CN114231467B - 一株金黄垂直链霉菌df06、菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一株金黄垂直链霉菌DF06、菌剂及其制备方法和应用。本发明提供一株金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)DF06，所述的金黄垂直链霉菌DF06的保藏编号为CGMCC No.23488。本发明金黄垂直链霉菌DF06能够有效防治植物病原真菌，不会使作物产品上有农药残留，而且还能提高植物的产量以及产品的质量，对环境无污染。

Description

一株金黄垂直链霉菌DF06、菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一株金黄垂直链霉菌DF06、菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

五味子为木兰科五味子属植物，是我国最早列入神农本草经中的上品中药材。五味子用途广泛，有很大的药用价值，具有安神、益气、滋肾等功效，还可加工成药品、酒和饮料等，经济价值较高。目前国内中药材市场、个人买卖、制药企业、酿酒加工企业和对外出口等相关行业对五味子年需求量大，在保护自然资源的同时，发展大面积人工栽培是解决原料短缺的根本途径。然而随着规模化和密集化栽培，造成五味子病虫害逐年加重。据文献报道，目前五味子栽培中的主要病害有叶枯病、褐斑病、灰霉病和根腐病，这些病害的发生给五味子的产量以及品质都带来相当大的不良影响。

目前，五味子病害的防治主要还是以化学药剂为主，多数药农只是借鉴或死搬传统农业的病害防治技术，导致化学农药的滥用、误用，造成环境污染，使植物产品农药残留超标，而且防治效果越来越差。五味子是一种重要的中药材，是人们用来防病、治病、保健的特殊商品，对减少农药残毒具有更高的要求。因此，采取有效的绿色防控措施控制病害发生、发展，是确保作物高产、优质的关键技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一株金黄垂直链霉菌DF06、菌剂及其制备方法和应用，本发明金黄垂直链霉菌DF06能够有效防治植物真菌病菌，不会使作物产品上有农药残留，而且还能提高植物的产量以及产品的质量，对环境无污染。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一株金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)DF06，所述金黄垂直链霉菌DF06的保藏编号为CGMCC No.23488。

本发明提供了上述技术方案所述金黄垂直链霉菌DF06在制备防治植物真菌病害和/或促进植物生长菌剂中的应用。

本发明提供了上述技术方案一种防治植物真菌病害和/或促进植物生长的菌剂，所述有效成分包括上述技术方案所述金黄垂直链霉菌DF06的代谢物。

优选的，所述金黄垂直链霉菌DF06的代谢产物中有效孢子数＞1×10⁷个/mL。

本发明提供了上述技术方案所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将金黄垂直链霉菌DF06的发酵种子接种于发酵培养基中培养，得菌剂。

优选的，所述发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：碳源5％～20％、CaCO₃0.5％～1％、K₂HPO₄ 0.25％～0.7％、NaCl 0.05％～0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.03％～0.05％和余量的水，pH值为7.2～7.6。

优选的，在接种时，接种量为发酵培养基体积的5％～20％；所述培养的温度为26～31℃，时间为5～10d，转速为155～210rpm。

优选的，所述培养后，还包括对培养所得培养物进行抽滤。

本发明提供了上述技术方案所述金黄垂直链霉菌DF06或上述技术方案所述菌剂在防治植物真菌病害和/或促进植物生长中的应用。

本发明提供了一种防治植物真菌病害和/或促进植物生长的方法，包括以下步骤：

将上述技术方案所述菌剂施于植物叶片或根部。

有益效果：

本发明提供一株金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)DF06，所述的金黄垂直链霉菌DF06的保藏编号为CGMCC No.23488。本发明所述菌株能抑制真菌病原菌丝的生长，诱导植物产生系统抗病性，同时菌株具有解磷、固氮和产生嗜铁素的能力，既能够有效防植物真菌病害，又能够促进植物对营养物质的吸收，促进生长，提高植物自身抗病性，从而达到对植物的防病促生效果，因此该菌株能够有效防治植物真菌病菌，不会使作物产品上有农药残留，而且还具有提高植物的产量以及产品的质量、对环境无污染、抑菌谱广的优势。实施例结果表明：该菌株对于五味子主要病原菌具有较好的抑制效果，其抑制率均大于75％，其中对五味子根腐病菌抑制率高达91.45％；而且对五味子幼苗的测定的株高、茎粗、最大叶面积、全株鲜重、干重和叶绿素含量等指标均有一定提高。该菌株为植物真菌病害生物防控提供了新的手段，同时也为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株。

生物保藏信息

金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)DF06，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2021年09月26日，保藏编号为CGMCC No.23488。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为金黄垂直链霉菌DF06对不同靶标病原真菌的抑制活性，其中a为五味子根腐病菌，b为苹果腐烂病菌，c为苹果炭疽病菌，d为水稻纹枯病菌，e为黄瓜枯萎病菌，f为烟草赤星病菌，g为棉花黄萎病菌，h为葡萄白腐病菌；

