CN1425279A - 固氮植物联合共生体的构建方法 - Google Patents

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CN1425279A
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韩桂云
赵淑清
张成刚
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Abstract

本发明涉及固氮植物联合共生技术，是一种固氮植物联合共生体的构建方法。具体操作为：将菌根菌、固氮菌与共生固氮植物相结合，以共生固氮为核心，将纯培养条件下的观察测试与放大规模的田间模拟相结合，针对不同的固氮植物选取相应的菌种进行混合接种，以增强宿主植物与微生物间的亲合力；(1)菌种选取：(2)共生体构建：用上述所选优势菌种组合对相同固氮树种进行混合接种，构建成联合共生体，优势菌种组合为VA菌根菌、外生菌根菌及分离于固氮树种根际中的固氮菌。本发明通过纯培养验证了固氮树种优良性状的发挥优劣与其同时受菌根侵染有关，构建联合共生体能极大地发挥固氮植物与微生物共生优势作用的、有利于脆弱地带的生态恢复。

Description

固氮植物联合共生体的构建方法
技术领域
本发明涉及固氮植物联合共生技术，具体地说是一种固氮植物联合共生体的构建方法。
背景技术
氮素是组成蛋白质的主要元素，是植物生长所必需的大量营养元素。空气中虽含有近80％的氮气，但并不能被高等植物直接吸收利用，人工合成氮素化肥的能源耗费巨大，不合理的过量施用带来的环境污染问题也日趋严重，人们逐渐认识到农林业生产完全依赖化肥终非良策，因此生物固氮的研究倍受关注。在贫瘠的土壤中生物固氮的最经常的限制因素是磷元素，这是因为磷元素在参与生物界的物质循环中，只有在无机磷和有机磷之间的转化，而不发生氧化还原反应，而且磷元素在无人为活动参与的情况下总是单向流动的，生物体中的有机磷经分解后形成不溶性无机磷酸盐在土壤中沉积，在被河流带入海洋，不参与陆地上的磷循环。而与植物共生的菌根真菌可以通过根外菌丝的形成，增加植物与土壤的接触点，扩大吸收面积，缩短磷的扩散距离(文献1：Hattingh，M.J.，Gray，L.E.，Gerdemsnn，J.W.1973.Uptake and translocation of 32 P-labelled phosphate to onionroots by endomycorrhizal fungi，Soil Sci.54：56～63；文献2：Nye P.H.，Tinker，P.B.1977.Solute movement in the soil-root system，Oxford：Blackwell Scientific Publications.；文献3：Rhode，L.H.and J.W.Gerdemann.1978.Translocation of calcium and phosphate byexternal hyphae of Vesicular-arbuscular mycorrhizae，Soil Sci.126：125～126)，从而提高宿主对磷素的吸收，改善植物营养状况，促进植物生长(文献4：Raiu，P.S.，Clark，R.B.，Ellis，J.R..et al，1990.Effects of species of VAM fungi on growth and mineraluptake of sorghum at different temperatures，Plant Soil.121：165～170；文献5：Sieverding，E.T，1983.Influence of Soil moisture regime on VA-mycorrhiza.H.II.Effects of soil temperature and water regime on growth，nutrient uptake and waterutilization of Eupatorium odoratum L.Z.Acker and Pflanzenbau.152：56～57)。菌根真菌与植物形成的共生体菌根还可分泌生长素、抗生素及一些酶提高植物的抗逆性，使菌根植物在贫瘠土壤中生存。
植物与微生物的共生是自然界普遍存在的一种生物学现象，其中与人类关系密切的有高等植物与菌根真菌共生形成的菌根，豆科固氮植物与根瘤菌或非豆科固氮植物与弗兰克氏放线菌共生形成的根瘤。近二十年来对于菌根和根瘤这样两位一体的共生体系的研究已取得显著进展，特别是从遗传特性、形态解剖、生理生态等方面对共生关系的建立、优化和机理都进行了深入的研究，通过人工接种促进共生体形成及应用的技术也有较快发展，在农林业生产实践中已显示出菌根和根瘤的应用潜力；但这方面多注重于植物与菌根真菌共生形成的菌根、固氮植物与根瘤菌或放线菌共生形成根瘤，进而在贫脊的土地上应用时，便不能最佳地形成植物与微生物间的营养共生环境，发挥固氮树种优良性状，极大满足它们各自生长的需求。