CN102696466A

CN102696466A - 一种杜鹃花无菌苗快速菌根化的方法

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Publication number: CN102696466A
Application number: CN2012102108952A
Authority: CN
Inventors: 张春英; 黄芳; 尹丽娟; 陈真; 杨兵
Original assignee: SHANGHAI INST OF GARDEN SCIENCE
Current assignee: Shanghai Academy of Landscape Architecture Science and Planning
Priority date: 2012-06-25
Filing date: 2012-06-25
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2032-06-25
Also published as: CN102696466B

Abstract

本发明属于植物学领域，提供了一种杜鹃花无菌苗快速菌根化的方法，解决了现有技术中的杜鹃花幼苗死亡率高、生长缓慢、叶片发黄等问题。本发明包括一个准备栽培基质及营养液的步骤，栽培基质由草炭和黄沙组成，重量比为2~3：1，在营养液中，葡萄糖的浓度为0.1~0.3%；还包括将播种或组织培养生根幼苗移栽入无菌处理的栽培基质中，接种至少1个菌块，菌块选自CGMCC NO：6010或者6031中的任意一种，菌块接种离根系0.5~1.0cm，幼苗放置在培养室培养。本发明的方法杜鹃花幼苗形成菌根快，侵染率高，幼苗生长快，可用科学研究，也可用于杜鹃花种苗生产。

Description

一种杜鹃花无菌苗快速菌根化的方法

技术领域：

本发明属于植物学领域，尤其涉及一种杜鹃花的栽培技术，具体来说是一种杜鹃花无菌苗快速菌根化的方法。

背景技术：

杜鹃花是世界著名的盆栽花卉和园林绿化植物，在我国是具有“花中西施”美誉的传统名花，深受人们的喜爱，种苗需求量大。播种繁殖及组织培养技术的突破是杜鹃花品种选育、种苗生产的关键环节。目前，很多杜鹃花种类能够播种繁殖和组织培养扩繁，但是幼苗生长缓慢、移栽成活率低、叶片发黄等问题是限制品种选育和种苗生产效率的关键因素。

杜鹃花是典型的菌根植物，菌根的形成可以增强寄主植物分解有机质和捕获氮的能力，促进植物的营养吸收，提高寄主抵抗逆境胁迫（如干旱、盐碱、重金属等）的能力，增加寄主的生长量等。许多研究表明菌根真菌在多种农作物、园艺作物上具有很高的应用价值，尤其是对植物苗期生长促进作用非常突出。如利用菌根菌剂开展湿地松育苗，得到的菌根化苗整齐粗壮，幼苗菌根化率达80%以上（戴玉明，“湿地松菌根化育苗试验”，《安徽农业科学》,2000,28(2):236）。组织培养技术是苗木生产的重要技术，但很多植物组培苗在练苗或移栽阶段常成活率低、生长缓慢的问题。研究表明：AM真菌能促进苹果、葡萄、柑桔等组培苗的生长，提高其移栽成活率（李瑞卿、刘润进、李敏，“园艺作物菌根及其在生态农业的应用”，《中国生态农业学报》，2002，20（1）：24~27）。墨兰组培苗在移栽阶段接入菌根真菌，8个月的生长后，幼苗干重比对照增加13.63%～16.95%，显著地促进了兰苗的生长（黄磊，贺筱蓉，郑立明等，“促进兰花组培苗生长的墨兰菌根真菌研究初报”，《热带作物学报》，2004，25（1）：36~39）。可见，实现种苗菌根化是克服组培苗生长缓慢，提高成活率的一个有效措施。我们曾对云锦杜鹃播种幼苗接种技术进行了初步探索，结果表明采用栽培基质单层接种法有利于菌根的形成及幼苗的生长（于芳、张春英、尹丽娟等，“云锦杜鹃菌根真菌接种技术及其效应”，《福建农林大学学报（自然科学版）》，2008，37（4）：360~364）。但在后来的试验中发现使用云锦杜鹃单层接种法常出现菌株生长过快，影响幼苗菌根化进程及后期生长。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种杜鹃花无菌苗快速菌根化的方法，所述的这种杜鹃花无菌苗快速菌根化的方法要解决现有技术中使用云锦杜鹃单层接种法常出现菌株生长过快、影响幼苗菌根化进程及后期生长的技术问题。

