CN104186201A - 硬皮马勃人工栽培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及菌类人工栽培领域，具体而言，涉及一种硬皮马勃人工栽培方法。该硬皮马勃人工栽培方法，包括下列步骤：1)获得硬皮马勃菌种；2)培养宿主树无菌苗；3)待无菌苗长出侧根时，在其根系接种硬皮马勃菌种，保持基质湿润，维持温度为25℃±3℃，培养得到硬皮马勃菌根苗；4)在大棚内培养所述菌根苗，保持棚内温度25℃±3℃，培养3-6个月直至硬皮马勃子实体发育成熟。本发明所提供的栽培方法可以有效建立硬皮马勃菌种与宿主树的共生关系，菌根感染率高达80％-90％，合成菌根苗后继续培养至子实体成熟所需时间短。按照本发明所提供的栽培方法培养出的成熟硬皮马勃肉质肥厚，产量高。
Description
技术领域
本发明涉及菌类人工栽培领域，具体而言，涉及一种硬皮马勃人工栽培方法。
背景技术
硬皮马勃是一种食、药用真菌，最早载于《名医别录》，味辛性平，入肺经，有消肿、止血、解毒等功效，用于咽喉肿痛及各种出血。现代医学研究表明,硬皮马勃具有多种药理作用和临床应用，含有甾体化合物、萜类化合物、小分子含氮化合物、马勃多糖、蛋白质、肽类等化学成分有抑菌、抗炎、止咳、杀虫、抗肿瘤细胞的作用，具有很高的药用价值。崔磊2006年报道，从马勃的新鲜子实体中分离出新蛋白质，其对小鼠脾细胞显示一种抗促细胞分裂剂活性，能减少乳腺癌细胞的生存能力。从硬皮马勃中分离得一种类似泛激素的肽，此肽对乳腺癌细胞有较强的抗增殖活性。
硬皮马勃含有丰富的蛋白质、矿物质、微量元素及氨基酸，幼嫩子实体肉质细腻，美味可口而深受广大消费者的喜爱，是老百姓餐桌上喜闻乐见的美味佳肴，又因其公认的药用价值而成为一种重要的食、药用菌倍受消费者青睐。但硬皮马勃自然产量有限且随大量的人为采摘，资源越来越少。人工栽培是增加资源、保护生态环境，维持可持续发展的重要方向。但硬皮马勃需与树木形成共生关系才能生长子实体，而由于人工栽培很难成功建立硬皮马勃与其宿主树的共生关系，因此，目前硬皮马勃尚不能人工栽培。
发明内容
本发明的目的在于提供一种硬皮马勃人工栽培方法，以解决上述的问题。
本发明提供了一种硬皮马勃人工栽培方法，包括下列步骤：
(1)将含有硬皮马勃子实体的组织置于母种培养基中培养，得到硬皮马勃母种，将硬皮马勃母种接种到液体菌种培养基中，培养得到硬皮马勃液体菌种；
和/或，
将硬皮马勃孢子粉配制成硬皮马勃孢子悬浮液；
和/或，
将硬皮马勃液体菌种接种到固体菌种培养基中培养得到硬皮马勃固体菌种；
(2)将思茅松、云南松或高山松的种子培养至萌发出白色芽点移栽入无菌苗培养基中培养得到无菌苗；
(3)待无菌苗长出侧根时，在其根系接种硬皮马勃液体菌种、硬皮马勃孢子悬浮液或硬皮马勃固体菌种，保持基质湿润，维持温度为25℃±3℃，培养得到硬皮马勃菌根苗；
(4)在大棚内培养所述菌根苗，保持棚内温度25℃±3℃，培养3-6个月直至硬皮马勃子实体发育成熟。
本发明提供了三种硬皮马勃菌种与无菌苗接种合成菌根苗，分别为：硬皮马勃孢子悬浮液、硬皮马勃液体菌种和硬皮马勃固体菌种。这样不仅丰富了硬皮马勃菌种的来源，而且硬皮马勃孢子悬浮液和硬皮马勃液体菌种的制备和培养均比硬皮马勃固体菌种简单，并且最终栽培出的成熟硬皮马勃品质相差无几。
本发明选择思茅松、云南松或高山松为宿主树种，通过单独培养硬皮马勃菌种和单独培养宿主树的无菌苗，并通过选择在无菌苗长出侧根时接入硬皮马勃菌种，得到了硬皮马勃菌根苗，通过将硬皮马勃菌根苗在大棚内培养，并通过控制大棚内的温度使得硬皮马勃菌根苗在3-6个月即可培养为成熟的硬皮马勃。
优选地，所述液体菌种培养基包括下列组分，按重量份计：
