洗涤，过滤后转移到新鲜的CYM斜面上进行培养1-2天，随后收集生长的菌丝放置在CYM板的中心，在25℃和黑暗条件下孵育14天，得到杂交菌种。
实施例2
一种促进羊肚菌果实化的培育方法，包括以下步骤：
选择一片面积为30m2矩形沙壤土作为种植土壤，使用30kg干燥的松科树枝，均匀的覆盖在地面上，选择矩形的四角作为着火点进行点火，直至火焰自然熄灭，静置350天。
将成分为47.65％2cm长的小麦秸秆，47.65％的鸡粪，1.50％的菜籽粕，0.50％的尿素，0.80％的磷酸氢钙，1.00％的石灰，0.60％的石膏制成起始堆肥，0.15％硫酸镁和0.15％硫酸钾的堆肥原料在搅拌机中充分混合，随后填充至固体发酵罐中，每天翻转发酵罐，堆肥发酵30天，得到堆肥混合物；
将堆肥混合物装入曝气池中，在恒定通气条件下发酵12天，通风速率为10m3/分钟，随后在第二天将温度升至70℃，维持一周，然后自然下降到40℃，再使用挖掘机将堆肥混合物搅拌混合，并重新填充到充气池中，每小时曝气10分钟，温度再次升高到60℃，继续发酵18天，随后自然下降到30℃，将堆肥混合物干燥至水分含量低于10％，均质并过50目筛后装入袋中，制得外源营养袋，备用。
选用植物品种编号为20200304的“赤艳”石榴，使用去离子水洗涤后，晾干去皮；将果皮冷冻干燥后在-80℃下保存，将冻干的果皮在研钵中研磨成粉末，将400g粉末置于2000mL蒸馏水中进行高压灭菌，随后在4000×g下离心15分钟，弃去沉淀，将上清液通过0.45μm滤膜进行过滤，冷冻干燥后即得石榴皮提取物。
将100mg山毛榉木的水提取物、100mg麦芽的无水丙酮提取物和20mg石榴皮提取物至于500mL琼脂中，以95℃的温度至融化，随后冷却至35℃，即得琼脂提取物；
将20g/L琼脂培养基、20g/L琼脂椰子水、20g/L琼脂植物提取物和20g/L琼脂乳糖溶解在无菌蒸馏水中，在121℃和15ps i的条件下下高压灭菌20分钟，即得改良琼脂培养基。
使用改良琼脂培养基对杂交菌种在5L发酵罐中进行培养，培养温度为28℃，培养时间为48小时。
杂交菌种培育48小时后，在表面火处理后的土壤上进行播种，铺设黑地膜，菌丝出土后放置外源营养袋，随后进行催菌，待菌体出土后，保持空气湿度在85％-90％，土壤含水量在20％-23％，环境温度在10-15℃；
菌种果实化后，保持环境温度在5-10℃，二氧化碳含量在400-450ppm，当发育的子囊果长至2cm后，控制土壤含水量保持在18％-23％，空气湿度为85％-95％，子囊果盖网完全打开后采收，即得羊肚菌。
实施例3
本实施例与实施例2的区别在于：
干燥的松科树枝的使用量为50kg；石榴皮提取物的使用量为30mL；
菌种果实化后，保持环境温度在8-12℃，二氧化碳含量在510-580ppm，当发育的子囊果长至2cm后，控制土壤含水量保持在18％-23％，空气湿度为85％-95％。
实施例4
本实施例与实施例2的区别在于：
干燥的松科树枝的使用量为80kg；石榴皮提取物的使用量为40mL；
菌种果实化后，保持环境温度在18-20℃，二氧化碳含量在580-600ppm，当发育的子囊果长至2cm后，控制土壤含水量保持在18％-23％，空气湿度为85％-95％。
对比例1
本对比例与实施例3的区别在于：
本对比例采用M.importuna作为羊肚菌代替杂交菌种作为种植样品。
对比例2
本对比例与实施例3的区别在于：
本对比例采用未经处理的农田作为种植土壤。
对比例3
本对比例与实施例3的区别在于：
本对比例采用马铃薯葡萄琼脂培养基，即PDA培养基为杂交菌种的培养基。
现对实施例2-4和对比例1-3中种植的羊肚菌进行产量测试。出菇一周后，采摘成熟子囊果，冷冻干燥后，称量其干重，测试结果如下表1所示。
表1实施例2-4和对比例1-3中种植的羊肚菌进行产量测试
由上表1可知，3个实施例中羊肚菌产量高于三个对比例的，其中对比例2差值最大，可知火处理后的土壤对羊肚菌产量具有良好的促进作用。
现在对实施例2-4和对比例1-3中种植的羊肚菌进行生长速率的测试。
在出菇1天后，统计不同区域中羊肚菌凝聚菌丝，子囊果和羊肚菌的数量，以对比不同区域中羊肚菌的生长速率，测试结果如表2所示。
表2实施例2-4和对比例1-3中种植的羊肚菌进行生长速率的测试
项目 凝聚菌丝(个/m2) 子囊果(个/m2) 羊肚菌(个/m2)
实施例2 100 54 8
实施例3 107 57 9
实施例4 103 54 8
对比例1 89 37 5
对比例2 64 28 3
对比例3 77 36 4
由表2的结果可知，实施例3中成熟羊肚菌和凝聚菌丝的个数最多，生长速率最快。总体上，三个对比例的生长速率相较于对比例中具有明显的优势。
