BR112014029988B1 - Método para produzir uma planta aprimorada e para seleção genômica de associações de planta-simbionte - Google Patents

Abstract

SELEÇÃO DE SIMBIOTAS POR TRIAGEM DE MÚLTIPLAS ASSOCIAÇÕES DE HOSPEDEIRO-SIMBIONTE. A presente invenção refere-se a novos métodos para seleção e produção de organismos, em particular organismos os quais apresentam comportamento simbiótico com simbiotas, e a novos organismos e simbiotas desenvolvidos deste modo, tais como simbiotas de plantas ou de gramínea e endófitas. Múltiplos simbiotas são implantados em múltiplos organismos e selecionados para aprimorar a compatibilidade e a performance simbióticas precocemente no processo de produção. Os métodos incluem a produção de organismos aprimorados a partir de germoplasma, inoculando, em um organismo hospedeiro, bibliotecas de germoplasmas com simbiotas selecionados entre bibliotecas de simbiotas e selecionando organismos hospedeiros aprimorados apresentando as características do simbiota desejadas, e a seleção de associações de organismo-simbiota com um perfil genético e metabólico desejados por análise metagenômica de bibliotecas de ácidos nucleicos de um organismo ou de uma associação de organismo- simbiota.

Description

Área da Invenção

[0001] A presente invenção se refere a novos métodos para sele cionar e reproduzir organismos, em particular organismos os quais apresentam comportamento simbiótico com simbiontes tais como en- dófitas fúngicos ou epífitas ou microbioma bacteriano em plantas, e tais como microbioma do rúmen em gado ruminante, e a novos organismos e simbiota desenvolvido por estes.

Antecedentes da Invenção

[0002] O fenótipo de muitas espécies de gado, colheitas e pasta gens depende da interação entre o genótipo do indivíduo e o genótipo de um simbionte. Plantas importantes, inclusive gramíneas forrageiras, leguminosas, árvores, arbustos, e videiras são comumente encontradas em associação com endófitas incluindo fungos, bactérias, vírus e micro-organismos. De modo similar, animais importantes, inclusive gado bovino, carneiros, porcos, cabras, etc. têm microbiomas presentes em seu intestino e rúmen.

[0003] Tanto propriedades hortícolas, agronômicas e veterinárias benéficas quanto prejudiciais resultam de associações semelhantes, inclusive tolerância aprimorada a água e estresse de nutrientes e resistência a pragas de insetos.

[0004] Por exemplo, plantas de azevém podem apresentar apri morada tolerância à estiagem e persistência se um endófita fúngico do genótipo correto colonizar a planta. De modo similar, em gramíneas, pode ser proporcionada resistência a insetos por metabólitos específicos produzidos pelo endófita, em particular alcaloides loline e peramina. Outros metabólitos produzidos pelo endófita fúngico, por exemplo lolitrems e alcaloides do ergot, podem ser tóxicos para animais de pastoreio e reduzir a alimentação dos herbívoros.

[0005] Sabe-se que existe considerável variação no perfil de me- tabólitos dos simbiontes. Por exemplo, cepas de endófitas fúngicos que carecem de uma ou outra ou ambas as toxinas animais têm sido introduzidas em variedades de azevém comerciais.

[0006] Os microbiomas bacterianos também influenciam a perfor mance da planta (por exemplo, no azevém, no trigo).

[0007] Em animais, os micro-organismos presentes no intestino são responsáveis pela digestão da ração de um animal. Os ruminantes hospedam uma série de micro-organismos extremamente grande e complexa em seu rúmen, e é esta comunidade microbiana que lhes permite converter forragem de baixa qualidade em proteína e lipídeos de alta qualidade para consumo humano sob a forma de carne e leite. Durante este processo é produzido metano, um potente gás de efeito estufa. Os simbiota bovinos - micro-organismos do rúmen podem ser importantes, por exemplo, no aprimoramento da eficiência de conversão alimentar e na redução da produção de metano. Nos ruminantes, o sucesso da digestão de ração de baixa qualidade pode depender de ter um perfil de microbiomas do rúmen particular. Se pudesse ser demonstrado que regiões do genoma do hospedeiro são associadas com diferenças no perfil microbiano do rúmen, então isto poderia ser explorado para reproduzir gado com menores emissões de metano e aprimorada eficiência de conversão alimentar.

[0008] Marcadores genéticos moleculares tais como marcadores de repetição de sequência simples (SSR, simples sequence repeat) foram desenvolvidos como testes de diagnóstico para distinguir entre grupos taxonômicos de simbiontes e detectar variação genética dentro dos grupos taxonômicos. Por exemplo, os marcadores podem ser usados para discriminar cepas de simbiontes com diferentes perfis de toxina.

[0009] No entanto, permanece a necessidade de métodos para identificar, isolar e/ou caracterizar organismos os quais apresentam comportamento simbiótico com simbiontes. As dificuldades na reprodução artificial destes simbiotas limitam sua utilidade. Por exemplo, muitos dos novos endófitas que se sabe que são benéficos para agricultura à base de pastagem apresentam baixas frequências de inoculação e são menos estáveis em germoplasma de elite.

[00010] Além disso, nas técnicas de reprodução tradicionais, por exemplo em gramíneas forrageiras tais como azevém perene e festuca alta, variedades de gramíneas são produzidas usando técnicas de cruzamento clássicas e genótipos de gramíneas são selecionados por suas características superiores, depois do monitoramento de sua performance ao longo de um período de múltiplos anos. Os genótipos das gramíneas selecionadas que formam a variedade experimental são em seguida inoculados com um único endófita e as associações de gra- mínea-endófita resultantes são avaliadas para quaisquer características favoráveis tais como resistência a insetos. As variedades sintéticas experimentais individuais implantando um único endófita nas mesmas são em seguida avaliadas para performance agronômica e performance animal resultante por animais de pastoreio durante um período de anos. Este processo de avaliação pode revelar que o único endófita sendo implantado nas diferentes variedades sintéticas experimentais pode não apresentar estabilidade vegetativa e/ou intergene- racional em algumas destas variedades ou o perfil de alcaloides desejado conferido pelo único endófita pode variar entre diferentes variedades sintéticas deixando de conferir níveis apropriados de resistência a insetos ou provocando toxicoses animais. Seria um desenvolvimento importante na arte se este processo demorado pudesse ser acelerado ou aprimorado de modo diverso.

[00011] É por conseguinte um objeto da presente invenção superar, ou no mínimo aliviar, uma ou mais das dificuldades ou deficiências associadas com a técnica anterior.

Sumário da Invenção

[00012] Por conseguinte, em um primeiro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para produzir um organismo aprimorado incluindo (i) proporcionar uma biblioteca de germoplasma de um organismo; e uma biblioteca de simbiontes; (ii) inocular a biblioteca de germoplasmas com um ou mais simbiontes selecionados entre a biblioteca de simbiontes para produzir simbiotas; (iii) reproduzir, selecionar, triar e/ou avaliar o germoplasma inoculado ou simbiota para uma ou mais características de simbiota desejadas; e (iv) em seguida identificar, cultivar ou usar de modo diverso os simbiotas que apresentam uma ou mais características desejadas para produzir o organismo aprimorado.

[00013] Por 'symbiotum' (ou simbiotas no plural) se entende um su- pra-organismo representando uma associação de organismos com simbionte. Por exemplo, simbiotas podem ser germoplasma da planta inoculada.

[00014] Por 'biblioteca' se entende um recurso, tal como uma coleção de simbiontes.

[00015] Os requerentes estabeleceram que é possível implantar múltiplos simbiontes em múltiplos organismos e selecionar por aprimoradas compatibilidade simbiótica e performance precocemente no processo de produção. Isto é, combinações de genótipos de simbion- te-organismo são produzidas e triadas por características desejadas incluindo aprimorada compatibilidade de simbiotas e performance ab initio. Isto pode ser contrastado com técnicas da arte anterior nas quais um organismo hospedeiro, por exemplo, uma variedade de gra- mínea, seria produzida e selecionada durante um período de tempo depois do qual ocorreria inoculação de simbionte com um único sim- bionte posteriormente no desenvolvimento varietal.

[00016] Conforme usado neste requerimento, o termo "organismo" se refere a um organismo multicelular eucariótico, incluindo, sem limitação, animais e plantas. Em modalidades particulares, o animal pode ser um mamífero ou uma ave. De particular importância são animais mamíferos de importância agrícola, tais como gado bovino, carneiros, porcos, cabras e semelhantes, que abrigam microbiomas no intestino ou no rúmen. Em modalidades particulares, o organismo é uma planta, incluindo sem limitação monocotiledôneas e dicotiledôneas. Tipos específicos de plantas incluem, sem limitação, gramíneas perenes, leguminosas, árvores decorativas ou frutíferas, videiras, arbustos e moitas, ervas, e flores decorativas ou comestíveis.

[00017] Em uma modalidade preferencial deste aspecto da presente invenção, o organismo pode ser uma planta ou um animal e o um ou mais simbiontes podem ser capazes de formar associações simbióticas com a planta ou o animal. Preferencialmente, o organismo é uma planta estabelecendo associações simbióticas com endófitas.

[00018] Por 'simbionte' se entende um micro-organismo que é associado com um organismo multicelular.

[00019] Por 'associado com' se entende que o simbionte vive sobre, em ou em íntima proximidade com o organismo. Por exemplo, o sim- bionte pode ser um micro-organismo que vive dentro do corpo ou das células de outro organismo ou sobre ou intimamente associado com a superfície do organismo, por exemplo um biofilme em íntima associação com uma planta. No caso de uma planta, o simbionte pode ser enodofítico, por exemplo vivendo dentro dos tecidos internos da plan ta, ou pode ser epifítico, por exemplo crescendo externamente sobre a planta.

[00020] O simbionte pode ser selecionado entre um ou mais entre fungos, vírus, bactérias e outros micro-organismos. Por exemplo, pode ser um endófita, tal como um endófita fúngico ou bacteriano, um epífi- ta, tal como um epífita fúngico ou bacteriano, um microbioma bacteri- ano, ou um micorriza tal como um micorriza arbuscular.

[00021] Por conseguinte, em uma modalidade preferencial da presente invenção, é proporcionado um método conforme descrito acima em que o organismo é uma planta, o método incluindo: (i) proporcionar uma biblioteca de germoplasma da planta; e uma biblioteca de endófitas e/ou epífitas e/ou microbiomas associados com planta; (ii) inocular a biblioteca de germoplasmas da planta com um ou mais endófitas e/ou epífitas e/ou microbiomas associados com planta selecionados entre a biblioteca para produzir simbiotas; (iii) reproduzir, selecionar, triar e/ou avaliar os simbiotas para uma ou mais características de simbiota desejadas; e (iv) identificar, cultivar ou usar de modo diverso os simbio- tas que apresentam uma ou mais características desejadas para produzir a planta aprimorada.

[00022] Em uma modalidade preferencial, o método pode ser usado para desenvolver variedades de simbiotas aprimorados apresentando uma ou mais características desejadas.

[00023] Em um aspecto adicional da presente invenção é proporcionado um método de seleção genômica de associações de organis- mo-simbionte, o método referido incluindo (i) proporcionar uma biblioteca de amostras de ácido nu- cleico do organismo referido ou da referida associação de organis- mo-simbionte; (ii) analisar as amostras referidas usando metagenômica para obter um perfil genético para cada amostra; (iii) selecionar organismos ou associações de organis- mo-simbionte com um perfil genético e/ou metabólico desejados. Em uma modalidade preferencial, o método pode incluir as etapas preliminares de: (i) proporcionar uma associação de organismo-simbionte; (ii) submeter a referida associação de organismo-simbionte a uma ou mais condições ambientais; e (iii) preparar uma biblioteca de amostras de ácido nu- cleico a partir de cada uma das associações de organismo-simbionte tratadas ambientalmente.

[00024] Em uma modalidade preferencial deste aspecto da presente invenção, o organismo pode ser uma planta ou um animal e o sim- bionte pode ser um microbioma bacteriano.

[00025] Em uma modalidade preferencial, o método pode ser usado para desenvolver variedades de simbiotas aprimorados apresentando uma ou mais características desejadas.

[00026] A planta pode ser uma gramínea, preferencialmente uma gramínea perene, uma leguminosa, uma videira, um arbusto, uma árvore, uma erva, uma flor, um arbusto ou uma moita. O método de acordo com este aspecto da presente invenção é particularmente aplicável a gramíneas e leguminosas.

[00027] O endófita pode ser um endófita fúngico ou bacteriano. O epífita pode ser um epífita fúngico ou bacteriano. Em uma modalidade preferencial, a biblioteca pode ser um microbioma bacteriano.

[00028] Em uma modalidade preferencial, o simbionte pode ser um endófita fúngico ou bacteriano, um epífita fúngico ou bacteriano, ou um microbioma bacteriano.

[00029] Por 'analisar as amostras referidas por metagenômica' se entende analisar material genético recuperado a partir do organismo ou da associação de organismo-simbionte, preferencialmente diretamente a partir do organismo ou da associação de organis- mo-simbionte, a fim de que amostras em grande parte não tendenciosas de uma proporção significativa, preferencialmente substancialmente todos, genes de uma proporção significativa, preferencialmente substancialmente todos, dos membros da associação amostrada sejam analisadas.

[00030] Esta análise pode envolver a detecção da presença ou ausência de marcadores polimórficos, tais como repetições de sequência simples (SSRs) ou marcadores genéticos do tipo de acasalamento.

[00031] Alternativamente, ou além disso, esta análise pode envolver o sequenciamento de DNA genômico e/ou mitocondrial e/ou de RNA ribossômico e a realização de comparações de sequências com bancos de dados de sequências de ácido nucleico conhecidas, por exemplo sequências de rRNA 16S as quais são indicativas de genes bacte- rianos.

[00032] A uma ou mais condições ambientais às quais a referida associação de organismo-simbionte pode ser submetida incluem, mas não estão limitadas a, diferentes condições nutricionais, tais como estresses de nutrientes, por exemplo baixo teor de nitrogênio ou fósforo; e diferentes condições de luz, temperatura ou água, tais como baixas condições de luz, estresse causado pelo frio ou estresse hídrico, respectivamente.

[00033] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o um ou mais simbiontes podem incluir uma variação genética, para reforçar a estabilidade do symbiotum, tolerância ao estresse abiótico (por exemplo, estresse hídrico) do symbiotum, tolerância ao estresse biótico (por exemplo, resistência a doenças) do symbiotum, eficiência do uso de nutrientes (por exemplo, eficiência do uso de fósforo, eficiência do uso de nitrogênio) do symbiotum; e por exemplo, para intro- gressão de características de simbiontes em animais tais como espécies de gado ruminante para reforçar a eficiência de conversão alimentar do symbiotum (isto é, organismo do gado ruminante com o mi- crobioma do seu rúmen) ou para mitigar a metanogênese do symbio- tum.

[00034] A variação genética pode ser introduzida utilizando quaisquer técnicas de rotina, por exemplo, através de uma ou mais entre mutagênese aleatória, di/poli-ploidização, mutagênese direcionada; cisgênese; transgênese; intragênese.

[00035] A análise genética pode ser conduzida conforme descrito acima. As plântulas podem ser triadas, por exemplo, para sequências de rRNA 16S bacterianas.

[00036] Os simbiotas podem ser de qualquer forma adequada, incluindo embriões inoculados, sementes de planta, sementes em germinação, plântulas, mudas, plantas, etc.

[00037] Em uma forma preferencial as amostras de ácido nucleico podem ser extraídas a partir das folhas de plântulas, mais preferencialmente a partir do epicótilo, hipocótilo ou brotação embrionária similar das plântulas. Em gramíneas, o DNA/RNA pode ser extraído dos per- filhos. Em outra forma preferencial as amostras de ácido nucleico podem ser extraídas a partir de amostras de raízes. Alternativamente, as amostras de ácido nucleico podem ser extraídas a partir de sementes em germinação integrais ou plântulas.

