CN114657101B - 一株托霍尼假单胞菌q4-3菌株及其在治疗和/或预防青枯病中的应用 - Google Patents

一株托霍尼假单胞菌q4-3菌株及其在治疗和/或预防青枯病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物病害生防技术领域，公开了一株托霍尼假单胞菌(Pseudomonas sp.)Q4‑3菌株及其在治疗和/或预防青枯病中的应用。所述托霍尼假单胞菌Q4‑3菌株于2021年11月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62060，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。该托霍尼假单胞菌Q4‑3菌株可通过降解青枯劳尔氏菌产生的3‑OHPAME，以及轻微抑制青枯劳尔氏菌的生长来实现对植物青枯病的有效防治，在植物病害生防技术领域具有相当的必要性。

Description

一株托霍尼假单胞菌Q4-3菌株及其在治疗和/或预防青枯病 中的应用
技术领域
本发明属于植物病害生防技术领域，更具体地，涉及一株托霍尼假单胞菌Q4-3菌株及其在治疗和/或预防青枯病中的应用。
背景技术
青枯病是一种在全球范围内广泛存在的细菌性病害，其病原菌为世界十大植物细菌性病原菌之一的青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum，简称青枯菌)，宿主包含450多种植物。青枯劳尔氏菌通常从根际或茎部的伤口处入侵宿主，在宿主的维管束组织中不断扩繁堵塞导管，影响其水份运输，使植株萎蔫甚至死亡。目前防治青枯病最常用的办法是选育和推广抗病品种，但青枯劳尔氏菌在传播过程中极易发生变异，能通过克服原有抗病品种所带有的抗性，使原本的抗病品种变为感病品种，导致防治效果有限。此外，在农业生产过程中，还常使用化学药剂防控青枯病，如乙蒜素和农用硫酸链霉素等均可抑制病原菌的生长，但这些药剂易导致病菌产生抗药性，不符合长期防控和现代环境保护的要求，故而采用生物防控手段进行植物青枯病的防治成为当今研究热点。
现有技术公开了假单胞菌菌株②-29可通过直接杀死病原菌来发挥对番茄青枯病的拮抗作用，但该拮抗方式易导致病原菌发生突变，产生超级细菌，难以保证青枯病的防治效果。
与传统方法中利用拮抗作用杀死病原菌不同，群体淬灭是通过降解/干扰病原菌群体感应系统中起主要作用的群体感应信号分子来进行病害防控的，对病原菌不造成“生与死”的选择压力，病原菌不易产生抗性，所以通过群体淬灭的机理来进行青枯病的防治是一种切实有效的生物防控手段，因此，寻找能通过群体淬灭的方式来防治植物青枯病的微生物就显得十分必要。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，旨在提供一株托霍尼假单胞菌(Pseudomonassp.)Q4-3菌株，通过群体淬灭的方式来实现对植物青枯病的有效防治。
本发明的第二目的是提供上述托霍尼假单胞菌Q4-3菌株在制备防治植物青枯病的菌剂中的应用。
本发明的第三目的是提供一种防治植物青枯病的菌剂。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一株托霍尼假单胞菌(Pseudomonas sp.)Q4-3菌株，该菌株于2021年11月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：62060，属于托霍尼假单胞菌(Pseudomonas tohonis)，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明从广东省湛江市海头湾木麻黄林场的罹患青枯病的木麻黄植株分离得到菌株Q4-3，通过16S rDNA基因及rpoD基因建树，并根据全基因组比较其与最近源菌株Pseudomonas tohonis TUM18999的ANI值，确定该菌株属于托霍尼假单胞菌。
菌株Q4-3为革兰氏阴性菌，在LB培养基中生长较快，富有运动型。菌落在LB固体培养基中呈现淡黄色，圆形，前期中间稍凹，表面光滑，边缘圆润，后期中间稍凸，边缘弥散；于LB液体培养基中呈扩散性混浊，明胶液化。