图2为金黄垂直链霉菌DF06解磷、固氮和产嗜铁素能力测定结果图，其中A为在无机磷培养基上的解磷能力测定，B为产嗜铁素能力测定，C为固氮能力测定；

图3为金黄垂直链霉菌DF06在高氏一号培养基上的形态特征；

图4为金黄垂直链霉菌DF06的系统发育树。

具体实施方式

如无特殊要求，本发明所述组分均为本领域技术人员常规购买所得即可。

本发明提供了一株金黄垂直链霉菌(Streptomyces aureoverticillatus)DF06，所述的金黄垂直链霉菌DF06的保藏编号为CGMCC No.23488。

在本发明中，所述金黄垂直链霉菌DF06具有一定的解磷、产嗜铁素和固氮能力；而且该菌株不能在D-木糖为碳源的培养基上生长，故不能分解木糖；在D-半乳糖、鼠李糖、蔗糖、D-果糖、葡萄糖、D-甘露醇和麦芽糖其中至少一种作为碳源时，均能生长，其中在以D-半乳糖为碳源的培养基中生长最好。本发明所提供的金黄垂直链霉菌DF06菌株采用“诱捕法”从中药材种植地根际土壤中分离得到，该菌株尤其对五味子常见病原菌具有显著的拮抗作用，能够有效防治五味子根腐病，对五味子叶部病害如叶枯病、褐斑病、灰霉病也有防效。

在本发明中，所述金黄垂直链霉菌DF06的16SrDNA序列优选如SEQ ID NO.1所示：ACGGGCGGGTGCTTACCATGCAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATATGACACGGGATCGCATGATCTTCGTGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAGTGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTT。

在本发明中，该菌株能够抑制植物真菌病原菌丝的生长，诱导植物产生系统抗病性，同时该菌株具有较强的降解有机磷和产生嗜铁素的能力，能够促进植物对营养物质的吸收，从而达到对植物的防病促生效果。因此，该菌株具有防治植物真菌病害和促进植物生长。

本发明提供了上述技术方案所述金黄垂直链霉菌DF06在制备防治植物真菌病害和/或促进植物生长菌剂中的应用。在本发明中，所述植物优选包括五味子、苹果、水稻、辣椒、黄瓜、烟草、油菜、小麦和玉米中的一种或几种；所述真菌病害优选包括叶枯病、褐斑病、灰霉病、根腐病、腐烂病、炭疽病、纹枯病、疫霉病、枯萎病、赤星病、菌核病、赤霉病和大斑病中的一种或多种；可实现对如上真菌病害的同时防治。

在本发明中，所述叶枯病优选包括五味子叶枯病；所述叶枯病的病原菌优选为苍术黑斑病菌(Alternaria tenuissima)；所述褐斑病优选为五味子褐斑病；所述褐斑病的病原菌优选为鹅掌揪链格孢(Alternaria liriodendri)；所述灰霉病包括五味子灰霉病和/或辣椒灰霉病；所述灰霉病的病原菌优选为灰霉菌(Botrytis cinereal)；所述根腐病优选包括五味子根腐病；所述根腐病的病原菌优选为镰刀菌(Fusarium spp.)。在本发明中，所述腐烂病优选包括苹果腐烂病；所述腐烂病的病原菌优选为黑腐皮壳属真菌(Valsamali)；所述炭疽病优选为苹果炭疽病；所述炭疽病的病原菌优选为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)；所述纹枯病优选包括水稻纹枯病和/或小麦纹枯病；所述纹枯病的病原菌优选为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；所述疫霉病包括辣椒疫霉病；所述疫霉病的病原菌优选为辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)；所述枯萎病优选包括黄瓜枯萎病；所述枯萎病的病原菌优选为尖孢镰孢菌黄瓜专化型(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum,FOC)。在本发明中，所述赤星病优选为烟草赤星病；所述赤星病的病原菌优选为交链孢霉(Alternaria alternata)；所述菌核病优选为油菜菌核病；所述菌核病的病原菌优选为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)。在本发明中，所述赤霉病优选为小麦赤霉病；所述赤霉病的病原菌优选为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)；所述大斑病优选包括玉米大斑病；所述大斑病的病原菌优选为玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)。

本发明提供了一种防治植物真菌病害和/或促进植物生长的菌剂，所述有效成分包括上述技术方案所述金黄垂直链霉菌DF06的代谢产物。在本发明中，所述金黄垂直链霉菌DF06的代谢产物中有效孢子数优选为1×10⁷个/mL。在本发明中，所述菌剂优选还包括辅助组分；所述辅助组分优选包括助剂、稳定剂和抗紫外剂中的一种或几种，但不限于上述辅助组分。本发明所述菌剂对于五味子主要病原菌具有较好的抑制效果，其抑制率均大于75％，其中对五味子根腐病菌抑制率高达91.45％；而且对五味子幼苗的测定的株高、茎粗、最大叶面积、全株鲜重、干重和叶绿素含量等指标均有一定提高。

