CN116114495A - 一种用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，具体步骤包括制备松材线虫悬浮液、幼苗侵染和样品鉴定和采集；本发明首次用无菌黑松幼苗进行松材线虫侵染室内实验，该方法实验背景单一，能较好地控制黑松植株生理状态，排除松树复杂的微生物背景，避免了松材线虫的室外传播和环境污染，成功建立了松材线虫对无菌黑松幼苗的侵染，保障了研究数据的科学性，为研究松材线虫与黑松间互作提供了一个理想模型，有利于从分子生物学角度研究黑松的抗病性及筛选抗病基因，培育具有抗松材线虫病的黑松苗木，提高经济效益。
Description
技术领域：
本发明涉及农业生物技术领域，特别涉及一种用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，该方法成功建立松材线虫对无菌黑松幼苗的侵染，侵染效率高、背景单一、无环境污染，为从分子生物学角度研究黑松对松材线虫的抗病性提供了理想模型。
背景技术：
松材线虫病又称松树萎蔫病(pine wilt disease，PWD)，是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)侵染引起的一种毁灭性病害，对我国的天然林保护和林业生态环境建设造成重大威胁。黑松(Pinus thunbergii)作为重要的造林和景观树种，在我国山东地区大面积种植，遭受松材线虫病的严重危害。
早期研究主要围绕松材线虫致病原、线虫与伴生细菌互作及致病机制等方面，近年来主要涉及松材线虫入侵机制和信息传感机制研究，包括松材线虫致病机制和表观遗传分析、松墨天牛在松材线虫扩散和侵染过程中的关键作用等，同时松材线虫的防治研究也取得一定进展，但是对于其寄主植物的抗病反应研究、寄主植物与松材线虫的互作机制研究报道较少。国内有些关于松树遗传改良和抗性树种选育的研究，但多为传统育种和遗传分析，分子抗病育种方面的研究比较少。从分子生物学角度研究黑松的抗病性，培育具有抗松材线虫病的黑松苗木具有重要意义。
抗性基因的功能分析及抗性植株的筛选鉴定成功与否依赖于实验研究体系的建立，尤其是黑松幼苗的松材线虫侵染体系的建立。研究者们利用两年生或多年生黑松植株，通过皮接法侵染得到了侵染植株，建立了黑松植株室外侵染的方法，但研究背景不单一，黑松植株生理状态不好控制，且无法排除复杂的微生物背景，还容易造成松材线虫的室外传播和环境污染，这就严重影响了研究数据的科学性。
本发明拟用松材线虫对无菌黑松幼苗进行侵染，环境干扰因素少，为从分子生物学角度研究黑松的抗病性提供理想模型。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，提供一种用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，通过科学高效的室内侵染方法，建立了黑松幼苗的松材线虫侵染体系理想模型，为对分子抗病育种的研究具有重要的理论价值。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，包括如下步骤：
(1)制备无菌育苗基质：配制含草炭土、蛭石和珍珠岩的育苗基质，混合均匀后，分装于玻璃组培瓶，置于高温高压蒸汽灭菌锅灭菌，取出后自然冷却；
(2)黑松种子消毒与种植：选取生长力旺盛、整齐一致的黑松种子，于超净工作台上消毒处理，无菌dH2O冲洗1-3min，体积百分比含量为75％的乙醇水溶液浸泡1-5min，氯化汞水溶液浸泡1-5min，无菌dH2O冲洗3-5次，每次1-3min，将种子接种于步骤(1)的无菌育苗基质中，每瓶5-7粒种子，均匀分布，施无菌dH2O 4-10mL；所述氯化汞水溶液是将1g氯化汞粉末溶解于1L蒸馏水中制得；
(3)将种植黑松种子的培养瓶置于人工气候室，弱光3000lux培养5-15d至种子萌发，之后8000lux光照培养4-6周，至幼苗长高至4.5cm-6cm，用于松材线虫侵染实验；
