CN105400714A - 一种金黄垂直链霉菌hn6的固体发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵方法，包括以下步骤：菌种活化；一级种子制备；二级种子制备；三级种子制备：按照10%的接种量将二级种子接入固体发酵培养基中，搅拌均匀，放入浅盘内，在无菌培养室保持湿度50%-70%，温度28℃培养96h，制得三级种子；和固体发酵，将配制好的固体发酵培养基加入到固体发酵罐内，将三级种子按照接种量10%接入固体发酵培养基，搅拌均匀，保持湿度60%-70%和温度28℃，发酵培养96小时，获得固体发酵培养物。本发明有益效果：成本低廉，最终发酵产物活菌浓度可达6.0-8.7×10⁹cfu？g^-1，发酵效率高；固体培养物对盆栽香蕉的枯萎病有很好的防治作用。

Description

一种金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵方法

技术领域

发明涉及微生物固体发酵工程技术领域，尤其涉及一种金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵方法。

背景技术

金黄垂直链霉菌HN6（StreptomycesaureoverticillatusHN6），已于2010年11月5日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址：中国武汉市武汉大学，邮编430072），保藏号为CCTCCNo.M2010293，属于链霉菌属，该菌株菌落较小，干燥，呈粉白色；基内菌丝橙红色，无可溶性色素，气生菌丝纤细、多分枝，分枝呈垂直状；孢子丝直，孢子链成熟后断裂成分生孢子，分生孢子圆柱形。菌株有较强的淀粉水解能力，并能够很好利用多种糖类，如果糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖等作为碳源生长。

研究发现：（1）金黄垂直链霉菌HN6对香蕉枯萎病原菌在内的多种植物病原菌有极强的抑菌活性；（2）金黄垂直链霉菌HN6对尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubemeFOC)侵染引起的香蕉枯萎病有很好的防治作用；（3）金黄垂直链霉菌HN6能明显提高组培香蕉苗苯丙氨酸解氨酶和超氧化物歧化酶的活性；（4）金黄垂直链霉菌HN6可以增加组培香蕉苗株高、茎粗、地上部分鲜重及地下部分鲜重；（5）金黄垂直链霉菌HN6可以提高植株叶片叶绿素、可溶性蛋白质及可溶性糖含量；（6）金黄垂直链霉菌HN6可有效增强组培香蕉苗根系活力。由此申请了“一株金黄垂直链霉菌HN6及其应用ZL201110062146.5”的发明专利和相关论文“王兰英,王琴,骆焱平.金黄垂直链霉菌HN6对香蕉的防病促生作用[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2015,43(05):1-6”。

以往香蕉枯萎病防治试验中主要采用金黄垂直链霉菌HN6孢子悬浮液或液体发酵物，

液态培养物容易实现纯种培养，产品浓度高，但液态培养物不易储存和运输，因此利用微生物固态发酵技术的优势特点，探索金黄垂直链霉菌HN6固体发酵工艺条件具有重要的意义。

随着各种生防微生物的不断分离、获得以及生防机制的深入研究，微生物活体防治植物病害备受关注。固体发酵是微生物常用的培养工艺，操作简便，产孢量大，培养物便于储存、运输和田间应用，在活体微生物防治植物病害中具有广阔的前景。采用固态发酵技术生产微生物活体制剂具有较明显的优越性。

玉米粉、麸皮等都是微生物固体发酵的重要原料，但近年来粮食作物种植面积持续下降，使得发酵成本急剧增高，因此寻找新的固体发酵基质资源迫在眉睫。木薯粉不仅含有残余的淀粉、蛋白质，还含有维生素养分。在食用菌栽培中木薯粉不仅可以提供碳源、氮源、无机盐，甚至可以提供食用菌所必需的生长素。因此将木薯粉应用于微生物固体发酵技术具有重要的理论意义。香蕉是世界上四大水果之一，通常收获香蕉果实是香蕉种植者的唯一目的。香蕉收获后，大量的茎、叶等资源作为废弃物，丢弃于田间地头，不仅浪费资源，也给环境带来巨大负担。但有研究证明香蕉这些副产物中，含有大量丰富的蛋白质、糖、维生素等营养成分，无氮浸出物的含量可达60%之上。用香蕉副产物堆制的有机肥不仅可提升土壤有机质，增加土壤中N、P、K等元素的含量，也可以改善土壤理化性状，甚至可增强植株抗病力，促进香蕉根的生长。因此，以香蕉茎、叶等副产物作为香蕉防病微生物固体发酵基质，最终将发酵产物应用于香蕉种植必将带来可观的效益。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵方法。