[00038] Preferencialmente as amostras de ácido nucleico são amostras de RNA, as quais podem ser então usadas para construir bibliotecas de cDNA.

[00039] O método de acordo com este aspecto da presente invenção pode incluir adicionalmente submeter as populações de simbiotas selecionados a fenotipagem para avaliação da performance de simbi- otas e/ou da manutenção de características desejadas; e seleção de simbiotas para gerar uma variedade de simbiotas sintéticos, por exemplo por policruzamento.

[00040] Por exemplo, a variedade de simbiotas selecionados pode ser submetida a um teste de identificação de simbionte, seguido por policruzamento para produzir uma semente da geração seguinte. Op-cionalmente, as etapas acima podem ser repetidas para confirmar a estabilidade dos simbiotas, características desejadas, a identidade do simbionte e/ou a incidência de simbionte na geração seguinte, por exemplo na geração de semente seguinte.

[00041] Por conseguinte, em um aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado simbiota aprimorado incluindo um ou mais organismos contendo um ou mais simbiontes produzidos utilizando o método descrito acima.

[00042] Por conseguinte, em um aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado um organismo aprimorado apresentando simbiota com um simbionte e produzido utilizando o método descrito acima.

[00043] O organismo aprimorado pode ser uma planta ou um animal.

[00044] Onde o organismo é uma planta, a planta pode ser uma gramínea, uma árvore, uma flor, uma erva, um arbusto ou uma moita, uma videira ou uma leguminosa, ou um produto da mesma.

[00045] O material da planta pode estar sob a forma de uma semente, uma plântula, um embrião ou semelhante.

[00046] As etapas do método descritas acima podem ser repetidas para desenvolver gerações posteriores de sementes, plantas ou animais simbiotas.

[00047] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona uma planta, uma semente de planta ou outra parte de planta derivada de uma semente ou planta da presente invenção e infectada de modo estável com um simbionte.

[00048] Preferencialmente, a célula de planta, a planta, a semente de planta ou outra parte da planta é uma gramínea, mais preferencialmente uma gramínea forrageira, de relva ou bioenergia, tais como as dos gêneros Lolium e Festuca, incluindo L perenne e L arundinaceum, e dos gêneros Brachiaria e Urochloa, incluindo B. brizantha, B. de- cumbens, B. humidicola e U. mosambicensis.

[00049] Por 'célula de planta' se entende qualquer célula de auto-propagação ligada por uma membrana semi-permeável e contendo plastídeo. Uma célula semelhante também necessitou de uma parede celular se for desejável propagação adicional. Célula de planta, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, inclui, sem limitação, culturas de suspensões de sementes, embriões, regiões meris- temáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófi- tos, pólem e micrósporos.

[00050] Foi empreendido um programa de verificação de endófitas em larga escala de modo a estabelecer a biblioteca de cepas de endó- fitas fúngicos. Foi estabelecida uma compilação de acessos de azevém perene e de festuca alta.

[00051] Os endófitas selecionados para inocular o germoplasma da planta podem ser selecionados utilizando as técnicas descritas em um Requerimento de Patente Provisória Australiana arquivado em 1°. de junho de 2012 intitulado "Novel Endophytes", cuja revelação integral é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Os novos endófitas descritos no mesmo são particularmente preferenciais.

[00052] Análise genética de endófitas nestes acessos levou à identificação de uma série de novas cepas de endófitas. Estas novas ce- pas de endófitas são geneticamente distintas das cepas de endófitas conhecidas. Pode ser realizado o perfil metabólico para determinar o perfil de toxinas destas cepas.

[00053] Detecção específica de endófitas em plantas com marcadores de SSR pode ser usada para confirmar a presença e a identidade de cepas de endófitas inoculadas artificialmente em, por exemplo, plantas, variedades e cultivares de gramíneas.

[00054] Na etapa de triagem (iii) de acordo com o método deste aspecto da presente invenção, o germoplasma inoculado pode ser tri- ado por análise genética e/ou perfil metabólico. Por exemplo, podem ser usadas técnicas de análise genética descritas no Requerimento de Patente Provisória Australiana intitulado "Novel Endophytes".

[00055] Alternativamente, ou além disso, o germoplasma inoculado pode ser submetido a análise genética (caracterizado geneticamente) para demonstrar distinção genética de simbiotas de genótipo de sim- bionte conhecido e confirmar a identidade de cepas de simbiontes inoculadas artificialmente em, por exemplo, plantas, variedades e cultivares de gramíneas.

[00056] Por 'análise genética' se entende analisar o DNA nuclear e/ou mitocondrial do simbionte.

[00057] Esta análise pode envolver detecção da presença ou ausência de marcadores polimórficos, tais como repetições de sequência simples (SSRs) ou marcadores do tipo de acasalamento. SSRs, também denominados micro-saté!ites, são baseados em um elemento de núcleo de 1 a 7 nucleotídeos, mais tipicamente um elemento de núcleo de 1 a 4 nucleotídeos, que é repetido em tandem. A série de SSR é embutida em sequências de DNA flanqueante complexas. Imagina-se que os micro-satélites surjam devido à propriedade de deslize (slippage) de replicação, na qual a enzima DNA polimerase pausa e rapidamente desliza em termos de seu template, a fim de que sequên- cias adjacentes curtas sejam repetidas. Alguns motivos de sequência são mais propensos a deslize do que outros, dando origem a variações nos números relativos de loci de SSR à base de diferentes tipos de motivos. Uma vez duplicada, a série de SSR pode expandir adicionalmente (ou contrair) devido a deslizamento adicional e/ou permuta de cromátides irmãs desiguais. O número total de sítios de SSR é elevado, de tal modo que em princípio os loci referidos são capazes de proporcionar etiquetas para qualquer gene ligado.

[00058] As SSRs são altamente polimórficas devido a variação no número de repetições e são herdadas de modo co-dominante. Sua detecção é baseada na reação de cadeia polimerase (PCR), necessitando de somente pequenas quantidades de DNA e adequada para automação. São ubíquas em genomas eucarióticos, incluindo geno- mas fúngicos e de plantas, e foi visto que ocorrem a cada 21 a 65 kb nos genomas da planta. Consequentemente, as SSRs são marcadores ideais para uma ampla gama de aplicações tais como análise da diversidade genética, identificação genotípica, mapeamento de genoma, mapeamento de traços e seleção assistida por marcador.

[00059] Marcadores de SSR conhecidos os quais podem ser usados para investigar a diversidade de endófitas em azevém perene são descritos em van Zijll de Jong et al (2003).

[00060] Alternativamente, ou além disso, a análise genética pode envolver sequenciamento de DNA genômico e/ou mitocondrial e a realização de comparações de sequências para avaliar a variação genética entre simbiontes.

[00061] O germoplasma inoculado ou associação de organis- mo-simbionte pode ser submetido a análise metabólica de modo a identificar a presença de traços metabólicos desejados.

[00062] Por 'análise metabólica' se entende a análise de metabóli- tos, em particular toxinas, produzidos pelos simbiontes. Preferencial- mente, isto é feito por geração de plantas inoculadas para cada um dos simbiontes e medição de, por exemplo, níveis de toxinas, resistência a pragas e/ou doenças, ou tolerância a água e/ou estresse de nutrientes em planta. Mais preferencialmente, isto é feito por geração de plantas inoculadas isogenicamente para cada um dos endófitas e medição dos níveis de toxinas em planta.

[00063] Por um 'perfil genético e metabólico desejados' se entende que o simbionte possui características genéticas e/ou metabólicas que resultam em um fenótipo benéfico em um organismo que abriga, ou associado de outro modo com, o simbionte.

[00064] As propriedades benéficas referidas incluem tolerância aprimorada a água e/ou estresse de nutrientes, aprimorada resistência a pragas e/ou doenças, reforçada tolerância ao estresse biótico, reforçada tolerância à estiagem, reforçada eficiência ao uso de água, reforçada tolerância a extremos de temperatura, reduzida toxicitade, reforçada disponibilidade de nutrientes e reforçado vigor em, por exemplo, uma planta com a qual o simbionte é associado, em relação a uma planta de controle carecendo do simbionte ou contendo um simbionte de controle tal como endófita tóxico padrão (ST, standard toxic).

[00065] As propriedades benéficas referidas também incluem reduzida toxicidade da planta associada a animais de pastoreio.

[00066] Por exemplo, a tolerância a água e/ou estresse de nutrientes pode ser aumentada por no mínimo aproximadamente 5%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 10%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 25%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 50%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 100%, em relação a um simbionte de controle tal como um endófita ST ou a uma planta de controle não simbionte. Preferencialmente, a tolerância a água e/ou estresse de nutrientes pode ser aumentada por entre aproximadamente 5% e aproximadamente 50%, mais preferencialmente entre aproximadamente 10% e aproximadamente 25%, em relação a um simbionte de controle tal como um endófita ST ou a uma planta de controle não simbionte.

[00067] Por exemplo, a resistência da planta a pragas e/ou doenças pode ser aumentada por no mínimo aproximadamente 5%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 10%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 25%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 50%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 100%, em relação a uma planta de controle. Preferencialmente, a resistência da planta a doenças e/ou pragas pode ser aumentada por entre aproximadamente 5% e aproximadamente 50%, mais preferencialmente entre aproximadamente 10% e aproximadamente 25%, em relação a uma planta de controle.

[00068] Por exemplo, a eficiência de uso de água e/ou o vigor da planta pode ser aumentado por no mínimo aproximadamente 5%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 10%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 25%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 50%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 100%, em relação a um simbionte de controle tal como um endófita ST ou a uma planta de controle não simbionte. Preferencialmente, a tolerância a água e/ou estresse de nutrientes pode ser aumentada por entre aproximadamente 5% e aproximadamente 50%, mais preferencialmente entre aproximadamente 10% e aproximadamente 25%, em relação a um simbionte de controle tal como um endófita ST ou a uma planta de controle não simbionte.

[00069] Por exemplo, a toxicidade pode ser reduzida por no mínimo aproximadamente 5%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 10%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 25%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 50%, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 100%, em relação a um simbionte de controle tal como um endófita ST ou uma planta de controle não simbionte. Preferencialmente, toxicidade pode ser reduzida por entre aproximadamente 5% e aproximadamente 100%, mais preferencialmente entre aproximadamente 50% e aproximadamente 100% em relação a um simbionte de controle tal como um endófita ST ou uma planta de controle não simbionte.

[00070] Em uma modalidade preferencial, a toxicidade pode ser reduzida até uma quantidade desprezível ou substancialmente zero de toxicidade.

[00071] Em uma modalidade preferencial, o endófita pode apresentar um perfil de toxinas desejado.

[00072] Preferencialmente o endófita é isolado a partir de uma espécie de festuca, preferencialmente festuca alta.

[00073] Preferencialmente, o endófita é do gênero Neotyphodium, mais preferencialmente é de uma espécie selecionada entre o grupo consistindo em N uncinatum, N coenophialum e N lolli, o mais preferencialmente N coenophialum. O endófita também pode ser do gênero Epichloê, incluindo E typhina, E baconii e E festucae. O endófita também pode ser do exogrupo não-Epichloê. O endófita também pode ser de uma espécie selecionada entre o grupo consistindo em FaTG-3 e FaTG-3 like, e FaTG-2 e FaTG-2 like.

[00074] O endófita também pode ser do gênero Acremonium, incluindo A. implicatum e endófitas de gramíneas Brachiaria-Urochloa conforme descrito no Requerimento de Patente Australiana No. 2011902393 intitulado "Fungi e associated methods", para o presente requerimento, cuja revelação integral é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00075] Por um 'perfil de toxinas desejado' se entende que o simbi- onte produz compostos significativamente menos tóxicos e/ou compostos significativamente mais benéficos do que um organismo de controle.

[00076] Por exemplo, no caso de plantas, o endófita pode produzir alcaloides significativamente menos tóxicos, tais como ergovalina, em comparação com uma planta inoculada com um endófita de controle tal como endófita tóxico padrão (ST, standard toxic); e/ou significativamente mais alcaloides conferindo propriedades benéficas tais como tolerância aprimorada a água e/ou estresse de nutrientes e aprimorada resistência a pragas e/ou doenças na planta com a qual o endófita é associado, tais como peramina, N-formilolina, N-acetilolina e noriolina, novamente quando comparado com uma planta inoculada com um endófita de controle tal como ST ou com uma planta de controle não endófita.

[00077] Em uma modalidade particularmente preferencial, o endófi- ta pode ser selecionado entre o grupo consistindo em E1, NEA10, NEA e NEA 2, os quais foram depositados no The National Measurement Institute em 5 de janeiro de 2010 com números de acesso V10/000001, V10/000002, V10/000003 e V10/000004, respectivamente, e estão descritos no Requerimento de Patente Internacional No. PCT/AU2011/000020, cuja revelação integral é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00078] Em uma modalidade particularmente preferencial, o endófi- ta pode ser selecionado entre o grupo consistindo em NEA16, NEA17, NEA18, NEA19, NEA20, NEA21 e NEA23, os quais foram depositados no The National Measurement Institute em 3 de abril de 2012 com números de acesso V12/001413, V12/001414, V12/001415, V12/001416, V12/001417, V12/001418 e V12/001419, respectivamente, e estão descritos em um Requerimento de Patente Australiana arquivado em 1°. de junho de 2012 intitulado 'Novel Endophytes', cuja revelação integral é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00079] Em uma modalidade particularmente preferencial, o endófi- ta pode ser selecionado entre o grupo consistindo em Acremonium 1.1.A (1.1 A), 3.3.A (3.3A), 5.1.B (5.1 B), 9.2.A (9.2A) e 12.1. A (12.1 A), os quais foram depositados no The National Measurement Institute em 15 de junho de 2011 com números de acesso V11/011370, V11/011371, V11/011372, V11/011373, e V11/011374, respectiva mente, os quais estão descritos no Requerimento de Patente Australiana No. 2011902393 intitulado "Fungi and associated methods", cuja revelação integral é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00080] Os endófitas referidos podem ter um perfil de toxinas desejado conforme descrito acima.

[00081] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, o um ou mais simbiontes podem incluir uma variação genética, por exemplo, para introgressão de traços endófitas em plantas tais como gramíneas para reforçar a estabilidade vegetativa do symbiotum, a estabilidade intergeracional de 'o symbiotum, a tolerância ao estresse abiótico (por exemplo, estresse hídrico) do symbiotum, a tolerância ao estresse biótico (por exemplo, resistência a doenças) do symbiotum, a eficiência do uso de nutrientes (por exemplo, a eficiência do uso de fósforo, a eficiência do uso de nitrogênio) do symbiotum; e por exemplo, para introgressão de características de simbiontes em animais tais como espécies de gado ruminante para reforçar a eficiência de conversão alimentar do symbiotum (isto é, organismo do gado ruminante com o microbioma do seu rúmen) ou para mitigar a metanogênese do symbiotum.

[00082] A variação genética pode ser introduzida utilizando quaisquer técnicas de rotina, por exemplo, através de uma ou mais entre mutagênese aleatória, di/poli-ploidização, mutagênese direcionada; cisgênese; transgênese; intragênese.

[00083] Em uma modalidade preferencial, o um ou mais endófitas podem ser variantes de endófitas conforme descrito em um Requerimento de Patente Australiana arquivado em 1°. de junho de 2012 intitulado "Designer Endophytes", cuja revelação integral é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00084] Em uma modalidade particularmente preferencial, o endófi- ta pode ser selecionado entre o grupo consistindo em uma variante de endófita selecionada entre o grupo consistindo em NEA12dh5, NEA12dh6, NEA12dh13, NEA12dh14, e NEA12dh17, os quais foram depositados no The National Measurement Institute em 3 de abril de 2012 com números de acesso V12/001408, V12/001409, V12/001410, V12/001411 e V12/001412, respectivamente.