所述托霍尼假单胞菌Q4-3菌株不仅可轻微抑制青枯劳尔氏菌的生长，还可通过降解青枯劳尔氏菌产生的群体感应信号分子——3-羟基棕榈酸甲酯(3-OH PAME)，适用于对植物青枯病长期有效的防治，在植物病害生防技术领域具有相当的必要性，因此，上述托霍尼假单胞菌Q4-3菌株在制备防治植物青枯病的菌剂中的应用应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述植物为花生、番茄、木麻黄的一种或几种。
优选地，所述青枯病为青枯劳尔氏菌引起的细菌性病害。
优选地，所述防治植物青枯病为降解青枯劳尔氏菌产生的3-OH PAME。
优选地，所述防治植物青枯病为轻微抑制青枯劳尔氏菌的生长。
本发明采用伤根灌菌法将托霍尼假单胞菌Q4-3菌株接种到木麻黄根部土壤中，采用注射接种法将托霍尼假单胞菌Q4-3菌株接种到番茄、花生的茎部，发现实验组木麻黄、番茄、花生的生长状况均显著优于正对照组(只接种青枯劳尔氏菌，未接种菌株Q4-3)，说明菌株Q4-3可有效防治植物青枯病，尤其是对花生青枯病和番茄青枯病的防治效果最佳(高达100％)，因此，本发明还提供了一种防治植物青枯病的菌剂，该菌剂包括托霍尼假单胞菌Q4-3菌株或其菌液。
优选地，所述托霍尼假单胞菌Q4-3菌株在菌剂中的浓度为OD600 1.0～1.5。
优选地，所述菌剂的给药方式为接种，如伤根灌菌接种或注射接种等。
本发明所述托霍尼假单胞菌Q4-3菌株在进行生物防控时只需要将其制备成菌剂即可施用，流程简单，生产成本低，防控效率高。在农业生产过程中将其通过伤根灌菌接种或注射接种的方法施用于待防控植物的根际土壤即可达到防治植物青枯病的目的，为防治植物青枯病提供了一种安全有效的生物防控手段和制剂。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明所述托霍尼假单胞菌Q4-3菌株可通过降解青枯劳尔氏菌产生的3-OHPAME，以及轻微抑制青枯劳尔氏菌的生长来实现对植物青枯病的有效防治，尤其是对花生青枯病和番茄青枯病的防治效果最佳(高达100％)。
2.本发明所述托霍尼假单胞菌Q4-3菌株对木麻黄、花生、番茄等植物均无致病力，可适用于制备成为抗植物细菌性病害的菌剂，为防治植物青枯病提供了新选择。
附图说明
图1A为待测菌液对3-OH PAME的降解率统计结果；图1B为负对照组对应的LC-MS图谱；图1C为实验组中编号为Q4-3的菌液对应的LC-MS图谱。
图2为菌株Q4-3基于16S rDNA基因序列的聚类图。
图3为菌株Q4-3基于rpoD基因序列的聚类图。
图4为培养基中胞外多糖的产生情况。
图5为菌株Q4-3对青枯菌生长的抑制情况。
图6A为木麻黄的生长状况；图6B为花生的生长状况；图6C为番茄的生长状况。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
LB培养基：Yeast extract 5.0g/L，Tryptone 10.0g/L，NaCl 10.0g/L，加H2O定容至1000mL，pH 7.0，其中固体平板需额外加入1.5％的琼脂粉。
MSM培养基：MgSO4·7H2O 0.2g/L，CaCl2·2H2O 0.01g/L，(NH4)2SO4 2.0g/L，FeSO4·7H2O 0.001g/L，Na2HPO4·12H2O 1.5g/L，NaH2PO4 1.5g/L，加H2O定容至1000mL，pH6.5，其中固体平板需额外加入1.5％的琼脂粉。
CPG培养基：Tryptone 10.0g/L，Casein 1.0g/L，Glucose 5.0g/L，加H2O定容至1000mL，pH 7.0，其中固体平板需额外加入1.5％的琼脂粉。
实施例1托霍尼假单胞菌Q4-3菌株的分离、筛选、鉴定和保藏
1、托霍尼假单胞菌Q4-3菌株的分离和筛选
(1)样品：广东省湛江市海头湾木麻黄林场的罹患青枯病的木麻黄枝条。
(2)分离和筛选：