本发明提供了上述技术方案所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：

将金黄垂直链霉菌DF06的发酵种子接种于发酵培养基中培养，得菌剂。

在本发明中，所述发酵培养基优选为液体发酵培养基；所述发酵培养基优选包括以下质量百分含量的组分：碳源5％～20％、CaCO₃ 0.5％～1％、K₂HPO₄ 0.25％～0.7％、NaCl 0.05％～0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.03％～0.05％和余量的水；进一步包括碳源5％～15％、CaCO₃ 0.5％～0.8％、K₂HPO₄0.4％～0.6％、NaCl 0.05％～0.08％、MgSO₄·7H₂O0.04％～0.05％和余量的水，更优选为碳源5％、CaCO₃ 0.5％、K₂HPO₄0.5％、NaCl 0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.05％和余量的水；所述碳源优选包括小米、可溶性淀粉和黄豆粉中的一种或几种，更优选为小米，本发明利用小米作为碳源能够更好的为菌株提供营养，保证菌株的生长；所述小米优选为小米浸汁。在本发明中，所述小米浸汁的制备方法优选包括以下步骤：将小米煮沸过滤，所得滤液即为小米浸汁。本发明对所述煮沸和过滤的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。在本发明中，所述发酵培养基的pH优选为7.2～7.6。

本发明在接种时，接种量优选为发酵培养基体积的10％。在本发明中，所述培养的温度优选为28℃；所述培养的时间优选为7d；所述培养的转速优选为180rpm。

所述培养后，本发明优选还包括对培养所得培养物进行抽滤。在本发明中，所述抽滤的方式优选为真空抽滤；所述抽滤的真空度优选为0.85～0.95Mpa；所述抽滤的温度优选为室温，即21～25℃。本发明通过抽滤能够过滤出去菌体，防止喷施不堵塞施药器械。

在本发明中，所述金黄垂直链霉菌DF06的发酵种子的制备方法，优选包括以下步骤：

将金黄垂直链霉菌DF06活化后，接种于种子培养液培养，得到金黄垂直链霉菌DF06的发酵种子。

在本发明中，所述活化采用的培养基优选为高氏一号固体培养基；所述高氏一号固体培养基优选包括以下质量百分含量的组分：可溶性淀粉2％、KNO₃0.1％、K₂HPO₄0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.05％、NaCl 0.05％、FeSO₄·7H₂O 0.001％、琼脂粉1.5％和余量的水；所述高氏一号固体培养基的pH优选为7.0～7.4。在本发明中，所述活化的温度优选为23～31℃，进一步优选为24～30℃，还优选为25～29℃，更优选为28℃；所述活化的时间优选为3d。本发明在所述活化时，接种量优选为一环。

所述活化后，本发明还优选包括将所述活化所得菌株制备成金黄垂直链霉菌DF06孢子悬浮液。本发明对所述制备的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。在本发明中，所述金黄垂直链霉菌DF06孢子悬浮液中有效活菌数优选为1×10⁹cfu/mL。

本发明将金黄垂直链霉菌DF06孢子悬浮液接种于种子培养液培养，得到金黄垂直链霉菌DF06的发酵种子。本发明在所述接种时，接种量优选为种子培养液体积的2％～10％，进一步优选为3％～8％，更优选为5％。在本发明中，所述培养的时间优选为3～5d，更优选为3d；所述培养的温度优选为25～31℃，进一步优选为27～30℃，更优选为29～30℃；所述培养的转速优选为112～220rpm，进一步优选为120～210rpm，还优选为130～200rpm，还优选为140～190rpm，最优选为160rpm。

在本发明中，所述种子培养液优选包括以下质量百分含量的组分：可溶性0.8％～2％、CaCO₃ 0.2％～0.8％、K₂HPO₄ 0.1％～0.8％、牛肉膏0.3％～1％，NaCl 0.03％～0.1％、MgSO₄·7H₂O 0.03％～0.08％和余量的水，进一步优选为可溶性淀粉2％、CaCO₃0.5％、K₂HPO₄ 0.5％、牛肉膏0.5％，NaCl 0.05％、MgSO₄·7H₂O 0.05％和余量的水；所述种子培养液的pH为7.2～7.6。本发明在种子培养基中加入牛肉膏有利于菌体的生长和孢子的产生，有利于在短时间内获得大量种子液。