[00085] Os endófitas referidos podem ter um perfil de toxinas desejado conforme descrito acima.

[00086] Preferencialmente, o organismo é inoculado com o simbio- nte por um método selecionado entre o grupo consistindo em infecção, reprodução, cruzamento, hibridização e combinações dos mesmos.

[00087] Em uma modalidade, a planta pode ser inoculada por inoculação isogênica. Isto tem a vantagem de que efeitos fenotípicos dos endófitas podem ser avaliados na ausência de efeitos genéticos específicos do hospedeiro. Mais particularmente, podem ser feitas múltiplas inoculações de endófitas no germoplasma da planta, e plântulas regeneradas em cultura antes de transferência para o solo ou outro meio de crescimento.

[00088] Em outra modalidade, uma biblioteca de germoplasma da planta pode ser inoculada com múltiplos endófitas. Isto tem a vantagem de permitir que sejam identificadas associações favoráveis de hospedeiro e endófita.

[00089] A identificação de um endófita do tipo de acasalamento oposto que é altamente compatível e estável em plantas proporciona um meio para reprodução molecular de endófitas para azevém perene. Preferencialmente a planta pode ser infectada por hiper-inoculação.

[00090] A fusão hifal entre cepas de endófitas do tipo de acasalamento oposto proporciona um meio para liberação de traços favoráveis na planta hospedeira, preferencialmente através de hiper-inoculação. As cepas referidas são preferencialmente selecionadas entre o grupo incluindo uma cepa de endófita que apresenta as características favoráveis de alta frequência de inoculação e alta compatibilidade com uma ampla gama de germoplasma, preferencialmente germoplasma hospedeiro de elite de azevém perene e/ou festuca alta e um endófita que apresenta uma baixa frequência de inoculação e baixa compatibi-lidade, mas tem um perfil de toxinas alcaloides altamente favorável.

[00091] As plantas infectadas com endófitas podem ser cultivadas por técnicas conhecidas. A pessoa versada na arte pode prontamente determinar condições de cultura apropriadas dependendo da planta a ser cultivada.

[00092] A etapa de triagem (iii) pode incluir análise de metabólitos da planta. Os metabólitos podem ser analisados por técnicas conhecidas tais como técnicas cromatográficas ou espectrometria de massa, por exemplo LCMS ou HPLC. Em uma modalidade particularmente preferencial, plantas infectadas com endófitas podem ser analisadas por cromatografia líquida de fase reversa - espectrometria de massa (LCMS). Este método de fase reversa pode permitir análise de meta- bólitos específicos (incluindo lolines, peramina, ergovalina, lolitrem, e jantitrens, tais como jantitrem I, jantitrem G e jantitrem F) em uma operação cromatográfica de LCMS de extrato de planta infectada com um único endófita.

[00093] Em uma modalidade particularmente preferencial, os endó- fitas podem ser selecionados entre o grupo consistindo em NEA2, NEA3, NE6, NEA10, NEA11, NEA12, E1, NEA17, NEA21, NEA23, NEA18, NEA19, NEA16, NEA20, NEA12dh5, NEA12dh6, NEA12dh13, NEA12dh14, NEA12dh17, NEA12-DsRed e IRM1-35.

[00094] Em outra modalidade particularmente preferencial, análise por LCMS incluindo análise por EIC (cromatograma de íons extraídos) pode permitir detecção dos metabólitos alcaloides a partir de pequenas quantidades de material da planta infectada com endófita. A identidade dos metabólitos pode ser confirmada por comparação do tempo de retenção com o de toxinas puras ou extratos de plantas infectada com endófita com um perfil de toxinas conhecido analisado sob substancialmente as mesmas condições e/ou por comparação de padrões de fragmentação de massa, por exemplo gerada.

[00095] Conforme declarado acima, no método de acordo com este aspecto da presente invenção, o organismo selecionado pode ser uma planta ou um animal, preferencialmente uma planta. Onde o organismo é uma planta, o germoplasma da planta pode estar presente como um embrião e o embrião pode ser tratado para formar uma semente artificial.

[00096] Por conseguinte, em uma modalidade preferencial é proporcionado um método para preparar sementes artificiais cujo método inclui: proporcionar uma fonte de sementes de planta; submeter a uma ou mais sementes a uma etapa de esterilização superficial; isolar o um ou mais embriões de semente a partir da uma ou mais sementes esterilizadas superficialmente; e revestir o um ou mais embriões com um revestimento para formar uma ou mais sementes artificiais.

[00097] As sementes artificiais podem ser preparadas utilizando as técnicas descritas no Requerimentos de Patente Provisória Australiana arquivados em 1°. de junho de 2012 e em 7 de setembro de 2012 inti- tulados "Method for large scale generation of symbiota", cujas revelações integrais são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00098] As sementes podem ser de qualquer planta adequada. A planta pode ser uma gramínea, preferencialmente uma gramínea perene, uma leguminosa, uma videira, um arbusto, uma árvore, uma erva, uma flor, um arbusto ou uma moita. O método de acordo com este aspecto da presente invenção é particularmente aplicável a gramíneas e leguminosas.

[00099] As sementes podem ser esterilizadas superficialmente por qualquer técnica adequada. Preferencialmente as sementes são esterilizadas por tratamento das mesmas com um ácido tal como ácido clorídrico e alvejante, tal como hipoclorito de sódio. Preferencialmente os tratamentos com ácido e alvejante são realizados sequencialmente. O tratamento com ácido pode ser por um período de a partir de uma hora até 24 horas, preferencialmente de um dia para o outro. O tratamento com alvejante pode ser por um período de 5 minutos até uma hora, preferencialmente aproximadamente 20 minutos. O tratamento com alvejante pode ser realizado duas vezes em dias sucessivos, com as sementes sendo lavadas depois de cada tratamento, por exemplo, usando água destilada estéril, e armazenadas em aproximadamente 4 a 30°C, preferencialmente aproximadamente 24°C.

[000100] Os embriões podem ser isolados a partir das sementes tratadas por técnicas de conhecimento das pessoas versadas na arte.

[000101] Em uma modalidade preferencial, os embriões podem ser tratados para criar um ou mais pontos de entrada para o simbionte, por exemplo endófita. Por exemplo, o embrião pode ser perfurado ou sua superfície pode ser danificada de modo diverso, por exemplo por ras- pagem ou causticação, de modo a facilitar a entrada do simbionte. Em uma modalidade particularmente preferencial, uma agulha hipodérmica ou similar pode ser usada para criar orifícios de punção única ou múltipla na superfície do embrião.

[000102] O revestimento pode ser de qualquer tipo adequado para encapsular o embrião, incluindo alginato, agar, polyco 2133, carbóxi metil celulose, carragena, gelrita, goma guar, pectato de sódio, goma tragacanto e semelhante. Em uma modalidade preferencial o revestimento é alginato, mais particularmente alginato de cálcio.

[000103] Em uma modalidade preferencial, os embriões podem ser misturados com o revestimento e gotas de revestimento contendo embriões individuais colocadas em uma solução de polimerização tal como solução de cloreto de cálcio, preferencialmente enquanto agitando, para formar sementes artificiais. Sementes artificiais podem ser coletadas depois de aproximadamente 1 a 60 minutos de agitação, preferencialmente depois de aproximadamente 15 minutos de agitação.

[000104] Em uma modalidade preferencial, os embriões podem ser inoculados com um simbionte tal como um endófita fúngico antes do revestimento. Em uma forma preferencial, os embriões podem ser inoculados diretamente com micélio endófita.

[000105] Alternativamente, em uma modalidade particularmente preferencial, embriões isolados podem ser revestidos com uma camada de revestimento contendo simbionte, tal como uma camada de revestimento contendo endófita fúngico.

[000106] Nesta modalidade, a etapa de inoculação pode incluir: - proporcionar uma fonte de embriões de semente; - inocular os embriões com um ou mais simbiontes tais como endófitas fúngicos; e - revestir o um ou mais embriões inoculados com um revestimento de modo a formar uma ou mais sementes artificiais.

[000107] Alternativamente, a etapa de inoculação pode incluir: - proporcionar uma fonte de embriões de semente; e - revestir os embriões com um revestimento contendo sim- biontes tais como endófitas fúngicos de modo a formar uma ou mais sementes artificiais.

[000108] Em uma modalidade preferencial as sementes podem ser duplamente revestidas. Preferencialmente a segunda camada de revestimento é alginato, mais preferencialmente alginato de cálcio, ainda mais preferencialmente alginato de cálcio colorido. Em uma modalidade preferencial, as sementes artificiais com a primeira camada de revestimento podem ser secadas ao ar antes de revestimento com a segunda camada.

[000109] Em uma modalidade preferencial, o método pode incluir adicionalmente revestimento das sementes artificiais com uma segunda camada de revestimento, a segunda camada de revestimento referida preferencialmente contendo nutrientes adicionados adequados para sustentar o embrião e/ou simbionte.

[000110] Alternativamente, a segunda camada de revestimento pode não conter nutrientes adicionados, esta camada privada de nutrientes sendo projetada para, por exemplo, reduzir o desenvolvimento de en- dófitas durante a germinação e o crescimento restrito de endófitas em íntima proximidade com o embrião.

[000111] Em uma modalidade preferencial o método pode incluir adi-cionalmente - cultivar as sementes artificiais de modo a formar plântulas ou mudas; e - triar as plântulas ou mudas para presença de simbionte tal como presença de endófitas fúngicos.

[000112] A etapa de cultivar as sementes artificiais pode ser empreendida usando qualquer meio de crescimento adequado. Um meio de germinação tal como MS (Murashige e Skoog), MS modificado ou MS + BAP (6-benzilamino purina) é particularmente preferencial.

[000113] A análise genética pode ser conduzida conforme descrito acima. As plântulas podem ser triadas, por exemplo, para repetições de sequência simples (SSRs) específicas de simbionte, por exemplo específicas de endófita.

[000114] Alternativamente, ou além disso, as mudas podem ser triadas para a presença de simbiota favorável através de fenotipagem molecular. A fenotipagem molecular pode ser realizada utilizando os métodos descritos em um Requerimento de Patente Provisória Australiana arquivado em 1°. de junho de 2012 intitulado "Molecular phenotyping method", cuja revelação integral é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[000115] Neste método mudas podem ser triadas para a presença de simbiota favorável através de fenotipagem molecular. As mudas podem ser avaliadas, por exemplo, para aprimorada produção de alcaloides e/ou proporção aumentada de carboidratos solúveis em água : proteínas. As técnicas referidas podem utilizar um teste enzimático, um ensaio colorimétrico, marcadores de SSR e/ou análise metabolô- mica. As análises referidas podem ser semi- automatizadas ou substancialmente totalmente automatizadas.

[000116] Portanto o método pode incluir triagem de simbiotas para a presença de características desejáveis, o método referido incluindo fenotipagem molecular de uma população de simbiotas.

[000117] Em uma modalidade preferencial, o método pode incluir avaliação da população de simbiotas para produção de alcaloides e/ou proporção de carboidratos solúveis em água (em inglês, WSC) : proteínas. Preferencialmente esta avaliação é feita usando um ou mais métodos selecionados entre o grupo consistindo em testes enzimáti- cos, ensaios colorimétricos, marcadores de SSR e análise metabolô- mica.

[000118] Em uma modalidade preferencial, a avaliação da produção de alcaloides inclui medição do perfil e/ou teor de alcaloides na população. Alcaloides preferenciais incluem peramina, lolitrem B e ergova- lina. Em uma modalidade preferencial, os alcaloides podem ser inferidos por marcadores de SSR e detectados por análise metabolômica, mais preferencialmente é usada uma combinação de marcador de SSR e análise metabolômica.

[000119] Em outra modalidade preferencial, pode ser avaliada a proporção de carboidratos solúveis em água : proteínas. Os carboidratos solúveis em água podem ser quantificados usando um teste en- zimático. Em uma modalidade preferencial, podem ser determinadas as concentrações individuais para sacarose, glicose, frutose e fructa- nos. As proteínas podem ser quantificadas usando um ensaio colori- métrico.

[000120] Em uma modalidade particularmente preferencial, proteína pode ser quantificada por um método incluindo: - extração de proteínas do simbiota usando um álcali, tal como NaOH, preferencialmente uma solução fraca de NaOH; - quantificação de proteínas usando um ensaio colorimétri- co, tal como um ensaio de Bradford.

[000121] Pode ser realizada detecção, por exemplo, usando uma leitora de placas.

[000122] O simbiota pode ser de qualquer forma adequada, incluindo embriões inoculados, sementes de planta, sementes em germinação, plântulas, mudas, plantas, etc.

[000123] Preferencialmente as sementes são derivadas de plantas infectadas com endófitas isto é, simbiota de planta/endófita.

[000124] No método de acordo com este aspecto da presente invenção, a etapa de triagem (iii) pode incluir triagem de sementes artificiais por envelhecimento acelerado, a qual é descrita em um Requerimento de Patente Australiana arquivado em 1°. de junho de 2012 in- titulado 'Method for selection of stable symbiota', cuja revelação integral é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[000125] Por conseguinte, a presente invenção proporciona um método para avaliar a compatibilidade e/ou a estabilidade de um simbiota de planta/endófita, o método referido incluindo: - proporcionar uma fonte de sementes incluindo simbiontes tais como embriões de plantas inoculados com endófitas fúngicos; - triar as sementes e/ou sua descendência para compatibilidade e/ou estabilidade da associação de simbionte de planta (isto é, simbiotas) tal como simbiota de planta/endófita fúngico aplicando envelhecimento acelerado à mesma.

[000126] No procedimento de envelhecimento acelerado, as sementes, ou sua descendência, podem ser submetidas a condições deteri- orativas, preferencialmente por meio de alta temperatura e/ou teor de umidade aumentado. Em uma modalidade particularmente preferencial as sementes podem ser expostas a um ambiente de alta umidade relativa. Por exemplo, as sementes podem ser expostas a temperaturas de aproximadamente -20 a 50°C, preferencialmente de 10 a 45°C, mais preferencialmente de 15 a 40°C, ainda mais preferencialmente de 25 a 40°C e/ou a níveis de umidade de aproximadamente 60% a 100%, preferencialmente de 80% a 100% por períodos de, por exemplo, aproximadamente 1 a 30 dias, preferencialmente 2 a 10 dias, mais preferencialmente 4 a 7 dias.

[000127] O envelhecimento acelerado reduz a viabilidade do endófita isto é, possibilita a contra-seleção de associações instáveis e permite a classificação dos simbiotas com base em sua estabilidade.

[000128] Preferencialmente o método inclui a etapa adicional de submeter as populações de simbiotas selecionados a um rápido teste de viabilidade de simbiontes endófitas, tais como fúngicos.

[000129] Por conseguinte, o método da presente invenção pode incluir adicionalmente avaliar a compatibilidade e/ou a estabilidade de uma associação de planta/simbionte (isto é, symbiotum) tal como sim- biota de planta/endófita fúngico incluindo - proporcionar uma fonte de sementes incluindo simbionte, por exemplo embriões de plantas inoculados com endófitas fúngicos; - triar as sementes e/ou sua descendência para compatibilidade e/ou estabilidade da associação de simbionte de planta (isto é, symbiotum) tal como simbiota de planta/endófita fúngico aplicando envelhecimento acelerado à mesma; e - submeter as populações de simbiotas selecionados a um rápido teste de viabilidade de simbionte endófita tal como fúngico.

[000130] A etapa do teste de viabilidade de acordo com este aspecto da presente invenção pode incluir: cultivar as sementes para produzir plântulas, mudas ou sementes em germinação; extração de DNA e/ou RNA a partir das plântulas, mudas ou sementes em germinação; e - submeter o DNA e/ou RNA extraído a um teste para um ou mais genes específicos de simbionte expressados na planta tais como um ou mais genes específicos de endófitas fúngicos.

