CN113025501A - 一株多功能棘孢木霉菌及其应用 - Google Patents

一株多功能棘孢木霉菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一株棘孢木霉菌及其应用。经研究发现，本发明的棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)T0206菌株在抑制枯萎病病原菌等多种病原菌，抑制黄瓜枯萎病等病害以及降解酚酸类物质方面具有非常好的效果，这种具有防病能力和酚酸类物质降解能力的多功能生防微生物及其微生物制剂对缓解由枯萎病和酚酸类物质胁迫引起的作物连作障碍的发生和提高作物产量具有重要意义。

Description

一株多功能棘孢木霉菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一株多功能棘孢木霉菌及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
枯萎病等土传病害的发生和根系分泌的酚酸类物质的化感作用是设施蔬菜连作障碍形成的主要原因。当植物连续种植时，根系分泌释放的酚酸类物质积累达到一定浓度，就会抑制下茬植物的生长，降低植株对枯萎病的抵抗能力。同时，阿魏酸等酚酸类物质可以促进枯萎病病原菌孢子的萌发，加重枯萎病的发生。
近几年，作物的连作障碍可通过特殊的栽培措施解决，但绝大多数作物的连作障碍至今未有切实可行的消减技术，如黄瓜、大豆、花生和人参等作物。目前生产上主要通过选择合理的种植制度、选育栽培具有优良化感性状的品种、科学合理施肥和生物防治等措施缓解作物连作障碍。在农业减肥减药的大环境下，生物防治已逐步成为减轻连作障碍的重要手段，它是利用有益微生物抑制土壤中病原菌的生长繁殖和降解酚酸类有害物质的一种方法。
发明人研究发现目前主要生防微生物的开发主要集中在单一的枯萎病防治或酚酸类有害物质降解，对有效的缓解连作障碍效果不佳。
发明内容
为了解决单一的枯萎病防治或酚酸类有害物质降解，对有效地缓解连作障碍效果不佳的问题，本发明提供一株有能力抑制枯萎病病原菌等多种病原菌的棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)T0206菌株，经研究发现，其在抑制枯萎病病菌等多种病原菌，抑制黄瓜枯萎病等病害以及降解酚酸类物质方面具有非常好的效果，这种同时具有防病能力和酚酸类物质降解能力的多功能生防微生物对缓解由枯萎病和酚酸类物质胁迫引起的作物连作障碍的发生和提高作物产量具有重要意义，同时也是农业可持续发展的需要。
具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
本发明第一方面，提供一株棘孢木霉菌(T.asperellum)T0206菌株，该菌株已于2021年3月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其生物保藏号为CGMCCNo.21467。
所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物和发酵产物也属于本发明的保护范围。
本发明第二方面，提供一种微生物制剂，所述微生物制剂含有棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物。
本发明第三方面，提供一种病害抑制剂，所述病害抑制剂含有棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物。
本发明第四方面，提供一种降解制剂，所述降解制剂含有棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物。
本发明第五方面，提供一种酚酸类物质耐受剂，所述酚酸类物质耐受剂含有棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物。
本发明第六方面，提供一种棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物的下述任一种应用：
1)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在抑制病原菌中的应用；
2)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备病原菌抑制剂中的应用；
3)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备病害抑制剂中的应用；
4)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在抑制病害中的应用；
5)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备降解制剂中的应用；
6)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备酚酸类物质耐受剂中的应用；
