CN108117998A - 一种炭角菌科真菌及其应用 - Google Patents

Abstract

一种炭角菌科真菌及其应用，属于生物技术领域。本发明一方面提供了一种新的炭角菌科真菌，另一方面提供了该菌的应用。本发明的炭角菌科真菌源于自然归于自然、与环境友好兼容、无污染无残留，对植物害虫有独特的高效控制作用，可作为无公害新型农药，用于农作物、果树、林木、草坪等地下害虫的无害化生产过程。

Description

一种炭角菌科真菌及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种炭角菌科真菌及其应用。

背景技术

随着化学农药造成的食品安全和生态环境威胁不断严重，生物农药在农林业可持续发展中的需求更加突出。生物农药主要包括农用抗生素、细菌杀虫制剂、昆虫病毒杀虫剂和真菌生物农药等。真菌是最大的杀灭病虫害微生物类群之一，某些具有生物防护作用的真菌能通过侵染破坏、毒性代谢物和营养吸收等多种方式有效杀灭特定类群的病虫害。真菌杀灭病虫害的特点，决定了真菌生物农药具有高效性（不容易导致病虫害产生抗性）、安全性（对人畜无毒和对天敌伤害较少）和低成本（常规的发酵培养即可）等诸多优势，因此，生防真菌的防治机理和应用已成为当前国内外生物农药领域的研究重点之一。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种炭角菌科真菌及其应用的技术方案。

所述的一种炭角菌科真菌（Xylaria radix）sj18，其保藏号为CGMCC No.12780。

所述的炭角菌科真菌及其代谢产物作为抑菌剂的应用。

所述的炭角菌科真菌及其代谢产物作为驱虫剂的应用。

所述的炭角菌科真菌在植物促根生长中的应用。

所述的炭角菌科真菌在促进植物耐盐作用中的应用。

本发明的炭角菌科真菌源于自然归于自然、与环境友好兼容、无污染无残留，对植物害虫有独特的高效控制作用，可作为无公害新型农药，用于农作物、果树、林木、草坪等地下害虫的无害化生产过程。

附图说明

图1为sj18菌在PDA培养基上4天的菌直径大小；

图2为sj18菌形态图；

图3为sj18菌的抑菌效果图；

图4为sj18菌的抑菌效果图；

图5为sj18菌促进拟南芥根部生长对比图；

图6为盐处理6d后的拟南芥苗表型。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实施例1：炭角菌科真菌的分离

从一株野生山核桃林木的根部取材，切成2cm左右小段，先经70%酒精表面消毒，再用50%安替福民（次氯酸钠溶液）消毒半小时，最后无菌水浸泡冲洗4-5次。

将野生山核桃林木的根部材料在超净台上切开，接种到PDA（固体土豆培养基）培养基平板上，待有菌长出时，分别划线纯化，并分别提取DNA进行分子鉴定，从而获得并确认该菌株。

具体鉴定步骤为：

1）从PDA平板上挑取待测菌加入至悬浮溶液A中，在菌液中加入经灭菌后的3-5mm碳化钨圆珠1颗，置于沸水浴中5min后，在液氮速冻下，用往复式粉碎机研磨，研磨后，待恢复至常温；

2）准备高吸附力的柱子：取带过滤柱的离心管，加入吸附剂悬液S，离心处理，使吸附剂在过滤柱中形成斜面，舍弃滤液；

3）菌裂解和核酸吸附：加入裂解液L到步骤1）预处理后的菌液中，上下剧烈震荡，静置，离心，再取上清加入到步骤2）制好的吸附柱中，室温放置，离心，舍弃滤液，收集管重新放回；

4）清洗：取步骤3）得到的上清液加入清洗液W，离心，清洗，每次倒掉收集管的滤液，最后一次甩15s后，吸附柱不再放回收集管，所述的清洗液W为浓度70%的酒精溶液；

5）洗脱：将吸附柱转移到新离心管中，滴上洗脱液E 10-15ul，盖紧盖子，保持60℃、5-10min，离心，收集到的滤液即为提取到的微量核酸溶液，所述的洗脱液E为灭过菌PH8.5的Tris溶液；