很早以前许多学者就认识到高等植物、根瘤、菌根同时存在的联合共生现象，固氮植物菌根的存在就是这种联合共生现象的具体表现；已有研究表明联合共生体中菌根菌与共生固氮菌之间存在着相互促进作用，尤其是菌根菌对固氮菌的固氮作用具有明显的增效作用，菌根的存在促进了宿主植物的生长，改善了植物根际的微生态环境；但是这类研究基本上是限于VA菌之间或外生菌之间，并且多停留在现象的描述上，并未在纯培养条件下进行，就将其归功于双接种的增效作用，这种盲目性的结论必然导致不能最好地利用固氮植物资源和菌根技术，发挥固氮植物与微生物共生的优势作用效果不够理想，对脆弱地带的生态恢复效果欠佳。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能极大地发挥固氮植物与微生物共生优势作用的、有利于脆弱地带的生态恢复的固氮植物联合共生体的构建方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：将菌根菌、固氮菌与共生固氮植物相结合，以共生固氮为核心，发挥多学科配套优势，特别是对逆境条件下的共生植物与微生物共生生态的过程、生态功能和对环境的适应及作用进行研究，将纯培养条件下的观察测试与放大规模的田间模拟相结合，从微观到宏观角度揭示共生体系的基本规律及其相互关系，同时针对不同的固氮植物选取相应的菌种进行混合接种，进一步增强宿主植物与微生物间的亲合力；其具体操作过程如下：
(1)共生菌种的选取：
a.在选定固氮树种分布的干旱、半干旱地区，随机选取至少3处不同地块的树龄在5年以上的树种根系样品进行外部形态观测和形态解剖学观察，确定其VA菌根菌和/或外生菌根菌的感染情况；
b.依据菌根感染强度和固氮结瘤量，确定共生菌与该树种的亲合力，选定该树种根际中的发育状态较优的菌种类型，并在每一不同地块多点取样，于其根际中分离出VA菌根菌和/或外生菌根菌，根瘤菌或弗兰克氏放线固氮菌，进行菌种扩繁培养；
c.在纯培养条件下，将分离培养好的菌种单接和组合搭配接种，确定共生体形成效应的回接试验，进一步对上述发育状态较优的菌种类型进行验证，确定优势菌种和优势菌种组合；
(2)共生体构建：
用上述所选优势菌种组合对相同固氮树种进行混合接种，构建成联合共生体，优势菌种组合为VA菌根菌、外生菌根菌及分离于固氮树种根际中的固氮菌。
其中所述发育状态较优的菌种类型判断基点为：外生菌根真菌以其在不同地块出现的频率多，分布广，在不同点的感染率高为好；VA菌根菌以在不同地点筛取的同类孢子含量多为好；固氮菌以其在根瘤内分离的固氮活性高的菌株菌种为较优的菌种类型。
当其中所述固氮树种为刺槐时其中所述优势菌种，VA菌为摩西球囊霉和/或苏格兰球囊霉，外生菌为毛边滑锈伞和/或劣味乳菇，固氮菌为刺槐根瘤菌。
其中所述与刺槐接种的优势菌种组合为摩西球囊霉+毛边滑锈伞+劣味乳菇+刺槐根瘤菌、或摩西球囊霉+毛边滑锈伞+刺槐根瘤菌，最佳组合为苏格兰球囊霉+毛边滑锈伞+劣味乳菇+刺槐根瘤菌。
本发明具有如下优点：
1.本发明接种VA菌根菌、外生菌根菌及分离于固氮树种根际中的固氮菌形成的联合共生体效果优于双接种和单接种，以此为理论依据能更好地应用于造林生产实践，又能发挥它们之间的促生优势；发挥固氮植物的抗逆性，而且在其感染VA菌和外生菌菌根后可极大限度地提高宿主的抗旱性、抗盐碱性、抗重金属毒害、抗极端湿度温度、抗极端PH值等能力。
2.本发明接种VA菌根菌、外生菌根菌及分离于固氮树种根际中的固氮菌形成的联合共生体增强宿主植物的适应性，能够较好地应用于今后的造林引种、育苗、经济林及果树栽培等生产实践中，尤其是逆境条件下的造林与复垦；同时在促进植物生长，植物病虫害的防治等方面都有很好的应用前景；能更好地恢复和重建农林生态系统，发挥共生优势。
3.本发明联合共生体的构建丰富和发展了联合共生理论，在森林生态系统中有较大的应用潜力，在加速树木生长，解决农村资源短缺，减少水土流失，改良土壤和改善生态环境等方面将产生重大的经济和生态环境效益。
4.本发明通过纯培养验证了固氮树种优良性状的发挥优劣与其同时受菌根侵染和结瘤有关，以联合共生生态效应为主干，创建出构建联合共生体优化组合的应用技术。
具体实施方式
实施例：本实施例围绕北方干旱和半干旱地区逆境条件下固氮树种刺槐，以下实验过程中部分方法参照《菌根研究及应用》(中国林业出版社，1997年第一版)一书。
(1)共生菌种的选取：
a.在选定固氮树种分布的干旱、半干旱地区，随机选取4处不同地块的树龄在5年以上的树种根系样品进行外部形态观测和形态解剖学观察，确定其VA菌根菌和/或外生菌根菌的感染情况；
于一年中4月下旬至5月上旬对辽宁西部半干旱地区喀左县、新民实验站、中国科学院沈阳应用研究所树木园及内蒙古干旱的乌兰敖都沙地共生资源野外生态调查，进行了主要豆科固氮树种刺槐(Rbinia pseudoacacia)、紫穗槐(Amorphafruticosa)、小叶锦鸡儿(Caragana microphylla)、兴安胡枝子(Lespedeza davurica)，非豆科固氮树种沙棘(Hippophae rhamnoides)、沙枣(Elaeagnus angustifolia)及沙地植被山竹岩黄耆(Hedysarum fruticosum)、网果胡卢巴(Trigonella korshinskyi)、沙打旺(Astragslus huangheensis)根瘤样品及根际菌土的采集，这些树龄在6-8年之间。参照《菌根研究及应用》(中国林业出版社，1997年第一版)对树种根系样品进行外部形态观测和形态解剖学观测法，确定其VA菌和/或外生菌的感染情况；采用国际通用的乙炔还原法测定固氮活性。