本发明的另一个目的在于提供该金黄垂直链霉菌HN6固体发酵物在防治香蕉枯萎病中的应用方法。

为实现所述目的，本发明采用以下技术方案：

一种金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵方法，包括以下步骤：

1）菌种活化：将菌种以划线法接种在扩大培养基上，28℃恒温培养5天，其中，所述菌种为金黄垂直链霉菌HN6（StreptomycesaureoverticillatusHN6）；

2）一级种子制备：将活化的金黄垂直链霉菌HN6制成浓度为10⁹cfu/g孢子悬浮液，然后按照5%的接种量接种于装有一级种子培养液的三角瓶中，180转/分钟搅拌，28℃下培养72小时，制得一级种子，备用；

3）二级种子制备：将制备好的一级种子培养液按照5%接种量接种在装有二级种子培养液的三角瓶中，180转/分钟搅拌，28℃下培养72小时，制得二级种子，备用；

4）三级种子制备：按照10%的接种量将二级种子接入固体发酵培养基中，搅拌均匀，放入浅盘内，在无菌培养室保持湿度50%-70%和温度28℃，培养96小时，制得三级种子；和

5）固体发酵，将配制好的固体发酵培养基加入到固体发酵罐内，装料系数为50%-60%，115℃高温高压灭菌30分钟；待罐内培养基冷却至30-40℃时，将三级种子按照接种量10%接入固体发酵培养基，搅拌均匀，保持湿度60%-70%和温度28℃，发酵培养96小时，获得金黄垂直链霉菌HN6固体发酵培养物。

进一步的，步骤1）中，所述的培养基为：可溶性淀粉2%、KNO₃0.1%、K₂HPO₄0.05%、MgSO₄0.05%、NaCl0.05%、FeSO₄0.001%，琼脂2%，补水至100%，上述百分比为质量百分比，待药品全部溶解后，调节pH至7.0-7.2，121℃高温高压灭菌20分钟。

进一步的，所述的一级种子液为：可溶性淀粉2%、KNO₃0.1%，K₂HPO₄0.05%、MgSO₄0.05%、NaCl0.05%、FeSO₄0.001%，补水至100%，上述百分比为质量百分比，待药品全部溶解后，调节pH至7.0-7.2，121℃高温高压灭菌20分钟。

进一步的，所述的二级种子液为：葡萄糖0.05%、可溶性淀粉0.05%、K₂HPO₄0.05%、NaCl0.05%、MgSO₄0.05%、蛋白胨0.05%、酵母膏0.05%和黄豆粉0.05%，补水至100%，上述百分比为质量百分比，待药品全部溶解后，调节pH至6.8-7.0，121℃高温高压灭菌20分钟。

进一步的，所述的固体发酵培养基为木薯粉、豆饼粉、香蕉秸秆渣、细沙土为基料，木薯粉、香蕉秸秆渣制备：将木薯及香蕉秸秆晾晒至干，粉碎、过30目筛，制成木薯粉及香蕉秸秆渣，备用，木薯粉、豆饼粉、香蕉秸秆渣、细沙土按照13:3:3:1质量比例混合，随后加入葡萄糖0.05%、MgSO₄0.05%、NaCl0.05%，K₂HPO₄0.02%、KH₂PO₄0.02%，上述百分比为质量百分比，混匀的固体基质与水以1:1.2质量比例搅拌均匀，115℃高温高压灭菌30分钟，冷却后备用。

所述的金黄垂直链霉菌HN6固体发酵培养物采用系列梯度稀释法进行菌落计数，最终统计发酵物的活菌体浓度达6.0-8.7×10⁹cfug^-1。

本发明有益效果：（1）本发明采用木薯粉、香蕉秸秆渣、细沙土为固体基质，配方独特，成本低廉，最终发酵产物活菌浓度可达6.0-8.7×10⁹cfug^-1，发酵效率高。（2）本发明所需用固体发酵设备简单，不需要特殊装置，易于产业化生产。（3）本发明固体基质中的木薯粉和香蕉秸秆渣在海南十分丰富，且香蕉秸秆渣被变废为宝，该材料具有区域优势。（4）本发明最终培养物对尖孢镰刀菌古巴专化型侵染引起的香蕉枯萎病防治方法简单，防治效果突出，不易造成环境污染。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1金黄垂直链霉菌HN6固体发酵生产工艺流程

（1）菌种活化：

本发明所用菌种为金黄垂直链霉菌HN6（StreptomycesaureoverticillatusHN6），将菌种以划线法接种在扩大培养基（可溶性淀粉2%，KNO30.1%，K2HPO40.05%、MgSO40.05%、NaCl0.05%、FeSO40.001%，琼脂2%，补水至100%，待药品全部溶解后，调节pH至7.0-7.2，121℃高温高压灭菌20min。）固体平板上，28℃恒温培养5天。