7)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备降解酚酸类物质中的应用。
本发明第七方面，提供一种促进植株生长的方法，所述方法包括向植株表面和/或周围土壤中喷施棘孢木霉菌T0206菌株的孢子悬浮液、棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物或/和微生物制剂或/和病原菌抑制剂或/和病害抑制剂或/和降解制剂或/和酚酸类物质耐受剂。
本发明一个或多个实施例具有以下有益效果：
1)本发明的棘孢木霉菌T0206菌株，可以在大田中使用并对苦瓜枯萎病有一定程度的防治效果，在移栽45天后防病效果达62.05％，温室盆栽试验中对黄瓜枯萎病的防效达到50％以上。
2)本发明的棘孢木霉菌T0206菌株对黄瓜枯萎病病原菌(尖镰孢菌黄瓜专化型Fusarium oxysporum f.sp.cucumebrium)、苦瓜枯萎病病原菌(尖镰孢菌苦瓜专化型F.oxysporum f.sp.momordicae)、番茄枯萎病病原菌(尖镰孢菌番茄专化型F.oxysporumf.sp.lycopersici)、烟草黑胫病菌(烟草疫霉Phytophthora nicotianae)、烟草根腐病菌(腐皮镰孢菌F.solani)、水稻纹枯病菌(立枯丝核菌Rhizoctonia solani)、辣椒炭疽病菌(辣椒刺盘孢Colletotrichum capsici)、马铃薯黑痣病菌(立枯丝核菌R.solani)、杨树烂皮病菌(污黑腐皮壳菌Valsa sordida)、苹果树腐烂病菌(苹果黑腐皮壳菌V.mali)、杨树水泡溃疡病菌(葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea)有较好的抑制作用，其中对苦瓜枯萎病病原菌的抑制效果最高，达到76.84％。
3)经试验证明，本发明的棘孢木霉菌T0206菌株，可以在含有阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸的培养基(浓度为20-600μg·mL-1)中生长，其中肉桂酸和对羟基苯甲酸能够促进T0206菌株的生长。
4)本发明系首次从苦瓜枯萎病发病土壤中分离获得的棘孢木霉T0206菌株，该菌株对植物土传病害枯萎病具有较强拮抗作用，同时对阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸等酚酸类物质具有较强降解能力，将可能为作物枯萎病及其它园艺作物的连作障碍缓解提供新的生防菌，提高作物连作障碍治理效果。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明实施例1中棘孢木霉T0206菌株菌落形态图；
图2为本发明实施例1中棘孢木霉T0206菌株分生孢子梗形态图；
图3为本发明实施例1中棘孢木霉T0206菌株对尖镰孢菌SG-15的平皿对峙效果；
图4为本发明实施例1中棘孢木霉T0206菌株基于单拷贝基因的系统发育树；
图5为本发明实施例7中棘孢木霉T0206菌株对4种酚酸类物质的耐受性评估。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了解决单一的枯萎病防治或酚酸类有害物质降解，对有效的缓解连作障碍效果不佳的问题，本发明提供一株具有抑制枯萎病病原菌等多种病原菌的棘孢木霉菌(T.asperellum)T0206菌株，经研究发现，其在抑制黄瓜枯萎病病原菌等多种病原菌，抑制黄瓜枯萎病等病害以及降解酚酸类物质方面具有非常好的效果，这种具有防病能力和酚酸类物质降解能力的多功能生防微生物对缓解由枯萎病和酚酸类物质胁迫引起的作物连作障碍的发生和提高作物产量具有重要意义，同时也是农业可持续发展的需要。
具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
本发明第一方面，提供一株棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)T0206菌株，该菌株已于2021年3月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，其生物保藏号为CGMCC No.21467。
该菌株是从山东省泰安市山东农业大学试验基地采集的苦瓜枯萎病病土中分离得到，菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(potato dextrose ager，PDA)上生长较快，4天左右长满整个平板，紧贴培养基表面产生短绒毛状气生菌丝；产孢簇离散分布于平板表面，初期白色，后期变绿。分生孢子梗顶端具两个或多个瓶梗，瓶梗较直，安剖形，中部稍微加粗，基部稍有缢缩，分生孢子球形至卵圆形，墨绿色。
在本发明一个或多个实施例中，棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物和发酵产物也属于本发明的保护范围。
