CN103329941A - 一种松杉人工林抗逆促生复合菌根菌剂及其制备和应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种针对松杉人工林的抗逆促生复合菌根菌剂及其制备和应用方法，由内生菌根菌剂和外生菌根菌剂复合而成；所述的内生菌根菌剂为摩西球囊霉(Glomus mosseae)或根内球囊霉(Glomus intraradices)采用温室盆栽培养法获得，所述的外生菌根菌剂为红汁乳菇（Lactarius hatsudake Tanaka）、多根硬皮马勃（Seleroderma polyrhizum Pers.）采用液体发酵培养基发酵而成。通过造林时对苗木根系进行蘸浆处理或埋于松、杉林土壤中，不仅能促进松、杉的生根、生长，还能增强树势，提高抗逆性，增强P的吸收率，预防松树落叶病、杉木炭疽病、松苗立枯病和猝倒病的发生。
Description
技术领域：
本发明涉及一种促进马尾松、湿地松、杉木生根、生长，改善水分、养分代谢，改良土壤、抗逆保健和提高生产力的松杉人工林抗逆促生复合菌根菌剂及其制备和应用方法，特别是对松杉人工林病害具有较好的抑制作用，提高对P的吸收利用效率。
背景技术：
我国人工林面积占全球人工林总面积的近三分之一，居世界首位。但是，我国人工林目前存在许多重大问题，如病虫危害日益加剧，地力衰退严重，生产力下降等，严重威胁人工林的建设和森林的可持续经营。为实现我国人工林，特别是用材林基地的可持续经营，保持森林的生产力和长久健康，亟待开展人工林森林生态系统中植物、动物、微生物间的相互共生关系，特别是菌根菌类微生物在森林生态系统的功能，以及利用菌根菌类微生物培育森林树木新方法的研究。随着菌剂制作技术的发展，高效复合菌根菌肥成为人工林发达国家研究的热点问题。
近年来，国内外学者在菌根真菌应用方面普遍加大了研究力度。国际上美国、法国、日本、澳大利亚、加拿大等国家和台湾地区新开发的菌根真菌的商品化接种剂种类不断增加。近年来，我国菌根菌肥生产开发的主要是松树外生菌根真菌Psolithus tinctorius（Pt）菌剂，由于外生菌根真菌菌剂可以工厂化生产，该类微生物肥料在我国已成功应用于经济林木育苗、荒山造林等方面。但与外生菌根真菌菌剂相比，我国内生菌根菌(AM)菌剂的生产较困难，生产成本高，在实际生产中的应用一直受到限制，而由内生和外生菌根优化组合而成的高效复合菌根菌肥尚无商业产品。随着我国林业六大工程体系的建设，复合菌根菌剂在人工林可持续发展中将会发挥其应有的经济效益、生态效益和社会效益。因此，以松杉林为对象，开展复合菌根菌剂研究，为建立适合我国国情的高效复合菌根菌肥制作及应用技术体系，是当前人工林发展一项紧迫的工作任务。
本研究成果对于实现菌根菌剂的产业化开发，促进菌根菌剂在林业上的应用具有积极作用，同时，为有效提高松杉人工林造林成活率，减少病虫害危害、恢复衰退地力，保护植被及生态系统多样性，保持林业的生产力和长久健康，实现我国人工林的可持续经营具有重要意义。
发明内容：
本发明的目的是提供一种松杉人工林的抗逆促生复合菌根菌剂及其制备和应用方法，该抗逆促生复合菌根菌剂提高了松杉苗的成活率和生长速度，增强了松杉树抗病害的能力及对P吸收利用效率。
本发明的技术方案是：
一种松杉人工林的抗逆促生复合菌根菌剂的制备方法，由内生菌根菌剂和外生菌根菌剂复合而成；所述的内生菌根菌剂为摩西球囊霉(Glomus mosseae)或根内球囊霉(Glomusintraradices)中的一种培养获得的含有侵染性的孢子、菌根及培养基质的混合体；所述的外生菌根菌剂为红汁乳菇（Lactarius hatsudake）和多根硬皮马勃(Seleroderma polyrhizum Pers.)分别采用液体发酵培养基发酵而成的培养物的混合物；内、外生菌根菌剂混合质量比例为1:1；外生菌根菌剂中多根硬皮马勃与红汁乳菇的液体发酵培养物的质量比为2:1；