[000131] Preferencialmente as sementes são derivadas de plantas inoculadas com simbionte tais como plantas inoculadas com endófitas fúngicos.

[000132] Preferencialmente as sementes são sementes artificiais, conforme descrito acima.

[000133] O teste rápido de viabilidade de endófitas é descrito em um Requerimento de Patente Australiana arquivado em 1°. de junho de 2012 intitulado 'Method for rapid endophyte viability assessment', cuja revelação integral é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[000134] Preferencialmente as sementes são cultivadas por um pe- ríodo de tempo relativamente curto, a fim de que possa ser obtida uma rápida avaliação da viabilidade de simbiontes tal como viabilidade de endófitas fúngicos.

[000135] Preferencialmente as sementes são cultivadas por aproximadamente 1 a 10 dias, mais preferencialmente por 3 a 10 dias, mais preferencialmente por 3 a 7 dias, mais preferencialmente por 3 a 5 dias.

[000136] Os requerentes verificaram que genes específicos de endó- fitas são expressados neste frame de tempo, permitindo precocemente avaliação da viabilidade de endófitas na planta.

[000137] Em uma forma preferencial o DNA/RNA pode ser extraído a partir das folhas de plântulas, mais preferencialmente a partir do epicó- tilo, do hipocótilo ou de brotação embrionária similar das plântulas. Em gramíneas, o DNA/RNA pode ser extraído a partir dos perfilhos. Em outra forma preferencial o DNA/RNA pode ser extraído a partir de sementes em germinação integrais.

[000138] Preferencialmente o RNA e o DNA podem ser co-extraídos, preferencialmente em uma única etapa. Preferencialmente, o DNA/RNA pode ser extraído de epicótilos, hipocótilos ou brotações embrionárias similares de plântulas de 1 a 10 dias de idade, preferencialmente de 3 a 10 dias de idade, mais preferencialmente de 3 a 7 dias de idade, mais preferencialmente de 3 a 5 dias de idade, de modo a acelerar o processo.

[000139] O teste pode ser um teste usado para amplificar e quantificar simultaneamente uma molécula de DNA/RNA alvo no DNA/RNA extraído. Preferencialmente o teste é um teste de reação de cadeia polimerase quantitativo em tempo real (Q-PCR qRT-PCR), ou um teste de reação de cadeia polimerase cinética (KPCR). Em uma forma particularmente preferencial, o teste pode ser um teste TaqMan ou similar.

[000140] Os genes específicos de endófitas podem ser de qualquer tipo adequado. Preferencialmente é somente, principalmente ou alta- mente expressado em planta. Genes codificando as proteínas 7490, 8263, 0005 e 2232 são particularmente preferenciais.

[000141] Iniciadores são designados para amplificação do um ou mais genes alvo por métodos de conhecimento daqueles versados na arte.

[000142] As sementes podem ser de qualquer planta adequada. A planta pode ser uma gramínea, preferencialmente uma gramínea perene, uma leguminosa, uma videira, um arbusto, uma árvore, uma erva, uma flor, um arbusto ou uma moita. O método de acordo com este aspecto da presente invenção é particularmente aplicável a gramíneas e leguminosas.

[000143] Preferencialmente as sementes são derivadas de simbion- te, por exemplo plantas infectadas com endófitas, por exemplo simbi- ota de planta/endófita.

[000144] Preferencialmente as sementes são sementes artificiais.

[000145] O método de acordo com este aspecto da presente invenção pode incluir adicionalmente submeter as populações de simbiotas selecionados a fenotipagem para avaliação da performance de simbi- otas e/ou manutenção de características desejadas; e seleção de sim- biotas para gerar uma variedade de simbiotas sintéticos, por exemplo por policruzamento.

[000146] Por exemplo, a variedade de simbiota selecionada pode ser submetida a um teste de identificação de simbionte, seguido por poli- cruzamento para produzir uma semente da geração seguinte. Opcionalmente, as etapas acima podem ser repetidas para confirmar a estabilidade do simbiota, características desejadas, a identidade do sim- bionte, por exemplo endófita fúngico e/ou a incidência do simbionte, por exemplo endófita fúngico na geração seguinte, por exemplo na geração de semente seguinte.

[000147] Por conseguinte, em um aspecto adicional da presente in- venção, é proporcionado simbiota aprimorado incluindo um ou mais organismos contendo um ou mais simbiontes produzidos utilizando o método descrito acima.

[000148] Por conseguinte, em um aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado um organismo aprimorado apresentando simbiota com um simbionte e produzido utilizando o método descrito acima.

[000149] O organismo aprimorado pode ser uma planta ou um animal.

[000150] Onde o organismo é uma planta, a planta pode ser uma gramínea, uma árvore, uma flor, uma erva, um arbusto ou uma moita, uma videira ou uma leguminosa, ou um produto da mesma.

[000151] O material da planta pode estar sob a forma de uma semente, uma plântula, um embrião ou semelhante.

[000152] As etapas do método descritas acima podem ser repetidas de modo a desenvolver posteriormente gerações de sementes, plantas ou animais simbiotas.

[000153] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona uma planta, uma semente de planta ou outra parte de planta derivada de uma semente ou planta da presente invenção e infectada de modo estável com um simbionte, por exemplo um endófita.

[000154] Preferencialmente, a célula de planta, planta, semente de planta ou outra parte da planta é uma gramínea, mais preferencialmente uma gramínea forrageira, de relva ou bioenergia, tais como as dos gêneros Lolium e Festuca, incluindo L perenne e L arundinaceum, e dos gêneros Brachiaha e Urochloa, incluindo B. brizantha, B. de- cumbens, B. humidicola e U. mosambicensis.

[000155] Por 'célula de planta' se entende qualquer célula de auto-propagação ligada por uma membrana semi-permeável e contendo plastídeo. Uma célula semelhante também necessitou de uma parede celular no caso de ser desejável propagação. Célula de planta, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, inclui, sem limitação, culturas de suspensão de sementes, embriões, regiões meriste- máticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólem e micrósporos.

[000156] Em uma modalidade alternativa da presente invenção o organismo pode ser um animal, preferencialmente selecionado entre gado bovino, carneiro, cabras, veado ou semelhante.

[000157] Por conseguinte, em uma modalidade preferencial da presente invenção, é proporcionado um método conforme descrito acima em que o organismo é um animal, o método incluindo: (i) proporcionar uma biblioteca de germoplasma do animal; e uma biblioteca de simbiontes; (ii) inocular a biblioteca de germoplasmas do animal com um ou mais simbiontes selecionados entre a biblioteca de simbiontes para produzir simbiota; (iii) reproduzir, selecionar, triar e/ou avaliar o simbiota para uma ou mais características de simbiota desejadas; e (iv) identificar, cultivar ou usar de modo diverso os simbio- tas que apresentam uma ou mais características desejadas para produzir o animal aprimorado.

[000158] Em um aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado um método de mapeamento de regiões do genoma de um organismo hospedeiro que afetam o perfil microbiano do rúmen no organismo, o método referido incluindo (i) proporcionar uma biblioteca de polimorfismos do geno- ma do hospedeiro; (ii) identificar o efeito sobre o perfil do microbioma do rú- men dos polimorfismos realizando um estudo de associação; e (iii) identificar uma ou mais regiões do genoma do hospe- deiro que afetam o perfil microbiano do rúmen no organismo.

[000159] Em uma modalidade preferencial, o organismo pode ser uma vaca.

[000160] Em um aspecto adicional, a presente invenção inclui identificação e/ou clonagem de ácidos nucleicos incluindo genes codificando polipeptídeos ou fatores de transcrição a partir dos genomas dos sim- biontes.

[000161] Métodos para identificação e/ou clonagem de ácidos nu- cleicos codificando os genes referidos são conhecidos por aqueles versados na arte e incluem a criação de bibliotecas de ácidos nuclei- cos, tais como bibliotecas de cDNA ou genômicas, e triagem das bibliotecas referidas, por exemplo usando sondas para genes do tipo desejado; ou mutação do genoma do simbionte da presente invenção, por exemplo usando mutagênese química ou de transposon, identificação de modificações na produção de polipeptídeos ou fatores de transcrição de interesse, e deste modo identificação de genes codificando os polipeptídeos ou fatores de transcrição referidos.

[000162] Deste modo, em um aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado um ácido nucleico substancialmente purificado ou isolado codificando um polipeptídeo ou fator de transcrição a partir do genoma de um simbionte da presente invenção.

[000163] Por 'ácido nucleico' se entende uma cadeia de nucleotídeos capaz de carregar informação genética. O termo geralmente se refere a genes ou fragmentos funcionalmente ativos ou variantes dos mesmos e ou outras sequências no genoma do organismo que influenciam seu fenótipo. O termo 'ácido nucleico' inclui DNA (tal como cDNA ou DNA genômico) e RNA (tal como mRNA ou microRNA) que é de filamento único ou de filamento duplo, opcionalmente contendo bases de nucleotídeo sintéticas, não-naturais ou alteradas, ácidos nucleicos sintéticos e combinações dos mesmos.

[000164] Por um 'ácido nucleico codificando um polipeptídeo ou fator de transcrição' se entende um ácido nucleico codificando uma enzima ou fator de transcrição normalmente presente em um simbionte da presente invenção.

[000165] A presente invenção engloba fragmentos funcionalmente ativos e variantes dos ácidos nucleicos da presente invenção. Por 'funcionalmente ativos' em relação ao ácido nucleico se entende que o fragmento ou variante (tal como um análogo, derivado ou mutante) é capaz de manipular a função do polipeptídeo codificado, por exemplo sendo traduzido em uma enzima ou em um fator de transcrição que é capaz de catalisar ou regular uma etapa envolvida no caminho relevante, ou de regular de modo diverso o caminho no simbionte. As variantes referidas incluem variantes alélicas que ocorrem naturalmente e variantes que não ocorrem naturalmente. Adições, deleções, substituições e derivações de um ou mais entre os nucleotídeos são con- templatadas contanto que as modificações não resultem em perda de atividade funcional do fragmento ou da variante. Preferencialmente o fragmento ou variante funcionalmente ativo tem no mínimo aproximadamente 80% de identidade com a parte relevante da sequência acima mencionada à qual o fragmento ou a variante corresponde, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 90% de identidade, ainda mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 95% de identidade, o mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 98% de identidade. As variantes e os fragmentos funcionalmente ativos referidos incluem, por exemplo, variantes e fragmentos tendo modificações de ácido nucleico conservadoras.

[000166] Preferencialmente o fragmento tem um tamanho de no mínimo 20 nucleotídeos, mais preferencialmente no mínimo 50 nucleotí- deos, mais preferencialmente no mínimo 100 nucleotídeos.

[000167] Preferencialmente, os fragmentos referidos são capazes de produzir a mesma atividade que o gene original quando expressado. Preferencialmente, os fragmentos referidos que mantêm regiões conservadas dentro de sequências de consenso.

[000168] Preferencialmente as variantes referidas são variantes das sequências especificadas que proporcionam ou substituição conservada, ou modificações limitadas em sequências de consenso até um nível, por exemplo, de não mais de aproximadamente 5%, mais preferencialmente não mais de 1%.

[000169] Por exemplo, fragmentos e variantes de uma sequência co- dificante X pode incluir uma sequência selvagem da espécie Z que codifica X, um fragmento de uma sequência selvagem em que o fragmento codifica X, e que conserva regiões conservadas dentro de sequências de consenso da espécie Z, e variantes da sequência selvagem ou fragmentos os quais codificam atividade de X e têm somente substituições conservadoras, uma variante X' que codifica atividade de X e na qual a sequência difere somente por substituições encontradas em uma ou mais sequências contribuintes usadas na formulação da sequência de consenso, ou uma variante X" que codifica atividade de X na qual a variante tem não mais de aproximadamente 95% de variação de aminoácidos, mais preferencialmente não mais de aproxima-damente 99% de variação de aminoácidos da sequência selvagem ou fragmento.

[000170] Por 'modificações de ácido nucleico conservadoras' ou 'substituição conservada' se entende substituições de ácido nucleico que resultam em conservação do aminoácido na proteína codificada, devido à degeneração do código genético. As variantes funcionalmente ativas referidas e fragmentos também incluem, por exemplo, aquelas tendo modificações de ácido nucleico as quais resultam em substituições de aminoácidos conservadoras de um ou mais resíduos na sequência de aminoácido correspondente.

[000171] Por 'substituições de aminoácidos conservadoras' se entende a substituição de um aminoácido por outro aminoácido da mesma classe, as classes sendo como se segue: Não polares: Ala, Val, Leu, lie, Pro, Met, Phe, Trp Polares não carregados: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin Acidíferos: Asp, Glu Bpasicos: Lys, Arg, His

[000172] Outras substituições de aminoácidos conservadoras também podem ser feitas como se segue: Aromáticos: Phe, Tyr, His Doadores de prótons: Asn, Gin, Lys, Arg, His, Trp Aceitadores de prótons: Glu, Asp, Thr, Ser, Tyr, Asn, Gin

[000173] Em um aspecto adicional da presente invenção, é proporcionado um constructo genético incluindo um ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[000174] Por 'constructo genético' se entende uma molécula de ácido nucleico recombinante.

[000175] Em uma modalidade preferencial, o constructo genético de acordo com a presente invenção pode ser um vetor.

[000176] Por um 'vetor' se entende um constructo genético usado para transferir material genético para uma célula alvo.

[000177] O vetor pode ser de qualquer tipo adequado e pode ser viral ou não-viral. O vetor pode ser um vetor de expressão. Os vetores referidos incluem sequências de ácido nucleico cromossômico, não-cromossômico e sintéticas, por exemplo derivadas de vírus de planta; plasmídeos bacterianos; derivados do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens; derivados do plasmídeo Ri de Agrobacterium rhizogenes; fago de DNA; cromossomas artificiais de levedura; cromossomas artificiais bacterianos; cromossomas artificiais bacteria- nos binários; vetores derivados de combinações de plasmídeos e fago de DNA. No entanto, qualquer outro vetor pode ser usado contanto que seja replicável ou integrativo ou viável na célula alvo.

[000178] Em uma modalidade preferencial deste aspecto da invenção, o constructo genético pode incluir adicionalmente um promotor e um terminador; os referidos promotor, gene e terminador sendo ligados operativamente.

[000179] Por um 'promotor' se entende uma sequência de ácido nu- cleico suficiente para transcrição direta de uma sequência de ácido nucleico ligada operativamente.

[000180] Por 'ligado operativamente' se entende que o um ou mais ácidos nucleicos e uma sequência reguladora, tal como um promotor, são ligados em um modo tal que permite a expressão do referido ácido nucleico sob condições apropriadas, por exemplo quando moléculas apropriadas tais como proteínas ativadoras transcricionais são ligadas à sequência reguladora. Preferencialmente um promotor ligado operativamente está a montante do ácido nucleico associado.

[000181] Por 'a montante' se entende na direção 3'->5' ao longo do ácido nucleico.

[000182] O promotor e o terminador podem ser de qualquer tipo adequado e podem ser endógenos à célula alvo ou podem ser exógenos, contanto que sejam funcionais na célula alvo.

[000183] Uma variedade de terminadores os quais podem ser empregados nos constructos genéticos da presente invenção também são de conhecimento geral das pessoas versadas na arte. O termina- dor pode ser do mesmo gene que a sequência do promotor ou um gene diferente. Terminadores particularmente adequados são sinais de poliadenilação, tais como o (CaMV)35S poliA e outros terminadores dos genes da nopalina sintase (nos) e da octopina sintase (ocs).