6）ITS序列的PCR扩增

取步骤5）得到的微量核酸溶液为模板，以引物ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS5（5’-GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG-3’）进行PCR扩增，PCR反应体积是60ul，10X TaqBuffer6ul, 2.5 mM 的dNTP mixture 5ul, Taq 3u, 10uM的引物各2.5ul，模板体积为6ul，剩余用纯水补足；PCR反应程序为：95°C 300s；94℃ 15s，52°C 45s，72°C 45s，共35-40轮循环；72℃ 300s。其扩增产物约600bp，该产物以常规PCR产物切胶纯化方法纯化后，最后以ITS4为测序引物，测得其ITS序列为：TTCTAGCTGAGCTGAGGTCACCTCTAGAATATATAGGGGTTTAACGGCTACCAGCCAGGGCCACCACACGAGCGAGAGAGATTACTACGCTGAGAGTGTACCCTAACTCCGCCACTAACTTTGAGGAACTACGCCGTAGATTCCCAACGCTAAGCAACAAGGGCTTAAGGGTCGAAATGACGCTCGAATAGGCATGCCCACTATAATACTAATGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCGCTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTAACTTATTTAGGTTTACAATTCATAGAAACAGTAATAAAAAACAAAAGTTTGGCGGTCCTTCGGCGGACCATAAGCCGGCTACAGGGTAGCTACAGGGTAACTATAGGGTAGCTGCAGGGTAACTACAGGGTAACTATAGGGTAACTACAGGGTAGCCGTAGCTCACGCCGAGGCAACGACGGTAAGGTTCACAAAGGGTTTGGAGTTTTAATAACTCAGTAATGATCCCTCCGCTGGCTCACCAACGGAGACCTTGTTCGATTTTTTAACTTCCAAGGA，经blast比对与现有的Xylaria sp. YS-13菌株相似性为97%，可以认为是同一种菌的不同菌株，定名为sj18。

上述溶液A为：100 mM Tris-HCl，25 mM EDTA，2.0 M NaC1，RnaseA 10ug/ml，pH8.0。带过滤柱的离心管是由离心柱铺上1-3层孔径1-10um的亲水微孔滤膜压紧得到。附剂悬液S通过以下步骤制得：称取3g硅土至50ml三角瓶中，加20-30ml双蒸水，充分振摇，静置片刻，去上清，清洗3遍，加入双蒸水至2倍硅土体积，总体积约20ml，经高压灭菌后常温存放待用。

裂解液L由以下组分混合得到：异硫氰酸胍30g、无菌水40ml、PH5.2的灭菌NaAc3ml、灭菌10% SDS 2.5ml、灭菌甘油2.5ml，总体积为50ml。

该分离纯化得到的菌株接入PDB（液体土豆培养基）摇菌，然后加甘油等冷冻保护剂以菌丝形态在超低温冰箱作永久保存。

炭角菌科真菌（Xylaria radix）sj18于 2016 年08 月08 日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101)，其保藏编号是：CGMCC No.12780。

实施例2：菌株的形态学和生物学特征

炭角菌科真菌 (Xylaria radix) sj18在PDA上生长良好，最适温度为32-34℃，在32℃下0.5cm菌块4天可以长到8cm，如图1所示。在pH5-11均能正常生长，且生长速度不受影响。菌丝为白色，培养1周后菌呈深褐色，不产孢子，菌丝形态如图2所示。炭角菌科真菌(Xylaria radix) sj18能利用多种糖进行生长，但乳糖抑制其生长。

实施例3：菌株的固相发酵物的气味分析

将sj18菌株的培养平板用0.5cm打孔器从直接5cm以上的菌落边缘取一块，接入装有培养基斜面的顶空玻璃瓶（带有密封塞），32ºC培养三天。将预处理（脱附）过的SPME管穿透样品瓶隔垫，插入瓶中，推手柄杆使纤维头伸出针管并置于样品上部空间（顶空方式），萃取时间大约30分钟。缩回纤维头，然后将针管退出样品瓶。紧接着，将SPME针管插入GC-MS仪（Agilent Technologies 7890A GC System、Agilent Technologies 5975C MS）进样口，推手柄杆，伸出纤维头，热脱附样品进色谱柱。缩回纤维头，移去针管。利用固相微萃取技术（SPME）分析其固相发酵物的气味表明（表1），其主要成分为甘菊环（Azulene）65.39%（61.77%+3.62%），石竹烯（Caryophyllene）7.41%和桉树脑（Eucalyptol）6.83%。