本发明提供了上述技术方案所述金黄垂直链霉菌DF06或上述技术方案所述所述菌剂在防治植物真菌病害和/或促进植物生长中的应用。

本发明提供了一种防治植物真菌病害和/或促进植物生长的方法，包括以下步骤：

将上述技术方案所述菌剂施于植物叶片或根部。

在本发明中，当所述菌剂施于植物叶片时，优选采用喷施；当所述菌剂施于植物根部时，优选采用泼浇、滴灌、蘸根、灌根和穴施中一种或几种；在本发明具体实施例中，所述优选采用灌根或蘸根和灌根联合处理。在本发明中，当采用蘸根和灌根联合处理时，所述蘸根后的第20d和第40d分别进行一次灌根处理；所述蘸根的时间优选为20min。在本发明中，所述喷施优选为叶面喷施；所述喷施优选采用喷雾器进行。在本发明中，所述菌剂优选为稀释后所得的稀释菌剂；所示稀释菌剂中的有效孢子数优选为1×10⁷个/mL。在本发明中，所述喷施的用量优选为常量喷雾；所述穴施或灌根的用量优选为10～400mL/棵，进一步优选为100～350mL/棵，还优选为150～300mL/棵，更优选为200～250mL/棵；若以每亩的用量计，所述灌根的用量优选为10L/亩。本发明中，菌剂具体用量与植物大小或者病害严重程度都有关系，因此，本领域技术人员可以根据植物大小或病害严重程度对菌剂的用量进行适应性调整。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一株金黄垂直链霉菌DF06、菌剂及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1金黄垂直链霉菌DF06的分离

配制腐殖酸(HVA)培养基(腐殖酸0.1g/L，CaCO₃0.02g/L，Na₂HPO₄0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，KCl 1.7g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，核黄素0.5mg/L，硫胺素0.5mg/L，维生素B₆0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇0.5mg/L，泛酸0.5mg/L，生物素0.25mg/L，对-氨基苯甲酸0.5mg/L，琼脂18g/L，pH值为7.2)，采用稀释平板法分离土壤样品，取10^-5稀释度土壤样品100μL，涂于HVA培养基平板，28℃培养7d后，对分离到的放线菌在高氏1号培养基上进行纯化，采用平板对峙法对上述分离到的放线菌进行皿内抑菌活性筛选(具体方法参考千慧敏,文艺,赵辉等.烟草黑胫病和根黑腐病生防假单胞杆菌的筛选与鉴定.中国生物防治学报,2019,35(6):940-948.)，获得金黄垂直链霉菌DF06菌株。该菌株的抑菌活性图1可以看出，金黄垂直链霉菌DF06菌株DF06具有广谱抑菌活性，对测试的靶标病原真菌(五味子根腐病菌、苹果腐烂病菌、苹果炭疽病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、烟草赤星病菌、棉花黄萎病菌、葡萄白腐病菌)均有较好的抑制活性，具有进一步研究的潜力。

实施例2：金黄垂直链霉菌DF06的鉴定

采用划线法(参考杨浦链霉菌WLU210的筛选、鉴定及其对苦瓜枯萎病对生防作用研究(张涵、习慧君、赵玉华、方鑫茹、张园园、赵莹、文才艺.杨浦链霉菌WLU210的筛选、鉴定及其对苦瓜枯萎病对生防作用研究[J].中国生物防治学报,2021,37(5):1058-1065.)将金黄垂直链霉菌DF06接种于不同形态观察培养基平板(高氏一号培养基、蔗糖察氏培养基、苹果酸钙琼脂培养基、葡萄糖天门冬素培养基、燕麦粉培养基、淀粉无机盐培养基、酪氨酸培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上，待其平板表面自然晾干后封口，在28℃恒温培养箱中倒置培养，于培养第7d观察并记录放线菌在各个培养基上的生长状况、形态特征和颜色变化情况，结果见表1和图3。

表1金黄垂直链霉菌DF06培养特征

培养基	基内菌丝	气生菌丝	菌落生长状况和形态特征
				高氏一号培养基	白色或橙色	橙白色	边缘白色，绒毛状
蔗糖察氏培养基	橙色	白橙相间	表面绒毛状，凸起，边缘波曲
				苹果酸钙琼脂培养基	乳白色	白色	表面粉状，中心凸起，边缘波曲
葡萄糖天门东素培养基	茉莉黄	白色	表面粉状，中心凸起，边缘波曲
				燕麦粉培养基	乳白色	粉色	表面粉状，中心凸起，边缘平坦
淀粉无机盐培养基	橙色	橙白相间	表面绒毛状，中心凸起，边缘波曲，不规则
				酪氨酸培养基	橙色	粉色	表面粉状，边缘白色，波曲
马铃薯葡萄糖培养基	浅粉色	粉色	表面粉状，中心凸起，边缘波曲