[000184] O constructo genético, além do promotor, do gene e do terminador, pode incluir elementos adicionais necessários para ex- pressão do ácido nucleico, em diferentes combinações, por exemplo espinha dorsal do vetor, origem de replicação (ori), múltiplos sítios de clonagem, sequências espaçadoras, reforçadores, íntrons, genes de resistência a antibiótico e outros genes marcadores selecionáveis [tais como o gene da neomicina fosfotransferase (nptll), o gene da higromi- cina fosfotransferase (hph), o gene da fosfinotricina acetiltransferase (bar ou par)], e genes repórter [tais como o gene da beta-glucuronidase (GUS) (gusA) e o gene da proteína fluorescente verde (GFP) (gfp)]. O constructo genético também pode conter um sítio de ligação de ribossoma para iniciação de translação. O constructo genético também pode incluir sequências apropriadas para amplificação da expressão.

[000185] Os versados na arte reconhecerão que os vários componentes do constructo genético são ligados operacionalmente, de modo a resultar na expressão do referido ácido nucleico. Técnicas para ligar operacionalmente os componentes do constructo genético da presente invenção são de conhecimento geral das pessoas versadas na arte. As técnicas referidas incluem o uso de ligantes, tais como ligantes sintéticos, por exemplo incluindo um ou mais sítios de enzimas de restrição.

[000186] Preferencialmente, o constructo genético é substancial mente purificado ou isolado.

[000187] Por 'substancialmente purificado' se entende que o cons- tructo genético é livre dos genes, os quais, no genoma do organismo que ocorre naturalmente a partir do qual o ácido nucleico ou o promotor da invenção é derivado, flanqueiam o ácido nucleico ou o promotor. O termo portanto inclui, por exemplo, um constructo genético o qual é incorporado em um vetor; em um vírus ou plasmídeo replicando autonomamente; ou no DNA genômico de um procariota ou de um eucari- ota; ou o qual existe como uma molécula separada (por exemplo um cDNA ou um genômico ou fragmento de cDNA produzido por PCR ou digestão de endonuclease de restrição) independente de outras sequências. Também inclui um constructo genético o qual é parte de um gene híbrido codificando sequência de polipeptídeo adicional.

[000188] Preferencialmente, o constructo genético substancialmente purificado é no mínimo aproximadamente 90% puro, mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 95% puro, ainda mais preferencialmente no mínimo aproximadamente 98% puro.

[000189] O termo "isolado" significa que o material é removido de seu ambiente original (por exemplo o ambiente natural se ocorrer naturalmente). Por exemplo, um ácido nucleico que ocorre naturalmente presente em uma planta viva não é isolado, mas o mesmo ácido nu- cleico separado de parte ou todos os materiais coexistentes no sistema natural, é isolado. Os ácidos nucleicos referidos podem ser parte de um vetor e/ou os ácidos nucleicos referidos podem ser parte de uma composição, e ainda serem isolados pelo fato de que um vetor ou composição semelhante não é parte de seu ambiente natural.

[000190] Como uma alternativa à utilização de um gene marcador selecionável para proporcionar um traço fenotípico para seleção de células hospedeiras transformadas, a presença do constructo genético em células transformadas podem ser determinadas por outras técnicas de conhecimento geral na arte, tais como PGR (reação de cadeia po- limerase), análise por hibridização Southern blot, ensaios histoquími- cos (por exemplo, testes de GUS), cromatografia de camada fina (TLC), análises por hibridização Northern e Western blot.

[000191] Os constructos genéticos da presente invenção podem ser introduzidos em organismos, por exemplo plantas, animais, micro-organismos ou fungos por qualquer técnica adequada. Técnicas para incorporação dos constructos genéticos da presente invenção em células de planta ou células fúngicas (por exemplo por transdução, transfecção, transformação ou direcionamento genético) são de conhecimento geral das pessoas versadas na arte. As técnicas referidas incluem introdução mediada por Agrobacteryum, introdução mediada por Rhizobium, eletroporação para tecidos, células e proto- plastos, fusão de protoplastos, injeção em órgãos reprodutivos, injeção em embriões imaturos e introdução de projéteis em alta velocidade em células, tecidos, calos, embriões imaturos e maduros, transformação biolística, transformação de Whiskers, e combinações das mesmas. A escolha da técnica dependerá em grande parte do tipo de planta ou fungo a ser transformado, e pode ser prontamente determinado por uma pessoa adequadamente versada. Para transformação de protoplastos, é particularmente preferencial transformação mediada por PEG. Para transformação de fungos, são particularmente preferenciais transformação mediada por PEG e eletropo- ração de protoplastos e transformação mediada por Agrobacterium de explantes hifais.

[000192] Células incorporando os constructos genéticos da presente invenção podem ser selecionadas, conforme descrito abaixo, e em seguida cultivadas em um meio apropriado para regenerar plantas ou fungos transformados, usando técnicas de conhecimento geral na arte. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e semelhantes, serão evidentes para a pessoa versada na arte. As plantas ou fungos resultantes podem ser reproduzidos, quer sexualmente ou assexuadamente, usando métodos de conhecimento geral na arte, para produzir gerações sucessivas de plantas ou fungos transformados.

[000193] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, exceto onde o contexto requer de modo diverso, o termo "compreendem" e variações do termo, tais como "compreendendo", "compreende" e "compreendido", não pretendem excluir aditivos, componentes, inteiros ou etapas adicionais.

[000194] Referência a qualquer técnica anterior na especificação não é, e não deve ser tomada como, um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que esta técnica anterior forma parte do conhecimento geral comum na Austrália ou qualquer outra jurisdição ou de que esta técnica anterior pode ser razoavelmente esperado que seja verificada, entendida e considerada como relevante por uma pessoa versada na arte. Descrição Detalhada das Modalidades Nas figuras:

[000195] A Figura 1 mostra uma análise genotípica do conteúdo de endófita em acessos de uma compilação de germoplasma de festuca alvo.

[000196] A Figura 2 mostra uma análise da diversidade genética de endófitas de festuca alta.

[000197] A Figura 3 mostra uma análise da diversidade de hospedeiro e endófita.

[000198] A Figura 4 mostra uma seleção de combinações de festu- ca-endófita para perfil metabólico, isolamento de endófitas e inoculação isogênica.

[000199] A Figura 5 mostra uma seleção de combinações de festu- ca-endófita para perfil metabólico, isolamento de endófitas e inoculação isogênica.

[000200] A Figura 6 mostra um perfil de toxinas desejado de endófi- tas de festuca alta.

[000201] A Figura 7 mostra uma análise do perfil metabólico.

[000202] A Figura 8 mostra endófitas selecionados para análise se- mi-quantitativa de metabólitos.

[000203] As Figuras 9 e 10 mostra análises metabolômicas de endó- fitas de festuca.

[000204] A Figura 11 mostra uma análise semi-quantitativa do perfil metabólico sob estresse de temperatura/hídrico.

[000205] A Figura 12 mostra endófitas selecionados para inoculação isogênica.

[000206] A Figura 13 mostra a genotipagem à base de SSR de culturas de endófitas isolados antes de inoculação isogênica.

[000207] A Figura 14 mostra a estabilidade vegetativa de endófitas em genótipos de hospedeiros de festuca alta e de azevém perene (estabilidade em 12 meses pós inoculação).

[000208] A Figura 15 mostra endófitas selecionados para inoculação isogênica.

[000209] As Figuras 16 a 19 mostram o perfil metabólico de associações isogênicas de festuca alta-endófita.

[000210] A Figura 20 mostra bioensaios anti-fúngicos de endófitas de festuca. Coluna 1 Colletotrichum graminicola, Coluna 2 Drechslera brizae, Coluna 3 Rhizoctonia cerealis.

[000211] A Figura 21 mostra o sequenciamento de novos endófitas de festuca selecionados.

[000212] A Figura 22 mostra o caminho biossintético da peramina.

[000213] As Figuras 23 A a C mostram a presença de gene perA dentro de endófitas exogrupo não-Epichloe (Figura 23A NEA17; Figura 23B NEA18; Figura 23C NEA19).

[000214] A Figura 24 mostra o caminho biossintético da ergovalina.

[000215] A Figura 25 mostra genes no cluster do gene eas.

[000216] As Figuras 26 A a D mostram a presença do gene dmaW para a biossíntese da ergovalina em cepas de endófitas (Figura 26A NEA17; Figura 26B NEA16; Figura 26C AR542; Figura 26D NEA20).

[000217] As Figuras 27 A a D mostram a presença de cluster do gene eas para a biossíntese da ergovalina. Figura 27A NEA17 de FaTG-2 (287819); Figura 27B NEA18 exogrupo não-Epichloe (FEtc6-75); Figura 27C NEA21 de FATG-3 (231557); Figura 27D NEA16 de N. coenophialum (FEtc7-342).

[000218] A Figura 28 mostra o caminho biossintético de Lolitrem B.

[000219] A Figura 29 mostra genes no cluster genético biossintético de Lolitrem B.

[000220] As Figuras 30 A a D mostram a presença do cluster genético biossintético 1 de Lolitrem B (ItmG, ItmM e ItmK) em cepas de endófitas. Figura 30A NEA17 de FaTG-2 (287819); Figura 30B NEA18 de exogrupo não-Epichloe (FEtc6-75); Figura 30C NEA21 de FATG-3 (231557); Figura 30D NEA16 de N. coenophialum (FEtc7-342).

[000221] As Figuras 31 A a D mostram a presença do cluster genético biossintético 2 de Lolitrem B (ItmB, ItmQ, ItmP, ItmF e ItmC) em cepas de endófitas. Figura 31A NEA17 de FaTG-2 (287819); Figura 31 B NEA18 de exogrupo não-Epichloe (FEtc6-75); Figura 31 C NEA21 de FATG-3 (231557); Figura 31D NEA16 de N. coenophialum (FEtc7-342).

[000222] As Figuras 32 A a D mostram a presença do cluster genético biossintético 3 de Lolitrem B (ItmE e ItmJ) em cepas de endófitas. Figura 32A NEA17 de FaTG-2 (287819); Figura 32B NEA18 de exo- grupo não-Epichloe (FEtc6-75); Figura 32C NEA21 de FATG-3 (231557); Figura 32D NEA16 de N. coenophialum (FEtc7-342).

[000223] A Figura 33 mostra o caminho biossintético da loline.

[000224] A Figura 34 mostra o cluster genético biossintético da loline.

[000225] As Figuras 35 A a D mostram a presença do cluster genético biossintético da Loline em cepas de endófitas. Figura 35A NEA17 de FaTG-2 (287819); Figura 35B NEA18 de exogrupo não-Epichloe (FEtc6-75); Figura 35C NEA21 de FATG-3 (231557); Figura 35D NEA16 de N. coenophialum (FEtc7-342).

[000226] As Figuras 36 A a F mostram a análise genética biossinté- tica de alcaloides para cepa de endófita NEA23 (269850). Figura 36A Presença de cluster do gene de loline; Figura 36B Presença do gene de peramina; Fiurag 36C Análise do cluster 01 do gene de Lolitrem; Figura 36D Análise dos clusters 02 e 03 do gene de Lolitrem; Figura 36E Análise do gene dmaW para produção de ergovalina; Figura 36F Análise de cluster do gene eas para produção de ergovalina.

[000227] A Figura 37 mostra a análise genotípica de NEA23 e NEA21.

[000228] A Figura 38 mostra a análise genotípica de NEA16 e NEA20.

[000229] A Figura 39 mostra o perfil de toxinas desejado de endófitas do azevém perene.

[000230] A Figura 40 mostra a análise genotípica do conteúdo de endófita em acessos de uma compilação de germoplasma de azevém alvo.

[000231] A Figura 41 mostra análise do conteúdo de endófita em acessos de uma compilação de germoplasma de azevém alvo. Círculos cinzentos - candidatos; Círculos pretos - controles.

[000232] A Figura 42 mostra uma determinação de 'semelhança' de cultivar do genótipo de planta hospedeira isogênica

[000233] A Figura 43 mostra uma determinação de 'semelhança' de cultivar do genótipo de planta hospedeira isogênica.

[000234] A Figura 44 mostra o desenvolvimento de um teste genético molecular do painel de hospedeiros para QC de associações de hos- pedeiro-endófita.

[000235] A Figura 45 mostra a inoculação de endófitas candidatos em culturas de meristema de painel de hospedeiros de azevém diversos.

[000236] A Figura 46 mostra endófitas selecionados.

[000237] A Figura 47 mostra uma caracterização detalhada dos known knowns e seus precursores.

[000238] A Figura 48 mostra um teste de identificação de painel de hospedeiros.

[000239] As Figuras 49 e 50 mostram o perfil metabólico em profundidade de novas associações de hospedeiro isogênico-endófita.

[000240] A Figura 51 mostra LEPJ: os known knowns.

[000241] A Figura 52 mostra a massa precisa de LEPJ.

[000242] A Figura 53 mostra a identificação de LEPJ. Análise LCMS de uma replicação de associações de Bro08_ST_1 apresentando cromatograma extraído de íon. (A) extração de íon positivo (B) peramina; (C) ergovalina; (D) lolitrem B (E) Janthitrem (F) Extração de íon negativo.

[000243] A Figura 54 mostra a identificação de LEPJ. Análise LCMS de uma replicação de associações de Tolosa_NEA12 apresentando cromatograma extraído de íon. (A) extração de íon positivo (B) peramina; (C) ergovalina; (D) lolitrem B (E) Janthitrem - (F) Extração de íon negativo.

[000244] A Figura 55 mostra a quantificação de LEPJ. Análise LC quant do teor de alcaloide de acordo com o tempo de retenção e o espectro (A) peramina; (B) ergovalina; (C) lolitrem B; (D) Janthitrem.

[000245] A Figura 56 mostra uma comparação de perfis de alcaloides (LEPJ) semi-quantitativos de plantas hospedeiras E+ versus E-. As barras de erro Y denotam erros padrões; Letras acima de cada coluna indicam diferenças significativas entre diferentes hospedeiros abrigando o mesmo endófita; * indicam diferenças significativas entre o mesmo hospedeiro abrigando diferentes endófitas; **Os valores de proporções são em relação a Bronsyn ST.

[000246] A Figura 57 mostra uma comparação de perfis de alcaloides semi-quantitativos para diversos endófitas em um hospedeiro iso- gênico (Imp04). As barras de erro Y denotam erros padrões; * indicam diferenças significativas entre o mesmo hospedeiro abrigando diferentes endófitas.

[000247] A Figura 58 mostra uma avaliação da estabilidade do perfil de alcaloides (LEPJ) de endófitas selecionados através de diferentes hospedeiros isogênicos. As barras de erro Y denotam erros padrões; Letras acima de cada coluna indicam diferenças significativas entre diferentes hospedeiros abrigando o mesmo endófita. * indicam diferenças significativas entre o mesmo hospedeiro abrigando diferentes endófitas; **Os valores de proporções são em relação ao Impact.

[000248] A Figura 59 mostra a biossíntese de lolitrem B.

[000249] A Figura 60 mostra a biossíntese da ergovalina.

[000250] A Figura 61 mostra uma análise do caminho biossintético de Lolitrem B.

[000251] A Figura 62 mostra o caminho de paspalinina - A tremorgen.

[000252] A Figura 63 mostra uma análise do caminho de: paspalinina - A tremorgen.

[000253] A Figura 64 mostra a presença de lolitrem e paspalinina em simbiotas.

[000254] A Figura 65 mostra que Peramina está presente em planta em quantidades traço na ausência de um endófita produtor de peramina.

[000255] A Figura 66 mostra o procedimento usado para avaliar modificações para o fenótipo do hospedeiro mediadas pelo endófita. 1 hospedeiro isogênico: Impact (Imp04); 5 associações de hospedei- ro-endófita: NEA10, NEA11, NEA12, ST, E-; 6 replicatas clonais.