在液体发酵培养之前先将红汁乳菇（Lactarius hatsudake）和多根硬皮马勃(Selerodermapolyrhizum Pers.)分别经过平板固体培养基扩繁培养，然后接种到液体发酵培养基中进行液体发酵培养；所述的液体发酵培养条件：用直径4-6mm的无菌打孔器,切取固体平板上培养的红汁乳菇（Lactarius hatsudake）和多根硬皮马勃(Seleroderma polyrhizum Pers.)菌片，分别接种于盛有80ml液体发酵培养基的300ml三角瓶中；所述的液体发酵培养基为PDAM液体培养基，pH值调为6，每瓶各接种3-5片；置25℃-28℃、转速180-200r·min–1摇床上恒温培养10-12d。
所述的摩西球囊霉(Glomus mosseae)和根内球囊霉(Glomus intraradices)均采自杉木林地；所述的多根硬皮马勃(Seleroderma polyrhizum Pers.)和红汁乳菇（Lactarius hatsudake）均采自马尾松或湿地松树林。
所述的内生菌根菌剂中摩西球囊霉Glomus mosseae和根内球囊霉Glomus intraradices孢子密度分别至少达到103个/ml、97个/ml。
所述的平板固体培养基配方和条件：采用综合PDA培养基：20wt%马铃薯汁1000mL、葡萄糖18g、磷酸二氢钾3.0g、硫酸镁1.2g、琼脂20g、维生素B10.01g；于超净工作台上制成平板培养基，培养温度范围是25℃-28℃；pH范围是5-6；培养时间7-10天。
一种松杉人工林的抗逆促生复合菌根菌剂，是由上述的方法制备而成的菌剂。
所述的松杉人工林的抗逆促生复合菌根菌剂的应用方法，施用于马尾松、湿地松或杉木树根或土壤中，提高松杉树的成活率和生长速度，促进松杉的生长，提高松树、杉木对P的吸收利用效率，改善土壤肥力，从而增强松、杉树抗病能力。40g/m2-60g/m2的施用量为松树的施用量，70g/m2-80g/m2的施用量为杉木的施用量；每平米有80-100株一年生苗。具体是在造林时，将所述的抗逆促生复合菌根菌剂按照1千克复合菌根菌剂:40千克水的比例加入水制成泥浆，将松杉树幼苗根系蘸浆，然后种植。或者具体是在松杉人工成林时，每225g所述的抗逆促生复合菌根菌剂中加入25g的聚丙烯酰胺型保水剂，充分混合后，在树体周围的土壤中挖坑埋入即可。
具体实施方式：
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1：优良外生菌株筛选
采自松林的外生菌根真菌多根硬皮马勃Seleroderma polyrhizum Pers.、光硬皮马勃Scleroderma cepa Pers.、红汁乳菇Lactarius hatsudake Tanaka、橙红乳菇Lactarius akahatsu，褐环乳牛肝菌Suillus luteus、乳牛肝菌Suillus bovines、鸡油菌Cantharellus cibarius Fr.、菱红菇Russula vesca Fr.、毒鹅膏菌Amanita phalloides、大孢硬皮马勃Scleroderma bovista Fr.10种子实体经组织分离于综合PDA培养，培养条件：培养基为综合PDA（20%马铃薯汁1000mL、葡萄糖18g、磷酸二氢钾3.0g、硫酸镁1.2g、琼脂20g、维生素B10.01g）；培养温度范围是25℃-28℃；pH范围是5-6；制成培养基用于一级种平板培养7天。观察各菌株的生长情况。
获得一级种后，采用回接实验，检测与马尾松、湿地松幼苗菌根合成能力影响。接种4个月后，从菌根形成及生长情况结果得出，多根硬皮马勃Seleroderma polyrhizum Pers.、光硬皮马勃Scleroderma cepa Pers.、红汁乳菇Lactarius hatsudake Tanaka、橙红乳菇Lactariusakahatsu分离培养特性较好，菌丝长速较快，气生菌丝量较多，可以较好与马尾松、湿地松幼苗形成菌根，他们与马尾松、湿地松幼苗菌根合成能力结果见表1。实验结果表明，接种4个月后，发现接种多根硬皮马勃Seleroderma polyrhizum Pers.、红汁乳菇Lactarius hatsudake的与马尾松苗木的增长率，增长率分别比对照提高42.35%和29.45%；光硬皮马勃Sclerodermacepa Pers.与马尾松的菌根合成性能相对较差。与湿地松的菌根合成性能比较最好的为光硬皮马勃Scleroderma cepa Pers.、其次是多根硬皮马勃Seleroderma polyrhizum Pers.、和红汁乳菇Lactarius hatsudake Tanaka。
