CN110604048A - 一种木本植物菌根多接种方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供种木本植物菌根多接种方法，克服了单一菌种的局限性，达到同一株木本植物能够被多种外生菌根真菌侵染的效果，能够比单一菌种接种更好的促进植物生长、定殖以及提高植物的抗逆性。同时，该方法可应用于废弃土地的植被恢复，多接种的苗木能够更好的促进废弃土地的微生物群落多样性，对废弃土地的改良具有积极作用。废弃土地经多接种苗木改良后，有利于生物多样性的提高，对土地肥力、土壤理化性质等指标均有积极作用。本发明的接种使用已侵染成功的母苗菌根接种幼苗，污染率大大降低。同时，采取土壤基质培养待接种植物，植物生长旺盛。

Description

一种木本植物菌根多接种方法和应用

技术领域

本发明属于环境污染治理以及废弃土地植被恢复技术领域，具体涉及一种木本植物菌根多接种方法和应用。

背景技术

外生菌根真菌(Ectomycorrhiza，ECM)是一类能与高等植物根系形成共生关系的大型真菌，植物-外生菌根真菌共生是自然界的一种普遍现象。利用外生菌根可使树木提前4-5年成材。外生菌根菌有利于在贫瘠土壤生长出茂盛树林，在低营养土壤环境中，外生菌根菌的感染力仍然较强，对荒地、矿山等废弃土地的植被恢复具有重要意义。外生菌根真菌在维护生态平衡和保护生物多样性方面起着至关重要的作用，是维持森林生态系统平衡的重要组成部分，在生态系统的物质和能量循环中起关键作用。

在现有技术中，多为单一外生菌根真菌的接种技术，对于单一真菌接种的植物，外生菌根真菌的存在虽然增强了树木抵抗重金属、干旱、盐及病害等胁迫的能力，但效果远不如多接种植物。对于荒地、矿山等废弃贫瘠土地，单一接种由于接种真菌种类的局限性，无法更好的促进植物的定殖，对微生物群落的恢复、土壤的改良及肥力恢复作用有限。

国外曾经使用培养基培养菌丝体直接进行双接种，此方法污染率较高，易受杂菌干扰，另外，培养基并不是植物生长的优良基质，培养基培养的植物生长较为缓慢。与此同时，国内的菌根双菌种接种和多接种技术鲜有报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供种木本植物菌根多接种方法，克服了单一菌种的局限性，达到同一株木本植物能够被多种外生菌根真菌侵染的效果，能够比单一菌种接种更好的促进植物生长、定殖以及提高植物的抗逆性。同时，该方法可应用于废弃土地的植被恢复，多接种的苗木能够更好的促进废弃土地的微生物群落多样性，对废弃土地的改良具有积极作用。废弃土地经多接种苗木改良后，有利于生物多样性的提高，对土地肥力、土壤理化性质等指标均有积极作用。本发明的接种使用已侵染成功的母苗菌根接种幼苗，污染率大大降低。同时，采取土壤基质培养待接种植物，植物生长旺盛。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种木本植物菌根多接种方法，所述方法具体包括如下步骤：

S1：将经消毒的待接种木本植物种子催芽，种子开始露白时播种到经灭菌的培养基质中，培养3～6个月，至长成幼苗；

S2：将S1得到的幼苗截掉主根根尖，保留长度为1.5～2.5cm主根，得到待接种幼苗；由于外生真菌只能侵染植物侧根，主根过长会抑制侧根生长，主根过短则植物的养分吸收不足，影响生长甚至死亡，1.5cm-2.5cm为最佳长度范围。

S3：将若干个育苗容器紧贴固定；

S4：将S2得到的待接种幼苗置于育苗容器相邻处，幼苗的侧根分为若干部分，各置于一个育苗容器中；

S5：每个容器各种植一棵被外生菌根真菌侵染且菌根化率80％以上的菌根化母苗，各容器中的菌根化母苗所被侵染的外生菌根真菌不同；采用经灭菌的基质填满各容器，将待接种幼苗侧根和菌根化母苗共同培养3～6个月，得到多接种木本植物。

进一步的，S1中所述种子消毒方式为75％酒精浸泡30秒后，使用10％次氯酸钠浸泡10分钟，后用灭菌水清洗种子3～5次。

进一步的，S1中所述培养基质为蛭石，所述灭菌方式为121℃灭菌2小时。

进一步的，S1中所述种子催芽方式为置于25℃培养箱中，所述幼苗培养环境为温度20～25℃，可在阳光房中培养，采用自然光光照，光照周期与自然周期相同，湿度为50％-60％。