[000256] A Figura 67 mostra o efeito do endófita sobre a performance do symbiotum. A. número de Perfilhos; B. Peso fresco de rebentos; C. Peso fresco de raiz; D. Peso seco de raiz

[000257] Cinza médio - 0,5 mM NO3- Cinza escuro - 2,5 mM NO3- Cinza claro - 10,0 mM NO3-

[000258] A Figura 68 mostra as plantas antes da colheita T1.

[000259] A Figura 69 mostra a performance conforme medida pelo número de Perfilhos.

[000260] A Figura 70 mostra a análise de sequência usando a plataforma de sequenciamento 454.

[000261] A Figura 71 mostra a análise de sequência usando a plataforma de sequenciamento Illumina.

[000262] A Figura 72 mostra um sumário dos genomas sequencia- dos de endófitas de azevém perene. Produção Total = 84,8 gigabases (GAII: 7,4 Gb, HiSeq: 77,4 Gb); Produção Média em HiSeq = 2,2 Gb por cepa; Produção Média em GAII = 373 Mb por cepa.

[000263] A Figura 73 mostra um sumário dos genomas sequencia- dos de endófitas de azevém perene. Número total de leituras = 436.920.622 pares; Número médio de leituras pareadas em HiSeq = 12.844.656 por cepa; Número médio de leituras pareadas em GAII = 1.863.852 por cepa.

[000264] As Figuras 74 a 78 mostram leituras de Illumina v 454 contigs.

[000265] A Figura 79 mostra display de cobertura de 454 FLX v 454 Titanium v Illumina GAII.

[000266] A Figura 80 mostra display de cobertura de 454 FLX v 454 Titanium v Illumina GAII v Hi Seq.

[000267] A Figura 81 mostra a correção de Homo polímero: vista gráfica.

[000268] A Figura 82 mostra a correção de Homo polímero: vista de bases.

[000269] A Figura 83 mostra a classe de Pan-genome SNP (Pan-genoma de polimorfismos de nucleotídeo único): vista gráfica, nível de leitura.

[000270] A Figura 84 mostra 77 rodadas de sequenciamento independente, ordenadas por similaridade.

[000271] A Figura 85 mostra que rodadas de sequenciamento independente também podem apresentar deleções específicas de cepas.

[000272] A Figura 86 mostra que rodadas de sequenciamento independente podem prever modificações de aminoácidos a partir de dados de polimorfismos de nucleotídeo único.

[000273] A Figura 87 mostra que o número de contig diminui com rodadas de refinamento da montagem.

[000274] A Figura 88 mostra que N50 aumenta com rodadas de refinamento da montagem.

[000275] A Figura 89 mostra que o refinamento da montagem diminui o número de andaimes (scaffolds), e únicos contigs 'não empilhados (unscaffolded)'.

[000276] A Figura 90 mostra que o número médio de bases por contig aumenta com o refinamento da montagem.

[000277] A Figura 91 mostra as estruturas de Lolitrem B, Ergovalina e Peramina, com perfis de toxinas desejáveis indicados.

[000278] A Figura 92 mostra bioensaios in vitro para avaliar a atividade anti-fúngica de endófitas de Neotyphodium.

[000279] A Figura 93 mostra um teste de folha destacada para avaliar a resistência a ferrugem da coroa (Puccinia coronata f. sp. Lolii) de plantas de azevém perene com e sem endófitas de Neotyphodium.

[000280] A Figura 94 mostra triagens de teste de campo e estufa para tolerância à estiagem e eficiência do uso de água de plantas de azevém perene com e sem endófitas de Neotyphodium.

[000281] A Figura 95 mostra as etapas envolvidas na divisão celular.

[000282] A Figura 96 mostra o fluxo de trabalho experimental para dobramento de cromossomas de células endófitas.

[000283] A Figura 97 mostra calibrações de citometria de fluxo para avaliação do teor de DNA em cepas de endófitas de Neotyphodium. Os picos indicam teor de DNA nuclear relativo.

[000284] A Figura 98 mostra a análise por citometria de fluxo de cepas de endófitas de Neotyphodium NEA12dh.

[000285] A Figura 99 mostra a análise da taxa de crescimento em cultura depois de 8 semanas de cepas de endófitas de Neotyphodium NEA12dh comparadas com cepas de endófitas de controle.

[000286] A Figura 100 mostra a análise da taxa de crescimento em cultura durante 5 semanas de cepas de endófitas de Neotyphodium NEA12dh comparadas com cepas de endófitas de controle.

[000287] A Figura 101 mostra bioensaios anti-fúngicos de cepas de endófitas de Neotyphodium NEA12dh.

[000288] A Figura 102 mostra bioensaios anti-fúngicos de cepas de endófitas de Neotyphodium NEA12dh.

[000289] A Figura 103 mostra a análise da profundidade de leitura do sequenciamento de pesquisa de genoma de cepas de endófitas de Neotyphodium tratadas com colchicina.

[000290] A Figura 104 mostra a análise do mapeamento de leituras do sequenciamento de pesquisa de genoma para montagem de sequência de pesquisa de genoma de NEA12.

[000291] A Figura 105 mostra o fluxo de trabalho experimental para mutagênese de raios X.

[000292] A Figura 106 mostra o caminho biossintético de in- dol-diterpeno de endófitas de Neotyphodium.

[000293] A Figura 107 mostra o crescimento in vitro de cepas de endófitas de Neotyphodium irradiadas com raios X.

[000294] A Figura 108 mostra clusters de gene Itm de endófitas de Neotyphodium.

[000295] A Figura 109 mostra a determinação da variação de sequência do genoma em cepas de endófitas de Neotyphodium irradiadas com raios X.

[000296] A Figura 110 mostra polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em sequências do genoma de cepas de endófitas de Ne- otyphodium irradiadas com raios X.

[000297] A Figura 111 mostra pequenas inserções/deleções (IN- DELs) em sequências do genoma de cepas de endófitas de Ne- otyphodium irradiadas com raios X.

[000298] A Figura 112 mostra deleções em sequências do genoma de cepas de endófitas de Neotyphodium irradiadas com raios X.

[000299] As Figuras 113 mostra os números de SNPs em regiões gênicas de sequências do genoma de cepas de endófitas de Ne- otyphodium irradiadas com raios X.

[000300] A Figura 114 mostra os números de INDELs em regiões gênicas de sequências do genoma de cepas de endófitas de Ne- otyphodium irradiadas com raios X.

[000301] A Figura 115 mostra o espectro de modificações de sequências do genoma (deleções) em sequências do genoma de cepas de endófitas de Neotyphodium irradiadas com raios X.

[000302] As Figuras 116 mostra o índice de mutagênese de cepas irradiadas com raios X com base no número de modificações de sequências do genoma observadas em sequências do genoma de cepas de endófitas de Neotyphodium irradiadas com raios X. '

[000303] A Figura 117 mostra o perfil metabólico de cepas de endó- fitas de Neotyphodium NEA12.

[000304] A Figura 118 mostra o perfil metabólico de cepas de endó- fitas de Neotyphodium irradiadas com raios X.

[000305] A Figura 119 mostra sementes artificiais geradas através de revestimento de alginato de cálcio de embriões de azevém perene usando um revestimento com matriz de alginato de cálcio sem nutrientes adicionados.

[000306] A Figura 120 mostra o revestimento de alginato de cálcio de embriões de azevém perene em sementes artificiais usando revesti- mento com matriz de alginato de cálcio colorida. Sementes artificiais de azevém perene coloridas com Queen Green (90610); a) sementes artificiais secas ao ar; b) sementes artificiais laminadas sobre meio de germinação. Sementes artificiais de azevém perene coloridas com Queen Pink (92330); c) sementes artificiais secas ao ar; d) sementes artificiais laminadas sobre meio de germinação.

[000307] A Figura 121 mostra o revestimento de alginato de cálcio de embriões de azevém perene em sementes artificiais usando revestimento com múltiplas camadas de matriz de alginato de cálcio, a) Sementes artificiais de azevém perene revestidas com uma primeira camada de revestimento de alginato de cálcio (não-colorida) (camada A) com nutrientes adicionados, b) Sementes artificiais de azevém perene revestidas com duas camadas de alginato de cálcio (primeira camada A; não-colorida mais segunda camada B; colorida com Queen Green) com nutrientes adicionados; c) sementes artificiais duplamente revestidas dispostas sobre meio de germinação.

[000308] A Figura 122 mostra o revestimento de alginato de cálcio de embriões de azevém perene em sementes artificiais usando revestimento com múltiplas camadas de matriz de alginato de cálcio, a) a c) Cortes transversais de sementes artificiais de azevém perene revestidas com uma primeira camada de revestimento de alginato de cálcio (não-colorida) (camada A) e uma segunda camada de revestimento de alginato de cálcio colorida com Queen-Pink ou com Queen-Green (camada B). d) a e) Cortes transversais de sementes artificiais de azevém perene revestidas com uma primeira camada de revestimento de alginato de cálcio (não-colorida) (camada A) e uma segunda camada de revestimento de alginato de cálcio colorida com Queen-Green (camada B).

[000309] A Figura 123 mostra a germinação de sementes, embriões e sementes artificiais de azevém perene cv. Bronsyn E- (endófita free, lote de sementes 2668), a) Sementes originais: 1% de frequência de germinação sobre papel filtro; b) Sementes esterilizadas superficialmente: 10% de frequência de germinação sobre papel filtro; c) Embriões isolados: 48% de frequência de germinação sobre meio de germinação; d) Sementes artificiais (com meio de germinação): 40% de frequência de germinação sobre meio MS.

[000310] A Figura 124 mostra a Germinação de sementes, embriões e sementes artificiais de azevém perene cv. Bronsyn E+ (endófita plus, lote de sementes 2667), a) Sementes originais: 10% de frequência de germinação sobre papel filtro; b) Sementes esterilizadas superficialmente: 30% de frequência de germinação sobre papel filtro; c) Embriões isolados: 90% de frequência de germinação sobre meio de germinação; d) Sementes artificiais (com meio de germinação): 81% de frequência de germinação sobre meio MS.

[000311] A Figura 125 mostra a germinação de sementes artificiais e o desenvolvimento de plântulas derivadas de sementes artificiais em azevém perene.

[000312] A Figura 126 mostra embriões de azevém perene derivados de sementes recém isoladas dispostos individualmente em cavidades de a) 96 cavidades e b) suspensão de micélio de endófita adicionado a cavidades individuais e deixada para secar ao ar parcialmente sob fluxo laminar antes de c) produção de sementes artificiais revestidas camada de com alginato de cálcio.

[000313] A Figura 127 mostra sementes artificiais produzidas pelo método 1.

[000314] A Figura 128 mostra sementes em germinação artificiais produzidas pelo método 1.

[000315] A Figura 129 mostra sementes artificiais produzidas pelo método 2.

[000316] A Figura 130 mostra sementes artificiais produzidas pelo método 2 com desenvolvimento de endófita.

[000317] A Figura 131 mostra sementes artificiais produzidas pelo método 3.

[000318] A Figura 132 mostra sementes artificiais produzidas pelo método 3 com desenvolvimento de endófita.

[000319] A Figura 133 mostra sementes em germinação artificiais produzidas pelo método 3.

[000320] A Figura 134 mostra um esquema de envelhecimento acelerado.

[000321] A Figura 135 mostra a taxa de germinação de sementes de azevém perene cv. Bronsyn com diferentes endófitas depois de tratamento de envelhecimento acelerado das sementes seguido por armazenamento das sementes.

[000322] A Figura 136 mostra a viabilidade do endófita em semente de azevém perene cv. Bronsyn com diferentes endófitas depois de tratamento de envelhecimento acelerado das sementes seguido por armazenamento das sementes.

[000323] A Figura 137 mostra taxas de germinação de sementes de simbiota representando diferentes endófitas em diferentes panos de fundos genéticos de hospedeiro depois de tratamento de envelhecimento acelerado das sementes. A Figura 138 mostra a viabilidade do endófita de diferentes endófitas em diferentes panos de fundos genéticos de hospedeiro depois de tratamento de envelhecimento acelerado das sementes. Em cada um dos gráficos para Alto, Trojan e Bealey, as barras representam os endófitas NEA10, NEA11, NEA12 e E1, nesta ordem da esquerda para a direita. Em cada um dos gráficos para Bronsyn, as barras representam os endófitas AR1, NEA10, NEA11, NEA12, E1 e ST, nesta ordem da esquerda para a direita.

[000324] A Figura 139 mostra a viabilidade do endófita de diferentes endófitas em diferentes panos de fundos genéticos de hospedeiro de- pois de tratamento de envelhecimento acelerado das sementes.

[000325] A Figura 140 mostra iniciadores designados para teste TaqMan.

[000326] A Figura 141 mostra a Funcionalidade do Iniciador TaqMan para o Gene LtmJ Endófita-Específico; de RNA e DNA marcados.

[000327] A Figura 142 mostra a Funcionalidade do Iniciador TaqMan para o Gene 7490 Endófita-Específico; de RNA e DNA marcados.

[000328] A Figura 143 mostra a Funcionalidade do Iniciador TaqMan para o Gene 8263 Endófita-Específico; de RNA e DNA marcados.

[000329] A Figura 144 mostra a Funcionalidade do Iniciador TaqMan para o Gene 0005 Endófita-Específico; de RNA e DNA marcados.

[000330] A Figura 145 mostra a Funcionalidade do Iniciador TaqMan para o Gene 2232 Endófita-Específico; de RNA e DNA marcados.

[000331] A Figura 146 mostra o controle de teste TaqMan - não modelo.

[000332] A Figura 147 mostra o controle de teste TaqMan - GAPDH de Planta. de RNA e DNA marcados.

[000333] A Figura 148 mostra Detecção em Amostras Reunidas de DNA/RNA Co-extraídas para o Gene 7490 Endófita-Específico; de RNA e DNA marcados.

[000334] A Figura 149 mostra Detecção em Amostras Reunidas de DNA/RNA Co-extraídas para o Gene 0005 Endófita-Específico; de RNA e DNA marcados.

[000335] A Figura 150 mostra um controle (não modelo) para Detecção em Amostras Reunidas de DNA/RNA Co-extraídas; de RNA e DNA marcados.

[000336] A Figura 151 mostra detecção em amostras de DNA/RNA co-extraídas de epicótilos de 10 dias de idade individuais do gene 2232 endófita-específico; de RNA e DNA marcados.

[000337] A Figura 152 mostra detecção em amostras de DNA/RNA co-extraídas de epicótilos de 10 dias de idade individuais do gene 7490 endófita-específico; de RNA e DNA marcados.

[000338] A Figura 153 mostra detecção em amostras de DNA/RNA co-extraídas de epicótilos de 10 dias de idade individuais do gene 0005 endófita-específico; de RNA e DNA marcados.

[000339] A Figura 154 mostra um controle (não modelo) para detecção em amostras de DNA/RNA co-extraídas de epicótilos de 10 dias de idade individuais; de RNA e DNA marcados.

[000340] A Figura 155 mostra Detecção em DNA/RNA Co-Extraído de Epicótilos Reunidos de 3, 5 e 7 Dias de Idade do Gene 2232 Endó- fita Específico. Círculos = Dia 7 Conjunto E+; Quadrados = Dia 5 Conjunto E+; Triângulos = Dia 3 E+ Pool; Losangos = Dia 7 Conjunto E-.

[000341] A Figura 156 mostra Detecção em DNA/RNA Co-Extraído de Epicótilos Reunidos de 3, 5 e 7 Dias de Idade do Gene 7490 Endó- fita Específico. Círculos = Dia 7 E+ Pool; Quadrados = Dia 5 E+ Pool; Triângulos = Dia 3 Conjunto E+; Losangos = Dia 7 Conjunto E-.