由表1和图3记载的可知，本发明所述菌株在高氏一号培养基中基内菌丝为白色或橙色，气生菌丝为成白色，边缘为白色，绒毛状；在蔗糖察氏培养基中基内菌丝为橙色，气生菌丝为白橙相间，表面绒毛状，凸起，边缘波曲；在苹果酸钙琼脂培养基中基内菌丝为乳白色，气生菌丝为白色，表面粉状，中心凸起，边缘波曲；在葡萄糖天门东素培养基中为基内菌丝为茉莉黄，气生菌丝为白色，表面粉状，中心凸起，边缘波曲；在燕麦粉培养基中基内菌丝为乳白色，气生菌丝为粉色，表面粉状，中心凸起，边缘平坦；在淀粉无机盐培养基中基内菌丝为橙色，气生菌丝为橙白相间，表面绒毛状，中心凸起，边缘波曲，不规则；在酪氨酸培养基中基内菌丝为橙色，气生菌丝为粉色，表面粉状，边缘白色，波曲；在马铃薯葡萄糖培养基中基内菌丝为浅粉色，气生菌丝为粉色，表面粉状，中心凸起，边缘波曲。

采用点接法(参考《杨浦链霉菌WLU210的筛选、鉴定及其对苦瓜枯萎病的生防作用研究》(张涵、习慧君、赵玉华、方鑫茹、张园园、赵莹、文才艺.杨浦链霉菌WLU210的筛选、鉴定及其对苦瓜枯萎病的生防作用研究[J].中国生物防治学报,2021,37(5):1058-1065.))，对金黄垂直链霉菌DF06菌株进行生理生化和碳源利用的测定(参考《常见细菌系统鉴定手册》或者写《链霉菌鉴定手册》)，7d后观察结果，观察结果见表2。

表2金黄垂直链霉菌DF06生理生化及碳源利用特征

由表2可知，金黄垂直链霉菌DF06菌株不能在D-木糖为碳源的培养基上生长，故不能分解木糖；在D-半乳糖、鼠李糖、蔗糖、D-果糖、葡萄糖、D-甘露醇和麦芽糖其中至少一种作为碳源时，均能生长，其中在以D-半乳糖为碳源的培养基中生长最好。

根据16S rDNA基因序列在微生物种属中的保守性，对金黄垂直链霉菌DF06进行鉴定。提取金黄垂直链霉菌DF06的基因组，PCR扩增其16S rDNA基因并送至北京擎科生物科技有限公司进行测序；具体步骤为：

一、使用CATB法提取DNA：1.低温液氮研磨菌体，加入650μL CATB提取液，置于65℃水浴1h；2.加入400μL的预混液(苯酚、氯仿和异戊醇的体积比25:24:1)，混匀后12000rpm离心10min，吸取全部上清液转移至新的无菌1.5mL离心管中；3.向离心管中加入0.6倍异戊醇，置于-20℃低温冷冻1h，置于12000rpm离心10min，弃上清；4.管中加入800μL体积百分含量为75％乙醇，12000rpm离心5min，弃上清，置于真空干燥仪内干燥常温30min；5.向管中加入50μL ddH₂O溶解DNA，并于-20℃保存。

二、PCR过程使用引物：ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG，SEQ ID NO.2；ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC，SEQ ID NO.3。

三、PCR体系：

高保真PCR酶预混液：12.5μL；引物F：1μL；引物R：1μL模板DNA：1μL；ddH₂O：9.5μL；共25μL体系。

四、PCR程序：

预变性：95℃5min，变性：95℃5s，退火：56℃30s，延伸：72℃30s，循环数：32次，12℃保存。

该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示，并制作系统发育树(图4)。结果表明，该菌属于链霉菌属的金黄垂直链霉菌，据此将该菌命名为金黄垂直链霉菌(Streptomycesaureoverticillatus)DF06。

实施例3：金黄垂直链霉菌DF06解磷、固氮、解钾以及产IAA和产嗜铁素能力测定

将在高氏一号培养基上培养5d的金黄垂直链霉菌DF06的菌饼(d＝40mm)分别接种于Ashby固体培养基平板、铬天青固体培养基平板、解磷(无机磷培养基和有机磷培养基)固体培养基平板和解钾培养基平板上上并放于28℃恒温培养箱中培养。5d后检查，若在解磷培养基上产生透明圈，说明其具有解磷能力；若在铬天青平板上产生淡黄色晕圈，说明其具有产生铁载体的能力；若在Ashby固体培养基上可以长出菌落，则说明其具有固氮能力，若在解钾培养基上产生黄色晕圈，则说明其具有解钾能力。结果表明，培养5d后在解磷培养基上接种点的周围产生了透明圈(图2中的A)，铬天青平板上接种点周围产生了淡黄色晕圈(图2中的B)，而在Ashby固体培养基上长出了接种菌株的菌落(图2中的C)，在解钾培养基上未产生黄色晕圈，说明该菌株具有一定解磷、产嗜铁素和固氮能力，但没有解钾能力。

将0.1ml浓度为0.5mmol/L三氯化铁溶解于体积百分含量35％的高氯酸中，再与等量的LB发酵液(金黄垂直链霉菌DF06在LB培养基培养5d后的发酵液)混合，遮光静置30min，观察颜色变化。若混合液由黄色变为淡红色，表明有IAA的产生，而若该混合液并没有变为淡红色，该菌株说明该菌株没有产IAA的能力。混合液的颜色并没有变为淡红色，说明该菌株说明该菌株没有产IAA的能力。