本发明提供了一种杜鹃花无菌苗快速菌根化的方法，包括以下步骤：

1)一个准备栽培基质及营养液的步骤，所述的栽培基质由草炭和黄沙组成，所述的草炭和黄沙的重量比为2~3：1，所述的营养液是液体培养基，在所述的液体培养基中，葡萄糖的质量百分比浓度在0.1~0.3%之间；

2)一个对无菌苗进行接种的步骤，将播种或组织培养生根幼苗移栽入无菌处理的栽培基质中，接种至少1个菌块，所述的菌块选自保藏号为CGMCC No：6010的真菌菌株或者保藏号为CGMCC No：6031的真菌菌株的真菌菌株中的任意一种或者两种的混合，所述的菌块的直径在2~4mm之间，所述的菌块接种处距离根系0.5~1.0cm，接种后幼苗放置在培养室培养，培养室条件为温度22~25℃，光照周期16~10h/8~14h，光强度为2000~4000lux，培养的时间为10~12周。

进一步的，所述的液体培养基为MMN液体培养基。

进一步的，所述的栽培基质中，所述的草炭和黄沙的重量比为3：1。

本发明还提供了一种真菌菌株，保藏号为CGMCC NO:6031，所述的菌株属于子囊菌纲、壳霉目、杯霉科、树粉孢属。

进一步的，本发明还提供了上述的一种真菌菌株在促进杜鹃花幼苗生长中的用途。

本发明的液体培养基中，葡萄糖的质量百分比浓度控制在0.1~0.3%。葡萄糖浓度高，菌株生长太快而不利于植物的生长。

本发明中的一种菌根真菌菌株（OBJF31菌株），其分类命名为Oidiodendron sp.，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号（中科院微生物研究所），保藏日期为2012年4月20号，保藏号为CGMCCNo：6010。

本发明中的另外一种菌根真菌菌株（OZT13菌株），其分类命名为Oidiodendron sp.，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）中，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号（中科院微生物研究所），保藏日期为2012年4月20号，保藏号为CGMCC No：6031。

本发明和已有技术相比较，其效果是积极和明显的。采用本发明的方法使得杜鹃花幼苗形成菌根快，侵染率高，幼苗生长快，是一种更快捷、更稳定的杜鹃花无菌苗菌根化方法。本发明的方法可用科学研究，也可用于杜鹃花种苗生产。

附图说明：

图1是本发明的OBJF31菌株菌落形态的照片。

图2是本发明的OBJF31菌株在光学显微镜400倍下菌丝体形态和孢子形状的照片。

图3是本发明的OZT13菌株菌落形态的照片。

图4是本发明的OZT13菌株在光学显微镜400倍下菌丝体形态和孢子形状的照片。

具体实施方式：

实施例1杜鹃花菌根真菌的分离与鉴定：

一、分离根系材料：采取上海滨江森林公园杜鹃花品种‘紫鹤’的生活根，连同泥土保湿放置在冰桶内，放在4℃冰箱保存待用。

二、分离与鉴定培养基：

（1）分离培养基：使用马丁~孟加拉红培养基(简称MA)，对其酸碱度进行调整改良。配方为：葡萄糖10克、胰蛋白胨5克、磷酸氢二钾1克、硫酸镁0.5克、孟加拉红0.033克，琼脂20克，蒸馏水定容至1000毫升，调节PH值至5.0，然后121℃高压灭菌20分钟，冷却至60℃以下时加入0.03克链霉素，混合均匀，倒平板待用。

（2）菌株鉴定培养基：使用麦芽提取物培养基（MEA），配方为：麦芽提取物20g、胰蛋白胨1克、葡萄糖20克、琼脂20克，蒸馏水定容至1000毫升，然后121℃高压灭菌20分钟，冷却至60℃以下时加入0.03克链霉素。

（3）菌丝体鉴定培养基（PDA培养基）：配方为：重量含量为20%的马铃薯汁为1000克、葡萄糖为20克、硫酸镁为0.6克、磷酸二氢钾为0.6克、维生素B1为0.2克、琼脂20克，培养基的pH=5.0。

三、分离与形态鉴定方法：

菌根真菌菌株的分离：从冰箱中取出杜鹃花品种‘紫鹤’的生活根，用自来水轻轻冲洗掉泥土，挑取健康的生活细根。清洗干净后，用72%酒精冲洗一下，放于10%家用84消毒液中洗涤15~20分钟，无菌水冲洗3~5次后，剪切成0.3~0.5厘米根段，置于装有MA培养基的培养皿中，每个培养皿中放置5个根段，然后置于25℃培养箱中黑暗培养2至4周，共培养100个根段。