进一步的，S3中所述育苗容器包括塑料花盆、育苗钵、容器袋、育苗盘、育苗箱。

进一步的，S3中，还包括在若干个育苗容器的相邻面剪去深度为1～2cm缺口的步骤，S4中将S2得到的待接种幼苗置于育苗容器缺口处。该操作能够使使幼苗更贴近土壤，防止其根系裸露在土壤外，并且更加有利于幼苗竖直固定在各育苗容器之间。

进一步的，S5中所述菌根化母苗的制备方法为，将发芽后30～50天的木本植物幼苗置于50ml离心管中，将直径1.0～2.0cm活跃生长的外生菌根真菌菌块置于50ml离心管中，使菌块紧贴木本植物幼苗根部，然后使用体积比1:(0.5～1.5)的蛭石与火山灰作为基质填充50ml离心管，置于培养环境为温度20～25℃的阳光房，培养时间为4～6个月，通过体式显微镜检查每个幼苗的根尖是否有外生菌根真菌(ECM)定殖，并检查菌根化率，挑选出菌根化率80％以上的菌根化母苗，菌根化率低于80％将导致子苗侵染成功率下降。

进一步的，所述母苗为松，进一步的为黑松。由于松(Pinus)高大木本植物，种类多，分布广，是我国常见的树种之一，不仅可以生长在各种不同的土壤上而且具有一定的抗旱能力，常被用于废弃荒地植被恢复的先锋树种，且在自然界中生长的松树常与外生菌根真菌形成菌根共生结构，大大提高了其耐逆性。有利于其作为先锋植物在废弃土地的定殖。

进一步的，S5中所述基质为体积比1:(0.5～1.5)的蛭石与火山灰；所述基质的灭菌方式为121℃灭菌2小时；所述培养环境为温度20～25℃的阳光房，采用自然光光照，光照周期与自然周期相同，湿度为50％-60％

上述木本植物菌根多接种方法在促进植物生长中的应用。

基于以上所述的木本植物菌根多接种方法得到的多外生菌根真菌接种木本植物。

以上所述的方法或所述的多接种木本植物在恢复废弃土壤的生物多样性中的应用。

相关技术术语的名词解释

菌根：菌根是指土壤中某些真菌与植物根的共生体。

主根：由胚根发育的根,称为主根。

侧根：主根生长达到一定长度，在一定部位上侧向地从内部生出许多支根。

菌根化率：已经发生菌根的植物中，菌根占植物总侧根数的比率。

母苗：已经有菌根形成，且菌根化率较高的植物。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

(1)本发明提供的接种方法，使用已侵染成功的母苗菌根接种幼苗，相对于国外采用的使用培养基培养菌丝体直接进行双接种的方法，不易受杂菌干扰，同时兼具侵染快速和菌根化率高的优点。

(2)本发明提供的接种方法，能够根据环境需要，实现多种外生菌根真菌成功侵染，而不仅仅是双接种，同时，菌根化率高达90％以上。

(3)相对于单接种非菌根苗，采用本发明多接种方法显著促进植株生长。

(4)在菌种接种时，采用已经菌根化完全的母苗携带的真菌侵染待菌根化的幼苗，菌根苗合成期间，对幼苗无需其他处理，大大简化了接种流程，操作简单，所需条件要求不高，是一种优良的植物外生菌根多接种技术。

(5)菌根苗合成流程中使用的基质经过探索，为较适于菌根形成的基质，可以使菌根在100天内快速形成，且菌根化率较高。

(6)另外，本发明采取土壤基质培养待接种植物，植物生长旺盛。

(7)本发明得到的接种方法可应用于废弃土地的植被恢复，多接种的苗木可以更好的促进废弃土地的微生物群落多样性，对废弃土地的改良及生物多样性的恢复具有积极作用

附图说明

图1.本发明母苗制备流程示意图；

图2.实施例1和实施例2中外生菌根真菌双接种技术操作流程示意图；

图3.实施例1中多接种结果，左为彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)菌根，右为土生空团菌(Cenococcum geophilum)菌根；

图4.实施例2中多接种结果左为紫色腊蘑(Laccaria amethystina)菌根，右为双色腊蘑(Laccaria bicolor)菌根；

图5.实施例4中双接种苗可以更有效的促进植物生长；

图6.实施例5中实验前位于江苏省南京市汤山街道老伏牛山的废弃Cu矿山；

图7.实施例5中5年后实验区概况。

具体实施方式

实验材料：

本发明实施例选取的待接种植物和外生菌根母苗均为黑松(Pinus thunbergii)。

实验菌株：

本发明实施例使用菌株共四种，其中，双色腊蘑(Laccaria bicolor)、土生空团菌(Cenococcum geophilum)和紫色腊蘑(Laccaria amethystina)采自南京紫金山，彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)采自南京伏牛山。菌种使用Modified Merlin-Norkans(MMN)培养基保存。