本发明第二方面，提供一种微生物制剂，所述微生物制剂含有棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物。
在本发明一个或多个实施例中，所述微生物制剂既能抑制病原菌生长，又能降解酚酸类物质；
优选地，所述微生物制剂对下述全部或部分病原菌具有抑制作用：黄瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、烟草黑胫病菌、烟草根腐病菌、水稻纹枯病菌、辣椒炭疽病菌、马铃薯黑痣病菌、杨树烂皮病菌、苹果树腐烂病菌、杨树水泡溃疡病菌；
优选地，所述酚酸类物质选自阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸。
在本发明一个或多个实施例中，本发明还提供上述微生物制剂的制备方法，包括如下步骤：使用瓶装方式发酵上述的棘孢木霉菌(T.asperellum)T0206菌株，得到发酵产物。
上述制备方法中，发酵采用的发酵培养料的原料组成为：麦粒70-80％、麦麸10-20％、腐殖酸10-20％，均为质量百分比。
述制备方法中，发酵的条件为：25-30℃，培养：8-15天；优选为28℃、培养10天。
进一步的，上述制备方法中，还包括：将发酵产物中的发酵培养物晾干、孢子收集等步骤。
本发明第三方面，提供一种病害抑制剂，所述病害抑制剂含有棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物。
在本发明一个或多个实施例中，所述病害为下述全部或部分病害：黄瓜枯萎病、苦瓜枯萎病、番茄枯萎病、烟草黑胫病、烟草根腐病、马铃薯黑痣病、苹果树腐烂病。
所述枯萎病体现在减轻枯萎病的危害症状。
上述病害抑制剂的活性成分可以是棘孢木霉菌T0206菌株和/或棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物，上述病害抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述病害抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效果确定。
本发明第四方面，提供一种降解制剂，所述降解制剂含有棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物。
在本发明一个或多个实施例中，所述降解制剂对酚酸类物质具有降解作用；
优选地，所述酚酸类物质选自阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸。
本发明第五方面，提供一种酚酸抑制剂，所述降解制剂含有棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物。
在本发明一个或多个实施例中，所述酚酸类物质选自阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸。
本发明第六方面，提供一种棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物的下述任一种应用：
1)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在抑制病原菌中的应用；
2)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备病原菌抑制剂中的应用；
3)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备病害抑制剂中的应用；
4)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在抑制病害中的应用；
5)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备降解制剂中的应用；
6)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备酚酸类物质耐受剂中的应用；
7)棘孢木霉菌T0206菌株或/和棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备降解酚酸类物质中的应用。
在本发明一个或多个实施例中，所述病原菌选自下述全部或部分病原菌：黄瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、烟草黑胫病菌、烟草根腐病菌、水稻纹枯病菌、辣椒炭疽病菌、马铃薯黑痣病菌、杨树烂皮病菌、苹果树腐烂病菌、杨树水泡溃疡病菌；
所述病害选自下述全部或部分病害：黄瓜枯萎病、苦瓜枯萎病、番茄枯萎病、烟草黑胫病、烟草根腐病、马铃薯黑痣病、苹果树腐烂病；
所述酚酸类物质选自阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸。