菌落形态和菌丝体显微特征观察鉴定：待菌落从根段中长出来，用牙签挑取菌落至MEA培养基，继续进行菌落形态鉴定。每个菌落点6个菌斑，培养2周后观察菌落形态的一致性和均匀性，并记录菌落的基本特征。若菌落形态有差异，进行二次分离和鉴定。菌落形态特征稳定的菌株用牙签挑取至PDA平板22℃培养箱中黑暗培养2周，然后于4℃培养箱中黑暗培养2周，光学显微镜100~400倍下观察菌丝体形态和孢子形状。本实施例所使用培养箱为赛福恒温恒湿培养箱HWS－350，光学显微镜为莱卡光学显微镜Leica DM2000。

四、分子鉴定方法：

菌丝的收集：MEA培养基活化菌株，接种至MEA液体培养基摇菌10~15天（150rpm，25℃），滤纸过滤收集菌丝，用于基因组DNA提取。总DNA提取使用CTAB法。

ITS区段的PCR扩增：rDNA ITS区段的扩增采用通用引物ITS1（5′TCC GTA GGTGAA CCT GCG G 3′），ITS4（5′TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3′）。PCR反应体系的组成为10×Buffer 5μl 25μmol/LM g2+3μl，10mmol/L dNTP 1μl，10μmol/L引物各1μl，模板DNA1μl（终浓度在50ng/l左右），Taq酶1U（0.25μl），用无菌纯水定容至50μl。PCR反应采用BIORAD DNA Engine型PCR仪，循环参数为：预变性95℃，2min，变性94℃，40s，退火60℃，40s，延伸72℃，45s；补平72℃，5min。共进行35个循环。

产物纯化及测序：PCR产物经试剂盒纯化后使用载体是PMD18~T转化连接，测序引物为M13R（~48），使用测序仪器ABI 3730Xl进行测序（测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成）。所得序列使用PRIMER3软件进行网上比对，并辅以人工校对，确定序列的可靠性。得到的序列在NCBI上BLAST，使用数据库为GenBank+EMBL+DDBJ+PDB。

五、OBJF31菌株鉴定结果：

本发明发现了两种真菌菌株，其中一种菌株形态特征：为灰白色至棕色绒毡状，呈圆形，中央微隆起，直径2.0~2.5cm；菌丝直径2.0~3.0μm，分生孢子椭圆形，大小2.5~3.5μm*1.5~2.0μm，具分生孢子梗，长度80～120μm。（附图1，2）

六、分子鉴定结果：

ITS序列：如SEQ ID NO:3所示。

序列经BLAST比对，与Oidiodendron sp.shylm72和Oidiodendron maius isolate TR088的ITS序列相似度为99%，经ITS序列比对最相近物种为树粉孢属（Oidiodendron）的真菌，鉴定为新的杜鹃花菌根真菌菌株，保藏号为CGMCC No：6010。

七、OZT13菌株鉴定结果：

另外一种真菌菌株的形态特征：为灰色至棕色绒毡状，呈圆形，中央微隆起，直径1.8~2.2cm；菌丝直径2.0~3.0μm，分生孢子椭圆形，大小2.5~3.5μm*1.5~2.0μm，具分生孢子梗，长度60~110μm。（附图3，4）

八、ITS序列：如SEQ ID NO:4所示。

序列经BLAST比对，与Oidiodendron sp.shylm72和Oidiodendron maius isolate TR088的ITS序列相似度分别为99%和98%，经ITS序列比对最相近物种为树粉孢属（Oidiodendron）的真菌。保藏号为CGMCCNo：6031。

实施例2适宜栽培基质的筛选

选择草炭、蛭石和黄沙三种常用栽培基质以不同比例混合作为待用栽培基质，具体配方为草炭：蛭石2：1、草炭：蛭石：黄沙2：1：1、草炭：黄沙2：1、草炭：黄沙3：1。基质按比例混合好后，高温灭菌，然后浇入灭菌MMN液体培养基，300ml/1000g栽培基质，混合均匀后，分装至栽培瓶内。移栽2~4cm高的无菌播种幼苗，接种菌块1个（直径2~4mm），所述的菌块选自保藏号为CGMCC No：6010的真菌菌株或者保藏号为CGMCC No：6031的真菌菌株中任意一种，每种基质栽培幼苗30棵，12周后统计不同基质中幼苗的生长情况（表1），含有蛭石的栽培基质中幼苗生长势较差，草炭与黄沙组合幼苗生长较好，侵染率也较高，其中以草炭：黄沙3：1混合基质中幼苗生长最好。