(4)制备松材线虫悬浮液：将松材线虫接种于含有灰葡萄孢的PDA培养基上，25℃暗培养4-7d，松材线虫爬满三角瓶内壁，在超净台上用无菌dH2O 1-5mL冲洗瓶壁，将松材线虫悬浮于无菌dH2O并转移至1.5mL离心管，40倍显微镜下检测松材线虫的活力并计数，然后2000-3000rpm离心，收集松材线虫，继续用无菌dH2O稀释并镜检计数，制备成浓度为200-300条/μL的松材线虫悬浮液，分装于0.2mL无菌离心管，每管8-15μL；
(5)幼苗侵染：在黑松幼苗顶端制造伤口，脱脂棉球覆于伤口，用注射器吸取松材线虫悬浮液注射至脱脂棉球覆盖的伤口处；取滤纸用无菌dH2O浸润后，覆盖于瓶口，用于保湿；
(6)样品鉴定与采集：步骤(5)后第3天起每天从无菌黑松幼苗中各部位分离松材线虫，以鉴定侵染效果，当鉴定侵染效率达到100％后采集幼苗冷冻保存。
进一步地，步骤(1)中所述的育苗基质成分质量比为草炭土：蛭石：珍珠岩＝5:2:3。
进一步地，步骤(1)中所述的组培瓶规格为容积240mL，高92mm，直径68mm，口径65mm，透气盖，每瓶分装的育苗基质高30mm。
进一步地，步骤(1)中所述的高温高压蒸汽灭菌锅的参数为压力105kPa，温度121℃，灭菌20min。
进一步地，步骤(1)中所述的室温冷却时间为1h以上。
进一步地，步骤(2)中所述，黑松种子于超净工作台上消毒处理，无菌水冲洗1min，75％乙醇浸泡1min，1‰氯化汞浸泡1min，无菌水冲洗3次，每次1min。
进一步地，步骤(2)中每瓶5粒种子，均匀分布，施无菌dH2O5mL。
进一步地，步骤(3)中，人工气候室条件为25℃，弱光3000lux培养10d左右至种子萌发。
进一步地，步骤(3)中所述种子萌发之后8000lux光照培养35d，至幼苗生长至高5cm，用于松材线虫侵染实验。
进一步地，步骤(4)中，松材线虫25℃暗培养5d，松材线虫爬满三角瓶内壁，在超净台上用无菌dH2O 2mL冲洗瓶壁。
进一步地，步骤(4)中所述40倍(目镜10倍，物镜4倍)显微镜下检测松材线虫的活力并计数，2500rpm离心3min收集松材线虫。
进一步地，步骤(4)中所述松材线虫用无菌dH2O重悬、稀释并镜检计数，制备成浓度为250条/μL的松材线虫悬浮液，分装于0.2mL无菌离心管，每管10μL。
进一步地，步骤(5)中所述在黑松幼苗顶端制造伤口，具体是用23号解剖刀在幼苗顶端针叶基部切掉第一根针叶，暴露伤口。
进一步地，步骤(5)中所述用1.5mm直径的脱脂棉球覆于伤口，用0.2mL注射器吸取松材线虫悬浮液注射至脱脂棉球覆盖的伤口处，每1株幼苗注射10μL松材线虫悬浮液，刚好吸附于棉球不流淌。
进一步地，步骤(5)中所述取直径9cm的无菌滤纸，无菌水浸润饱和后，覆盖于瓶口，用于保湿；7d内适时适量施水至滤纸，持续保湿。
进一步地，步骤(6)中所述鉴定松材线虫侵染效果是指：分别取松材线虫侵染过的幼苗的针叶、伤口以下1cm处茎段、2cm处茎段、3cm处茎段和根，用布氏漏斗法分离松材线虫，镜检，观察松材线虫存在的位点及成活情况；待鉴定侵染效率达到100％，即在幼苗各部位都分离到了活的松材线虫，则将幼苗冷冻保存；由于松材线虫的生活周期为3-7天，因此鉴定时间不超过7天，如第7天在侵染位点以外还分离不到松材线虫，说明侵染不成功，停止检测，重新侵染。经多次实验证明，本发明所述方法的侵染成功率为100％。，
本发明使用的野生松材线虫采集自青岛浮山。
本发明采用无菌苗感染野生松材线虫，更能排除黑松菌群对实验材料的影响，又能够遵循松材线虫的生长周期，真实的模拟黑松幼苗在田间被松材线虫侵染的环境，利于后续进行科学鉴定等研究工作，能够提高鉴定结果的准确程度及其稳定性，对环境无污染。