本发明第七方面，提供一种促进植株生长的方法，所述方法包括向植株表面和/或周围土壤中喷施棘孢木霉菌T0206菌株的孢子悬浮液、棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物或/和微生物制剂或/和病原菌抑制剂或/和病害抑制剂或/和降解制剂或/和酚酸类物质耐受剂。
迄今国内外尚未报道，同时具有防治枯萎病能力和酚酸降解能力等多功能的棘孢木霉菌株，本发明系首次从苦瓜枯萎病发病土壤中分离获得的棘孢木霉T0206菌株，该菌株对植物土传病害枯萎病具有较强拮抗作用，对阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸等酚酸类物质具有较强降解能力，将可能为作物枯萎病及其它园艺作物的连作障碍缓解提供新的生防菌，提高作物连作障碍治理效果。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
实施例1：菌株的分离和鉴定
1.菌株的分离：
从山东省泰安市山东农业大学试验基地采集苦瓜枯萎病病土，采用土壤稀释涂布法进行处理，将土样梯度稀释后，取100μL稀释度为104、105、106的稀释液均匀的涂布在含有PDA培养基的平板上，25℃恒温培养，3天后逐日观察，待有菌丝长出时，挑取菌丝块转移到新的PDA平板上继续培养。待产生孢子时，进行单孢分离纯化，将纯化好的菌株进行编号，斜面保存备用。
PDA培养基配方：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂17g、自来水1000mL。
2.棘孢木霉菌T0206菌株显微形态结构观察结果
棘孢木霉菌T0206菌株在PDA培养基上生长较快，4天左右长满整个平板，紧贴培养基表面产生短绒毛状气生菌丝；产孢簇离散分布于平板表面，初期白色，后期变绿，菌落有特殊芳香气味；分生孢子梗顶端具两个或多个瓶梗，瓶梗较直，安剖形，中部稍微加粗，基部稍有缢缩，分生孢子球形至卵圆形，墨绿色，结果如图1和图2所示。
3.拮抗菌的筛选
将上述单孢分离纯化的菌株分别与枯萎病病原菌进行平皿对峙试验，采用两点对峙，用灭菌打孔器打取已活化好的各拮抗木霉菌株和尖镰孢菌SG-15菌株的菌饼，先将SG-15菌株的菌饼接在新鲜的PDA平皿一侧(距边缘2.5cm)，再将拮抗菌点接在距离SG-15菌饼4.0cm处，以仅接病原菌菌SG-15饼的平皿为对照。放入28℃恒温培养箱倒置培养。5d后，测量处理和对照的菌落直径，计算菌丝生长抑制率。棘孢木霉菌T0206菌株与尖镰孢菌SG-15菌株的对峙培养效果如图3所示。
抑菌率＝(对照平板菌落直径－对峙平板菌落直径)/对照平板菌落直径×100％。
试验结果见表1。
表1不同木霉菌株对尖镰孢菌菌落生长的抑制效果
Figure BDA0003004307250000081
4.T0206菌株的分子生物学鉴定
将T0206菌株接于PDA培养基，28℃培养3天，用无菌手术刀，刮下0.5g菌丝，研磨，用DNA试剂盒法提取真菌的基因组DNA。采用全基因组鸟枪法(Whole Genome Shotgun，WGS)策略，构建不同插入片段的文库，利用第二代测序技术(Next-Generation Sequencing，NGS)，基于Illumina Novaseq测序平台获得T0206菌株的基因组框架图。首先基于T0206菌株的ITS序列Blast比对分析，选取10-20个参考菌株基因组，进行平均核苷酸一致性分析(Average Nucleotide Identity,ANI)，然后基于单拷贝基因构建进化树。
基于单拷贝基因构建进化树方法：首先对所选菌株基因组进行基因家族分析，基于同源基因聚类分析的结果，选取单一拷贝的同源基因进行多序列比对，去除序列比对中的不可靠序列比对位点。采用RAxML(version 8.2.12)软件中的最大似然法(MaximumLikelihood)构建系统发育树(CriscuoloA，2011)，建树完成后，对系统发育树分支的可靠性进行验证，结果如图4所示。系统发育树显示T0206菌株与Trichoderma asperellum聚在同一分支上，基因序列相似性为100％。基于序列相似性和系统发育分析，并结合其生理生化指标，将拮抗菌株T0206菌株鉴定为Trichoderma asperellum。
实施例2：棘孢木霉菌T0206菌株抑菌能力测定
将实施例1步骤3中对枯萎病病原菌具有较强拮抗活性的木霉菌株与黄瓜枯萎病病菌等多种病原真菌分别进行平皿对峙试验，采用两点对峙(实验参数参照施例1步骤3)，以不接棘孢木霉菌T0206菌株的为对照，计算菌落生长抑制率。试验结果见表2。
表2T0206菌株对不同病原菌菌落生长的抑制效果
Figure BDA0003004307250000091
实施例3：棘孢木霉菌T0206菌株微生物制剂的制备
1.种子液的制备
将4℃下保存在试管斜面上的实施例1分离保藏的T0206菌株(CGMCC No.21467)的菌种，转移到新鲜的PDA培养基平板上活化，于28℃培养3天长出新鲜菌丝后，再转移到大批新鲜的PDA平板上，于28℃培养5天。待产生孢子后，无菌条件下刮取下来，用无菌水制备成浓度为1×105cfu·mL-1的孢子悬浮液即为T0206菌株种子液。
PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL。
2.微生物制剂的制备
将5mL T0206菌株接种到灭菌的发酵培养料中，发酵培养料的配方为：麦粒75％、麦麸10％、腐殖酸15％(均为质量百分比)，28℃、培养10天。待培养料干燥后，使用325目的筛网收集T0206菌株分生孢子，并与腐殖酸原粉等复混，制成有效孢子含量为2×107cfu·g-1的T0206菌株微生物制剂，以备使用。
实施例4：T0206菌株微生物制剂在防治黄瓜枯萎病中的应用
1.试验方法：
试验设3个处理，分别为：处理组，添加实施例3中制备的T0206菌株微生物制剂，记为T0206；阳性对照处理组，添加灭活的T0206菌株微生物制剂，记为MT0206；阴性对照组，添加等量的不含有T0206菌株的微生物制剂载体，记为CK。
防病试验在温室中进行，选取生长良好，3-4叶期的黄瓜苗移栽到含有黄瓜枯萎病病原菌的土壤中(每克土壤中病原菌数量为1×106cfu)，每处理设3个重复，每重复30株幼苗。接种病原菌后，处理组(T0206)每株添加5gT0206菌株微生物制剂(有效成分含量2×107cfu·g-1)，阳性对照组(MT0206)每株添加5g灭活的T0206菌株微生物制剂，阴性对照组(CK)每株添加5g腐殖酸原粉。15天后调查黄瓜苗发病情况与病情指数，计算防治效果。试验重复4次。
病情指数＝Σ(各级代表值×各级病株数)/(最高级代表值×总株数)×100
防治效果(％)＝(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数×100
移栽15天后调查黄瓜枯萎病发病情况。黄瓜苗期枯萎病分级标准：0级，无症状；1级，真叶、子叶黄化面积或枯萎面积不超过总面积的50％；2级，真叶、子叶黄化面积或枯萎面积超过总面积的50％；3级，叶片枯萎或枯死，仅生长点存活；4级，植株枯死。
2.试验结果：
温室盆栽防病试验结果表明，T0206菌株对黄瓜枯萎病的防治效果明显(结果见表3)。经T0206菌株处理后的黄瓜幼苗，可明显降低黄瓜枯萎病的发病率与病情指数，防治效果可达到55.14％，且黄瓜幼苗发病时间比对照组植株较晚，说明经T0206菌株微生物制剂处理可增强黄瓜幼苗对枯萎病的抗病能力。
表3T0206菌株微生物制剂对黄瓜枯萎病的防治效果
Figure BDA0003004307250000111
注：MT0206代表灭活的T0206菌株微生物制剂
实施例5：棘孢木霉菌T0206菌株微生物制剂在防治或抑制苦瓜枯萎病中的应用
1.试验方法：
试验设3个处理，分别为：处理组，添加实施例3中制备的T0206菌株微生物制剂，记为T0206；阳性对照处理组，添加灭活的T0206菌株微生物制剂，记为MT0206；阴性对照组，添加等量的不含有T0206菌株的制剂载体，记为CK。。
防病试验在大田中进行，选取生长良好，3-4叶期的苦瓜苗移栽到含有苦瓜枯萎病病原菌的土壤中(每克土壤中病原菌数量为1×106cfu)，每处理设3个重复，每重复30株幼苗。接种病原菌后，处理组(T0206)每株添加5gT0206菌株微生物制剂(有效成分含量2×107cfu·g-1)，阳性对照组(MT0206)每株添加5g灭活的T0206菌株微生物制剂，阴性对照组(CK)每株添加5g腐殖酸原粉。15天后调查苦瓜苗发病情况与病情指数，计算防治效果。试验重复4次。
病情指数＝Σ(各级代表值×各级病株数)/(最高级代表值×总株数)×100
防治效果(％)＝(对照组病情指数－处理组病情指数)/对照组病情指数×100
移栽15天后调查苦瓜枯萎病发病情况。病害分级标准：0级，无病症；1级，子叶发黄；3级，子叶变黄且边缘皱缩，真叶正常；5级，子叶皱缩枯死，部分真叶发黄；7级，真叶发黄，部分叶片黄化或停止生长；9级，全株叶片黄化萎蔫或枯死。
2.试验结果：
大田防病试验结果表明，T0206菌株微生物制剂对苦瓜枯萎病的防治效果明显(结果见表4)。经T0206菌株处理后的苦瓜植株，可明显降低苦瓜枯萎病的发病率与病情指数，防治效果可达到43.33-62.05％，且苦瓜发病时间比对照组植株较晚。说明经T0206菌株微生物制剂处理后的苦瓜植株，可增强苦瓜对枯萎病的抗病能力。
表4T0206菌株微生物制剂对苦瓜枯萎病的防治效果
Figure BDA0003004307250000121
注：MT0206代表灭活的T0206菌株微生物制剂
实施例6：棘孢木霉菌T0206菌株微生物制剂对苦瓜促生作用
1.试验方法
该试验在温室盆栽中进行，试验设2个处理即CK对照组和T0206菌株处理组，将长势一致的苦瓜苗栽种到温室中，每个处理21株苗，T0206处理组栽苗时分别在苦瓜苗根部施加5gT0206菌株微生物制剂，CK对照组栽苗时分别在苦瓜苗根部施加5g腐殖酸原粉。
30天后测定各处理苦瓜苗的茎粗、地上部和根部长度、鲜重、干重(烘箱105℃保持30min，转为80℃烘干至恒重)等形态指标。