（2）一级种子制备：

将活化的金黄垂直链霉菌HN6制成浓度为109cfug^-1孢子悬浮液，然后按照5%的接种量接种于装有一级种子培养液（溶性淀粉2%，KNO₃0.1%，K₂HPO₄0.05%、MgSO₄0.05%、NaCl0.05%、FeSO₄0.001%，补水至100%，待药品全部溶解后，调节pH至7.0-7.2，121℃高温高压灭菌20min）的三角瓶中，180r·min^-1，28℃培养72h，制得一级种子，备用。

（3）二级种子制备：

将制备好的一级种子培养液按照5%接种量接种在装有二级种子培养液（葡萄糖0.05%、可溶性淀粉0.05%、K₂HPO₄0.05%、NaCl0.05%、MgSO₄0.05%、蛋白胨0.05%、酵母膏0.05%和黄豆粉0.05%，补水至100%，待药品全部溶解后，调节pH至6.8-7.0，121℃高温高压灭菌20min）的三角瓶中，180r·min^-1，28℃培养72h，制得二级种子，备用。

（4）固体发酵培养基配制：

木薯粉、香蕉秸秆渣制备：将木薯及香蕉秸秆晾晒至干，粉碎、过30目筛，制成木薯粉及香蕉秸秆渣，备用。

固体干基：以木薯粉、豆饼粉、香蕉秸秆渣、细沙土为基料（木薯粉、豆饼粉、香蕉秸秆渣、细沙土比例为13:3:3:1），葡萄糖0.05%，MgSO₄0.05%，NaCl0.05%，K₂HPO₄0.02%，KH₂PO₄0.02%。将固体培养基加入质量比为1:1.2的自来水，搅拌均匀，115℃高温高压灭菌30min，冷却后备用。

（5）三级种子制备

待固体发酵培养基冷却后，按照10%的接种量将二级种子接入固体发酵培养基，搅拌均匀，放入浅盘（70×50cm搪瓷盘）内，在无菌培养室保持湿度50%-70%，温度28℃培养96h，制得三级种子。

（6）固体发酵

按照（4）所述方法配制固体干基，将配制好的固体干基加入到固体发酵罐内，装料系数为50%-60%，115℃高温高压灭菌30min。待罐内培养基冷却至30-40℃时将三级种子按照接种量10%接入固体培养基，搅拌均匀，保持湿度60%-70%，温度28℃发酵培养96h，获得金黄垂直链霉菌HN6固体发酵培养物。

（7）发酵物菌落计数

采用系列梯度稀释法对金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵培养物进行菌落计数，最终统计发酵物的活菌体浓度可达6.0-8.7×10⁹cfug^-1。

实施例2金黄垂直链霉菌HN6固体发酵物对香蕉枯萎病的防治效果

（1）将香蕉枯萎病原菌（Fusariumoxysporumf.sp.cubenseFOC4)接入查氏培养液（NaNO₃0.2%，KCl0.05%，FeSO₄0.001%，KH₂PO₄0.1%g，MgSO₄0.05%，蔗糖3%，补水至100%，待药品全部溶解后，121℃高温高压灭菌20min），150r·min^-1，25℃振荡培养7天，得到香蕉枯萎病原菌液体培养液，用无菌水将该培养液稀释至孢子浓度为10⁷cfu·g^-1，备用。

（2）从海南大学环境与植物保护学院教学基地采集非香蕉种植地土样，过20目筛，170℃灭菌1.5h，冷却后分装于口径为20cm育苗钵中，取金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵培养物5g与钵内土壤混合均匀，以不接菌的固体干基处理为对照1，不做处理的灭菌土样为对照2。将四叶期的粉蕉（MusaABB）组培苗根部用清水冲洗干净，移栽于育苗钵内，在光照强度为1500-2500lx、温度为25-30℃、12小时光暗交替条件下培养7天，以伤根法接入孢子浓度为107cfu·g^-1香蕉枯萎病原菌，然后按下列病情分级标准每隔8天调查各处理的病情指数，统计最终防效。

香蕉枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.cubenseFOC4）在文献“麦明晓,黄惠琴,鲍时翔.香蕉镰刀菌枯萎病4号生理小种研究进展[J].中国生物防治,2009,25(增1):71-75”中公开过，公众可从海南大学获得。

上述涉及香蕉组培苗四叶期的粉蕉（MusaABB）组培苗在文献“李梅婷,严琰,张绍升.香蕉枯萎病菌及其粗毒素对香蕉的致病性比较[J].热带作物学报,2010,31(3):446-452”中公开过，公众可从海南大学获得。