无机磷培养基：

(NH4)₂SO₄0.05wt.％，NaCl 0.03wt.％，KCl 0.03wt.％，MgSO₄·7H₂O 0.03wt.％，Ca₃(PO4)₂0.5wt.％，FeSO₄·7H₂O 0.003wt.％，MnSO₄·H₂O 0.003wt.％，葡萄糖1wt.％，pH7.4～7.6，琼脂2wt.％，定容到100mL。

有机磷培养基：

(NH₄)₂SO₄0.05wt.％，MgSO₄·7H₂O 0.03wt.％，NaCl 0.03wt.％，KCl 0.03wt.％，CaCO₃0.35wt.％，葡萄糖1wt.％，MnSO₄·H₂O 0.003wt.％，FeSO₄·7H₂O 0.003wt.％，卵磷脂0.02wt.％，琼脂2wt.％，定容到100mL。

铬天青培养基：(青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，产品编号：HB9132)

称取CAS检测培养基1wt.％，加热煮沸完全溶解于100ml蒸馏水中。

Ashby培养基(固氮选择性培养基)：

KH₂PO₄0.02wt.％，CaCO₃0.5wt.％，MgSO₄·7H₂O 0.02wt.％，NaCl 0.02wt.％，CaSO₄·2H₂O 0.01wt.％，甘露醇1wt.％，pH 7.4～7.6，琼脂2wt.％，定容到100mL。

亚历山鲍罗夫培养基(解钾培养基)：

Na2HPO40.2wt.％，FeCl₃0.0005wt.％，MgSO₄·7H₂O 0.05wt.％，CaCO₃0.01wt.％，蔗糖0.5wt.％，钾长石粉0.1wt.％，琼脂2wt.％，定容到100mL。

实施例4：金黄垂直链霉菌DF06代谢产物抑菌活性测定

金黄垂直链霉菌DF06代谢产物(菌剂)通过如下步骤制备：

(1)菌种活化：将金黄垂直链霉菌DF06菌株在28℃条件下活化培养3d，其中活化培养基为高氏一号固体培养基，该培养基的组分为：可溶性淀粉2wt.％、KNO₃0.1wt.％、K₂HPO40.05wt.％、MgSO4·7H2O 0.05wt.％、NaCl 0.05wt.％、FeSO4·7H2O 0.001wt.％、琼脂粉1.5wt.％，补水至100％，pH 7.0～7.4，活化培养时的接种量为一环，得到活化的金黄垂直链霉菌DF06。

(2)发酵种子制备：将活化的金黄垂直链霉菌DF06制成浓度为10⁹cfu/mL孢子悬浮液，然后按照5％(体积百分含量)的接种量接种于已灭菌的种子培养液中，每瓶装液量为50mL，160r/min、30℃下培养3d可获得黄垂直链霉菌DF06发酵种子，其中种子培养液组分为：可溶性淀粉2wt.％、CaCO₃ 0.5wt.％、K₂HPO₄ 0.5wt.％、牛肉膏0.5wt.％、NaCl0.05wt.％、MgSO₄·7H₂O 0.05wt.％，补水至100％，pH 7.2～7.6。

(3)金黄垂直链霉菌DF06代谢产物的制备：无菌条件下，将种子按体积百分含量10％的接种量接入液体发酵培养基中，180r/min、28℃条件下培养7d，0.85～0.95Mpa、室温真空抽滤。除去菌体，得金黄垂直链霉菌DF06代谢产物(有效孢子数＞1×10⁷个孢子/mL)，其中发酵培养基组成为：小米浸汁5wt.％、CaCO₃ 0.5wt.％、K₂HPO₄ 0.5wt.％、NaCl0.05wt.％、MgSO₄·7H₂O 0.05wt.％，补水至100％，pH 7.2～7.6。

取金黄垂直链霉菌DF06代谢产物1mL于无菌培养皿内，与9mL冷却至50℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在培养基平面中央分别接入1个4mm的供试病原菌(详见表3)菌饼，置于25℃恒温培养箱中培养，记为实验组，待对照组菌落长至培养皿的2/3时，其中对照组为只接种1个4mm供试病原菌菌饼的培养基，采用十字交叉法(贺宏伟，陈彬，韩立荣，冯俊涛，张兴.番茄枯萎病菌拮抗放线菌对筛选及其抑菌活性研究[J].河北农业大学学报,2018,41(4):29-33.)测定菌落直径，并计算抑制率，检测结果如表3所示。