[000342] A Figura 157 mostra Detecção em DNA/RNA Co-Extraído de Epicótilos Reunidos de 3, 5 e 7 Dias de Idade do Gene 0005 Endófita Específico. Círculos = Dia 7 Conjunto E+; Quadrados = Dia 5 Conjunto E+; Triângulos = Dia 3 Conjunto E+; Losangos = Dia 7 Conjunto E-.

[000343] A Figura 158 mostra o perfil metabólico de população de simbiotas para permitir reprodução e seleção desde o início.

[000344] A Figura 159 mostra as 20 principais plantas produtoras de peramina.

[000345] A Figura 160 mostra a fenotipagem molecular de uma população de simbiotas para permitir reprodução e seleção desde o início.

[000346] A Figura 161 mostra a produção de glicose-6-fosfato a partir de glicose.

[000347] A Figura 162 mostra a presença de carboidratos solúveis em água em uma população de simbiotas.

[000348] A Figura 163 mostra quantificação de proteínas.

[000349] A Figura 164 mostra a diversidade genética e a relação en tre germoplasma.

[000350] A Figura 165 mostra a diversidade genética e a relação entre germoplasma.

[000351] A Figura 166 mostra genotipagem por sequenciamento.

[000352] A Figura 167 mostra o procedimento para genotipagem por sequenciamento.

[000353] A Figura 168 mostra um esquema genérico para um pro grama comercial de reprodução de azevém atual.

[000354] A Figura 169 mostra uma representação esquemática de relações entre requisitos para números de indivíduos para serem ge- notipados e fenotipados para estudos de seleção genômica, e valores de hereditariedade para traços específicos.

[000355] A Figura 170 mostra um esquema para implementação de seleção genômica em um programa de reprodução de azevém.

[000356] A Figura 171 mostra a caracterização do microbioma em azevém perene (Lolium perenne). O eixo vertical mostra a % de sequências mapeadas de bibliotecas de cDNA de simbiota do microbio- ma de azevém perene cultivados sob condições de nutrientes plenos depois de mapeamento para sequências de bancos de dados não-vegetais no banco de dados 1. O eixo horizontal mostra amostras analisadas: L = folha; R = raiz; FR = livre de endófita; ST = endófita tóxico padrão.

[000357] A Figura 172 mostra uma análise 16S de microbioma em azevém perene (Lolium perenne). A figura mostra uma distribuição ta- xonômica dos micro-organismos representados no microbioma de Lolium perenne.

[000358] A Figura 173 mostra microbiomas de folha e raiz em azevém perene (Lolium perenne). O gráfico representa a soma por classe bacteriana de contagens de leituras de sequências de folhas e raízes, respectivamente.

[000359] A Figura 174 mostra microbiomas de folha e raiz em azevém perene (Lolium perenne). A figura mostra uma árvore de amostra produzida por agrupamento (clustering) hierárquico de séries de amostras.

[000360] As Figuras 175 e 176 mostram microbiomas de folha e raiz em azevém perene (Lolium perenne). As figuras mostram dois de onze clusters contendo mais de 0 genes: Figura 175: Cluster 5 - baixo NH4 induzido; Figura 176: Cluster 3 - baixo N reprimido.

[000361] A Figura 177 mostra microbiomas de folha e raiz em azevém perene (Lolium perenne). As figuras mostram mapeamento de leituras para sequências anotadas como espécies de Azospirillum.

[000362] A Figura 178 mostra microbiomas de folha e raiz em Antarctic hairgrass (Deschampsia antarctica). A figura mostra uma distribuição taxonômica dos micro-organismos representados no microbio- ma de folhas e de raízes de de Deschampsia antarctica.

[000363] A Figura 179 mostra microbiomas de folha e raiz em Antarctic hairgrass (Deschampsia antarctica). A figura mostra um mapa de calor apresentando diferenças na predominência de espécies bac- terianas em brotos e raízes.

[000364] A Figura 180 mostra microbiomas de raiz em Antarctic hairgrass (Deschampsia antarctica). A figura mostra uma região ampliada do mapa de calor apresentando diferenças na predominância de espécies bacterianas em resposta a diferente estado nutricional em amostras de raiz.

[000365] A Figura 181 mostra microbiomas de folha em Antarctic hairgrass (Deschampsia antarctica). A figura mostra uma região ampliada do mapa de calor apresentando diferenças na predominência de espécies bacterianas em resposta a diferente estado nutricional em amostras de folha.

[000366] A Figura 182 mostra microbiomas de folha e raiz em Antarctic hairgrass (Deschampsia antarctica). A figura mostra uma região ampliada do mapa de calor apresentando espécies de Azospirillum agrupadas juntas.

[000367] A Figura 183 mostra suspensões de endófitas em diferentes taxas de diluição.

[000368] A Figura 184 mostra um estudo de ampla associação de genoma para avaliar o efeito de 624930 polimorfismos no hospedeiro (15 vacas leiteiras) sobre os perfis do microbioma de seus rúmens. São mostrados os resultados para cinco contigs. Cinza indica cromossomas de número ímpar, preto indica cromossomas de número par.

[000369] A invenção será agora descrita com referência aos exemplos não-limitantes que se seguem.

Exemplo 1 - Um novo paradigma na reprodução de gramíneas forrageiras

[000370] O Velho Paradigma:

[000371] Reprodução e seleção de gramínea somente seguida por inoculação de único endófita e avaliação de simbiota levando a variedades sintéticas de gramíneas implantando um único endófita não selecionado.

[000372] O Novo Paradigma:

[000373] Reprodução e seleção desde o início de simbiota de gra- mínea-endófita seguidas por avaliação de simbiotas levando a variedades sintéticas de simbiotas implantando múltiplos endófitas.

[000374] Para Aplicação em Lolium/Festuca e Brachiaria/Urochloa.

[000375] Reprodução Molecular Ab Initio da Geração Seguinte de Simbiota de Gramínea- Endófita.

Novos Princípios e Abordagens

[000376] Conceito Estendido de Variedades Sintéticas para Ambos os Parceiros do Symbiotum isto é, Gramínea Hospedeira e Endófita

[000377] Implantar múltiplos genótipos de endófitas e gramíneas em populações selecionadas para ótimas compatibilidade e performance do simbiota

[000378]

Capturar Desde o Início Efeitos do Genótipo da Planta X Genótipo do Endófita

[000379] Reproduzir e selecionar deste o início simbiotas para ótimas compatibilidade e performance de simbiotas ao invés de reproduzir e selecionar gramínea hospedeira somente seguidos por inoculação de endófita e avaliação de simbiotas

[000380] Capturar e Explorar Efeitos Mais Amplos do Genótipo do Endófita sobre a Performance do Simbiota

[000381] Explorar efeitos significativos do genótipo do endófita sobre a performance do simbiota bem além de resistência a praga (e reduzida toxicose animal)

Capturar e Explorar Nova Diversidade Genética de Endófita Glo-bal [Etapa 1]

[000382] Implantar múltiplos novos endófitas desde o início ao invés de endófitas de única marca tardias no processo de desenvolvimento varietal deste modo explorando ampla gama de diversidade genotípica de endófita [isto é, 'compilação de germoplasma de endó- fita']

Gerar e Explorar Diversidade Genética de Endófita De Novo [Eta-pa 2]

[000383] Gerar variação genética de novo [isto é, mutagênese aleatória (por exemplo, radiação ionizante); di-/poli-ploidização (por exemplo, tratamento com colchicina); mutagênese direcionada (por exemplo, ExZact-Delete e ExZact-Edit); cisgênese; transgênese; intragêne- se; edição de genoma integrativa (por exemplo, ExZact-Add)] em novos endófitas para reforçada introgressão de traço de endófita no estabelecimento em larga escala de simbiotas de gramínea-endófita [isto é, 'reprodução de endófitas' do inventor]

Capturar Ampla Diversidade Genotípica de Gramínea e Endófitas em Populações de Simbiotas Para Reprodução de Simbiotas Desde o Iníio [Etapa 3]

[000384] Estabelecer populações de simbiotas em larga escala envolvendo 10s a 100s de genótipos de endófita e, 100s a 1000s de ge- nótipos de gramínea para reprodução e seleção de simbiota desde o início

[000385] Método de implantação para inoculação em larga escala de endófita com base em sementes artificiais geradas a partir de embriões de gramíneas isolados diretamente inoculados com diferentes endófitas seguida por revestimento em camadas de alginato ou revestidas por camada de alginato contendo endófita [isto é, 'sementes artificiais de simbiotas']

[000386] Para genótipos de gramíneas Brachiaria/Urochloa inocular endófitas únicos e também co-inocular múltiplos endófitas em (particularmente apomíticos) genótipos de gramíneas hospedeiras

Realizar Reprodução e Seleção Desde o Início de Simbiotas [Eta-pas 4 a 8]

[000387] Selecionar populações de simbiotas em larga escala envolvendo 10s a 100s de genótipos de endófita em 100s a 1000s de genótipos de gramínea para compatibilidade e estabilidade aplicando envelhecimento acelerado a sementes artificiais de simbiotas e/ou sua descendências como ferramenta de seleção [Etapa 4]

[000388] Selecionar populações de simbiotas da Etapa 4 para viabilidade aplicando teste rápido de viabilidade de endófitas [Etapa 5]

[000389] Submeter populações de simbiotas da Etapa 5 a fenotipa- gem extensiva, multi-anual para performance de simbiotas e produção de alcaloide [Etapa 6]

[000390] Selecionar simbiotas SynO da Etapa 6 para po- li-cruzamento para produzir variedades experimentais de simbiotas sintéticas [Etapa 7] seguido porr determinação da incidêcia e identidade de endófitas [Etapa 8]

Reprodução molecular desde o início da geração seguinte do simbiota de gramínea-endófita - fluxo de trabalho de endófita Germoplasma de Endófita

[000391] Etapa 1 : Verificação da diversidade global em novos endó- fitas

[000392] Etapa 2: Geração de novo da diversidade de novos endófi- tas

Estabelecimento de simbiota

[000393] Etapa 3: Geração em larga escala de simbiota de gramí- nea-endófita

Seleção de simbiotas para estabilidade, perfil de alcaloides dese-jado e performance

[000394] Etapa 4: Ferramentas de seleção para estabilidade do sim- biota

[000395] Etapa 5: Teste rápido de viabilidade de endófitas

[000396] Etapa 6: Fenotipagem multi-anual (incl molecular) de simbiota

[000397] Etapa 7: Seleção de geradores de simbiotas SynO para po li-cruzamento para produzir variedades sintéticas experimentais para avaliação extensiva

[000398] Etapa 8: Teste de ID de Endófitas

Poli-cruzamento de geradores de simbiotas SynO

[000399] Etapa 9: Poli-cruzamento de geradores de simbiotas selecionados (SynO) com identidade e incidência de endófitas conhecidas e recuperação de sementes de Syn1

Confirmar a estabilidade dos simbiotas, o perfil de alcaloides e a identidade e a incidência de endófitas

[000400] Etapa 10: Ferramenta de seleção para estabilidade dos simbiotas

[000401] Etapa 11 : Teste rápido de viabilidade de endófitas

[000402] Etapa 12: Fenotipagem molecular de simbiota*

[000403] Etapa 13: Teste de ID de Endófitas*

Avaliação de simbiota Syn1

[000404] Etapa 14: Avaliação de variedade sintética experimental de simbiota (Syn1) para performance agronômica *Avaliação do perfil de alcaloides e da identidade e da incidência de endófitas sobre amostras reunidas na geração Syn1

[000405] Poli-cruzamento de plantas simbiotas Syn1

[000406] Etapa 15: Poli-cruzamento antecipado de simbiota (Syn1) com identidade e incidência de endófitas conhecidas e recuperação de sementes de Syn2

[000407] Etapa 16: Ferramenta de seleção para estabilidade do sim- biotas

[000408] Etapa 17: Teste rápido de viabilidade de endófitas

[000409] Etapa 18: Fenotipagem molecular de simbiota*

[000410] Etapa 19: Teste de ID de Endófitas*

Avaliação de simbiota Syn2

[000411] Etapa 20: Avaliação de variedade sintética experimental simbiota (Syn2) para performance agronômica e animal *Avaliação do perfil de alcaloides e da identidade e da incidência de endófitas sobre amostras reunidas na geração Syn2

Exemplo 2 - Verificação de endófitas de festuca alta

[000412] Os objetivos deste trabalho sobre verificação e caracterização de endófitas em festuca alta (Lolium arundinaceum) foram: 1. Identificação e caracterização de novos endófitas de fes- tuca alta para avaliação no germoplasma. 2. Desenvolvimento e avaliação de associações otimizadas entre novos endófitas e germoplasma de elite.

[000413] A verificação de endófitas foi baseada na triagem de 568 acessos de modo a identificar plantas positivas para endófitas seguida por genotipagem de 210 endófitas de modo a identificar novos endófi- tas em festuca alta.

[000414] A caracterização em planta de novos endófitas de festuca alta foi baseada nas seguintes etapas: • Culturas de meristema para cultivares de festuca alta estabelecidos para painel de hospedeiro isogênico • Perfis metabólicos endógenos determinados para 48 amostras • Foi realizado isolamento de 38 endófitas • Foi realizada inoculação de 15 a 20 endófitas em painel de hospedeiro isogênico • Foram caracterizadas associações isogênicas de hos- pedeiro-endófita

Análise genotípica do conteúdo de endófita em acessos de uma compilação de germoplasma de festuca alvo

[000415] Inicialmente, 472 acessos de 30 países foram testados para incidência de endófitas; com 2 replicatas de 6 a 10 sementes em cada volume por acesso usado na análise e na incidência de endófitas ava- liado com 6 SSRs.

[000416] Novos acessos foram incluídos na análise das origens geográficas sub-representadas; com um total de 568 acessos de 40 países testados para incidência de endófitas.

Tabela 1: Análise genotípica do conteúdo de endófita em acessos de uma compilação de germoplasma de festuca alvo

[000417] Análise genotípica do conteúdo de endófita em acessos de uma compilação de germoplasma de festuca alvo é mostrada na Tabela 1. Foram detectados 233 acessos positivos para endófita (41%). As origens geográficas são representadas na avaliação da incidência de endófitas.

[000418] Uma análise da diversidade genética de endófitas de fes- tuca alta é mostrada na Figura 2. Uma série selecionada de 210 acessos foram usados para avaliar a diversidade genética de endófitas de festuca alta. A diversidade genética foi avaliada com 38 marcadores de SSR. Foram detectados seis grupos taxonômicos diferentes. A maioria foi de N. coenophialum. Vinte foram FaTG-2. Seis foram FaTG-3 putativo. Treze foram semelhante a FaTG-3 (FaTG-3 like).

[000419] A diversidade de hospedeiro e endófita é mostrada na Figura 3.

[000420] Seleção de combinações de festuca-endófita para perfil metabólico, isolamento de endófitas e inoculação isogênica é mostrado na Figura 4. 52 acessos foram inicialmente selecionados para perfil metabólico e isolamento de endófitas. A presença de endófita foi detectada de modo consistente em 25 acessos (vermelho). Um adicional de 48 acessos de clusters sub-representados foram estabelecidos na estufa e triados para presença de endófita. 20 acessos foram positivos para endófita (azul) e foram selecionados para análise adicional.

[000421] Seleção de combinações de festuca-endófita para perfil metabólico, isolamento de endófitas e inoculação isogênica são mostrados na Figura 5. Seleções iniciais são mostradas em vermelho. Seleções adicionais são mostradas em azul.

[000422] O perfil de toxinas desejado de endófitas de festuca alta é mostrado na Figura 6.

Exemplo 3 - Perfil metabólico

[000423] O esquema experimental usado para análise se- mi-quantitativa do perfil metabólico de associações de festuca al- ta-endófita para a detecção da produção de alcaloides no pano de fundo de hospedeiro endógeno é descrito abaixo. Esquema experimental para análise semi-quantitativa de metabó- litos

[000424] Uma análise do perfil metabólico para detecção de ergova- lina e peramina é mostrada na Figura 7.