在说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种促进羊肚菌果实化的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用原生质体融合技术对羊肚菌进行种间杂交，得到杂交菌种，其具体步骤为：
在无菌操作台上，将M.importuna和M.sextelata羊肚菌使用75％乙醇溶液洗涤，随后取柄盖交界处组织，分别使用完全酵母提取物培养基培养1天，并在4℃下保存；
分别将菌丝依次使用无菌蒸馏水和0.6mol/L甘露醇溶液洗涤3次后，加入酶解液中，以50rpm速率摇动，并在30℃下孵育3小时，随后过滤，使用0.6mol/L甘露醇溶液洗涤，将滤液在室温下以2000rpm速率离心，收集沉淀，即得M.importuna和M.sextelata羊肚菌原生质体；
将M.importuna羊肚菌原生质体在45℃下加热20分钟进行灭活处理；再将M.sextelata羊肚菌原生质体使用30w紫外线照射5分钟，照射距离30cm，得到灭活的M.importuna和M.sextelata羊肚菌原生质体；
向完全酵母提取物培养基中加入0.6mol/L甘露醇溶液，得到洗涤液，备用；
将灭活的M.importuna和M.sextelata羊肚菌原生质体加入含有0.05mol/L CaCl2的PEG溶液中，静置10分钟后，间隔5分钟分次加入洗涤液洗涤，过滤后转移到新鲜的完全酵母提取物培养基斜面上进行培养1-2天，随后收集生长的菌丝放置在完全酵母提取物培养基板的中心，在25℃和黑暗条件下孵育14天，得到杂交菌种；
(2)将种植土壤进行表面火处理，具体步骤为：选择一片矩形沙壤土作为种植土壤，使用干燥的松科树枝，均匀的覆盖在地面上，选择矩形的四角作为着火点进行点火，直至火焰自然熄灭，静置350天；
(3)使用改良琼脂培养基对杂交菌种进行培养，所述改良琼脂培养基的配方为：琼脂培养基20g/L、琼脂椰子水20g/L、琼脂植物提取物20g/L、琼脂乳糖20g/L，所述植物提取物由山毛榉木的水提取物、麦芽的无水丙酮提取物和石榴皮提取物以10：10：2-4的质量比混合得到；
(4)在表面火处理后的土壤上进行播种，铺设黑地膜，待菌丝出土后放置外源营养袋，待菌体出土后，保持空气湿度在85％-90％，土壤含水量在20％-23％，环境温度在10-15℃；
菌种果实化后，保持环境温度在5-20℃，二氧化碳含量在400-600ppm，当发育的子囊果长至2cm后，控制土壤含水量保持在18％-23％，空气湿度为85％-95％，子囊果盖网完全打开后采收，即得羊肚菌。
2.根据权利要求1所述的一种促进羊肚菌果实化的培育方法，其特征在于，所述酶解液由真菌溶壁酶和蜗牛酶在0.6mol/L甘露醇溶液中混合制得，酶解液与菌丝的质量体积比为1g:5mL。
3.根据权利要求2所述的一种促进羊肚菌果实化的培育方法，其特征在于，所述PEG溶液为25％浓度的PEG-4000溶液。
4.根据权利要求1所述的一种促进羊肚菌果实化的培育方法，其特征在于，干燥的松科树枝的覆盖密度为1-2.7kg/m2。
5.根据权利要求1所述的一种促进羊肚菌果实化的培育方法，其特征在于，石榴皮提取物由以下步骤制得：
选用植物品种编号为20200304的“赤艳”石榴，使用去离子水洗涤后，晾干去皮；将果皮冷冻干燥后在-80℃下保存，将冻干的果皮在研钵中研磨成粉末，将粉末置于蒸馏水中进行高压灭菌，随后在4000×g下离心15分钟，弃去沉淀，将上清液通过0.45μm滤膜进行过滤，冷冻干燥后即得石榴皮提取物。
6.根据权利要求5所述的一种促进羊肚菌果实化的培育方法，其特征在于，外源营养袋由以下步骤制得：
将成分为47.65％2cm长的小麦秸秆，47.65％的鸡粪，1.50％的菜籽粕，0.50％的尿素，0.80％的磷酸氢钙，1.00％的石灰，0.60％的石膏制成起始堆肥，0.15％硫酸镁和0.15％硫酸钾的堆肥原料在搅拌机中充分混合，随后填充至固体发酵罐中，每天翻转发酵罐，堆肥发酵30天，得到堆肥混合物；
将堆肥混合物装入曝气池中，在恒定通气条件下发酵12天，通风速率为10m3/分钟，随后在第二天将温度升至70℃，维持一周，然后自然下降到40℃，随后将堆肥混合物搅拌混合，并重新填充到充气池中，将温度再次升高到60℃，每小时曝气10分钟，继续发酵18天，随后自然下降到30℃，将堆肥混合物干燥至水分含量低于10％，均质并过50目筛后装入袋中，即得外源营养袋。
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