表3金黄垂直链霉菌DF06菌株代谢产物对五味子主要病原菌的皿内抑制效果

注：病菌的提取方法参考《植物病理研究方法》(第三版)(方中达[M].中国农业出版社)。

由表3记载的可知，金黄垂直链霉菌DF06菌株代谢产物对五味子主要病原菌具有较好的抑制效果，其抑制率均大于75％，其中对五味子根腐病菌抑制率高达91.45％。

实施例5：金黄垂直链霉菌DF06代谢产物对五味子苗期根腐病盆栽防效

采用伤根接种法(胡建坤，黄蓉，方荣，石博，周坤华.茄子黄萎病苗期人工接种技术研究.江西农业大学学报，2017,39(6):1131-1138)进行盆栽防效测定，待种播五味子幼苗长出4～6片真叶时开始试验；

预防试验为：先在五味子根际周围均匀灌根10mL实施例4制备得到的金黄垂直链霉菌DF06代谢产物(有效孢子数＞1×10⁷个孢子/mL)，25℃培养24h后灌根10mL有效孢子数为1×10⁷个/mL的五味子根腐病菌孢子悬浮液；

治疗试验为：先在五味子根际周围均匀灌根10mL有效孢子数为1×10⁷个/mL五味子根腐病菌孢子悬浮液，24h后再灌根10mL实施例4制备得到的金黄垂直链霉菌DF06代谢产物(有效孢子数＞1×10⁷个孢子/mL)；

以25wt.％的多菌灵可湿性粉剂稀释1000倍液灌根处理作为阳性对照，具体为先在五味子根际周围均匀灌根10mL有效孢子数为1×10⁷个/mL五味子根腐病菌孢子悬浮液24h后，再灌根10mL 25wt.％的多菌灵可湿性粉剂稀释1000倍液；

以无菌水灌根处理作为阴性对照，具体为先在五味子根际周围均匀灌根10mL有效孢子数为1×10⁷个/mL五味子根腐病菌孢子悬浮液24h后，再灌根10mL无菌水；

将不同处理处理后得到的五味子幼苗在25℃，光照/黑暗＝12h/12h的条件下培养，每组处理12盆，重复3次，接种30d后调查发病情况，调查结果见表4。

五味子根腐病病情分级标准:0级:根部正常、完好；1级:根尾和根表面有轻微病变，病变尚未侵及根体组织；2级:根尾和根表面有明显病变，维管束呈褐色；3级:维管束呈深褐色，生育严重受阻，病根有部分开始腐烂，但腐烂部分占根部面积的30％以下；4级:腐烂部分占根部面积的30％以上或全株因病枯死(齐永红.生物菌剂防治柴胡根腐病及促生作用研究[J].中国野生植物资源,2017,36(6:71-74.)。

表4金黄垂直链霉菌DF06代谢产物对五味子根腐病的盆栽防效

由表4记载的可知，金黄垂直链霉菌DF06代谢产物对五味子根腐病均具有一定防治效果，其保护和治疗效果分别为68.42％和52.24％，优于多菌灵的处理。

实施例6：金黄垂直链霉菌DF06代谢产物对五味子幼苗的促生效果测定

种播育苗，选择健康、长势一致的五味子幼苗移栽到装有灭菌土的小花盆中，小花盆的尺寸为：花盆上口径15cm，下口径10.5cm，高13.5cm，容积1.72升，每盆移栽1棵五味子幼苗；待长到第5片真叶时灌根，设置金黄垂直链霉菌DF06代谢产物(有效孢子数约为2×10⁷个/mL)和10倍稀释金黄垂直链霉菌DF06代谢产物(有效孢子数约为1×10⁷个/mL)两种处理，以浇灌无菌水的幼苗作为空白对照，每隔5d灌根一次，每次灌根10mL/盆，连续灌根3次，每组处理12盆，设3次重复。

待处理90d后测定不同处理下的五味子幼苗各种生理指标，调查结果如表5所示。

表5金黄垂直链霉菌DF06代谢产物对五味子幼苗生长的影响

由表5记载的可知，金黄垂直链霉菌DF06菌株代谢产物对五味子幼苗的生长具有促进作用，其中测定的株高、茎粗、最大叶面积、全株鲜重、干重和叶绿素含量等指标均有一定提高，其中对五味子幼苗的株高和叶绿素含量促进作用表现最显著，代谢原液处理下较对照分别增加47.28％和1.67％。

实施例7：金黄垂直链霉菌DF06防治五味子苗期根腐病田间效果评价

将实施例4制备的得到的金黄垂直链霉菌DF06代谢产物与水按照体积比1：10混合，得到稀释菌剂(有效孢子数为1×10⁷个/mL)。

选取五味子根腐病发生严重的田块，采用蘸根和灌根的方式接种稀释菌剂，具体步骤为：

取300mL金黄垂直链霉菌DF06代谢产物，将50棵待移栽的五味子幼苗在该代谢产物中浸泡10min后种植；

种植第20d和第40d分别采取灌根处理的方式再接种一次稀释菌液，每次灌根的用量为10L/亩；

以40wt.％多菌灵为药剂对照，采用灌根，用量为125g/亩，清水处理为空白对照；

每个小区面积为20m²，每个处理重复3次。

种植60d后对植株发病情况进行调查和记载。每个小区调查10株，分别计算发病率，以实施例4中所述的病情分级标准为准计算病情指数和最终防效，结果见表6。

表6稀释菌剂对五味子幼苗根腐病的防效

处理	发病率(％)	病情指数	防治效果(％)
				CK	18.67±1.12	14.06±2.03	-
药剂对照	7.00±0.96	3.96±0.76	71.83
				稀释菌剂	10.33±1.02	5.63±0.96	59.96