马钤薯100-200份，葡萄糖10-20份，酒石酸铵1-2份，蛋白胨2-4份，MgSO41-2份，KH2PO41-2份，水500-1500份；优选地，马钤薯120-180份，葡萄糖12-18份，酒石酸铵1-2份，蛋白胨2-4份，MgSO41-2份，KH2PO41-2份，水800-1200份；
所述母种培养基为在所述液体菌种培养基各组分及用量的基础上增加15-20份的琼脂。
优选地，所述无菌苗培养基包括下列组分，按重量份计：
蛭石15000-40000份，珍珠岩20000-50000份，草炭50000-100000份，红壤土100000-300000份，腐殖质10000-30000份，磷酸二氢铵100-200份，MgSO4100-200份，KH2PO4100-200份；优选地，蛭石20000-30000份，珍珠岩30000-40000份，草炭60000-90000份，红壤土150000-250000份，腐殖质15000-25000份，磷酸二氢铵120-180份，MgSO4130-180份，KH2PO4120-180份；优选地，腐殖质包括牛粪和鸡粪。
优选地，所述固体菌种培养基包括下列组分，按重量份计：
木屑100000-200000份，麦粒10000-20000份，蔗糖100-200份，酒石酸铵100-200份，蛋白胨200-400份，MgSO4100-200份，KH2PO4100-200份；
优选地，在步骤(1)中，配制硬皮马勃孢子悬浮液的方法为：按重量份计，向50-500份硬皮马勃孢子粉中加入500-5000份无菌水。
优选地，在步骤(3)中，每株无菌苗接种硬皮马勃孢子悬浮液5-10ml，所述硬皮马勃孢子悬浮液的菌球浓度为5×106-5×1010个/ml。
优选地，在步骤(1)中，将硬皮马勃母种接入液体菌种培养基中后保持基质湿润，维持温度为27℃±2℃，在125-160r/min的转速下振荡暗光培养8-12天。
优选地，在步骤(3)中，每株无菌苗接种硬皮马勃液体菌种10-20ml，所述硬皮马勃液体菌种的菌球浓度为1000-2000个/ml。
优选地，在步骤(3)中，每株无菌苗接入固体菌种50-100g。
优选地，所述母种培养基、所述液体菌种培养基和所述固体菌种培养基的pH分别为4.0-6.0。
本发明通过选择合适的母种培养基和液体菌种培养基的各种组分及其用量，使得母种培养基适于将硬皮马勃子实体组织培养为硬皮马勃母种，液体菌种培养基适于将硬皮马勃母种培养为硬皮马勃液体菌种，培养所得硬皮马勃液体菌种的菌球浓度高达1000-2000个/ml。
在配制硬皮马勃孢子悬浮液的过程中，发明人通过控制硬皮马勃孢子粉与水的用量比例，使得配制出的硬皮马勃孢子悬浮液的菌球浓度为5×106-5×1010个/ml。
无菌水是将水中微生物杀死或过滤而得到的水,水中的无机盐等不会减少。发明人在配制硬皮马勃孢子悬浮液时选择无菌水的目的是防止水中带入的杂菌对培养的影响。
实验中发现摇床的转速对菌类的生长也有一定影响。当转速低于125r/min时，菌丝生长量明显减少，菌丝分散程度明显降低；而当转速高于160r/min时，虽然菌丝分散程度高，但菌丝太短，菌丝团较小，不利于后续的接种，从而降低了菌根感染率。因此，本发明将摇床转速控制在125-160r/min。
本发明中控制每株无菌苗接种硬皮马勃孢子悬浮液5-10ml、硬皮马勃液体菌种10-20ml或硬皮马勃固体菌种50-100g，使得接种量既能满足接种需要，又不至于接种量太大造成浪费，从而可以为后续接种提供菌种，减少培养硬皮马勃菌种的次数。
发明人在实验中发现，当所述母种培养基、所述液体菌种培养基和所述固体菌种培养基的pH分别为4.0-6.0时，菌种生长速度较快，而当pH小于4.0或pH大于6.0时，菌种的生长均受到抑制，所以在培养过程中要及时调整母种培养基、液体菌种培养基和固体菌种培养基的pH为4.0-6.0。