外生菌根母苗的培育：

取40株发芽后约40天的木本植物黑松幼苗，分为4组，分别为双色腊蘑(Laccariabicolor)侵染组，土生空团菌(Cenococcum geophilum)侵染组，紫色腊蘑(Laccariaamethystina)侵染组，彩色豆马勃(Pisolithus tinctorius)侵染组，每组10株。

将各株幼苗分别置于50ml离心管中，其中10个离心管中放置了直径约1.5cm活跃生长的Pisolithus tinctorius菌块，10个离心管中放置了直径约1.5cm活跃生长的Cenococcum geophilum菌块，10个离心管中放置了直径约1.5cm活跃生长的Laccariaamethystina菌块，10个离心管中放置了直径约1.5cm活跃生长的Laccaria bicolor菌块。

使各离心管中的菌块紧贴黑松幼苗根部，然后使用体积比1:1的蛭石与火山灰作为基质填充50ml离心管。置于培养环境为温度20-25℃的阳光房，培养时间为5个月。通过体式显微镜检查每个幼苗的根尖的ECM定殖，从各组挑选出菌根化率80％以上的菌根化母苗。

得到Pisolithus tinctorius母苗、Cenococcum geophilum母苗、Laccariabicolor母苗、Laccaria amethystina母苗。

实施例1Pisolithus tinctorius和Cenococcum geophilum接种

S1待接种植物幼苗的培育：将经75％酒精浸泡30秒后，使用10％次氯酸钠浸泡10分钟，后用灭菌水清洗种子3次消毒的黑松种子置于25℃培养箱中催芽，种子开始露白时播种到经121℃灭菌2小时灭菌的培养基质中，所用基质为蛭石，培养环境为温度20-25℃的阳光房。

S2：S1中所述种子培育至长成幼苗后，截掉主根根尖，保留1.5cm主根。

S3：将两个塑料花盆紧贴固定，两个相邻面剪去深度为1cm缺口。

S4：将S2的幼苗置于缺口处，幼苗的侧根分为两部分，各置于一个花盆中。

S5：一个花盆种植一株菌根化率80％以上的Pisolithus tinctorius母苗，另一花盆种植一株菌根化率80％以上的Cenococcum geophilum母苗，采用经121℃灭菌2小时灭菌的体积比1:0.5的蛭石与火山灰填满两个花盆，将待接种幼苗侧根和菌根化母苗在20～25℃的阳光房共同培养3个月，得到Pisolithus tinctorius和Cenococcum geophilum接种的木本植物黑松。

实验结果：

本实施例黑松侧根分别被Pisolithus tinctorius和Pisolithus tinctorius侵染(图3)，左为Pisolithus tinctorius菌根，右为Cenococcum geophilum菌根。

体式显微镜检查每个Pisolithus tinctorius和Cenococcum geophilum接种的木本植物黑松幼苗的根尖的ECM定殖。

污染率＝被目标真菌之外的杂菌侵染的侧根数/总侧根数＝0.5％，

菌根化率＝被外生真菌侵染的侧根数/总侧根数＝90.0％。

实施例2Laccaria bicolor和Laccaria amethystina接种

S1待接种植物幼苗的培育：将经75％酒精浸泡30秒后，使用10％次氯酸钠浸泡10分钟，后用灭菌水清洗种子5次消毒的黑松种子置于25℃培养箱中催芽，种子开始露白时播种到经121℃灭菌2小时灭菌的培养基质中，所用基质为蛭石，培养环境为温度20-25℃的阳光房。

S2：S1中所述种子培育至长成幼苗后，截掉主根根尖，保留2.5cm主根。

S3：将两个育苗钵紧贴固定，两个相邻面剪去深度为2cm缺口。

S4：将S2的幼苗置于缺口处，幼苗的侧根分为两部分，各置于一个育苗钵中。

S5：一个育苗钵种植一株菌根化率80％以上的Laccaria bicolor母苗，另一花育苗钵植一株菌根化率80％以上的Laccaria amethystina母苗，采用经121℃灭菌2小时灭菌的体积比1:1.5的蛭石与火山灰填满两个育苗钵，将待接种幼苗侧根和菌根化母苗在20～25℃的阳光房共同培养6个月，得到Laccaria bicolor和Laccaria amethystina接种的木本植物黑松。