表1不同基质中幼苗生长情况调查

实施例4MMN培养基中葡萄糖浓度的筛选

MMN液体培养基中除葡萄糖外营养成分及含量均不变，

MMN液体培养基的配方为：氯化钙（Cacl 2·2H2O）0.05g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.15g，氯化钠（NaCl）0.025g，氯化高铁（FeCl3）0.012g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.5g，维生素B10.1mg，磷酸氢二铵（（N H4）2H PO4）0.25g，柠檬酸0.2g，麦芽提取物2g，蒸馏水定容至1000毫升。

1L培养基中葡萄糖添加量分别调整为0.5g（0.05%）、1g（0.1%）、3g（0.3%）、5g（0.5%）、10g（1%）和15g（1.5%）。以草炭：黄沙3：1作为基质，浇入不同葡萄糖含量的MMN培养基300ml/L，基质与营养液混合均匀后，分装至组培瓶内，然后高温灭菌。每瓶移栽入幼苗4棵，每两株苗之间接入菌块1个，所述的菌块选自保藏号为CGMCC No：6010的真菌菌株或者保藏号为CGMCC No：6031的真菌菌株中任意一种，放置在培养室内培养。在葡萄糖含量1%与1.5%培养基上，1周后基质表面出现菌斑，到第三周，菌丝就铺满基质表面，影响幼苗生长，甚至有些幼苗死亡，葡萄糖含量0.5%时，到第六周菌丝开始铺满基质表面。幼苗培养10周时，添加0.1%与0.3%葡萄糖含量的MMN培养基的幼苗生长最好，基质表面菌丝很少或肉眼看不到菌丝，幼苗平均菌根侵染率也比较高，均在65%以上。实施例5培养条件优化后的幼苗菌根化接种和接种幼苗生长效应对比

试验设置2种接种条件，一种是采用于芳等（2008）筛选出的单层接种法：培养基质采用草炭：蛭石2：1，营养液采用MMN液体培养基；另一种是采用本发明优化的方法：培养基质为草炭：黄沙3：1，营养液采用MMN液体培养基，但葡萄糖浓度控制在0.3%，氮源浓度3.8mM。接种方法采用实施例2的方法，所述的菌块选自保藏号为CGMCC No：6010的真菌菌株或者保藏号为CGMCC No：6031的真菌菌株中任意一种，接种后共培养10周后检测幼苗的生长及侵染情况，结果表明本发明的方法幼苗侵染率提高55%，幼苗的生长量提高16%，幼苗根长也有增加（表2）。

表2不同方法幼苗接种效果比较（共培养10周）

培养条件	于芳等单层接种法	本发明改良的方法
			侵染率（%）	43.5	67.5
幼苗鲜重(mg)	44	51
			幼苗根长(cm)	3.8	4.0

实施例6

无菌培养9周的云锦杜鹃播种苗，高约2~4cm，分别接种菌株OBJF31和4个文献（张春英等，2010;于芳等，2008）中筛选的同类型优良菌株，并设不接种对照。在幼苗根系两侧分别打洞，各埋入约直径0.5mm的圆形菌块1个，每个菌株接种处理幼苗30棵，不接种对照幼苗30棵，幼苗放置在培养室内培养，温度25℃。接种处理20周后，检测幼苗侵染率和生物量，菌株OBJF31接种苗侵染率、平均苗高、平均生物量和成活率均高于其它菌株接种苗和对照幼苗（表3）。

表3不同菌株接种处理20周后幼苗生长表现指标

实施例7

无菌培养9周的云锦杜鹃播种苗，高约2~4cm，移栽在灭菌处理的不同pH值的基质中。栽培基质pH值的调整方法：以栽培基质原始pH值为基础，按基质体积比分别添加一定量CaCO₃（添加比例按照0、3、5kg/m³），调整栽培基质pH值分别为5.5、6.8、7.2。幼苗移栽后接种，接种菌株为OBJF31和HS04，接种方法和幼苗培养条件同实施例1，每个处理接种30棵，并分别设置不接种对照。接种20周后，检测苗木的侵染率和生物量（表4），菌株OBJF31的接种苗在3个pH值基质中生物量和成活率均高于菌株HS04接种苗和对照非接种苗，且叶色墨绿。