综合比较而言，接种红汁乳菇Lactarius hatsudake、多根硬皮马勃Seleroderma polyrhizumPers.均对马尾松、湿地松苗木的增长率、侵染率都具有促进作用，有利于提高马尾松、湿地松人工造林的有效性。
表1 6株外生菌根菌与松树幼苗的菌根合成情况
注：菌根形成情况用“+”表示；Note：+means the degree of Mycorrhizal synthesis
实施例2：内、外生菌株的优良组合筛选
内生菌根真菌为摩西球囊霉Glomus mosseae或根内球囊霉Glomus intraradices；外生菌根真菌为多根硬皮马勃和红汁乳菇；
其中：内生菌根菌剂是温室盆栽培养法扩繁培养获得的含有侵染性的孢子、菌根及培养基质的混合体。具体为，摩西球囊霉Glomus mosseae或根内球囊霉Glomus intraradices以高粱为宿主植株，以沙:蛭石:土=2:1:1为培养基质，以20株/5L盆为栽培密度，同时每周施2次浓度为30%的Hoagland’s营养液。培养3-4个月后检测培养基质中孢子密度分别可达到103个/ml、97个/ml，菌根侵染率分别可达到89.6%、88.9%。
外生菌根菌剂为二级液体发酵菌剂。先将红汁乳菇（Lactarius hatsudake）和多根硬皮马勃(Seleroderma polyrhizum Pers.)经过平板固体培养基扩繁培养，然后分别接种到液体发酵培养基中进行液体发酵培养得到培养物，再混合；液体发酵培养基及培养条件为：以PDAM液体培养基为基础培养基，以葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源，pH值调为6；用直径4-6mm的无菌打孔器，切取平板固体平板上培养的红汁乳菇（Lactarius hatsudake）和多根硬皮马勃(Seleroderma polyrhizum Pers.)菌片，分别接种于盛有80ml液体发酵培养基的300ml三角瓶中，每瓶各接种3-5片；置25℃-28℃、转速180-200r·min–1摇床上恒温培养10-12d,即得。
将一种内生菌根菌剂与2种外生菌根菌剂分别单独接种、两两组合接种（按质量比为1:1的比例）以及三种组合接种（质量比为1:1:1）于马尾松、湿地松、杉木幼苗，由表2可以看出，实验结束时所有处理组的苗高、地径和侵染率都增长了。综合比较而言，对马尾松、湿地松、杉木生长的影响及侵染率效果最好的处理为内、外生菌根真菌的组合（A4与B2处理组），即摩西球囊霉/多根硬皮马勃/红汁乳菇。
表2不同接种处理对松、杉幼苗地径、苗高及侵染率的影响
Table2The effect of different streatments on growth and infection rate of Pinus and Chinese Fir
注（Note）：表中数值之后的字母表示Duncan’s检验结果，不同小写字母表示在5%水平差异显著（P=0.05）。
A1：多根硬皮马勃；A2：红汁乳菇；A3：多根硬皮马勃/红汁乳菇；A4：摩西球囊霉/多根硬皮马勃/红汁乳菇。
B1：摩西球囊霉；B2：摩西球囊霉/多根硬皮马勃/红汁乳菇。
实施例3：复合菌根菌剂中各菌株的不同比例筛选
在超净工作台上将内、外生菌根菌剂按不同比例混均，对松杉苗进行盆栽试验，综合比较各不同比例接种结果表明，摩西球囊霉:多根硬皮马勃:红汁乳菇的适宜比例范围为1-3:1-2:1；其中A2处理组对松杉苗生物量及菌根侵染率的影响效果最好，即摩西球囊霉:多根硬皮马勃:红汁乳菇=3:2:1；其次是A1处理组。结果如表3所示。（如无特殊说明，本发明中出现的菌株比例均是指培养之后的培养物的质量比例，如：摩西球囊霉Glomus mosseae或根内球囊霉Glomus intraradices是温室盆栽培养法扩繁培养获得的含有侵染性的孢子、菌根及培养基质的混合体。多根硬皮马勃和红汁乳菇是液体发酵培养基中进行液体发酵培养得到培养物）