称取5.0g木麻黄患病枝条(枝条需提前切碎并混匀)，置于200mL MSM培养基中，并加入3-OH PAME使其终浓度为1μmol/L。摇匀后于28℃、200rpm摇床震荡培养7d，取100μL培养液涂布于含有1μmol/L 3-OH PAME的MSM平板中，吹干封板并倒置于28℃培养箱培养48h，挑取形态互不相同的菌落于LB平板上反复划线得到单菌落，保菌留用。于LB平板上将前述菌株活化后，挑取单菌落于含10mL LB液体培养基的50mL离心管中，置于28℃、200rpm摇床震荡培养12h，将所有菌液均调至OD6001.0～1.5，并用LC-MS法测定不同菌株对3-OH PAME的降解率。
其中，LC-MS测定法：在MSM液体培养基中加入终浓度为1μmol/L的3-OH PAME作为唯一碳源，设置实验组和负对照组(CK)，两组离心管(50mL)中均加入10mL MSM液体培养基。其中，实验组：加入100μL菌液；对照组：加入100μL LB液体培养基。两组分别于28℃、200rpm摇床震荡培养7d，所得培养液分别用10mL二氯甲烷萃取三次，取下层溶液置于50mL锥形瓶中，设置旋转蒸发仪水浴锅40℃，压强500pa，蒸干有机溶剂后，用1mL色谱甲醇分两次洗脱后，所得样品用色谱甲醇定容至1mL，最后用LC-MS测定不同菌株对3-OH PAME的降解率。(LC-MS测定条件：LC-MS型号：Thermo Fisher公司的Q Exactive Focus液质联用仪；色谱柱：waters色谱柱(SKU：186003539，ACQUITY UPLC HSS T3 Column,
Figure GDA0004197518330000041
1.8μm,2.1mm X100mm,1/pk)；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；流动相：甲醇：水＝80：20；特征离子：Na+；分子量：309；出峰时间：6.0-6.5min；进样量：10μL。)
测得的两组MSM培养基中3-OH PAME的LC-MS图谱如图1B和1C所示，其中，图1B为负对照组(CK)对应的LC-MS图谱，图1C为实验组中编号为Q4-3的菌液对应的LC-MS图谱，且根据图1B、1C计算得到的待测菌液对3-OH PAME的降解率统计结果如图1A所示，可见，编号为Q4-3的菌株对3-OH PAME的降解率大于85％，即Q4-3菌株为一株3-OH PAME淬灭效果优异的生防菌株。
2、托霍尼假单胞菌Q4-3菌株的鉴定
(1)形态鉴定：
菌株Q4-3为革兰氏阴性菌，在LB培养基中生长较快，富有运动型。菌落在LB固体培养基中呈现淡黄色，圆形，好氧，菌体为杆状，前期中间稍凹，表面光滑，边缘圆润，后期中间稍凸，边缘弥散；于LB液体培养基中呈扩散性混浊，明胶液化。
(2)分子鉴定：
采用系统发育树分析(Phylogenetic analysis)的方法鉴定菌株Q4-3，以明确菌株Q4-3的分类地位。具体是：通过16S rDNA、rpoD序列基因序列来构建系统发育树。通过对菌株Q4-3进行基因组测序，得到了菌株Q4-3的16S rDNA、rpoD基因序列，运用MEGA5.0软件采用Neighbor-joining方法构建系统发育树，综合分析了菌株Q4-3的进化关系，其基于16SrDNA基因序列的聚类图如图2所示，基于rpoD基因序列的聚类图如图3所示。由图2可知，菌株Q4-3 16S rDNA序列的进化系数与Pseudomonas tohonis TUM18999最为相近，同源性为99.93％；由图3可知，菌株Q4-3与Pseudomonas tohonis TUM18999最为接近。
对菌株Q4-3进行全基因组测序，通过比较基因组分析，发现菌株Q4-3与Pseudomonas tohonis TUM18999的基因组最近缘，ANI值为97.87％，高于种的阈值(95％)，故可判定该菌株Q4-3属于Pseudomonas属的Pseudomonas tohonis，命名为托霍尼假单胞菌(Pseudomonas sp.)Q4-3。
3、托霍尼假单胞菌Q4-3菌株的保藏
托霍尼假单胞菌Q4-3菌株于2021年11月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No：62060，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2托霍尼假单胞菌Q4-3菌株对3-OH PAME的降解作用