表4不同pH基质中不同菌株对云锦杜鹃幼苗生长的影响

实施例8

无菌培养9周的云锦杜鹃播种苗，高约2~4cm，分别接种菌株OZT13和4个文献（张春英等，2010;于芳等，2008）中筛选的同类型优良菌株，并设不接种对照。在幼苗根系两侧分别打洞，各埋入约直径0.5mm的圆形菌块1个，每个菌株接种处理幼苗30棵，不接种对照幼苗30棵，幼苗放置在培养室内培养，温度25℃。接种处理20周后，检测幼苗侵染率和生物量，菌株OZT13接种苗侵染率、平均苗高、平均生物量和成活率均高于其它菌株接种苗和对照幼苗（表5）。

表5不同菌株接种处理20周后幼苗生长表现指标

序列表

<110> 上海市园林科学研究所

<120> 一种杜鹃花无菌苗快速菌根化的方法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物ITS1

<400> 1

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物ITS4

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 559

<212> DNA

<213> OBJF31真菌核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区

<400> 3

ttccgtaggg tgaacctgcg gagggatcat tacagagttc atgccctccg ggtagatctc 60

ccacccactg ctatcactac tctcgttgct ttggcgggcc gctgggccct gcccggccgc 120

cggccccggc tggcgcgtgc ccgccagaga cctcacagac tctgaatgtt agtgtcgtcc 180

gagtaactat ataatcgtta aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga 240

agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgcg aattgcagaa ttcagtgagt catcgaatct 300

ttgaacgcac attgcgccct gtggtattcc gcagggcatg cctgttcgag cgtcatttca 360

accctcaagc ctcgcttggt gttgggccct gcccgccgcg gccggcccta aagatagtgg 420

cggcgccgcc tggccctcag cgtagtacag ctctcgctcc agggtccggc ggtagcctgc 480

cagaaccccc aactctatgg ttgacctcgg atcaggtagg gatacccgct gaacttaagc 540

atatcaataa ggcggagga 559

<210> 4

<211> 560

<212> DNA

<213> OZT13真菌核糖体脱氧核糖核酸内转录间隔区

<400> 4

gattctctcc ggttactgat atgcttaagt tcagcgggta tccctacctg atccgaggtc 60

aaccatagag ttgggggttc tggcaggcta ccgccggacc ctggagcgag agctgtacta 120

cgctgagggc caggcggcgc cgccactatc tttagggccg gccgcggcgg gcagggccca 180

acaccaagcg aggcttgagg gttgaaatga cgctcgaaca ggcatgccct gcggaatacc 240

acagggcgca atgtgcgttc aaagattcga tgactcactg aattctgcaa ttcgcattac 300

ttatcgcatt tcgctgcgtt cttcatcgat gccagaacca agagatccgt tgttgaaagt 360

tttaacgatt atatagttac tcggacgaca ctaacattca gagtctgtga ggtctctggc 420

gggcacgcgc cagccggggc cggcggccgg gcagggccca gcggcccgcc aaagcaacga 480

gagtagtgat agcagtgggt gggagatcta cccggagggc atgaactctg taatgatccc 540

tccgcaggtc accctacggg 560

Claims

1.一种杜鹃花无菌苗快速菌根化的方法，其特征在于：包括以下步骤：

2)一个对无菌苗进行接种的步骤，将播种或组织培养生根幼苗移栽入无菌处理的栽培基质中，在幼苗的两侧接种至少1个菌块，所述的菌块选自保藏号为CGMCC No：6010的真菌菌株或者保藏号为CGMCC No：6031的真菌菌株中的任意一种，所述的菌块的直径在2~4mm之间，所述的菌块接种处距离根系0.5~1.0cm，接种后幼苗放置在培养室培养，培养室条件为温度22~25℃，光照周期16~10h/8~14h，光强度为2000~4000lux，培养的时间为10~12周。

2.如权利要求1所述的杜鹃花无菌苗快速菌根化的方法，其特征在于：所述的液体培养基为MMN液体培养基。

3.如权利要求1所述的杜鹃花无菌苗快速菌根化的方法，其特征在于：所述的栽培基质中，所述的草炭和黄沙的重量比为3：1。

4.一种真菌菌株，保藏号为CGMCC NO:6031，所述的菌株属于子囊菌纲、壳霉目、杯霉科、树粉孢属。

5.权利要求4所述的一种真菌菌株在促进杜鹃花幼苗生长中的用途。