本发明所提供的栽培方法可以有效建立硬皮马勃菌种与宿主树的共生关系，菌根感染率高达80％-90％，合成菌根苗后继续培养至子实体成熟所需时间短。按照本发明所提供的栽培方法培养出的成熟硬皮马勃呈白色、乳白色、浅黄色或黄褐色，表面光滑或有少许粗糙不定形的小鳞片或有不规则裂纹，肉质肥厚，产量高。
具体实施方式
本发明中所用的蛭石密度为80kg/m3，珍珠岩密度为2.2-2.4g/cm3，草炭密度为5-7g/cm3，红壤土含水量为31％，牛粪和鸡粪含水量均为31％。
实施例1
(1)按下列比例称取配制母种培养基的各种组分：马钤薯100g，葡萄糖10g，酒石酸铵1g，蛋白胨2g，MgSO41g，KH2PO41g，琼脂15g，水500ml；将各组分混合，调节pH至4.0，得到母种培养基，将母体培养基置于25mm×200mm的试管中；
(2)采集野生中等成熟的硬皮马勃子实体，在超净工作台中无菌操作，用解剖刀切取子实体中间部分2mm×5mm×10mm的组织块，将该组织块放入盛有母种培养基的试管中，将试管置于27℃±2℃的环境中，暗光培养，待菌丝体长满试管斜面，得到硬皮马勃母种；
(3)按下列比例称取配制液体菌种培养基的各种组分：马钤薯100g，葡萄糖10g，酒石酸铵1g，蛋白胨2g，MgSO41g，KH2PO41g，水500ml；将各组分混合，调节pH至4.0，得到液体菌种培养基，取300ml液体菌种培养基于500ml的三角瓶中，在121℃的温度下灭菌30min，冷却待用；
(4)向三角瓶中加入硬皮马勃母种，加入量为1试管硬皮马勃母种加入10个三角瓶中，将三角瓶置于27℃±2℃的环境中，在125r/min下振荡暗光培养12天，得到液体菌种，菌球浓度为2000个/ml；
(5)在组培瓶底部平铺一层滤纸，用自来水浸湿，然后用包头纸系好，121℃灭菌30min，冷却待用；
(6)精选思茅松成熟种子，用自来水冲洗2h，之后用30％H2O2浸泡15min，同时不断摇动，然后用无菌水冲洗三次。放入灭菌的组培瓶中，每瓶放入5粒种子，置于23℃±3℃的环境中黑暗处培养，每天检查2次，剔除污染杂菌的种子，至种子萌发出白色芽点；
(7)按下列比例称取配制无菌苗培养基的各种组分：蛭石15kg，珍珠岩20kg，草炭50kg，红壤土100kg，牛粪10kg，鸡粪5kg，磷酸二氢铵100g，MgSO4100g，KH2PO4100g；将蛭石、珍珠岩、草炭预湿，加入红壤土、牛粪，将磷酸二氢铵、MgSO4、KH2PO4加150ml水溶解，喷洒入基质中，混匀，121℃灭菌50min，冷却后将基质装入用高锰酸钾消毒的塑料盆中；
(8)将萌发的种子移栽入塑料盆中，置于温室大棚中，保持基质湿润，在25℃±3℃的温度下培养无菌苗；
(9)待无菌苗长出侧根时，在其根系接入10ml液体菌种，保持基质湿润，在温度为25℃±3℃的环境中培养3个月，得到硬皮马勃菌根苗，继续培养3个月大部分菌根苗生长出硬皮马勃子实体(出菇)，再培养8天成熟。
实施例1的菌根感染率为85.65％，成熟硬皮马勃表面光滑，呈白色，肉质肥厚。
实施例2
(1)按下列比例称取配制母种培养基的各种组分：马钤薯200g，葡萄糖20g，酒石酸铵2g，蛋白胨4g，MgSO42g，KH2PO42g，琼脂20g，水1500ml；将各组分混合，调节pH至6.0，得到母种培养基，将母体培养基置于25mm×200mm的试管中；
(2)采集野生中等成熟的硬皮马勃子实体，在超净工作台中无菌操作，用解剖刀切取子实体中间部分2mm×5mm×10mm的组织块，将该组织块放入盛有母种培养基的试管中，将试管置于27℃±2℃的环境中，暗光培养，待菌丝体长满试管斜面，得到硬皮马勃母种；
(3)按下列比例称取配制液体菌种培养基的各种组分：马钤薯200g，葡萄糖20g，酒石酸铵2g，蛋白胨4g，MgSO44g，KH2PO42g，水1500ml；将各组分混合，调节pH至6.0，得到液体菌种培养基，取300ml液体菌种培养基于500ml的三角瓶中，在121℃的温度下灭菌30min，冷却待用；
