CN111357566A - 一种外生菌根真菌的菌根苗快速培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及林业菌根苗培育技术领域，具体涉及一种外生菌根真菌的菌根苗快速培育方法，包括以下步骤：a、将无菌苗培育土进行高温高压灭菌；b、将宿主植物种子用消毒液进行表面消毒后，播于灭菌的无菌苗培育土中，待其发芽后继续培育30‑45天，然后移栽到装有经高温高压灭菌的菌根苗培育基质的无菌容器中；c、选取高活力的菌根，去除表土后用自来水冲洗干净，最后再用无菌水清洗；d、将洗净的菌根贴放于上述宿主幼苗根系上，置于温室或者培养箱中培育至形成菌根苗；e、选取菌根形成良好的菌根苗，作为感染母苗，与无菌幼苗或经过消毒处理的宿主植物种子在无菌的菌根苗培育基质中共同培育，以获得大量外生菌根真菌的菌根苗。

Description

一种外生菌根真菌的菌根苗快速培育方法

技术领域

本发明涉及林业菌根苗培育技术领域，具体涉及一种外生菌根真菌的菌根苗快速培育方法。

背景技术

外生菌根真菌一般与高等宿主植物形成根际共生体系，在庞大的森林根际网络系统中，宿主植物提供给外生菌根真菌碳水化合物，反过来外生菌根真菌有助于宿主植物吸收土壤中的水分、矿质元素以及促进有利于宿主植物生长发育的次生代谢产物的分泌。很多外生菌根真菌不仅能够促进宿主植物的生长和提高其抗逆境能力，而且其子实体具有很高的食用和医用价值，比如块菌属的松露(Tuber spp.)，牛肝菌属的美味牛肝菌(Boletusedulis)，口蘑属的松茸(Tricholoma matsutake)，红菇属的正红菇(Russulagriseocarnosa)、大红菇(Russula alutacea)、红菇(Russula lepida)和大朱菇(Russularubra)，色钉菇属的红血铆钉菇(Chroogomphidius viscidus)和松乳菇(Lactariusdeliciosus)等。归因于它们的生态和商业价值，很多研究者致力于外生菌根真菌的研究，尤其是其商业化栽培技术的研究和探索。目前，一些外生菌根真菌已成功地进行商业化栽培，比如松乳菇(Lactarius deliciosus)，红色根须腹菌(Rhizopogon roseolus)和黑孢块菌(Tuber melanosporum)等。然而，一些极具经济价值的外生菌根真菌，比如所有红菇属的菌根真菌，红血铆钉菇和松茸等，还无法进行人工栽培。因为它们都必须在有宿主植物存在的条件下，与其共生形成菌根，才能生产出子实体。因此，菌根苗的形成是外生菌根真菌子实体能否产生的必要前提，所以，如何培育菌根苗，成为外生菌根真菌子实体能否人工栽培的关键环节。特别是红菇属的外生菌根真菌和红血铆钉菇等，由于无法分离和纯化培养菌丝，到目前为止还未能人工培育菌根苗。

此外，外生菌根菌对宿主抗逆境有着显著的作用，但不同的外生菌根真菌对于不同的逆境所起的作用不同，所以对于特定逆境环境的改良，需要用特有的菌根菌的菌根苗。一般情况下，菌根苗可以通过孢子侵染或菌丝体接种获得，但是目前只有为数不多的外生菌根菌能进行菌丝纯化培养，所以如何高效快速的获得各种外生菌根真菌的菌根苗，成为菌根苗在逆境改良应用中的瓶颈。

发明内容

针对于上述问题，本发明的目的在于提供一种外生菌根真菌的菌根苗快速培育方法，避免了现有菌根苗生产技术中菌丝体需要纯化培养的限制；另外，该方法还具有操作简便，培育周期短，效果显著的特点。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种外生菌根真菌的菌根苗快速培育方法，包括以下步骤：