2.试验结果：
苦瓜植株在施加T0206菌株微生物制剂生长30天后，可以观察到T0206菌株微生物制剂处理组的株高高于CK对照，挖出苦瓜苗后可见T0206菌株处理的须根发达，新根更多；测定各处理植物鲜重、干重、株高、茎粗等生长指标，结果显示，相较于CK对照处理，T0206菌株微生物制剂处理的株高、茎粗、鲜重和干重分别提高了35.20％、13.59％、16.29％和17.19％，其结果具体见表5。
表5棘孢木霉菌T0206菌株微生物制剂处理对苦瓜苗生长的影响
Figure BDA0003004307250000122
实施例7：棘孢木霉菌T0206菌株对酚酸类物质降解能力测定
1.平皿定性测试
(1)试验方法
将T0206菌株接种于含有0μg·mL-1、20μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1、200μg·mL-1、400μg·mL-1和600μg·mL-1浓度的阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸的查氏培养基(无蔗糖)中，每个稀释浓度重复3次，于28℃恒温培养箱培养5天，待对照长满平皿后，采用十字交叉法测定菌落直径。
查氏无蔗糖培养基(Czapek-Dox medium)：KNO3 2g，KH2PO4 1g，KCl1g，MgSO4·7H2O0.5g，FeSO4 0.01g，琼脂20g，蒸馏水定容至1000mL。
(2)试验结果
平皿测试结果表明，T0206菌株对阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸等4种酚酸类物质都具有较高的耐受性(结果见图5)。与对照相比，T0206菌株在含有肉桂酸和对羟基苯甲酸的培养基中的生长速率更快，且随着酚酸浓度的增加菌落直径增加，这一结果说明T0206菌株可以较高效地利用肉桂酸和对羟基苯甲酸。
2.液相色谱测定
(1)试验方法
取T0206菌株孢子悬液2mL(孢子浓度为1×107cfu·mL-1)和无菌水(CK组)2mL分别接种于100mL含200μg·mL-1各酚酸类物质的查氏液体培养基中摇床培养(28℃，160r·min-1)，于72h取酚酸降解液，待萃取。用等体积乙酸乙酯与发酵液均匀混合后，超声30min后静置过夜，取上层乙酸乙酯旋转蒸干并回溶于2mL甲醇，高效液相检测酚酸含量。高效液相色谱检测使用分离柱为Waters公司的symmetey C18柱，检测波长为280nm，柱温30℃，进样量为20μL，流动相组分为甲醇和水(流动相中超纯水用分析纯的冰醋酸调节pH至2.8)，体积流量为1mL·min-1。
(2)查氏液体培养基(Czapek-Dox medium)：KNO3 2g，KH2PO4 1g，KCl 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4 0.01g，蔗糖30g，蒸馏水定容至1000mL。试验结果
通过液相色谱测定酚酸类物质的结果显示，与CK组相比，T0206菌株对阿魏酸、香草醛的消除率达到84％以上，对肉桂酸和对羟基苯甲酸的消除率达到95％以上。具体见表6。
表6棘孢木霉菌T0206菌株对阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸等的消除作用
Figure BDA0003004307250000141
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.棘孢木霉菌(Trichoderma asperellum)T0206菌株，该菌株已于2021年3月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.21467。
2.一种微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂含有权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株或/和权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物。
3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂既能抑制病原菌，又能降解酚酸类物质。
4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂对下述全部或部分病原菌具有抑制作用：黄瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、烟草黑胫病菌、烟草根腐病菌、水稻纹枯病菌、辣椒炭疽病菌、马铃薯黑痣病菌、杨树烂皮病菌、苹果树腐烂病菌、杨树水泡溃疡病菌；
优选地，所述酚酸类物质选自阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸。