表1. SJ18菌发酵物的固相微萃取的GC-MS分析

实施例4：菌株的抑菌作用

先分别在PDA培养皿以各自最适的温度培养sj18和各病害真菌，实验首先设定互作实验的温度28ºC，将sj18菌落边缘打孔0.5cm菌块移至二分隔一次性培养皿的一边PDA培养基上，培养3d后，将病菌的0.5cm菌块接入另一边培养基上，同时以两边都接病菌的二分隔培养皿平板为对照，观察sj18对该病菌的抑制效果。在供试的9个病害真菌中，该菌的气味对葡萄座腔菌（otryosphaeria dothidea），胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和串珠状赤霉(Gibberella moniliformis)有明显抑制效果。如图3A所示，sj18生长3d后对葡萄座腔菌（otryosphaeria dothidea）3d的抑制效果，左培养皿左半是sj18菌，右半是病菌，右培养皿两边都是病菌；如图3B所示，sj18生长3d后对胶孢炭疽菌10d后效果，各培养皿菌设置同3A；如图3C所示，sj8生长3d后对串珠状赤霉10d后的抑制效果。

sj18抑菌效果比较（3个重复性的统计结果）：

实施例5：菌株的驱虫作用

先准备sj18菌，用打孔器打1cm的sj18菌块接种到200mlPDB培养基，32 ºC150rpm摇3d，菌液经滤纸抽滤后获得菌丝，置于4ºC冰箱备用。再准备青菜苗，在实验室25 ºC播种，3-5d后大约5-10cm高时，移出到盆里，一盆种3-4苗，盆里放置泥炭，移苗前在移的位置埋菌丝5个/株，对照和菌处理的各30株，放置于苗圃露天（7月中旬），适当遮荫，隔天傍晚浇水，sj18根部接种的青菜与未接种对照的生虫结果统计如图4所示，两组青菜苗大小差不多,但是菌处理组的青菜生虫比例明显降低。

实施例6：菌株的促根作用

先准备拟南芥苗，在B5培养皿的上半部分点上8-10颗种子，22 ºC 16h光照4d后用于接种sj18菌。同时，准备sj18菌，用打孔器打1cm的sj18菌块接种到200mlPDB培养基，32 ºC150rpm摇3d，其菌丝悬液可用于接种。实际操作时，先将菌液1ml3000g离心5min，去上清，加100ul-1ml10mM Mg₂SO₄重悬，在超净台上，取5ul菌丝悬液滴加到4d拟南芥培养皿中的下半部分，距离苗的基部大约5cm，同时在另外的拟南芥培养皿中滴加无菌丝的的10mM Mg₂SO₄溶液作为对照，将接种好的培养皿倾斜60度放置在22 ºC 16h光照下培养，10d后观察拍照。如图5所示，可以看到sj18存在下，根的密集生长，但地上部分并未有明显差异，这可能与菌本身需要营养吸收有一定关系。

实施例7：菌株促进植物的耐盐作用

先准备拟南芥小苗，在B5培养基平板上点种子，22 ºC 16h光照培养7d后，移入已高压灭菌的蛭石中，以拟南芥营养液浇灌。与此同时，准备sj18菌，主要步骤有，用打孔器打1cm的sj18菌块接种到200mlPDB培养基，32 ºC150rpm摇3d，菌液经滤纸抽滤后获得菌丝，用于拟南芥小苗侵染。将拟南芥小苗移入蛭石时，预先在移入位置的蛭石中埋入sj18菌丝，每颗苗0.5g左右，然后挑取状态较为一致的苗24株，移入装有蛭石的管子中，分成4捆，两捆一组，一组是菌侵染的，另一组是无菌侵染的对照，移苗后控制湿度达80%左右培养一周后进行耐盐处理。之前经过计算得知4捆蛭石吸收营养液的体积大约为1.5L，因此准备1.5L300mM NaCl溶液，浸泡6d后，观察到两组存在极为显著的差异，即sj18菌处理明显有利于植物增加耐盐性。另外，将苗取出后发现其根部也存在明显差异。结合之前的该菌对根部生长促进的情况，可以认为，虽然该菌在正常营养条件下对地上部分无明显影响，但却可以明显提高其在盐状况下的生长。如图6所示，a.整体情况，上方两捆是未进行菌处理，下方两捆是进行菌处理的；b.未进行菌处理（左边）和菌处理（右边）的盐处理后的典型（组里数量最多）小苗表型比较。

sj18促进拟南芥耐盐效果

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Claims (5)

1.一种炭角菌科真菌（Xylaria radix）sj18，其保藏号为CGMCC No.12780。

2.如权利要求1所述的炭角菌科真菌及其代谢产物作为抑菌剂的应用。

3.如权利要求1所述的炭角菌科真菌及其代谢产物作为驱虫剂的应用。

4.如权利要求1所述的炭角菌科真菌在植物促根生长中的应用。

5.如权利要求1所述的炭角菌科真菌在促进植物耐盐作用中的应用。