a、将无菌苗培育土进行高温高压灭菌；

b、将宿主植物种子用消毒液进行表面消毒后，播于灭菌的无菌苗培育土中，待其发芽后继续培育30-45天，然后移栽到装有经高温高压灭菌的菌根苗培育基质的无菌容器中；

c、选取高活力的菌根，去除表土后用自来水冲洗干净，最后再用无菌水清洗；

d、将洗净的菌根贴放于上述宿主幼苗根系上，置于温室或者培养箱中培育至形成菌根苗；

e、选取菌根形成良好的菌根苗，作为感染母苗，与无菌幼苗或经过消毒处理的宿主植物种子在无菌的菌根苗培育基质中共同培育，以获得大量外生菌根真菌的菌根苗。

进一步的，a步骤中无菌苗培育土选用蛭石或者菌根苗培育基质。

进一步的，所述菌根苗培育基质由珍珠岩或煅烧心土与森林表土按2：1的比例混合而成。

优选的，所述煅烧心土为心土经过高温煅烧成颗粒状(直径1.5～3mm)，pH为5.5-6.0的无养分土；森林表土取自于生长目的外生菌根真菌的森林中，去除腐殖质层后，过孔径1cm的筛子。

优选的，a与b步骤中高温高压灭菌温度为121℃，压力为1.2pa，灭菌时间为3h。

优选的，b步骤中消毒液选用30％的H₂O₂或1％的NaClO。

优选的，d步骤中温室或培养室的培育条件为：光照条件下，培育温度为23-25℃，培育时间为16h；黑暗条件下，培育温度为20℃，培育时间为8h；温室光照为自然光或在恒温培养箱的光照为6000lux的条件下进行培育。

与现有技术相比较，本发明的有益效果如下：

通过多种外生菌根真菌的菌根苗培育试验表明，本发明是一种耗时短，操作简便且效率高的培育方法，特别适用于菌丝不能分离纯化培养但具有较高经济价值的外生菌根真菌，并且不受生长季节和环境的束缚，在一年中可以多次生产，可广泛运用于外生菌根苗的生产中。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍。应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为外生菌根真菌的菌根苗的感染扩繁图；

图2为接种菌根的子实体-花盖菇图；

图3为接种2个月后在米槠苗上形成的花盖菇的菌根图；

图4为接种所使用的日本绒紫红菇(Russula mariae)子实体图；

图5为接种3个月后米槠苗上形成的日本绒紫红菇的菌根图；

图6为接种2个月后无菌苗形成的绿盖粉孢牛肝菌(Tylopilus virens)菌根图；

图7为接种2个月后无菌苗上形成的土生空团菌的菌根图；

图8为接种2个月后无菌苗上形成的乳菇属(Lactarius rubrobrunneus)的菌根图；

图9为接种2个月后无菌苗上形成的革菌科(Thelephoraceae sp)的菌根图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下面将结合实施例对本发明作进一步的描述。

1)无菌苗的种植

基质的灭菌：将蛭石或者本发明配制的菌根苗培育基质作为无菌苗培育土，用高压灭菌锅对其进行121℃，1.2pa，3h灭菌。

宿主种子消毒：将收集的宿主种子用30％的H₂O₂溶液或者1％的NaClO消毒液浸泡(浸泡时间因植物不同略有差异，壳斗科植物的种子，1h；种子小的植物，如松树和白桦的种子，15min)，然后将种子用无菌水清洗干净，再将种子用灭菌水浸泡24h备用。

宿主种子播种及处理：将灭菌好的种子播撒到装有灭菌的无菌苗培育土的育苗盘中，浇适量的自来水保持土壤湿润，再放入温室或者培养箱中培育；对于壳斗科，待种子的主根冒出3-5cm后，用灭菌后的剪刀减去1/3的幼根部分，再移植到新的育苗盘中继续培育30-45天以上(因宿主不同略有差异，松树和白桦等树种不能超过2个月)，直至长成良好的侧根以便于后续菌根接种。在此培育期间，定期检查土壤含水量，若土壤基质水分不足时，用无菌水或者自来水全部浇透。

2)菌根接种

将野外新鲜活力高的外生菌根真菌的菌根，去表土后，用自来水冲洗干净，最后再用无菌水清洗2-3次；然后将洗净的菌根贴放于高温高压灭菌的菌根苗培育基质中的宿主幼苗根系上，并放置于温度可控的温室或培养室中培育得到菌根苗。