b.依据菌根感染强度和固氮结瘤量，确定共生菌与该树种的亲合力，选定该树种根际中的发育状态较优的菌种类型，并在每一不同地块多点取样，于其根际中分离出VA菌根菌和/或外生菌根菌，根瘤菌或弗兰克氏放线固氮菌，进行菌种扩繁培养；
固氮树种VA菌根真菌的收集、分离与扩繁培养：
宿主植物是上述9种固氮植物，采集范围是目的树种根部附近0-30cm土层深度并带有须根；VA菌孢子的分离：称取土壤20g，用常规湿筛倾析法筛取孢子，将细筛上残留物生部转入离心管，用常规蔗糖离心法离心后，取蔗糖上清液滤液滤下孢子，用自来水反复冲洗转移至平皿中；依据其形态、大小、颜色分类，进行VA菌孢子的扩繁，是以须根发达的苜蓿(Medicago sativa)，白车轴草(Trifolium repens)为生物载体，种子用40％甲醛1∶100的溶液浸泡消毒15分钟后播种。培养基质为过2mm筛的河沙土，用高压蒸气灭菌法灭菌3小时。扩繁方式有两种，(1)单孢繁殖的塑料试管长20cm，口径4cm底部空心；为通气良好将小玻璃球放在试管底部，然后装培养基质至试管2/3处，孢子用氯氨T(1g/150ml)消毒15分钟，在体视显微镜下挑孢子至直径为3cm中央有一小孔的滤纸上，在小心放入上述试管内，覆盖2cm厚的灭菌基质，最后播种，浇水；(2)多孢繁殖选用直径为11cm的花盆用为容器，其它方法同单孢扩繁；繁殖场地在树木苗圃地，冬季置于温室内，并定时浇水。
外生菌根真菌与固氮菌或弗兰克氏放线菌的分离与培养按常规技术进行。
固氮树种为刺槐：刺槐林下VA菌主要有摩西球囊霉(Glomus mosseae)、苏格兰球囊霉(G.caledonium)、聚丛球囊霉(G.aggregatum)、细凹无梗囊霉(Acaulospora scrobiculata)、外生菌根真菌有尖顶地星(Geastrum triplex)、笼头菌(Clathrus sp.)、赭鳞蘑菇(Agaricus subrutilecens)、蘑菇属(Agaricus subrutilecens)、红笼头菌(Clathrus sp.)、晶粒鬼伞(Coprinus micaceus)、棱散尾菌(Lysurusmokusin)、硬柄小皮伞(Marasmius oreades)、白鬼笔(Phallus incpudicus)、深红鬼笔(Phallus rubicundus)、毛边滑锈伞(Hebeloma mesophasum)、劣味乳菇(Lactariusinsulsus)，固氮根瘤菌为刺槐根瘤菌(Rhizobium robinia Pseudoacacia)；
刺槐根瘤菌菌种的分离筛选、形态及生理特性的研究参照《微生物学杂志》第9卷第4期7～14页；本发明应用刺槐根瘤菌形态特征为：杆状细菌，两端钝园、单个或成对，大小为0.3～1.4μm，革兰氏染色阴性；在YMA培养基上生长7天后菌落直径4～7mm，菌落园形、稍有隆起、边缘整齐、无色或乳白色、表面湿润、较稀；有次端生或者周生鞭毛；生理特性：在B.T.B.培养基上可使培养基变黄产酸；在肉汤蛋白胨培养基上，培养24～48小时仍不生长，在石蕊牛奶培养基上变红，产酸；不利用甘露糖，耐2.6％的NaCl在PH5～9都正常生长，在30℃时生长正常，35℃生长微弱，不利用纤维素，世代时间在2.5～4.5小时之间。
其中发育状态较优的菌种类型有VA菌为摩西球囊霉和/苏格兰球囊霉，外生菌为毛边滑锈伞和劣味乳菇，固氮菌为刺槐根瘤菌
c.在纯培养条件下，将分离培养好的菌种单接和组合搭配接种，确定共生体形成效应的回接试验，进一步对上述发育状态较优的菌种类型进行验证，确定优势菌种和优势菌种组合；
①纯培养条件下刺槐幼苗接种培养
刺槐属树种是一种速生、耐贫瘠的固氮树种；本试验是参照Melin(1936)验证分离的已知真菌与特定的宿主在纯培养条件下形成外生菌根能力的纯培养技术方法和设备进行，实验方案设置见表1，将当年采到的刺槐种子冰冻处理1周，用30％的双氧水消毒15-20分钟，倒掉双氧水液，用无菌水70-80℃浸泡种子直至热水冷却，加入0.5％小苏打水再浸种2-3小时，放在灭菌后的内垫纱布的培养皿中盖上盖，置于25-28℃恒温催芽；培养基质为珍珠岩、泥碳分别过2mm筛，珍珠岩取筛上大粒，泥碳取下面粒性均一的碎屑，珍珠岩：泥碳为按7∶1的质量比用M.M.N营养液拌料，所用营养液为总质量的1.2倍。