(4)向三角瓶中加入硬皮马勃母种，加入量为1试管硬皮马勃母种加入10个三角瓶中，将三角瓶置于27℃±2℃的环境中，在160r/min下振荡暗光培养8天，得到液体菌种，菌球浓度为1000个/ml；
(5)在组培瓶底部平铺一层滤纸，用自来水浸湿，然后用包头纸系好，121℃灭菌30min，冷却待用；
(6)精选高山松成熟种子，用自来水冲洗1h，之后用30％H2O2浸泡30min，同时不断摇动，然后用无菌水冲洗三次。放入灭菌的组培瓶中，每瓶放入5粒种子，置于23℃±3℃的环境中黑暗处培养，每天检查2次，剔除污染杂菌的种子，至种子萌发出白色芽点；
(7)按下列比例称取配制无菌苗培养基的各种组分：蛭石40kg，珍珠岩50kg，草炭100kg，红壤土300kg，牛粪20kg，鸡粪15kg，磷酸二氢铵200g，MgSO4200g，KH2PO4200g；将蛭石、珍珠岩、草炭预湿，加入红壤土、牛粪，将磷酸二氢铵、MgSO4、KH2PO4加150ml水溶解，喷洒入基质中，混匀，121℃灭菌50min，冷却后将基质装入育苗袋中；
(8)将萌发的种子移栽入育苗袋中，置于温室大棚中，保持基质湿润，在25℃±3℃的温度下培养无菌苗；
(9)待无菌苗长出侧根时，在其根系接入20ml液体菌种，保持基质湿润，在温度为25℃±3℃的环境中培养3个月，得到硬皮马勃菌根苗，继续培养3个月大部分菌根苗生长出硬皮马勃子实体(出菇)，再培养8天成熟。
实施例2的菌根感染率为85.37％，成熟硬皮马勃表面光滑，呈白色，肉质肥厚。
实施例3
(1)按下列比例称取配制母种培养基的各种组分：马钤薯140g，葡萄糖14g，酒石酸铵1g，蛋白胨2g，MgSO41g，KH2PO41g，琼脂15g，水800ml；将各组分混合，调节pH至4.5，得到母种培养基，将母体培养基置于25mm×200mm的试管中；
(2)采集野生中等成熟的硬皮马勃子实体，在超净工作台中无菌操作，用解剖刀切取子实体中间部分2mm×5mm×10mm的组织块，将该组织块放入盛有母种培养基的试管中，将试管置于27℃±2℃的环境中，暗光培养，待菌丝体长满试管斜面，得到硬皮马勃母种；
(3)按下列比例称取配制液体菌种培养基的各种组分：马钤薯140g，葡萄糖14g，酒石酸铵1g，蛋白胨2g，MgSO41g，KH2PO41g，水800ml；将各组分混合，调节pH至4.5，得到液体菌种培养基，取300ml液体菌种培养基于500ml的三角瓶中，在121℃的温度下灭菌30min，冷却待用；
(4)向三角瓶中加入硬皮马勃母种，加入量为1试管硬皮马勃母种加入10个三角瓶中，将三角瓶置于27℃±2℃的环境中，在135r/min下振荡暗光培养11天，得到液体菌种，菌球浓度为1800个/ml；
(5)在组培瓶底部平铺一层滤纸，用自来水浸湿，然后用包头纸系好，121℃灭菌30min，冷却待用；
(6)精选思茅松成熟种子，用自来水冲洗1h，之后用30％H2O2浸泡30min，同时不断摇动，然后用无菌水冲洗三次。放入灭菌的组培瓶中，每瓶放入5粒种子，置于23℃±3℃的环境中黑暗处培养，每天检查2次，剔除污染杂菌的种子，至种子萌发出白色芽点；
(7)按下列比例称取配制无菌苗培养基的各种组分：蛭石20kg，珍珠岩30kg，草炭60kg，红壤土150kg，牛粪12kg，鸡粪7kg，磷酸二氢铵120g，MgSO4130g，KH2PO4120g；将蛭石、珍珠岩、草炭预湿，加入红壤土、牛粪，将磷酸二氢铵、MgSO4、KH2PO4加150ml水溶解，喷洒入基质中，混匀，121℃灭菌50min，冷却后将基质装入用高锰酸钾消毒的烧制陶土盆中；
(8)将萌发的思茅松种子移栽入烧制陶土盆中，置于温室大棚中，保持基质湿润，在25℃±3℃的温度下培养思茅松无菌苗；
(9)待思茅松无菌苗长出侧根时，在其根系接入12ml液体菌种，保持基质湿润，在温度为25℃±3℃的环境中培养3个月，得到硬皮马勃菌根苗，继续培养4个月大部分菌根苗生长出硬皮马勃子实体(出菇)，再培养7天成熟。