高活力菌根的选取是通过野外收集外生菌根真菌的土壤样品，然后在4℃低温条件下运回，并通过实体显微镜挑取获得。

3)菌根苗的感染扩繁

将2)中菌根形成良好的感染母苗与无菌苗或者无菌种子，在经高温高压灭菌的菌根苗培育基质中共同培育，培育过程中，实时根据土壤的水分状况用自来水进行浇水；经过2个月的共同培育后，使得感染母苗和无菌苗之间形成交叉感染，以此得到更多的菌根苗(如附图1：图中母苗：松树苗；幼苗：无菌种子发芽后两个星期；共培育2个月，95％以上的幼苗可形成菌根)。

上述菌根苗培育基质的制备：挖取野外目的外生菌根真菌的森林表土，将土壤碾碎过1cm孔径的筛子，然后加珍珠岩或者煅烧心土混合(煅烧心土：森林表土＝2:1)；其中煅烧心土为心土经过高温煅烧成颗粒状(直径1.5～3mm)，pH为5.5-6.0的无养分土。

高温高压灭菌的菌根苗培育基质的制备：向菌根苗培育基质加少量水混合后，进行121℃，1.2pa，3h高温高压水蒸气灭菌。

实施例1

红菇属花盖菇(Russula cyanoxantha)菌根接种无菌米槠苗形成菌根苗

实验中所运用的花盖菇菌根采自日本东京都西东京市绿町东京大学田無演习林(如图2所示)，其宿主为小叶青冈(Quercus myrsinifolia)，本次接种实验所使用的宿主幼苗为壳斗科阔叶树种米槠的6个月无菌幼苗。

(1)将无菌苗培育土，进行121℃，1.2pa，3h高温高压水蒸气灭菌，得到无菌培育基质，其中无菌苗培育土选用蛭石或者菌根苗培育基质。

(2)宿主种子消毒：将收集的米槠种子用30％的H₂O₂溶液浸泡1h，然后再用自来水清洗干净，最终在用自来水中浸泡过夜备用。

(3)无菌苗的培育及处理：将灭菌好的米槠种子播撒到无菌育苗盘基质中，浇适量的水保持土壤水分；放入自然光的温室培育(25℃，16h；20℃，8h)；然后将已经冒出3-5cm主根的种子，用灭菌后的剪刀减去1/3的幼根部分，再移植到新的育苗盘中继续培育直到长出3-4片叶；在此培育期间，定期检查土壤含水量，若土壤基质水分不足时，用自来水全部浇透。

(4)菌根苗培育基质的灭菌：挖取野外出菇地的表土，取出碎石和其他树根，将土壤碾碎过1cm的筛子，然后与煅烧心土1:2混合，进行121℃，1.2pa，3h高温高压水蒸气灭菌；上述煅烧心土为心土经过高温煅烧成颗粒状(直径1.5～3mm)，pH为5.5-6.0的无养分土。

(5)菌根接种宿主苗：将野外新鲜活力高的外生菌根真菌的菌根，去表土后，用自来水冲洗干净；然后将洗净的菌根贴放于无菌培育基质中的宿主幼苗根系上，并放置于温度可控的温室或培养室中培育得到菌根苗。培育条件为：光照条件下，培育温度为23-25℃，培育时间为16h；黑暗条件下，培育温度为20℃，培育时间为8h；温室光照为自然光或在恒温培养箱的光照为6000lux的条件下进行培育。