将上述拌好的基质用塑料布蒙一晚后按三分之二高度装入300mm*38mm玻璃大试管，轻轻压实，高压灭菌1.5小时，刺槐根瘤菌在Ash л培养基上活化菌种，在摇床上液体培养36小时镜检观测，稀释104至105倍用血球计数器计数，所用外生菌根真菌有毛边滑锈伞(Hebeloma mesophasum)→E1、劣味乳菇(Lactarius insulsus)→E2，VA菌为摩西球囊霉(Glomus mosseae)→I1、苏格兰球囊霉(G.caledonium)→I2，刺槐根瘤菌→N，在无菌室定量(标准每管VA菌孢子50个，外生菌根菌和固氮菌分别为10ml)接种，顺序为外生菌剂→VA菌孢子→固氮菌，外生菌根菌剂要深入试管二分之一高度，VA菌孢子接种方式同其扩繁时的接入方法，试管内可加无菌水使其含水量在50％，每管最后接进3粒健壮出芽整齐的刺槐种子，每种搭配重复三次，盖上口径为50mm的塑料小杯，自然光照为主辅以人工光(10500LUX)室温条件下培养5个月，定期浇20-30ml无菌水/每管，在小苗长至大试管高时打开小杯盖。6个月后，取出刺槐小苗样品，进行苗高、地径、侧根数、菌根感染率、生物量、结瘤量、根瘤固氮活性等指标的测定。其中以不接任何菌种的植株作为对照组→CK，其它生长条件与接菌组相同。
表1实验方案设置
       接菌            VA菌根菌       外生菌根菌   根瘤菌
 I1(50spores) I2(50spores)   E1(10g)   E2(10g)   N(10ml)
单接   I1   1
  I2   1
I12   1/2   1/2
  E1   1
  E2   1
  E12   1/2   1/2
  N   1
  CK
双接   I1E1   1/2   1/2
  I1E2   1/2   1/2
  I1E12   1/3   1/3   1/3
  I2E1   1/2   1/2
  I2E2   1/2   1/2
  I2E12   1/3   1/3   1/3
  I12E1   1/3   1/3   1/3
  I12E2   1/3   1/3   1/3
  I12E12   1/4   1/4   1/4   1/4
  I1N   1/2   1/2
  I2N   1/2   1/2
  I12N   1/3   1/3   1/3
  E1N   1/2   1/2
  E2N   1/2   1/2
  E12N   1/3   1/3   1/3
复合接   I1E1N   1/3   1/3   1/3
  I1E2N   1/3   1/3   1/3
  I1E12N   1/4   1/4   1/4   1/4
  I2E1N   1/3   1/3   1/3
  I2E2N   1/3   1/3   1/3
  I2E12N   1/4   1/4   1/4   1/4
  I12E1N   1/4   1/4   1/4   1/4
  I12E2N   1/4   1/4   1/4   1/4
  I12E12N   1/5   1/5   1/5   1/5   1/5
②刺槐联合共生的确认
本施例参考Philips & Hayman(1970)的染色法，根据根样鲜嫩的特点加热处理时间适当缩短来进行VA菌侵染观测的，经化学处理在显微镜下进行组织及细胞的形态结构观察，确定其感染情况；感染VA菌根菌的刺槐根系皮层细胞中，发现有泡囊及内生菌丝，在根际培养基质中筛析出了孢子，在根系表面观察到VA菌外生菌丝结构；侵染结果充分确认了摩西球囊霉(Glomus mosseae)、苏格兰球囊霉(G.caledonium)与刺槐形成的共生关系。
刺槐外生菌根外形的识别：毛边滑锈伞(Hebeloma mesophasum)、劣味乳菇(Lactarius insulsus)侵入后使其吸收小根外形产生变化，侧根末梢呈短棍棒状，稍肥大，转变为菌根的小根其长度生长受到抑制，根的分枝发育加强，在原根轴上长出许多更稠密的侧根末梢，以至在外形上形成短棒状。通过显微观察和解剖特征观测进一步证实，这两种外生菌根真菌均能侵染刺槐根系而形成菌根。
菌根发育与刺槐生长结果见表2。
表2
   菌种        宿主植物生长情况    菌根菌发育状况
  株高cm  地径cm  生物量g  侧根数  侵染率％
 I1  11.32  0.167  0.18  17  55
 I2  14.57  0.202  0.20  20  65
 I12  14.63  0.213  0.25  21  70
 E1  14.65  0.230  0.25  23  55
 E2  13.46  0.216  0.19  19  70
 E12  13.96  0.220  0.22  21  70
 I1E1  14.76  0.186  0.18  17  70
 I1E2  13.34  0.196  0.20  17  60
 I1E12  14.48  0.198  0.18  20  75
 I2E1  15.04  0.172  0.21  18  60
 I2E2  15.34  0.198  0.30  19  85
 I2E12  15.79  0.237  0.47  22  95
 I12E1  15.61  0.212  0.33  23  75
 I12E2  14.99  0.202  0.24  25  85