实施例3的菌根感染率为85.16％，成熟硬皮马勃表面有少许粗糙不定形的小鳞片，呈浅黄色，肉质肥厚。
实施例4
(1)按下列比例称取配制母种培养基的各种组分：马钤薯160g，葡萄糖16g，酒石酸铵2g，蛋白胨4g，MgSO42g，KH2PO42g，琼脂20g，水1200ml；将各组分混合，调节pH至5.5，得到母种培养基，将母体培养基置于25mm×200mm的试管中；
(2)采集野生中等成熟的硬皮马勃子实体，在超净工作台中无菌操作，用解剖刀切取子实体中间部分2mm×5mm×10mm的组织块，将该组织块放入盛有母种培养基的试管中，将试管置于27℃±2℃的环境中，暗光培养，待菌丝体长满试管斜面，得到硬皮马勃母种；
(3)按下列比例称取配制液体菌种培养基的各种组分：马钤薯160g，葡萄糖16g，酒石酸铵2g，蛋白胨4g，MgSO42g，KH2PO42g，水1200ml；将各组分混合，调节pH至5.5，得到液体菌种培养基，取300ml液体菌种培养基于500ml的三角瓶中，在121℃的温度下灭菌30min，冷却待用；
(4)向三角瓶中加入硬皮马勃母种，加入量为1试管硬皮马勃母种加入10个三角瓶中，将三角瓶置于27℃±2℃的环境中，在150r/min下振荡暗光培养9天，得到液体菌种，菌球浓度为1200个/ml；
(5)在组培瓶底部平铺一层滤纸，用自来水浸湿，然后用包头纸系好，121℃灭菌30min，冷却待用；
(6)精选云南松成熟种子，用自来水冲洗1.5h，之后用30％H2O2浸泡20min，同时不断摇动，然后用无菌水冲洗三次。放入灭菌的组培瓶中，每瓶放入5粒种子，置于23℃±3℃的环境中黑暗处培养，每天检查2次，剔除污染杂菌的种子，至种子萌发出白色芽点；
(7)按下列比例称取配制无菌苗培养基的各种组分：蛭石30kg，珍珠岩40kg，草炭90kg，红壤土250kg，牛粪18kg，鸡粪9kg，磷酸二氢铵180g，MgSO4180g，KH2PO4180g；将蛭石、珍珠岩、草炭预湿，加入红壤土、牛粪，将磷酸二氢铵、MgSO4、KH2PO4加150ml水溶解，喷洒入基质中，混匀，121℃灭菌50min，冷却后将基质装入育苗袋中；
(8)将萌发的思茅松种子移栽入育苗袋中，置于温室大棚中，保持基质湿润，在25℃±3℃的温度下培养思茅松无菌苗；
(9)待思茅松无菌苗长出侧根时，在其根系接入18ml液体菌种，保持基质湿润，在温度为25℃±3℃的环境中培养3个月，得到硬皮马勃菌根苗，继续培养3个月大部分菌根苗生长出硬皮马勃子实体(出菇)，再培养8天成熟。
实施例4的菌根感染率为85.25％，成熟硬皮马勃表面光滑，呈乳白色，肉质肥厚。
实施例5
(1)按下列比例称取配制母种培养基的各种组分：马钤薯150g，葡萄糖15g，酒石酸铵1.5g，蛋白胨3g，MgSO41.5g，KH2PO41.5g，琼脂18g，水1000ml；将各组分混合，调节pH至5.0，得到母种培养基，将母体培养基置于25mm×200mm的试管中；
(2)采集野生中等成熟的硬皮马勃子实体，在超净工作台中无菌操作，用解剖刀切取子实体中间部分2mm×5mm×10mm的组织块，将该组织块放入盛有母种培养基的试管中，将试管置于27℃±2℃的环境中，暗光培养，待菌丝体长满试管斜面，得到硬皮马勃母种；
(3)按下列比例称取配制液体菌种培养基的各种组分：马钤薯150g，葡萄糖15g，酒石酸铵1.5g，蛋白胨3g，MgSO41.5g，KH2PO41.5g，水1000ml；将各组分混合，调节pH至5.0，得到液体菌种培养基，取300ml液体菌种培养基于500ml的三角瓶中，在121℃的温度下灭菌30min，冷却待用；
(4)向三角瓶中加入硬皮马勃母种，加入量为1试管硬皮马勃母种加入10个三角瓶中，将三角瓶置于27℃±2℃的环境中，在145r/min下振荡暗光培养10天，得到液体菌种，菌球浓度为1500个/ml；