本发明与现有技术相比，有益效果有：首次用无菌黑松幼苗进行松材线虫侵染室内实验，该方法实验背景单一，能较好地控制黑松植株生理状态，排除松树复杂的微生物背景，避免了松材线虫的室外传播和环境污染，成功建立了松材线虫对无菌黑松幼苗的侵染，保障了研究数据的科学性，为研究松材线虫与黑松间互作提供了一个理想模型，有利于从分子生物学角度研究黑松的抗病性及筛选抗病基因，培育具有抗松材线虫病的黑松苗木，提高经济效益。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例涉及一种用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，包括如下步骤：
(一)制备无菌黑松幼苗：
(1)制备无菌育苗基质：配制含草炭土、蛭石和珍珠岩的育苗基质，草炭土、蛭石和珍珠岩的质量比为5:2:3，混合均匀后，分装于玻璃组培瓶中，每瓶分装的育苗基质高30mm，置于高温高压蒸汽灭菌锅(压力105kPa，温度121℃)中灭菌20min，取出后自然冷却；组培瓶规格为容积240mL、高92mm、直径68mm、口径65mm、透气瓶盖；
(2)黑松种子消毒与种植：选取生长力旺盛(先提前做过萌发实验的同一批种子)、整齐一致的黑松种子，于超净工作台上消毒处理：无菌dH2O冲洗1min，体积百分比含量为75％的乙醇水溶液浸泡1min，1‰氯化汞(1g氯化汞粉末溶解于1L蒸馏水)浸泡1min，无菌dH2O冲洗3次，每次1min；将消毒后的种子接种于步骤(1)的无菌育苗基质中，每瓶5粒种子，均匀分布，施无菌dH2O 5mL；
(3)将种植黑松种子的培养瓶置于人工气候室，25℃，弱光3000lux培养10天左右至种子萌发，之后8000lux光照培养35天，至幼苗长高至5cm，用于松材线虫侵染实验，完成无菌黑松幼苗的制备；
(二)制备松材线虫悬浮液：
将松材线虫接种于表面长满灰葡萄孢菌丝的PDA培养基上，25℃暗培养5天，松材线虫爬满三角瓶内壁，在超净台上用无菌dH2O 2mL冲洗瓶壁，将松材线虫悬浮于无菌dH2O并转移至1.5mL离心管，40倍(目镜10倍，物镜4倍)显微镜下检测松材线虫的活力并计数，2500rpm离心3分钟，收集松材线虫，继续用无菌dH2O重悬、稀释并镜检计数，制备成浓度为250条/μL的松材线虫悬浮液，分装于0.2mL无菌离心管，每管10μL；
(三)幼苗侵染：
打开培养瓶的透气盖，在黑松幼苗顶端制造伤口，用23号解剖刀，在幼苗顶端针叶基部切掉第一根针叶，暴露伤口；用1.5mm直径的脱脂棉球覆于伤口，用0.2mL注射器吸取松材线虫悬浮液注射至脱脂棉球覆盖的伤口处，每1株幼苗注射10μL松材线虫悬浮液，刚好吸附于棉球不流淌；取直径9cm的无菌滤纸，无菌水浸润饱和后，覆盖于瓶口，用于保湿；7d内适时适量施水至滤纸，持续保湿；
(四)样品鉴定与采集：
松材线虫侵染后，于第3天开始，分别取针叶、伤口以下1cm处茎段、2cm处茎段、3cm处茎段和根，用布氏漏斗法分离松材线虫，镜检，观察松材线虫侵染位点及成活情况；第5天检测到各部位都有活的松材线虫，侵染效率为100％，说明侵染成功，随即将幼苗冷冻保存；冷冻保存是为了将幼苗应用于组学测序或者其他实验，用于分子生物学实验必须-80℃冰箱保存，以防幼苗的RNA降解或蛋白发生变化。
本发明通过大量创造性的劳动得到了科学高效的黑松幼苗室内松材线虫侵染的方法及其具体参数，能够方便高效的得到侵染松材线虫的黑松幼苗，为后续科学研究、鉴定提供便利，降低科研成本，减少科研人员的不必要的劳动，有利于抗松材线虫黑松植株鉴定创新以及松材线虫抗性相关重要基因资源的发掘鉴定。
Claims (10)
1.一种用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)制备松材线虫悬浮液：将松材线虫接种于含有灰葡萄孢的PDA培养基上，25℃暗培养4-7d，松材线虫爬满三角瓶内壁，在超净台上用无菌dH2O 1-5mL冲洗瓶壁，将松材线虫悬浮于无菌dH2O并转移至1.5mL离心管，40倍显微镜下检测松材线虫的活力并计数，然后2000-3000rpm离心，收集松材线虫，继续用无菌dH2O稀释并镜检计数，制备成浓度为200-300条/μL的松材线虫悬浮液，分装于0.2mL无菌离心管，每管8-15μL；