5.一种病害抑制剂，其特征在于，所述病害抑制剂含有权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株或/和权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物；
优选地，所述病害为下述全部或部分病害：黄瓜枯萎病、苦瓜枯萎病、番茄枯萎病、烟草黑胫病、烟草根腐病、马铃薯黑痣病、苹果树腐烂病。
6.一种降解制剂，其特征在于，所述降解制剂含有权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株或/和权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物；
优选地，所述降解制剂对酚酸类物质具有降解作用；
优选地，所述酚酸类物质选自阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸。
7.一种酚酸类物质耐受剂，其特征在于，所述酚酸类物质耐受剂含有权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株或/和权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物；
优选地，所述酚酸类物质选自阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸。
8.权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株或/和权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物的下述任一种应用：
1)权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株或/和权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在抑制病原菌中的应用；
2)权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株或/和权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备病原菌抑制剂中的应用；
3)权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株或/和权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备病害抑制剂中的应用；
4)权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株或/和权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在抑制病害中的应用；
5)权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株或/和权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备降解制剂中的应用；
6)权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株或/和权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备酚酸类物质耐受剂中的应用；
7)权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株或/和权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物在制备降解酚酸类物质中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述病原菌选自下述全部或部分病原菌：黄瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、烟草黑胫病菌、烟草根腐病菌、水稻纹枯病菌、辣椒炭疽病菌、马铃薯黑痣病菌、杨树烂皮病菌、苹果树腐烂病菌、杨树水泡溃疡病菌；
所述病害选自下述全部或部分病害：黄瓜枯萎病、苦瓜枯萎病、番茄枯萎病、烟草黑胫病、烟草根腐病、马铃薯黑痣病、苹果树腐烂病；
所述酚酸类物质选自阿魏酸、香草醛、肉桂酸和对羟基苯甲酸。
10.一种促进植株生长的方法，其特征在于，所述方法包括向植株表面和/或周围土壤中喷施权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的孢子悬浮液、权利要求1所述棘孢木霉菌T0206菌株的代谢物或发酵产物或/和权利要求2所述微生物制剂或/和权利要求3所述病原菌抑制剂或/和权利要求5所述病害抑制剂或/和权利要求6所述降解制剂或/和权利要求7所述酚酸类物质耐受剂。
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