(5)在组培瓶底部平铺一层滤纸，用自来水浸湿，然后用包头纸系好，121℃灭菌30min，冷却待用；
(6)精选思茅松成熟种子，用自来水冲洗1.5h，之后用30％H2O2浸泡20min，同时不断摇动，然后用无菌水冲洗三次。放入灭菌的组培瓶中，每瓶放入5粒种子，置于23℃±3℃的环境中黑暗处培养，每天检查2次，剔除污染杂菌的种子，至种子萌发出白色芽点；
(7)按下列比例称取配制无菌苗培养基的各种组分：蛭石24kg，珍珠岩35kg，草炭75kg，红壤土200kg，牛粪15kg，鸡粪7.5kg，磷酸二氢铵150g，MgSO4150g，KH2PO4150g；将蛭石、珍珠岩、草炭预湿，加入红壤土、牛粪，将磷酸二氢铵、MgSO4、KH2PO4加150ml水溶解，喷洒入基质中，混匀，121℃灭菌50min，冷却后将基质装入用高锰酸钾消毒的塑料盆中；
(8)将萌发的思茅松种子移栽入塑料盆中，置于温室大棚中，保持基质湿润，在25℃±3℃的温度下培养思茅松无菌苗；
(9)待思茅松无菌苗长出侧根时，在其根系接入15ml液体菌种，保持基质湿润，在温度为25℃±3℃的环境中培养3个月，得到硬皮马勃菌根苗，继续培养3个月大部分菌根苗生长出硬皮马勃子实体(出菇)，再培养6天成熟。
实施例5的菌根感染率为85.67％，成熟硬皮马勃表面光滑，呈白色，肉质肥厚。
实施例6
(1)采集野生硬皮马勃菌成熟子实体，切开包被露出孢子粉，孢子粉黑褐色、分散方为成熟，将孢子粉连同包被风干，保存于7℃±3℃冰箱待用。
(2)取步骤(1)中的孢子粉500g，加入无菌水500ml，均匀摇动，配成孢子悬浮液，显微镜下镜检孢子浓度为5×1010个/ml。
(3)培养无菌苗：无菌苗的培养过程与实施例1的步骤(5)-(8)完全相同。待无菌苗长出侧根时，在其根系接入5ml孢子悬浮液，保持基质湿润，在温度为25℃±3℃的环境中培养3个月，得到硬皮马勃菌根苗，继续培养6个月大部分菌根苗生长出硬皮马勃子实体(出菇)，再培养5天成熟。
实施例6的菌根感染率为85.46％，成熟硬皮马勃表面有不规则裂纹，呈浅黄色，肉质肥厚。
实施例7
(1)采集野生硬皮马勃菌成熟子实体，切开包被露出孢子粉，孢子粉黑褐色、分散方为成熟，将孢子粉连同包被风干，保存于7℃±3℃冰箱待用。
(2)取步骤(1)中的孢子粉300g，加入3000ml无菌水，均匀摇动，配成孢子悬浮液，显微镜下镜检孢子浓度为5×108个/ml。
(3)培养无菌苗：无菌苗的培养过程与实施例2的步骤(5)-(8)完全相同。待无菌苗长出侧根时，在其根系接入7.5ml孢子悬浮液，保持基质湿润，在温度为25℃±3℃的环境中培养3个月，得到硬皮马勃菌根苗，继续培养5个月大部分菌根苗生长出硬皮马勃子实体(出菇)，再培养7天成熟。
实施例7的菌根感染率为87.78％，成熟硬皮马勃表面有少许粗糙不定形的小鳞片，呈浅黄色，肉质肥厚。
实施例8
(1)采集野生硬皮马勃菌成熟子实体，切开包被露出孢子粉，孢子粉黑褐色、分散方为成熟，将孢子粉连同包被风干，保存于7℃±3℃冰箱待用。
(2)取步骤(1)中的孢子粉50g，加入5000ml无菌水，均匀摇动，配成孢子悬浮液，显微镜下镜检孢子浓度为5×106个/ml。
(3)培养无菌苗：无菌苗的培养过程与实施例4的步骤(5)-(8)完全相同。待无菌苗长出侧根时，在其根系接入10ml孢子悬浮液，保持基质湿润，在温度为25℃±3℃的环境中培养3个月，得到硬皮马勃菌根苗，继续培养4个月大部分菌根苗生长出硬皮马勃子实体(出菇)，再培养5天成熟。
实施例8的菌根感染率为89.88％，成熟硬皮马勃表面光滑，略带黄褐色，肉质肥厚。
实施例9
(1)按下列比例称取各种组分：橡胶木屑200kg，麦粒20kg，蔗糖200g，酒石酸铵200g，蛋白胨400g，MgSO4200g，KH2PO4200g；