(6)花盖菇菌根的形成：菌根接种后的无菌苗在3个月的侵染过程中，形成菌根，并成功感染无菌苗根系形成大量菌根苗(如附图2-3所示)。

实施例2

日本绒紫红菇(Russula mariae)菌根接种无菌米槠苗形成菌根苗

实验中所运用的日本绒紫红菇菌根，采自日本东京都西东京市绿町东京大学田無演习林(如图4所示)，其宿主为米槠。本次接种实验使用的宿主幼苗为米槠6个月的无菌幼苗。

(1)-(5)同实施例1

(6)日本绒紫红菇菌根的形成：菌根接种后的无菌苗在3个月的侵染过程中，形成菌根，并成功感染无菌苗根系形成大量菌根苗(如附图4-5所示)。

实施例3

绿盖粉孢牛肝菌菌根(Tylopilus virens)接种无菌米槠苗形成菌根苗

实验中所运用的绿盖粉孢牛肝菌菌根，采自福建省三明市陈大镇砂蕉村的米槠林，本次接种实验使用的宿主幼苗是米槠和栲树的1年生无菌苗。

(1)-(5)实施例1

(6)绿盖粉孢牛肝菌,菌根的形成：接种菌根3个月后，米槠苗上形成菌根，并成功感染无菌苗的根系形成大量的菌根苗(如附图6所示)。

实施例4

土生空团菌(Cenococcum geophilum)菌根接种无菌苗形成菌根苗

本次实验中的土生空团菌菌根，采自于日本东京都西东京市绿町东京大学田無演习林，其宿主为小叶青冈和米槠。本次接种实验所使用的宿主幼苗米槠的6个月的无菌实生苗。

(1)-(5)同实施例1

(6)土生空团菌菌根的形成：接种1个月后，就可以在无菌苗上形成土生空团菌的菌根(如附图7所示)。

实施例5

乳菇属(Lactarius rubrobrunneus)菌根接种无菌苗形成菌根苗

实验中所运用的菌根，采自福建省三明市陈大镇砂蕉村米槠林，本次接种实验所使用的宿主幼苗为米槠和栲树的1年生无菌实生苗。

(1)-(5)同实施例1

(6)Lactarius rubrobrunneus的菌根形成：接种2个月后，就可以在无菌苗上形成L.rubrobrunneus的菌根(如附图8所示)。

实施例6

锁瑚菌属(Clavulina sp)菌根苗的培育

实验中所运用的菌根，采自福建省三明市陈大镇砂蕉村米槠林，接种所使用的苗均为米槠和栲树的1年生无菌实生苗。

(1)-(5)同实施例1

(6)Clavulina sp的菌根形成：接种2个月后，就可以在无菌苗中发现新长出的Clavulina sp菌根。

实施例7

革菌科(Thelephoraceae sp)菌根接种无菌苗形成菌根苗

实验中所运用的菌根,采自福建省三明市陈大镇砂蕉村米槠林。接种所使用的苗均为米槠和栲树的1年生无菌实生苗。

(1)-(5)同实施例1

(6)Thelephoraceae sp的菌根形成：接种2个月后，就可以在无菌苗中发现新长出的Thelephoraceae sp菌根(如附图9所示)。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种外生菌根真菌的菌根苗快速培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、将无菌苗培育土进行高温高压灭菌；

b、将宿主植物种子用消毒液进行表面消毒后，播于灭菌的无菌苗培育土中，待其发芽后继续培育30-45天，然后移栽到装有经高温高压灭菌的菌根苗培育基质的无菌容器中；

c、选取高活力的菌根，去除表土后用自来水冲洗干净，最后再用无菌水清洗；

d、将洗净的菌根贴放于上述宿主幼苗根系上，置于温室或者培养箱中培育至形成菌根苗；

e、选取菌根形成良好的菌根苗，作为感染母苗，与无菌幼苗或经过消毒处理的宿主植物种子在无菌的菌根苗培育基质中共同培育，以获得大量外生菌根真菌的菌根苗。

2.根据权利要求1所述的一种外生菌根真菌的菌根苗快速培育方法，其特征在于，a步骤中无菌苗培育土选用蛭石或者菌根苗培育基质。

3.根据权利要求1或2所述的一种外生菌根真菌的菌根苗快速培育方法，其特征在于，所述菌根苗培育基质由珍珠岩或煅烧心土与森林表土按2：1的比例混合而成。

4.根据权利要求3所述的外生菌根真菌的菌根苗快速培育方法，其特征在于，所述煅烧心土为心土经过高温煅烧成颗粒状，pH为5.5-6.0的无养分土；森林表土取自于生长目的外生菌根真菌的森林中，去除腐殖质层后，过孔径1cm的筛子。

5.根据权利要求1所述的外生菌根真菌的菌根苗快速培育方法，其特征在于：a与b步骤中高温高压灭菌温度为121℃，压力为1.2pa，灭菌时间为3h。

6.根据权利要求1所述的外生菌根真菌的菌根苗快速培育方法，其特征在于：b步骤中消毒液选用30％的H₂O₂或1％的NaClO。

7.根据权利要求1所述的外生菌根真菌的菌根苗快速培育方法，其特征在于：d步骤中温室或培养室的培育条件为：光照条件下，培育温度为23-25℃，培育时间为16h；黑暗条件下，培育温度为20℃，培育时间为8h；温室光照为自然光或在恒温培养箱的光照为6000lux的条件下进行培育。

Images