在GM1000野生型菌株中转入含有epsA-LacZ启动子融合质粒(自带四环素抗性基因)，得到GM1000报告菌株。3-OH PAME作为青枯菌群体感应系统中一个重要的群体感应信号分子，可以正调控EPS的产生，因此通过检测溶液中EPS的含量可以反映出其中的3-OHPAME含量。
在含有终浓度为50μg/mL的四环素的CPG固体平板上活化GM1000报告菌株，封板后倒置于28℃培养箱培养48h；在LB固体平板上活化菌株Q4-3，封板后倒置于28℃培养箱培养24h。分别挑取菌株Q4-3和GM1000单菌落于装有10mL LB和含有四环素的CPG液体培养基中，于28℃、200rpm摇床培养16h得到种子液，再按1：100的比例将种子液分别加入到新的液体培养基中，于28℃、200rpm摇床培养至OD600为0.4。
在24孔板中加入1mL含终浓度为320μg/mL的x-gal的CPG液体培养基，设置实验组和对照组，三个为一组重复。其中，实验组(GM1000+Q4-3)：每孔按1：1000的比例加入Q4-3、GM1000菌液；对照组(GM1000)：每孔按1：000的比例加入LB液体培养基、GM1000菌液。两组分别置于28℃、200rpm摇床避光摇8d，拍照记录(图4)。
由图4可知，实验组(GM1000+Q4-3组)中胞外多糖的含量显著变少，而对照组(GM1000组)中胞外多糖的含量无明显变化，表明菌株Q4-3可显著减少溶液中EPS的含量，说明Q4-3可有效淬灭青枯菌产生的群体感应信号3-OH PAME，进而有效防治植物青枯病。
实施例3托霍尼假单胞菌Q4-3菌株对青枯菌生长的抑制作用
在CPG固体平板上活化木麻黄青枯病菌NS25，封板后倒置于28℃培养箱中培养48h；在LB固体平板上分别活化菌株Q4-3、Q4-7、Q6-6，封板后倒置于28℃培养箱培养24h。挑取菌株Q4-3、Q4-7、Q6-6，分别和NS25单菌落于含有10mL LB和CPG液体培养液的50mL离心管中进行培养，于28℃、200rpm摇床振荡培养至OD600 1.0～1.5。取已融化的15mL固体LB培养基在10×10cm的方形培养皿里倒板，吹干后，将15mL浓度为1％的琼脂糖(先冷却到50～60℃后加入300μL NS25菌液)铺在上面，吹干。用直径为5mm的打孔器打孔，灭菌牙签挑去培养基后，向孔内注入20μL待测菌液，吹干，封口。把板正放在28℃培养箱里，培养16～18h，观察三种菌株作用后的培养基中是否有透明的抑菌圈，拍照记录实验结果(图5)。
由图5可知，菌株Q4-3作用后的培养基上出现了较明显的抑菌圈，而Q4-7、Q6-6未见抑菌圈，说明菌株Q4-3可轻微抑制木麻黄青枯病菌NS25的生长，从而有效防治植物青枯病。
实施例4托霍尼假单胞菌Q4-3菌株对植物青枯病的防治作用
在CPG固体平板上活化青枯菌NS25，封板后倒置于28℃培养箱培养48h；在LB固体平板上活化菌株Q4-3，封板后倒置于28℃培养箱培养24h。分别挑取Q4-3和NS25单菌落于含有10mL LB和CPG液体培养基的50mL离心管中，于28℃、200rpm摇床中培养至OD6001.0～1.5，得到种子液。
一、托霍尼假单胞菌Q4-3菌株对木麻黄青枯病的防治作用
种子液按1：100的比例分别加入到300mL LB、CPG液体培养基中，于28℃、200rpm摇床中振荡培养14～16h至OD6001.0～1.5。设置实验组(NS25+Q4-3组)、正对照(NS25组)、负对照(CK组)，每组处理3个重复。实验组(NS25+Q4-3组)：取60mL Q4-3菌液与等量的NS25菌液混合；正对照(NS25组)：取60mL NS25菌液与等量的LB液体培养基混合；负对照(CK组)：取60mL LB液体培养基与等量的CPG液体培养基混合。
采用伤根灌菌法对健康的木麻黄植株进行接种，具体是：用酒精消毒过的剪刀剪掉健康木麻黄植株一半的根须，取40mL前述三组混合液分别淋到木麻黄盆栽中，做3个重复，每天观察接种植物的生长状况，做好记录。
接种25天后木麻黄的生长状况如图6A所示，可见，实验组(NS25+Q4-3组)木麻黄的生长状况显著优于正对照(NS25组)，说明菌株Q4-3可有效防治木麻黄青枯病。