 I12E12  15.10  0.184  0.28  21  65
 CK  11.08  0.132  0.08  11  0
③菌根对刺槐生长的促进作用
本实验结果证实接种VA菌对宿主植物的生长有明显的促进作用，接种不同的VA菌对宿主植物生长的改善作用是有差别的，接种苏格兰球囊霉(G.caledonium)比摩西球囊霉(Glomus mosseae)的效果好，说明宿主植物良好的生长状况是由于菌根侵染造成的，但它们混合接种的优势更明显，说明它们相互创造了适合于对方生长的微生态环境；同样证实接种外生菌根菌对宿主植物的生长有促进作用，毛边滑锈伞(Hebeloma mesophasum)是比较适合的外生菌根菌。
④VA菌和外生菌根菌对刺槐生长的作用
本实验结果证实接种VA菌和外生菌根真菌之间对宿主植物的生长都有促进作用，不同菌种组合菌根的侵染状况、刺槐苗木的生长情况是有差异的；菌根菌可促进宿主植物对P及其它营养元素的吸收，微量的锌可促进VA菌孢子的萌发，外生菌促进宿主植物吸收微量元素促进VA菌孢子的生长，VA菌的良好生长反过来进一步促进宿主植物更好的生长，另外菌根菌产生的生长素、菌根对植物根际环境的改善也产生同样的作用规律；混合接种苏格兰球囊霉+毛边滑锈伞+劣味乳菇及摩西球囊霉+苏格兰球囊霉+毛边滑锈伞刺槐苗木生长最好，显然优于任何一种单接菌根菌的效果，菌根侵染率和侧根数都有显著提高，说明宿主植物生长状况的改善是菌根侵染的结果，而其它的各种组合并未发现比单接种有明显优势，所以这两种VA菌和外生菌混合接种增效作用显然源于苏格兰球囊霉和毛边滑锈伞这两种优良菌种及其联合优势，进一步为刺槐选取择优良菌根真菌提供了可靠的依据。
⑤菌根菌与固氮菌的相互作用
菌根菌与固氮菌的相互作用效果见表3。
固氮活性的测定：采用国际通用的乙炔还原法称取瘤重，装瓶，注入乙炔，用NaCl中止反应，于实验室在100型气相层析仪上检测乙炔含量。
表3
  菌株(strains)           根瘤结瘤固氮能力      菌根菌发育情况
  结瘤量(drynodule weightgperroot)    固氮活性(μmol C2H4perdry nodules.h)    侧根数   侵染率(％)
  I1N     0.004     3.177     17     40
  I2N     0.003     3.294     16     50
  I12N     0.006     4.026     19     55
  E1N     0.004     2.776     19     75
  E2N     0.003     4.205     21     80
  E12N     0.007     19.903     24     75
  N     0.002     1.745     14     0
  CK     0     0     11     0
实验证实菌根菌对固氮过程有促进作用，但不同菌种组合效果也不尽相同接种摩西球囊霉+苏格兰球囊霉+根瘤菌和毛边滑锈伞+劣味乳菇+根瘤菌组合较佳，尤其后种组合效果最佳；从实验看出，固氮菌对菌根菌发育影响不明显，说明菌根菌对宿主植物是否固氮依赖性并不大，而固氮植物的结瘤固氮对菌根有很高的依赖性，将菌根技术应用于固氮植物将产生重要的经济和生态效益。
⑥刺槐联合共生体中宿主植物、菌根菌及固氮菌间的相互作用
纯培养条件下联合共生效果见表4。
表4
   菌种       宿主植物生长情况        根瘤结瘤固氮能力   菌根菌发育情况
  株高cm   地径cm   生物量g   结瘤量(drynoduleweight g perroot)   固氮活性(μmolC2H4perdrynodules.h)  侧根数(条)  侵染率(％)
 I1E1N  16.10  0.198  0.20  0.006  6.772  19  80
 I1E2N  14.80  0.202  0.18  0.004  5.659  18  70
 I1E12N  16.10  0.197  0.38  0.006  8.133  29  85
 I2E1N  14.60  0.203  0.21  0.007  4.965  21  75
 I2E2N  15.58  0.204  0.19  0.005  3.843  17  90
 I2E12N  16.20  0.266  0.25  0.012  9.608  20  100
 I12E1N  15.60  0.213  0.21  0.010  5.263  26  75
 I12E2N  16.43  0.222  0.18  0.008  6.031  23  90
 I12E12N  15.34  0.215  0.22  0.013  7.621  24  85
 N  14.97  0.190  0.16  0.002  1.745  14  0
 CK  11.08  0.132  0.08  0  0  11  0