(2)将橡胶木屑预湿，麦粒用水浸泡8小时，过滤与木屑混匀，蔗糖、酒石酸铵、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4溶于500ml水，喷洒入木屑中，调至pH为6.0，得到固体菌种培养基；
(3)将固体菌种培养基分装于500ml塑料瓶中，每瓶装450ml，121℃灭菌60min，冷却待用；
(4)接种实施例1的液体菌种，接种量为每瓶40ml，接种后置于27℃±2℃的环境中暗光培养，菌丝长满基质即得固体菌种；
(5)培养无菌苗：无菌苗的培养过程与实施例1的步骤(5)-(8)完全相同。待无菌苗长出侧根时，在其根系接入固体菌种，接入量为每株苗50g，保持基质湿润，在温度为25℃±3℃的环境中培养3个月，得到硬皮马勃菌根苗，继续培养3个月大部分菌根苗生长出硬皮马勃子实体(出菇)，再培养8天成熟。
实施例9的菌根感染率为80.5％，成熟硬皮马勃表面有不规则裂纹，呈浅黄色，肉质肥厚。
实施例10
(1)按下列比例称取各种组分：橡胶木屑100kg，麦粒10kg，蔗糖100g，酒石酸铵100g，蛋白胨200g，MgSO4100g，KH2PO4100g；
(2)将橡胶木屑预湿，麦粒用水浸泡8小时，过滤与木屑混匀，蔗糖，酒石酸铵、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4溶于500ml水，喷洒入木屑中，调至pH为4.0，得到固体菌种培养基；
(3)将固体菌种培养基分装于500ml塑料瓶中，每瓶装450ml，121℃灭菌60min，冷却待用；
(4)接种实施例4的液体菌种，接种量为每瓶40ml，接种后置于27℃±2℃的环境中暗光培养，菌丝长满基质即得固体菌种；
(5)培养无菌苗：无菌苗的培养过程与实施例4的步骤(5)-(8)完全相同。待无菌苗长出侧根时，在其根系接入固体菌种，接入量为每株苗100g，保持基质湿润，在温度为25℃±3℃的环境中培养3个月，得到硬皮马勃菌根苗，继续培养5个月大部分菌根苗生长出硬皮马勃子实体(出菇)，再培养5天成熟。
实施例10的菌根感染率为80.2％，成熟硬皮马勃表面有少许粗糙不定形的小鳞片，呈浅黄色，肉质肥厚。
实施例11
(1)按下列比例称取各种组分：橡胶木屑150kg，麦粒15kg，蔗糖150g，酒石酸铵150g，蛋白胨300g，MgSO4150g，KH2PO4150g；
(2)将橡胶木屑预湿，麦粒用水浸泡8小时，过滤与木屑混匀，蔗糖，酒石酸铵、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4溶于500ml水，喷洒入木屑中，调至pH为5.0，得到固体菌种培养基；
(3)将固体菌种培养基分装于500ml塑料瓶中，每瓶装450ml，121℃灭菌60min，冷却待用；
(4)接种实施例5的液体菌种，接种量为每瓶40ml，接种后置于27℃±2℃的环境中暗光培养，菌丝长满基质即得固体菌种；
(5)培养无菌苗：无菌苗的培养过程与实施例5的步骤(5)-(8)完全相同。待无菌苗长出侧根时，在其根系接入固体菌种，接入量为每株苗75g，保持基质湿润，在温度为25℃±3℃的环境中培养3个月，得到硬皮马勃菌根苗，继续培养6个月大部分菌根苗生长出硬皮马勃子实体(出菇)，再培养7天成熟。
实施例11的菌根感染率为80.8％，成熟硬皮马勃表面光滑，呈乳白色，肉质肥厚。
本发明所提供的栽培方法可以有效建立硬皮马勃菌种与宿主树的共生关系，菌根感染率高达80％-90％，合成菌根苗后继续培养至子实体成熟所需时间短。按照本发明所提供的栽培方法培养出的成熟硬皮马勃呈白色、乳白色、浅黄色或黄褐色，表面光滑或有少许粗糙不定形的小鳞片或有不规则裂纹，肉质肥厚，产量高。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种硬皮马勃人工栽培方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)将含有硬皮马勃子实体的组织置于母种培养基中培养，得到硬皮马勃母种，将硬皮马勃母种接种到液体菌种培养基中，培养得到硬皮马勃液体菌种；