二、托霍尼假单胞菌Q4-3菌株对番茄青枯病、花生青枯病的防治作用
种子液按1：100的比例分别加入到300mL LB、CPG液体培养基中，于28℃、200rpm摇床中振荡培养14～16h至OD6001.0～1.5。设置实验组(NS25+Q4-3组)、正对照(NS25组)、负对照(CK组)，每组处理3个重复。实验组(NS25+Q4-3组)：取1mL Q4-3菌液与等量的NS25菌液混合；正对照(NS25组)：取1mL NS25菌液与等量的LB培养基混合；负对照(CK组)：取1mL LB培养基与等量的CPG培养基混合。
用1mL注射器分别取200μL上述三组混合液注射到番茄、花生的茎部，做3个重复，每天观察番茄、花生的生长状况，做好记录。
接种7天后花生的生长状况如图6B所示，接种6天后番茄的生长状况如图6C所示，可见，实验组(NS25+Q4-3组)番茄、花生的生长状况显著优于正对照(NS25组)，说明菌株Q4-3可有效防治番茄青枯病和花生青枯病。
此外，青枯病的病情指数评判标准为：0，0％叶片枯萎；1，1～25％叶片枯萎；2，26～50％叶片枯萎；3，51～75％叶片枯萎，4，76～99％叶片枯萎；5，植株死亡。根据平均病情指数＝每种处理各重复的病情指数之和/重复数计算得到平均病情指数，即正对照(NS25组)平均病情指数分别为：木麻黄3.33(接种25天)，花生3.33(接种7天)，番茄3(接种6天)；实验组(NS25+Q4-3组)平均病情指数分别为：木麻黄0.67，花生0，番茄0。
再根据生防效果(％)＝(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数×100％计算可知，菌株Q4-3对木麻黄青枯病的生防效果为79.88％，对花生青枯病和番茄青枯病的生防效果均为100％，说明菌株Q4-3可有效治疗和/或预防木麻黄青枯病、花生青枯病和番茄青枯病，尤其是对花生青枯病和番茄青枯病的防治效果最佳。
综上，本发明所述托霍尼假单胞菌Q4-3菌株可通过降解青枯劳尔氏菌产生的3-OHPAME，以及轻微抑制青枯劳尔氏菌的生长来实现对植物青枯病的有效防治，尤其是对花生青枯病和番茄青枯病的防治效果最佳(高达100％)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1. 一株托霍尼假单胞菌（Pseudomonas sp.）Q4-3菌株，其特征在于，所述托霍尼假单胞菌Q4-3菌株于2021年11月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：62060。
2.权利要求1所述托霍尼假单胞菌Q4-3菌株在制备防治植物青枯病的菌剂中的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述植物为花生、番茄、木麻黄的一种或几种。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述青枯病为青枯劳尔氏菌引起的细菌性病害。
5. 根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述防治植物青枯病为降解青枯劳尔氏菌产生的3-OH PAME。
6.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述防治植物青枯病为抑制青枯劳尔氏菌的生长。
7.一种防治植物青枯病的菌剂，其特征在于，所述菌剂包括权利要求书1所述托霍尼假单胞菌Q4-3菌株或其菌液。
8. 根据权利要求7所述菌剂，其特征在于，所述托霍尼假单胞菌Q4-3菌株在菌剂中的浓度为OD600 1.0～1.5。
9.根据权利要求7所述菌剂，其特征在于，所述菌剂的给药方式为接种。
10.根据权利要求9所述菌剂，其特征在于，所述接种为伤根灌菌接种或注射接种。
CN202210357007.3A 2022-04-06 2022-04-06 一株托霍尼假单胞菌q4-3菌株及其在治疗和/或预防青枯病中的应用 Active CN114657101B (zh)

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