(2)幼苗侵染：在4.5cm-6cm高的无菌黑松幼苗顶端制造伤口，脱脂棉球覆于伤口，用注射器吸取松材线虫悬浮液注射至脱脂棉球覆盖的伤口处；取滤纸用无菌dH2O浸润后，覆盖于瓶口，用于保湿；
(3)样品鉴定与采集：步骤(5)后第3天起每天从无菌黑松幼苗中各部位分离松材线虫，以鉴定侵染效果，当鉴定侵染效率达到100％后采集幼苗冷冻保存。
2.根据权利要求1所述的用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，其特征在于，所述无菌黑松幼苗的制备方法具体为：
(1)制备无菌育苗基质：配制含草炭土、蛭石和珍珠岩的育苗基质，混合均匀后，分装于玻璃组培瓶，置于高温高压蒸汽灭菌锅灭菌，取出后自然冷却；
(2)黑松种子消毒与种植：选取生长力旺盛、整齐一致的黑松种子，于超净工作台上消毒处理，即无菌dH2O冲洗1-3min，乙醇水溶液浸泡1-5min，氯化汞水溶液浸泡1-5min，无菌dH2O冲洗3-5次，每次1-3min；将种子接种于步骤(1)的无菌育苗基质中，每瓶5-7粒种子，均匀分布，施无菌dH2O 4-10mL；
(3)将种植黑松种子的玻璃组培瓶置于人工气候室，弱光3000lux培养5-15d至种子萌发，之后8000lux光照培养4-6周，至幼苗长高至4.5cm-6cm，用于松材线虫侵染实验。
3.根据权利要求1所述的用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，其特征在于，步骤(1)的离心时间为3min。
4.根据权利要求1所述的用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，其特征在于，步骤(2)中所述在黑松幼苗顶端制造伤口，具体是用23号解剖刀在幼苗顶端针叶基部切掉第一根针叶，暴露伤口。
5.根据权利要求1所述的用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，其特征在于，步骤(2)中所述脱脂棉球的直径为1.5mm，每1株幼苗注射10μL松材线虫悬浮液，刚好吸附于棉球不流淌。
6.根据权利要求1所述的用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，其特征在于，步骤(3)中所述鉴定松材线虫侵染效果是指：分别取松材线虫侵染过的幼苗的针叶、伤口以下1cm处茎段、2cm处茎段、3cm处茎段和根，用布氏漏斗法分离松材线虫，镜检，观察松材线虫存在的位点及成活情况；待鉴定侵染效率达到100％，即在幼苗各部位都分离到了活的松材线虫，则将幼苗冷冻保存。
7.根据权利要求2所述的用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的育苗基质成分质量比为草炭土：蛭石：珍珠岩＝5:2:3。
8.根据权利要求2所述的用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的组培瓶规格为容积240mL，高92mm，直径68mm，口径65mm，透气盖，每瓶分装的育苗基质高30mm。
9.根据权利要求2所述的用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的高温高压蒸汽灭菌锅的参数为压力105kPa，温度121℃，灭菌20min。
10.根据权利要求2所述的用松材线虫侵染无菌黑松幼苗的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的室温冷却时间为1h以上。
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