实验结果：

本实施例黑松侧根分别被Laccaria bicolor和Laccaria amethystina侵染(图4)，左为Laccaria amethystina菌根，右为Laccaria bicolor菌根。

体式显微镜检查每个Laccaria bicolor和Laccaria amethystina接种的木本植物黑松幼苗的根尖的ECM定殖。

污染率＝被目标真菌之外的杂菌侵染的侧根数/总侧根数＝0.5％，

菌根化率＝被外生真菌侵染的侧根数/总侧根数＝91.5％。

实施例3Pisolithus tinctorius、Cenococcum geophilum、Laccaria bicolor、Laccaria amethystina接种

S1待接种植物幼苗的培育：将经75％酒精浸泡30秒后，使用10％次氯酸钠浸泡10分钟，后用灭菌水清洗种子5次消毒的黑松种子置于25℃培养箱中催芽，种子开始露白时播种到经121℃灭菌2小时灭菌的培养基质中，所用基质为蛭石，培养环境为温度20-25℃的阳光房。

S2：S1中所述种子培育至长成幼苗后，截掉主根根尖，保留2.5cm主根。

S3：将4个育苗钵紧贴固定，4个育苗钵的相邻面剪去深度为2cm缺口。

S4：将S2的幼苗置于缺口处，幼苗的侧根分为4部分，各置于一个育苗钵中。

S5：4个育苗钵分别种植菌根化率80％以上的Pisolithus tinctorius母苗一株、Cenococcum geophilum母苗一株、Laccaria bicolor母苗一株、Laccaria amethystina母苗一株，采用经121℃灭菌2小时灭菌的体积比1:1.5的蛭石与火山灰填满4个育苗钵，将待接种幼苗分出的4部分侧根分别和一株菌根化母苗共同培养，培养条件为20～25℃的阳光房6个月，得到Pisolithus tinctorius、Cenococcum geophilum、Laccaria bicolor、Laccaria amethystina同时接种的木本植物黑松。

实验结果：

本实施例黑松侧根分别被Pisolithus tinctorius、Cenococcum geophilum、Laccaria bicolor、Laccaria amethystina侵染。

体式显微镜检查每个Pisolithus tinctorius、Cenococcum geophilum、Laccariabicolor、Laccaria amethystina四接种的木本植物黑松幼苗的根尖的ECM定殖。

污染率＝被目标真菌之外的杂菌侵染的侧根数/总侧根数＝0.5％，

菌根化率＝被外生真菌侵染的侧根数/总侧根数＝90.5％。

实施例4多接种促进植物生长

本实验对3个月的黑松幼苗，采取本发明接种方法进行接菌处理，得到Pisolithustinctorius、Cenococcum geophilum接种黑松苗(双接种)，并同时制备Pisolithustinctorius单接种黑松苗、Cenococcum geophilum单接种黑松苗以及未接菌的非菌根苗NM，培养基质均使用蛭石：火山灰＝1:1.5(体积比)，培养环境为温度20～25℃的阳光房，采用自然光光照，光照周期与自然周期相同，湿度为50％～60％。

三个月后检查外生真菌的侵染情况，确认外生真菌侵染成功后，继续培养3个月，收取植株置于80℃烘箱进行烘干后称重。

结果发现，多接种黑松苗干重最大，单接种黑松苗次之，非菌根苗最小，接种多种外生菌根真菌的苗木生物量显著高于未接种外生真菌的苗木和单接种苗木，由此可见，外生真菌多接种可以明显促进植物的生长。证实本发明多接种苗可以更有效的促进植物生长(图5)。

实施例5多接种植物土壤修复效力研究

本实验地点位于江苏省南京市汤山街道老伏牛山的废弃Cu矿山，使用多接种植物对其进行修复实验。

多接种黑松移栽前，该地区植被覆盖率低，Cu污染严重(800-2400mg/kg)，土壤贫瘠，营养匮乏，作物结实率低，当地水体Cu污染也非常严重(图6)。

本实验于2013年在50m²的试验区分别均匀移栽本发明多接种方法得到的6月龄Laccaria bicolor、Laccaria amethystina双接种黑松苗(La+Lb)，以及Laccariaamethystina(La)单接种苗，Laccaria bicolor(Lb)单接种苗以及非菌根化黑松苗(NM)，每个处理各移栽3株。