由表6记载的可知，稀释菌剂对五味子幼苗根腐病具有较好的防治效果，其发病率为10.33％，显著低于对照发病率18.67％，最终防治效果为59.96％。

综上所述，本发明所述菌株对于五味子主要病原菌具有较好的抑制效果，其抑制率均大于75％，其中对五味子根腐病菌抑制率高达91.45％；而且对五味子幼苗的测定的株高、茎粗、最大叶面积、全株鲜重、干重和叶绿素含量等指标均有一定提高。该菌株为植物真菌病害生物防控提供了新的手段，同时也为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 渭南东旺农华生物科技有限公司

西北农林科技大学

<120> 一株金黄垂直链霉菌DF06、菌剂及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 894

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

acgggcgggt gcttaccatg cagtcgaacg atgaagccct tcggggtgga ttagtggcga 60

acgggtgagt aacacgtggg caatctgccc tgcactctgg gacaagccct ggaaacgggg 120

tctaataccg gatatgacac gggatcgcat gatcttcgtg tggaaagctc cggcggtgca 180

ggatgagccc gcggcctatc agcttgttgg tgaggtagtg gctcaccaag gcgacgacgg 240

gtagccggcc tgagagggcg accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac 300

gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc gacgccgcgt 360

gagggatgac ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagcag ggaagaagcg aaagtgacgg 420

tacctgcaga agaagcgccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggcgc 480

aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag agctcgtagg cggcttgtca cgtcggttgt 540

gaaagcccgg ggcttaaccc cgggtctgca gtcgatacgg gcaggctaga gttcggtagg 600

ggagatcgga attcctggtg tagcggtgaa atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg 660

cgaaggcgga tctctgggcc gatactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag 720

gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acggtgggca ctaggtgtgg gcaacattcc 780

acgttgtccg tgccgcagct aacgcattaa gtgccccgcc tggggagtac ggccgcaagg 840

ctaaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg gctt 894

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (9)

1.一株金黄垂直链霉菌（Streptomyces aureoverticillatus）DF06，其特征在于，所述金黄垂直链霉菌DF06的保藏编号为CGMCC No.23488。

2.权利要求1所述金黄垂直链霉菌DF06在制备防治植物真菌病害和/或促进植物生长菌剂中的应用；所述植物真菌病害的病原菌为五味子根腐病菌、苹果腐烂病菌、苹果炭疽病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、烟草赤星病菌、棉花黄萎病菌、葡萄白腐病菌、五味子灰霉病菌、五味子叶枯病菌和五味子褐斑病菌中的一种或多种；所述促进植物生长为促进五味子生长。

3.一种防治植物真菌病害和/或促进植物生长的菌剂，其特征在于，有效成分包括权利要求1所述金黄垂直链霉菌DF06。

4.权利要求3所述菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将金黄垂直链霉菌DF06的发酵种子接种于发酵培养基中培养，得菌剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括以下质量百分含量的组分：碳源5%~20%、CaCO₃ 0.5%~1%、K₂HPO₄ 0.25%~0.7%、NaCl 0.05%~0.1%、MgSO₄∙7H₂O0.03%~0.05%和余量的水，pH值为7.2~7.6。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在接种时，接种量为发酵培养基体积的5%~20%；所述培养的温度为26~31℃，时间为5~10d，转速为155~210rpm。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养后，还包括对培养所得培养物进行抽滤。

8.权利要求1所述金黄垂直链霉菌DF06或权利要求3所述菌剂在防治植物真菌病害和/或促进植物生长中的应用；所述植物真菌病害的病原菌为五味子根腐病菌、苹果腐烂病菌、苹果炭疽病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、烟草赤星病菌、棉花黄萎病菌、葡萄白腐病菌、五味子灰霉病菌、五味子叶枯病菌和五味子褐斑病菌中的一种或多种；所述促进植物生长为促进五味子生长。

9.一种防治植物真菌病害和/或促进植物生长的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求3所述菌剂施于植物叶片或根部；所述植物真菌病害的病原菌为五味子根腐病菌、苹果腐烂病菌、苹果炭疽病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜枯萎病菌、烟草赤星病菌、棉花黄萎病菌、葡萄白腐病菌、五味子灰霉病菌、五味子叶枯病菌和五味子褐斑病菌中的一种或多种；所述促进植物生长为促进五味子生长。

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