表3内、外生菌根菌剂不同比例对松杉苗生长的影响
A1：摩西球囊霉:多根硬皮马勃:红汁乳菇=1:1:1；A2：摩西球囊霉:多根硬皮马勃:红汁乳菇=3:2:1；A3：摩西球囊霉:多根硬皮马勃:红汁乳菇=4:1:1。
实施例4：复合菌根菌剂对松杉人工林土壤理化性质的影响
将摩西球囊霉、多根硬皮马勃、红汁乳菇按3:2:1的比例制备复合菌根菌剂后接种松杉苗，研究复合菌根菌剂对松杉苗根际土壤酸碱性、有机质含量和氮、磷、钾含量的影响，结果如表4表明，与对照相比，接种复合菌根菌剂能显著降低松、杉苗根际土壤pH值、增加土壤有机质以及碱解氮、速效磷和速效钾的含量，从而明显改善了根际土壤的肥力，从而促进植物生长。
表4复合菌根菌剂对松杉人工林土壤理化性质的影响
1：摩西球囊霉:多根硬皮马勃:红汁乳菇=3:2:1；
实施例5：复合菌根菌剂的最佳施用量
在苗圃对松、杉播种苗做了不同施用量的田间试验，具体是在造林时，将抗逆促生复合菌根菌剂按照1千克复合菌根菌剂:40千克水的比例加入水制成泥浆，将松杉树幼苗根系蘸浆，然后种植。或者具体是在松杉人工成林时，每225g所述的抗逆促生复合菌根菌剂中加入25g的聚丙烯酰胺型保水剂，充分混合后，在树体周围的土壤中挖坑埋入即可。结果表明：施用菌肥后对松、杉苗生长的影响与对照不施菌肥相比均差异显著（表5-6）。其中，在40、50、60g/m2的施用量下湿地松地径增长的差异不显著，以50g/m2的施用量下湿地松地径增长最快，达到0.500±0.012mm；苗高方面50、60g/m2的施用量下湿地松苗高增长差异不显著，60g/m2施用量下湿地松苗高略大于50g/m2的苗高，再综合比较生物量指标，确定50g/m2的施用量为湿地松苗圃地的最佳施用量，每平米有80-100株一年生苗。
同样综合比较了不同施用量下杉木苗地径、苗高的增长及生物量指标，结果表明在80g/m2的施用量下杉木的地径、苗高增长最快，分别达到0.507±0.012mm、4.233±0.033cm，因而确定80g/m2是杉木苗圃地的最佳施用量。
表5不同用量对湿地松苗的地径和树高的影响
| 施肥条件(g/m2) | 地径/mm | 苗高/cm |
| 60 | 0.480±0.031c | 5.167±0.088d |
| 50 | 0.500±0.012c | 5.067±0.043d |
| 40 | 0.463±0.027c | 4.800±0.051c |
| 30 | 0.327±0.018b | 3.233±0.037b |
| CK | 0.253±0.007a | 2.467±0.067a |
表6不同用量对杉木苗的地径和树高的影响
| 施肥条件(g/m2) | 地径/mm | 苗高/cm |
| 80 | 0.507±0.012a | 4.233±0.033a |
| 70 | 0.480±0.020ab | 4.133±0.033a |
| 60 | 0.453±0.018b | 3.367±0.033b |
| 50 | 0.340±0.023c | 3.467±0.088b |
| CK | 0.267±0.013d | 2.200±0.058c |
同时对杉木幼林做了复合菌根菌肥对杉木幼林生长影响的试验。结果表明复合菌根菌肥对杉木幼林促生长作用明显，树高和地径明显提高（见表7），施肥的试验样地的平均树高增长量为135.7cm，比对照样地增加了46.54%；平均地径增长量为36.5mm，比对照样地增加了44.84%；同时杉木病害发生率控制在8%左右，促生、防病效果明显。因此，复合菌根菌肥可作为集促生、防病于一体的新型肥料施用于松杉林地。
表7施用复合菌根菌肥对杉木幼林树高、地径增长量及病害发生率的影响
| 处理组 | 树高增长量/cm | 地径增长量/mm | 病害发生率% |
| 施菌肥 | 135.7 | 36.5 | 8.3 |