实验结果有力地证实了菌根菌与固氮菌双接种对宿主植物的生长起到了良好的促进作用，同时接种VA菌、外生菌根菌和固氮菌刺槐的生长指标比单接固氮菌、单接菌根菌及VA菌与外生菌混合接种都好，证实其植物生长促进是综合作用的结果，其机理为对植物生长起促进作用的除水份外，氮磷的供应最主要，固氮菌为植物提供充足氮元素，菌根菌提供磷元素并改善植物的根际及生理生化性状来促进植物的生长，联合接种VA菌和外生菌相互取长补短更有效地满足固氮菌对磷及其它微量元素的需求，其促进作用更加明显；对刺槐其较佳组合为摩西球囊霉+毛边滑锈伞+劣味乳菇+根瘤菌，其最佳组合为苏格兰球囊霉+毛边滑锈伞+劣味乳菇+根瘤菌；由此进一步证明了最佳的促进结瘤固氮能力的菌种组合与促进刺槐的生长组合是一致的，显然高于单接种VA菌或外生菌对固氮的促进，它们相得益彰。
本实施例通过纯培养验证了固氮树种优良性状的发挥优劣与其同时受菌根侵染有关，为刺槐联合共生体人工构建提供了基础。
(2)刺槐联合共生体人工构建盆栽实验
将上述所选优势菌种组合对相同固氮树种进行接种，构建成联合共生体
盆栽相对于纯培养条件来说是半开放似的，接近自然条件，因此它是纯培养的进一步扩展，能为更大面积的造林生产实践应用联合共生技术而提供理论与实践依据，并形成一套行之有效的人工接种方法。
A.材料与方法
①供试土壤来自树木园林内40厘米以下的生土，过筛，在阳光下晒二天，加干热灭菌的河沙，沙土比为2∶1，混匀后装入直径为20厘米的泥盆中，每盆加过磷酸钙5克，每盆装2.5公斤，其土壤理化性质见表5。
表5土壤理化性质：
有机质含量(％) 速效有机质(mg/kg) PH
N  P2O5  K2O N P  K 6.66
0.119  0.290  2.608 87.08 60.74  129.98
②接种物来源和菌剂用量
刺槐根瘤菌N(Rhizobium)分离于刺槐根瘤；根瘤菌在匀浆器中匀碎离心(1000转/每分钟，5-10分钟)，离心后的菌体按1毫升/100棵苗的量接种。
VA菌根接种物是通过白车轴草扩繁后获得含有孢子和细根碎片(侵染率为48％)的菌根菌剂，主要是G.aggregatum.其中I1(摩西球囊霉)分离于刺槐林下，VAH(聚丛球囊霉)分离于沙棘林下每盆接种50克，6-8个孢子/克，均匀散布于盆中。
外生菌根真菌：E2(劣味乳菇Lactarius insulsus)；E1(毛边滑锈伞Hebelomamesophasum)按常规方法分别制成固体菌剂，每盆50克。
实验处理：(1)不加接种物(CK对照组)；(2)单接种根瘤菌N；(3)单接种菌根真菌一：I1，二：VAH；E2；E1(4)同时接种菌根真菌和根瘤菌I1+N，VAH+N；E2+N；E1+N(5)内、外菌根真菌混接I1+E2，VAH+E2，I1+E1，VAH+E1；(6)内、外菌根真菌和根瘤菌三接N+I1+E2，N+VAH+E2，N+I1+E1，N+VAH+E1；每种处理重复5次，每盆确定有5棵苗。
刺槐种子处理：用氯化汞消毒灭菌，在28℃的恒温箱中催芽；挑选萌芽整齐生长良好的种子播种；先将内生菌根真菌和外生菌根真菌接种于盆中，播入种子；小苗长出一星期，接种刺槐根瘤菌，盆栽前两个星期置于温室中，之后放于室外，苗株长至6个月后进行各项指标测试。
B.生长指标和生理指标的测定
6个月后进行各项指标测试，包括：株高、地径、鲜重、主根长、侧根数、结瘤量、固氮活性、叶绿素含量、净光和效率、叶片含氮量、叶片含磷量、菌根侵染率；其中叶绿素含量采用ANON法进行测量；净光和效率采用CL-301P光合测定仪进行测定；菌根侵染率采用压片染色法进行计数统计；菌根及根瘤形态解剖观察及切片观察；固氮活性采用乙炔还原法进行测试；叶片含氮量采用凯氏定氮法进行测试；叶片含磷量采用钒钼黄比色法进行测试。
C.结果
①联合共生的确认
纯培养条件是人为设置较理想化的环境，除形成共生体的双方外，选择机会不大，因而在自然条件下形成共生体还存在一定的差别，而盆载实验条件下的观测为自然状态下联合共生体的研究提供了具有实践意义的理论依据。
VA菌根形态特征的观测：经压片染色法，可以在显微镜下发现VA菌根形成的丛枝和泡囊结构，由VA菌菌丝体侵入宿主植物皮层细胞内，并在细胞内连续进行分枝形成的一种枝状结构，它在VA菌感染的初期出现，仅维持2-3周时间，以后渐渐消亡，变成碎粒状；而泡囊则出现在细胞感染的后期，由于新老菌丝可在同一根段上出现，因此有时可同时观察到丛枝和泡囊结构。以上结果充分确认了盆栽实验条件下，VA菌根真菌与刺槐形成菌根的共生关系。
刺槐外生菌根外形的识别及解剖学特性的观测：外生菌根的特征是在距小根生长点不远的地方，真菌的菌丝缠绕在根的周围；这种菌丝体密集交织形成菌丝套，其上菌丝体外延伸到土壤中，向内从根表皮细胞间进入外皮层，菌丝体只镶嵌在皮层细胞间成一网状，既哈迪氏网。侧根末端呈短棒状，稍肥大，转变为菌根的小根其长度生长受到抑制，根的分枝发育加强，在原根轴上长出许多更稠密的侧根末梢。这两种外生菌根真菌均能侵染刺槐根系而形成菌根，但外形上没有差异；通过切片观察，可以发现刺槐外皮层细胞间隙的外生菌根的哈迪氏网横切面呈迷路状。
刺槐能够与根瘤菌形成根瘤，证明其感染成功。
②菌根、根瘤菌对刺槐生长的促进作用
盆栽条件下共生效果见表6。
表6