香蕉枯萎病的分级标准：

0级：外观无可见症状,解剖假茎维管束组织未变褐；

1级：外观无可见症状,解剖假茎维管束组织变褐；

3级：叶片黄化或倒垂；

5级：假茎基部开裂,但病株尚未枯死；

7级：病株枯死。

病情指数＝

防治效果（%）＝

（3）金黄垂直链霉菌HN6固体发酵物对香蕉枯萎病的防治效果

表1金黄垂直链霉菌HN6固体发酵物对香蕉枯萎病的防治效果

注：不接菌的培养干基为CK1；不做处理的灭菌土样为CK2。

由表1可知：接种香蕉枯萎病原菌14天（d），对照1（不接菌的培养干基处理）和对照2（不做处理的灭菌土样处理）均出现病症，金黄垂直链霉菌HN6固体发酵培养物处理未发病；接种30d，两对照均到发病盛期，病情指数分别达80.00和83.12，而供试菌株固体发酵培养物处理病情指数最低，为24.32。依据30d的病情指数计算防效可知，金黄垂直链霉菌HN6固体发酵培养物防治效果明显，防效可达70.74%，由此可见该菌株固体培养物对盆栽香蕉的枯萎病有很好的防治作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）菌种活化：将菌种以划线法接种在扩大培养基上，28℃恒温培养5天，其中所述菌种为金黄垂直链霉菌HN6（StreptomycesaureoverticillatusHN6）；

2）一级种子制备：将活化的金黄垂直链霉菌HN6制成浓度为10⁹cfug^-1孢子悬浮液，然后按照5%的接种量接种于装有一级种子培养液的三角瓶中，180转/分钟搅拌，28℃下培养72小时，制得一级种子，备用；

3）二级种子制备：将制备好的一级种子培养液按照5%接种量接种在装有二级种子培养液的三角瓶中，180转/分钟搅拌，28℃下培养72小时，制得二级种子，备用；

4）三级种子制备：按照10%的接种量将二级种子接入固体发酵培养基中，搅拌均匀，放入浅盘内，在无菌培养室保持湿度50%-70%和温度28℃，培养96小时，制得三级种子；

5）固体发酵，将配制好的固体发酵培养基加入到固体发酵罐内，装料系数为50%-60%，115℃高温高压灭菌30分钟；待罐内培养基冷却至30-40℃时，将三级种子按照接种量10%接入固体发酵培养基，搅拌均匀，保持湿度60%-70%和温度28℃，发酵培养96小时，获得金黄垂直链霉菌HN6固体发酵培养物。

2.根据权利要求1所述的金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵方法，其特征在于，步骤1）中，所述的培养基为：可溶性淀粉2%、KNO₃0.1%、K₂HPO₄0.05%、MgSO₄0.05%、NaCl0.05%、FeSO₄0.001%，琼脂2%，补水至100%，上述百分比为质量百分比，待药品全部溶解后，调节pH至7.0-7.2，121℃高温高压灭菌20分钟。

3.根据权利要求1所述的金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵方法，其特征在于，所述的一级种子液为：可溶性淀粉2%、KNO₃0.1%，K₂HPO₄0.05%、MgSO₄0.05%、NaCl0.05%、FeSO₄0.001%，补水至100%，上述百分比为质量百分比，待药品全部溶解后，调节pH至7.0-7.2，121℃高温高压灭菌20分钟。

4.根据权利要求1所述的金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵方法，其特征在于，所述的二级种子液为：葡萄糖0.05%、可溶性淀粉0.05%、K₂HPO₄0.05%、NaCl0.05%、MgSO₄0.05%、蛋白胨0.05%、酵母膏0.05%和黄豆粉0.05%，补水至100%，上述百分比为质量百分比，待药品全部溶解后，调节pH至6.8-7.0，121℃高温高压灭菌20分钟。

5.根据权利要求1所述的金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵方法，其特征在于，所述的固体发酵培养基为木薯粉、豆饼粉、香蕉秸秆渣、细沙土为基料，按照13:3:3:1质量比例混合，随后加入葡萄糖0.05%、MgSO₄0.05%、NaCl0.05%，K₂HPO₄0.02%、KH₂PO₄0.02%，上述百分比为质量百分比，混匀的固体基质与水以1:1.2质量比例搅拌均匀，115℃高温高压灭菌30分钟，冷却后备用。

6.根据权利要求1-5任一项所述的金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵方法，其特征在于，所述的金黄垂直链霉菌HN6固体发酵培养物采用系列梯度稀释法进行菌落计数，最终统计发酵物的活菌体浓度达6.0-8.7×10⁹cfug^-1。

7.一种金黄垂直链霉菌HN6固体发酵培养物，其特征在于，根据权利要求1-6任一项所述的金黄垂直链霉菌HN6的固体发酵方法制备。

8.权利要求7所述的金黄垂直链霉菌HN6固体发酵培养物用于盆栽香蕉的枯萎病防治。