和/或，
将硬皮马勃孢子粉配制成硬皮马勃孢子悬浮液；
和/或，
将硬皮马勃液体菌种接种到固体菌种培养基中培养得到硬皮马勃固体菌种；
(2)将思茅松、云南松或高山松的种子培养至萌发出白色芽点移栽入无菌苗培养基中培养得到无菌苗；
(3)待无菌苗长出侧根时，在其根系接种硬皮马勃液体菌种、硬皮马勃孢子悬浮液或硬皮马勃固体菌种，保持基质湿润，维持温度为25℃±3℃，培养得到硬皮马勃菌根苗；
(4)在大棚内培养所述菌根苗，保持棚内温度25℃±3℃，培养3-6个月直至硬皮马勃子实体发育成熟。
2.根据权利要求1所述的硬皮马勃人工栽培方法，其特征在于，所述液体菌种培养基包括下列组分，按重量份计：
马钤薯100-200份，葡萄糖10-20份，酒石酸铵1-2份，蛋白胨2-4份，MgSO41-2份，KH2PO41-2份，水500-1500份；优选地，马钤薯120-180份，葡萄糖12-18份，酒石酸铵1-2份，蛋白胨2-4份，MgSO41-2份，KH2PO41-2份，水800-1200份；
所述母种培养基为在所述液体菌种培养基各组分及用量的基础上增加15-20份的琼脂。
3.根据权利要求1所述的硬皮马勃人工栽培方法，其特征在于，所述无菌苗培养基包括下列组分，按重量份计：
蛭石15000-40000份，珍珠岩20000-50000份，草炭50000-100000份，红壤土100000-300000份，腐殖质15000-45000份，磷酸二氢铵100-200份，MgSO4100-200份，KH2PO4100-200份；优选地，蛭石20000-30000份，珍珠岩30000-40000份，草炭60000-90000份，红壤土150000-250000份，腐殖质19000-27000份，磷酸二氢铵120-180份，MgSO4130-180份，KH2PO4120-180份；优选地，腐殖质包括牛粪和鸡粪。
4.根据权利要求1所述的硬皮马勃人工栽培方法，其特征在于，所述固体菌种培养基包括下列组分，按重量份计：
木屑100000-200000份，麦粒10000-20000份，蔗糖100-200份，酒石酸铵100-200份，蛋白胨200-400份，MgSO4100-200份，KH2PO4100-200份。
5.根据权利要求1所述的硬皮马勃人工栽培方法，其特征在于，在步骤(1)中，配制硬皮马勃孢子悬浮液的方法为：按重量份计，向50-500份硬皮马勃孢子粉中加入500-5000份无菌水。
6.根据权利要求5所述的硬皮马勃人工栽培方法，其特征在于，在步骤(3)中，每株无菌苗接种硬皮马勃孢子悬浮液5-10ml，所述硬皮马勃孢子悬浮液的菌球浓度为5×106-5×1010个/ml。
7.根据权利要求1所述的硬皮马勃人工栽培方法，其特征在于，在步骤(1)中，将硬皮马勃母种接入液体菌种培养基中后保持基质湿润，维持温度为27℃±2℃，在125-160r/min的转速下振荡暗光培养8-12天。
8.根据权利要求1所述的硬皮马勃人工栽培方法，其特征在于，在步骤(3)中，每株无菌苗接种硬皮马勃液体菌种10-20ml，所述硬皮马勃液体菌种的菌球浓度为1000-2000个/ml。
9.根据权利要求1所述的硬皮马勃人工栽培方法，其特征在于，在步骤(3)中，每株无菌苗接入固体菌种50-100g。
10.根据权利要求1所述的硬皮马勃人工栽培方法，其特征在于，所述母种培养基、所述液体菌种培养基和所述固体菌种培养基的pH分别为4.0-6.0。
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