  接菌                  刺槐生物量指标               刺槐生理指标    菌根发育状况
  株高(cm)    地径(cm)   鲜重(g)    叶片全磷(％)   叶片全磷(％)   净光和效率(mgCO2·dm-2.h-1)   叶绿素含量(mg/g)   结瘤量(g)   固氮活性(μmolC2H4h-1lg-1)   侧根数(个)  侵染率(％)
 N  37.00  0.7315  25.60  2.92  0.439  5.54  6.500  1.2650  2580  22.00  45
 VAH  36.40  0.7612  25.00  2.80  0.434  5.28  6.518  1.1605  1500  19.20  55
 I1  37.50  0.7651  25.80  2.87  0.437  5.43  6.545  1.2609  2025  20.70  65
 E2  35.33  0.7825  24.55  2.80  0.429  5.56  6.270  1.2208  1432  21.75  48
 E1  37.85  0.7166  25.60  2.81  0.439  5.73  6.282  1.2496  2260  23.23  57
 VAH+E2  35.85  0.7700  25.08  2.83  0.438  5.55  6.545  1.2420  2625  22.23  52
 I1+E2  41.09  0.7865  25.86  2.84  0.439  5.97  6.887  1.6456  2830  21.82  72
 VAH+E1  35.90  0.7756  25.00  2.82  0.429  5.73  6.128  1.5594  2100  22.80  60
 I1+E1  42.27  0.8169  25.89  2.85  0.445  5.76  6.586  1.6550  2825  22.80  80
 N+VAH+E2  36.30  0.7928  26.58  2.93  0.445  5.90  6.857  1.6508  2954  22.67  75
 N+I1+E2  41.50  0.8250  27.00  2.94  0.461  6.03  6.937  1.6800  3510  23.80  79
 N+VAH+E1  43.73  0.8725  26.50  2.94  0.451  6.02  6.647  1.7047  3288  24.40  82
 N+I1+E1  44.73  0.8838  27.55  3.13  0.542  6.40  6.906  1.8291  3800  25.27  89
 CK  32.86  0.6585  24.43  2.69  0.410  5.18  5.708  1.0812  3388  19.09  40
刺槐联合共生关系的存在：刺槐联合共生的人工构建在上述人工纯培养的实验条件下，证实了刺槐接种VA菌根菌、外生菌根菌及固氮根瘤菌均成功感染了刺槐无菌苗，并能在形成根瘤的同时形成菌根，充分证实了它们之间的联合共生关系，说明共生体是长期协同进化的必然结果，那么在自然状态下的半开放实验条件下，也应得到同样的结论，本实险结果恰好也证实了这点，即刺槐联合共生体存在的必然性，与此它们之间的相互作用生态效应也得到了充分体现。
菌根真菌间的联合共生对刺槐的生长效应：刺槐同时具有VA菌根菌、外生菌根菌，说明是长期的自然选择，决定了这种共生方式的优越性，二者之间存在联合共生优势，而以往这类研究基本上限于VA菌根菌之间或外生菌根菌之间，并均非针对具体的宿主植物——固氮树种进行；本发明结果表明：VA菌根菌与外生菌根菌间存在增效作用，但它们必须是建立在菌种合理搭配的基础上，不同菌种组合效果不同，对刺槐来说最好组合为I1+E2与I1+E1各项指标及生理功能，株高、地径、鲜重、净光和效率、叶绿素含量分别比对照组增加25.05％、19.44％、5.855％、15.25％、20.66％和28.64％、24.05％、5.98％、11.20％、20.64％优于任何一种单接种效果，同时菌根的侵染率和叶片含磷量分别比对照组增加80％、7.07％和100％、8.54％说明宿主植物的生长状况的改善与菌根的感染是分不开的，所以VA菌根菌与外生菌根菌的混合接种的增效作用显然源于优良菌种及其综合优势复合效应。