| CK | 92.6 | 25.2 | 32.7 |
| 增长率/% | 46.54 | 44.84 | - |
单独采用根内球囊霉与多根硬皮马勃、红汁乳菇制备的复合菌根菌剂，采用上述使用方式使用时，也能达到上述类似的优异效果。
Claims (9)
1.一种松杉人工林的抗逆促生复合菌根菌剂的制备方法，其特征在于，由内生菌根菌剂和外生菌根菌剂复合而成；所述的内生菌根菌剂为摩西球囊霉(Glomus mosseae)或根内球囊霉(Glomus intraradices)中的一种培养获得的含有侵染性的孢子、菌根及培养基质的混合体；所述的外生菌根菌剂为红汁乳菇（Lactarius hatsudake）和多根硬皮马勃(Seleroderma polyrhizumPers.)分别采用液体发酵培养基发酵而成的培养物的混合物；内、外生菌根菌剂混合质量比例为1:1；外生菌根菌剂中多根硬皮马勃与红汁乳菇的液体发酵培养物的质量比为2:1；
在液体发酵培养之前先将红汁乳菇（Lactarius hatsudake）和多根硬皮马勃(Selerodermapolyrhizum Pers.)分别经过平板固体培养基扩繁培养，然后接种到液体发酵培养基中进行液体发酵培养；所述的液体发酵培养条件：用直径4-6mm的无菌打孔器,切取固体平板上培养的红汁乳菇（Lactarius hatsudake）和多根硬皮马勃(Seleroderma polyrhizum Pers.)菌片，分别接种于盛有80ml液体发酵培养基的300ml三角瓶中；所述的液体发酵培养基为PDAM液体培养基，pH值调为6，每瓶各接种3-5片；置25℃-28℃、转速180-200r·min–1摇床上恒温培养10-12d。
2.根据权利要求1所述的松杉人工林的抗逆促生复合菌根菌剂的制备方法，其特征在于，所述的摩西球囊霉(Glomus mosseae)和根内球囊霉(Glomus intraradices)均采自杉木林地；所述的多根硬皮马勃(Seleroderma polyrhizum Pers.)和红汁乳菇（Lactarius hatsudake）均采自马尾松或湿地松树林。
3.根据权利要求1所述的松杉人工林的抗逆促生复合菌根菌剂的制备方法，所述的内生菌根菌剂中摩西球囊霉Glomus mosseae和根内球囊霉Glomus intraradices孢子密度分别至少达到103个/ml、97个/ml。
4.根据权利要求1所述的松杉人工林的抗逆促生复合菌根菌剂的制备方法，其特征在于，所述的平板固体培养基配方和条件：采用综合PDA培养基：20wt%马铃薯汁1000mL、葡萄糖18g、磷酸二氢钾3.0g、硫酸镁1.2g、琼脂20g、维生素B10.01g；于超净工作台上制成平板培养基，培养温度范围是25℃-28℃；pH范围是5-6；培养时间7-10天。
5.一种松杉人工林的抗逆促生复合菌根菌剂，其特征在于，是由权利要求1-4任一项所述的方法制备而成的菌剂。
6.权利要求5所述的松杉人工林的抗逆促生复合菌根菌剂的应用方法，其特征在于，施用于马尾松、湿地松或杉木树根或土壤中，提高松杉树的成活率和生长速度，促进松杉的生长，提高松树、杉木对P的吸收利用效率，改善土壤肥力，从而增强松、杉树抗病能力。
7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，40g/m2-60g/m2的施用量为松树的施用量，70g/m2-80g/m2的施用量为杉木的施用量；每平米有80-100株一年生苗。
8.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，具体是在造林时，将所述的抗逆促生复合菌根菌剂按照1千克复合菌根菌剂:40千克水的比例加入水制成泥浆，将松杉树幼苗根系蘸浆，然后种植。
9.根据权利要求7所述的应用方法，其特征在于，具体是在松杉人工成林时，每225g所述的抗逆促生复合菌根菌剂中加入25g的聚丙烯酰胺型保水剂，充分混合后，在树体周围的土壤中挖坑埋入即可。
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