5年后进行观察，NM长势较差，且有一株死亡；La或Lb单接种苗均存活但长势明显弱于La+Lb；La+Lb长势最好。

废弃矿区种植根化黑松苗后，土壤明显得到改善，当地土壤由无植物定殖恢复为多种植物定殖，当地生态效应得到明显改善(图7)。

本发明提供的接种方法，使用已侵染成功的母苗菌根接种幼苗，相对于国外采用的使用培养基培养菌丝体直接进行双接种的方法，不易受杂菌干扰，同时兼具侵染快速和菌根化率高的优点。由图5可以明显看出，接种多种外生菌根真菌的苗木生物量显著高于未接种外生真菌的苗木和单接种苗木，由此可见，外生真菌多接种可以明显促进植物的生长。在菌种接种时，采用已经菌根化完全的母苗携带的真菌侵染待菌根化的幼苗，菌根苗合成期间，对幼苗无需其他处理，大大简化了接种流程，操作简单，所需条件要求不高，是一种优良的植物外生菌根多接种技术。

本发明提供的接种方法，能够根据环境需要，实现多种外生菌根真菌成功侵染，而不仅仅是双接种，同时，菌根化率高达90％以上。

菌根苗合成流程中使用的基质经过探索，为较适于菌根形成的基质，可以使菌根在100天内快速形成，且菌根化率较高。另外，本发明采取土壤基质培养待接种植物，植物生长旺盛。

本发明得到的接种方法可应用于废弃土地的植被恢复，多接种的苗木可以更好的促进废弃土地的微生物群落多样性，对废弃土地的改良及生物多样性的恢复具有积极作用。

Claims (10)

1.一种木本植物菌根多接种方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

S1：将经消毒的待接种木本植物种子催芽，种子开始露白时播种到经灭菌的培养基质中，培养3～6个月，至长成幼苗；

S2：将S1得到的幼苗截掉主根根尖，保留1.5～2.5cm主根，得到待接种幼苗；

S3：将若干个育苗容器紧贴固定；

S4：将S2得到的待接种幼苗置于育苗容器相邻处，幼苗的侧根分为若干部分，各置于一个育苗容器中；

S5：每个容器中各种植一株被外生菌根真菌侵染且菌根化率80％以上的菌根化母苗，各容器中的菌根化母苗所被侵染的外生菌根真菌不同；采用经灭菌的基质填满各容器，将待接种幼苗侧根和菌根化母苗共同培养3～6个月，得到多接种木本植物。

2.根据权利要求1所述的木本植物菌根多接种方法，其特征在于，S1中所述种子消毒方式为75％酒精浸泡30秒后，使用10％次氯酸钠浸泡10分钟，后用灭菌水清洗种子3～5次；所述培养基质为蛭石，所述灭菌方式为121℃灭菌2小时。

3.根据权利要求1所述的木本植物菌根多接种方法，其特征在于，S1中所述种子催芽方式为置于25℃培养箱中，所述幼苗培养环境为温度20～25℃，采用自然光光照，光照周期与自然周期相同，湿度为50％～60％。

4.根据权利要求1所述的木本植物菌根多接种方法，其特征在于，S3中所述育苗容器包括塑料花盆、育苗钵、容器袋、育苗盘、育苗箱。

5.根据权利要求1所述的木本植物菌根多接种方法，其特征在于，S3中，还包括在若干个育苗容器的相邻面剪去深度为1～2cm缺口的步骤，S4中将S2得到的待接种幼苗置于育苗容器缺口处。

6.根据权利要求1所述的木本植物菌根多接种方法，其特征在于，S5中所述菌根化母苗的制备方法为，将发芽后30～50天的木本植物幼苗置于50ml离心管中，将直径1.0～2.0cm活跃生长的外生菌根真菌菌块置于50ml离心管中，使菌块紧贴木本植物幼苗根部，然后使用体积比1:(0.5～1.5)的蛭石与火山灰作为基质填充50ml离心管，置于培养环境为温度20～25℃的阳光房，培养时间为4～6个月，通过体式显微镜检查每个幼苗的根尖的外生菌根真菌定殖，挑选出菌根化率80％以上的菌根化母苗。

7.根据权利要求1所述的木本植物菌根多接种方法，其特征在于，S5中所述基质为体积比1:(0.5～1.5)的蛭石与火山灰；所述基质的灭菌方式为121℃灭菌2小时；所述培养环境为温度20～25℃，采用自然光光照，光照周期与自然周期相同，湿度范围为50％～60％。

8.权利要求1至7任一项所述的木本植物菌根多接种方法在促进植物生长中的应用。

9.基于权利要求1至7中任一项所述的木本植物菌根多接种方法得到的多接种木本植物。

10.权利要求1至7任一项所述的方法或权利要求9所述的多接种木本植物在恢复废弃土壤生物多样性中的应用。