菌根真菌与根瘤菌之间对刺槐联合共生的增效作用：菌根真菌与根瘤菌共同生活在同一根际微生态系统中，在长期的进化中形成了对宿主植物的联合共生体，追溯共生的起源在于对逆境的适应，随着自然选择作用，由最初的单体受益演替为协同进化，在生长发育过程中体现了不可替代的优越性；实验结果有力的证实了菌根菌与固氮菌双接种对宿主动植物的生长起到了良好的催进作用，同时接种VA菌根菌、外生菌根菌及固氮根瘤菌的刺槐地上部分的生长指标均比相应的单接种VA菌根菌、外生菌根菌及固氮根瘤菌及双接菌根菌要好，这充分说明对刺槐生长的促进作用是它们综合作用的结果；虽然各种菌根菌与固氮菌的联合接种都表现了良好的促生优势，但接种刺槐根瘤菌+摩西球囊霉+毛边滑锈伞是最好优化组合，其表现在植株的生长和生理指标：株高、地径、鲜重、净光和效率、叶绿素含量分别比对照组增加36.12％、34.21％、12.77％、23.55％、20.99％，而促结瘤固氮能力和促菌根发育也表现出最佳的增效作用；则其固氮结瘤量、固氮活性及叶片含氮量也比对照组高69.17％、272.55％、90.71％；菌根的发育状况为侧根数、感染率和叶片含磷量也比对照组高47.86％、112.5％、32.20％；由此可知这种最佳优势组合的联合共生优势表现在菌根真菌与固氮菌之间的相互增效作用，不仅提高了根瘤菌的结瘤固氮能力，而且也促进了菌根的生长发育，同时菌根的良好发育与根瘤菌的固氮能力提高之间成正相关；再通过对比单接根瘤菌对植株的生长效应方面表现在宿主的各项生理功能和生长指标株高、地径、鲜重、侧根数、净光和效率、叶绿素含量、结瘤量、固氮活性、叶片含氮量、菌根侵染率和叶片含磷量均比对照组高12.6％、11.09％、15.24％、4.79％、6.95％、13.88％、17.00％、152.94％、8.55％、12.50％和7.07％，仅接VA菌根菌和外生菌根菌的混合接种I1+E1对植株的生长效应方面表现在宿主的各项生理功能和生长指标株高、地径、鲜重、净光和效率、叶绿素含量、菌根侵染率和叶片含磷量均比对照组高28.64％、24.05％、5.98％、11.20％、20.64％、100％和8.54％，均不如混接菌根菌与固氮菌对宿主树木的各项生长发育指标和生理功能，由此再一次证明VA菌根菌、外生菌根菌及固氮根瘤菌的联合共生的增效作用，其机理在于混接VA菌根菌、外生菌根菌及固氮根瘤菌同时满足植物对氮磷营养的需求，良好的宿主植物为固氮菌和菌根菌提供了更充分的营养，增强结瘤固氮能力和菌根感染能力，这样构成一个良性循环而形成了联合共生的增效作用。
盆栽模拟实例接种的各类菌种均对刺槐有较好的生长效应，但不同的菌种对其生长效应也不相同；其中双接种效果优于单接种，而本发明的联合共生体：VA菌根菌、外生菌根菌及分离于固氮树种根际中的刺槐根瘤菌，混合接种效果更好，刺槐的各项生长指标均有明显提高，比较几种接种方式的组合搭配，认为E1+I1+N最佳，明显体现了菌根菌对根瘤菌结瘤固氮能力的增效作用。
本实施例所用各类菌株都为非特异性的菌株体，而各菌株体所在的菌种于自然界普遍存在，分布较广，各菌种在微生物学杂志、生态学报、土壤学报、林业科学研究、应用生态学报上1989～2000年间发表的论文中均有提及和利用，其中劣味乳菇分离于1979年；毛边滑锈伞分离于1987年；摩西球囊霉分离于刺槐林下，聚丛球囊霉分离于沙棘林下，都于1998年分离得到，依据N.C.SCHEWCKand YVONNE PEREZ 1988.1Mannual for the identification of VA mycorrizal fungi(second edition published)进行分类鉴定；刺槐根瘤菌分离于1986年。

Claims (5)

1.一种固氮植物联合共生体的构建方法，其特征在于：将菌根菌、固氮菌与共生固氮植物相结合，以共生固氮为核心，将纯培养条件下的观察测试与放大规模的田间模拟相结合，针对不同的固氮植物选取相应的菌种进行混合接种，以增强宿主植物与微生物间的亲合力；具体操作过程如下：
(1)共生菌种的选取：
a.在选定固氮树种分布的干旱、半干旱地区，随机选取至少3处不同地块的树龄在5年以上的树种根系样品进行外部形态观测和形态解剖学观察，确定其VA菌根菌和/或外生菌根菌的感染情况；
b.依据菌根感染强度和固氮结瘤量，确定共生菌与该树种的亲合力，选定该树种根际中的发育状态较优的菌种类型，并在每一不同地块多点取样，于其根际中分离出VA菌根菌和/或外生菌根菌，根瘤菌或弗兰克氏放线固氮菌，进行菌种扩繁培养；
c.在纯培养条件下，将分离培养好的菌种单接和组合搭配接种，确定共生体形成效应的回接试验，进一步对上述发育状态较优的菌种类型进行验证，确定优势菌种和优势菌种组合；
(2)共生体构建：
用上述所选优势菌种组合对相同固氮树种进行混合接种，构建成联合共生体，优势菌种组合为VA菌根菌、外生菌根菌及分离于固氮树种根际中的固氮菌。
2.按照权利要求1所述固氮植物联合共生体的构建方法，其特征在于：其中所述固氮树种为刺槐。
3.按照权利要求1所述固氮植物联合共生体的构建方法，其特征在于：固氮树种为刺槐时，所述优势菌种中VA菌为摩西球囊霉和/或苏格兰球囊霉，外生菌为毛边滑锈伞和/或劣味乳菇，固氮菌为刺槐根瘤菌。
4.按照权利要求1所述固氮植物联合共生体的构建方法，其特征在于：固氮树种为刺槐时，与刺槐接种的优势菌种组合为摩西球囊霉+毛边滑锈伞+劣味乳菇+刺槐根瘤菌、或摩西球囊霉+毛边滑锈伞+刺槐根瘤菌。
5.按照权利要求1所述固氮植物联合共生体的构建方法，其特征在于：固氮树种为刺槐时，与刺槐接种的优势菌种组合为苏格兰球囊霉+毛边滑锈伞+劣味乳菇+刺槐根瘤菌。
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