[000425] Endófitas selecionadas para análise semi-quantitativa de metabólitos são mostrados na Figura 8.

[000426] Análise do perfil metabólico para a detecção da produção de alcaloides de diferentes endófitas de festuca

[000427] Uma análise metabólica de associações de festuca al- ta-endófita para a detecção da produção de alcaloides incluindo loline, formato de loline, peramina, ergovalina e lolitrem B no pano de fundo de hospedeiro endógeno é mostrado na Figura 9. O perfil de alcaloides (isto é, lolines, peramina, ergovalina e lolitrem B) de associações de festuca alta-endófita no pano de fundo de hospedeiro endógeno para uma gama de cepas de endófitas

pertencentes a diferentes espécies de endófitas é mostrado na Tabela 2.

Tabela 2 Perfil de alcaloides (isto é, lolines, peramina, ergovalina e loli- trem B) de associações de festuca alta-endófita no pano de fundo de hospedeiro endógeno para uma gama de cepas de endófitas pertencentes a diferentes espécies de endófitas (* Dados publicados; nd = não determinado).

[000428] Análise metabólica adicional dos endófitas de festuca é mostrado na Figura 10.

Exemplo 4 - Análise semi-quantitativa do perfil metabólico sob estresse de temperatura/hídrico

[000429] Além da análise metabólica de associações de festuca al- ta-endófita cultivadas sob condições de rotina, para a detecção da produção de alcaloides conferida pelos endófitas no pano de fundo de hospedeiro endógeno (Figuras 7 a 10), fiu realizada uma análise se- miquantitativa de perfis metabólicos de associações de festuca al- ta-endófita cultivadas sob condições de alta temperatura e estresse hídrico. Associações de festuca alta-endófita correspondentes foram cultivadas sob 16h de iluminação e 30°C; 18 horas de escuridão: e 20°C, e em seguida amostradas para análise do perfil de alcaloides conforme descrito abaixo: • Colheita (controle) ^ liofilização ^ 50 mg de material de pseudocaule (pseudostem) ^ extração com 80% de metanol ^ Aná-lise LCMS • Recuperação e estresse hídrico • Segunda colheita (estresse) ^ liofilização ^ SSR confirmam todos de um material de planta novamente.

[000430] Isto foi realizado em um ambiente controlado (câmara de crescimento) simulando condições de verão, com leve irrigação conforme requerido. Nove cópias por acesso foram plantadas em mistura de envasamento geral. Foi usado um Randomized Complete Block (Bloco Completo Randomizado) com subamostragem.

[000431] A Figura 11 mostra uma análise semi-quantitativa do perfil metabólico de associações de festuca alta- endófita cultivadas sob condições de alta temperatura e estresse hídrico.

Exemplo 5 - Inoculação isogênica em planta em festuca alta com novos endófitas Sumário:

[000432] Um total de 36 endófitas de festuca foram isolados a partir de uma gama de acessos de festuca de diferentes origens geográficas conforme descrito na Tabela 3, e foi visto que pertencem a diferentes grupos taxonômicos como se segue: 19 destes sendo N. coenophia- lum; 5 destes sendo FaTG-2; 3 destes sendo Exogrupo; 3 destes sendo FaTG-3; 3 destes sendo FaTG-3 like; e 3 destes sendo N. un- cinatum.

Tabela 3 - Isolamento de culturas fúngicas a partir de combinações de festuca-endófita selecionadas

[000433] Estabelecimento de Culturas de Meristema para Painel de Diversos Hospedeiros de Festuca para Inoculação na Planta de Endó- fitas de Festuca

[000434] A Tabela 4 mostra cultivares de festuca alta e de azevém perene selecionados usados para identificar genótipos de plantas típicas incluídas no painel de diversos hospedeiros para inoculação na planta de endófitas de festuca. Todos os genótipos das plantas selecionadas têm frequência de regeneração de >80%.

Tabela 4 - Cultivares de festuca alta e de azevém perene selecio-nados usados para identificar genótipos de plantas típicas incluídos no painel de diversos hospedeiros para inoculação na planta de endófitas de festuca

[000435] Endófitas fúngicos isolados a partir de acessos de festuca contendo endófita selecionados para inoculação isogênica em planta no painel de diversos hospedeiros são mostrados na Figura 12. A Figura 13 mostra genotipagem à base de SSR de culturas de endófitas isolados antes de inoculação isogênica em planta para confirmar sua identidade.

[000436] Resultados da genotipagem à base de SSR indicando o número de alelos e tamanhos para diferentes marcadores de SSR para as diferentes cepas de endófitas de festuca são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5 - Presença de alelos em cepas de endófitas

[000437] Resultados da inoculação isogênica em planta no painel de diversos hospedeiros de endófitas selecionados fúngicos isolados a partir de acessos de festuca contendo endófita são mostrados na Tabela 6. São proporcionados dados sobre o número de inoculações testadas, número de inoculações com sucesso e % de inoculações com sucesso na Tabela 6 de modo a ilustrar a capacidade de inoculação de endófitas de festuca alta em hospedeiros de festuca alta e de azevém perene. A. Número de Inoculações testadas

B. Número de sucesso das inoculações

C. Percentagem de sucesso das inoculações

Tabela 6 - Capacidade de Inoculação de Endófitas de festuca alta em Hospedeiros de Festuca Alta e de Azevém Perene

Exemplo 6 - Estabilidade Vegetativa de Endófitas em Genótipos de Hospedeiros de Festuca Alta e de Azevém Perene

[000438] Depois de inoculação isogênica em planta com uma gama de endófitas selecionados isolados a partir de acessos de festuca, foi avaliada a estabilidade vegetativa de endófitas destes endófitas nos diferentes genótipos de hospedeiros de festuca alta e de azevém perene (isto é, BRO 08, BARI 27, DOV 24), mostrando que: • Vários endófitas de festuca alta (por exemplo, NEA17, NEA18, NEA19) foram estáveis em azevém perene (BRO08). • BARI27 formou associações estáveis com todos os en- dófitas com a exceção de NEA15. • NEA15 não teve êxito em formar associações estáveis com qualquer um dos genótipos de hospedeiros testados. • DOV24 formaram poucas associações estáveis.

[000439] A estabilidade destas associações de novos endófitas de festuca alta inoculados em diferentes genótipos de festuca alta e de azevém perene do painel de diversos hospedeiros foi avaliada 12 meses pós-inoculação. Os resultados correspondentes são mostrados na Tabela 7.

Tabela 7 - Estabilidade de associações de novos endófitas de festuca alta (por exemplo, NEA13, NEA14, NEA15, NEA16, NEA17, etc.) inoculados em diferentes festuca alta e genótipos de azevém perene (BARI 27, BRO 08, OOV 24, JESS 01 e QUAN 17) do painel de diversos hospedeiros avaliados 12 meses pós-inoculação. NA - não aplicável, Nl - não inoculado, número de associação estável/número de associações

[000440] A Figura 14 mostra estabilidade em 12 meses pós inoculação de endófitas selecionados em genótipos de hospedeiros de festu- ca alta e de azevém perene do painel de diversos hospedeiros.

[000441] A gama de novos endófitas de festuca selecionados para inoculação isogênica em planta é mostrada na Figura 15. 1. A Tabela 8 mostra novos endófitas de festuca alta adici-onais (por exemplo, NEA20, NEA2, NEA22, etc.) selecionados para inoculações isogênicas em planta em genótipos de festuca alta (isto é, BARI 27, JESS 01 e QUAN 17) do painel de diversos hospedeiros, com base nos seguintes critérios de seleção: Produz pouca ou nenhuma ergovalina 2. Não produz lolitrem B 3. Produz lolines e/ou peramina

Tabela 8 - Novos endófitas adicionais de festuca alta (por exemplo, NEA20, NEA21, NEA22, etc.) selecionados para inoculações isogênicas em planta em genótipos de festuca alta (isto é, BARI 27, JESS 01 e QUAN 17) do painel de diversos hospedeiros. Nco = N. coenophialum; ? = perfil de alcaloides não testado; TBI - A ser Inoculado.

[000442] Exemplo 6 - Perfil metabólico de associações de endófi- ta-festuca alta estabelecidas depois de inoculações isogênicas em planta de novos endófitas de festuca alta em genótipos de festuca alta do painel de diversos hospedeiros

[000443] O perfil metabólico de associações de endófita-festuca alta estabelecidas depois de inoculações isogênicas em planta de novos endófitas de festuca alta em genótipos de festuca alta do painel de di-versos hospedeiros é mostrado nas Figuras 16, 18 e 19. Estas figuras: • Comparam perfis semi-quantitativos de alcaloides de endófitas selecionados entre diferentes hospedeiros isogênicos • Comparam perfis semi-quantitativos de alcaloides para diversos endófitas em um hospedeiro isogênico • Comparam perfis semi-quantitativos de alcaloides de endófitas de festuca alta e azevém perene no genótipo de azevém perene Bro08

[000444] A Figura 17 mostra a presença de peramina e ergovalina em associações de endófita-festuca alta estabelecidas depois de ino-culações isogênicas em planta de novos endófitas de festuca alta em genótipos de festuca alta do painel de diversos hospedeiros.

[000445] A Tabela 9 mostra o perfil metabólico de associações de endófita-festuca alta estabelecidas depois de inoculações isogênicas em planta de novos endófitas de festuca alta em genótipos de festuca alta do painel de diversos hospedeiros. Plantas positivas para endófita confirmadas (E+) foram divididas para 5 replicatas e aparadas regu-larmente para estimular o perfilhamento. Quatro meses depois plantas E+ foram replantadas em 12 replicatas. Um mês depois plantas E+ foram replantadas no caso de menos de 9 cópias positivas estarem disponíveis neste momento. O estado de endófita foi testado usando marcadores de SSR depois de cada replante.

Tabela 9 - Associações de endófita-festuca alta estabelecidas depois de inoculações isogênicas em planta de novos endófitas de festuca alta em genótipos de festuca alta do painel de diversos hospedeiros usados para perfil metabólico.

[000446] Uma gama de associações de endófita-festuca alta estabelecidas depois de inoculações isogênicas em planta de novos endófi- tas de festuca alta em genótipos de festuca alta do painel de diversos hospedeiros foram selecionadas para perfil metabólico (Tabela 9). No total, 29 associações isogênicas de hospedeiro-endófita foram submetidas a Análise LCMS, seguindo o esquema experimental descrito abaixo.Esquema experimental • Desbastar e replantar as plantas • 16h de iluminação, 30°C; 18h de escuridão, 20°C • Colheita (controle) ^ liofilização ^ 50 mg de material de pseudocaule ^ extração com 80% de metanol ^ Análise LCMS • Recuperação e estresse hídrico • Segunda colheita (estressada) ^ liofilização ^ 50 mg de material de pseudocaule ^ 80% de extração de metanol ^ Análise LCMS.

[000447] Isto foi realizado em um ambiente controlado (câmara de crescimento) simulando condições de versão, com leve irrigação con-forme requerido. Nove cópias por acesso foram plantadas em mistura de envasamento geral. Foi usado um bloco completo randomizado (Randomized Complete Block) com sub-amostragem.

Exemplo 8 - Propriedades bio-protetoras de endófitas de festuca

[000448] Três patógenos fúngicos (isto é, Colletrotrichum graminico- la, Drechslera brizae e Rhizoctonia cerealis) - que provocam uma gama de doenças fúngicas e infectam uma gama de diferentes plantas hospedeiras - foram incluídos em bioensaios anti-fúngicos usados para analisar as potenciais atividades anti-fúngicas de endófitas de festuca isolados. A Figura 20 mostra resultados de bioensaios anti-fúngicos de endófitas de festuca isolados. Resultados de bioensaios anti-fúngicos também são mostrados na Tabela 10. Foi visto que uma gama de en- dófitas tinha atividade anti-fúngica alta (H) e média (M) (Tabela 10).

Atividade anti-fúngica: Baixa, Média, Alta Tabela 10 - Bioensaios anti-fúngicos de novos endófitas de fes- tuca isolados

Exemplo 9 - Sequenciamento de pesquisa de genoma de novos endófitas de festuca alta

[000449] Uma gama de novos endófitas de festuca alta foram submetidos a sequenciamento de pesquisa de genoma (GSS, Genome Survey Sequencing).

[000450] A Figura 21 mostra uma estratégia para GSS de novos en- dófitas de festuca selecionados. Os perfis de alcaloides de novos en- dófitas de festuca submetidos a análise por GSS são mostrados na Tabela 11.

Tabela 11 - Perfis de alcaloides de endófitas sequenciados. Verde: Alcaloide presente, Amarelo: Alcaloide ausente, Cinza: Perfil de alcaloides não determinado * Os perfis são tomados a partir de dados publicados

[000451] A Figura 22 mostra o caminho biossintético da peramina. PerA codifica uma única enzima multifuncional que catalisa todas as etapas biossintéticas. Número de Acesso do GenBank: AB205145. A presença do gene perA em endófitas do exogrupo não-Epichloê é mostrada na Figura 23.

[000452] A Figura 24 mostra o caminho biossintético da ergovalina. Genes no cluster genético eas os quais estão envolvidos na biossíntese da ergovalina são mostrados na Figura 25 e na Tabela 12. O gene dmaW codifica a enzima DMAT sintase, a qual catalisa a primeira etapa empenhada na biossíntese da ergovali- na. A presença do gene dmaW em novos endófitas de festuca é mostrada na Figura 26 e a presença do cluster genético eas em novos endófitas de festuca é mostrada na Figura 27.

Tabela 12 - Genes no cluster eas

[000453] A Figura 28 mostra o caminho biossintético de Lolitrem B. Genes no cluster genéticos os quais estão envolvidos na biossíntese de Lolitrem B são mostrados na Figura 29 e na Tabela 13. A presença do cluster genético 1 (ItmG, ItmM e ItmK) em endófitas é mostrada na Figura 30, a presença do cluster genético 2 (ItmB, ItmQ, ItmP, ItmF e ItmC) é mostrada na Figura 31 e a presença do cluster genético 3 (ItmE e ItmJ) é mostrada na Figura 32.

Tabela 13 - Genes no cluster genético envolvidos na biossíntese de Lolitrem B

[000454] A Figura 33 mostra o caminho biossintético da Loline. Genes no cluster genético os quais estão envolvidos na biossíntese da Loline são mostrados na Figura 34 e Tabela 14. A presença do cluster genético biossintético da Loline em novos endófitas de festuca é mostrada na Figura 35.

Tabela 14 - Genes no cluster genético biossintético da Loline

[000455] A Figura 36 e mostra a análise genética biossintética de alcaloides para cepa de endófita NEA23. As Tabelas 15 e 16 mostram análises genéticas biossintéticas de alcaloides para várias cepas de endófitas. A Tabela 15 mostra resultados da avaliação da presen- ça/ausência de gene biossintético de alcaloide para diferentes endófi- tas por mapeamento de leituras de sequência de pesquisa de genoma correspondentes aos diferentes genes/clusters genéticos biossintéticos de alcaloide.

Tabela 15 - Avaliação da presença/ausência de gene biossintético de alcaloide para diferentes endófitas por mapeamento de leituras de sequência de pesquisa de genoma correspondentes aos diferentes genes/clusters genéticos biossintéticos de alcaloide.

[000456] A Tabela 16 mostra resultados da avaliação da presen- ça/ausência de genes biossintéticos de alcaloide para diferentes endó- fitas por mapeamento de leituras de sequência de pesquisa de geno- ma correspondentes aos diferentes genes/clusters genéticos biossinté- ticos de alcaloide bem como perfil de alcaloides correspondentes ob- servados para associações de festuca alta-endófita correspondentes.

Tabela 16 - Análise genética biossintética de alcaloides. Verde: alcaloide presente, Amarelo: Alcaloide ausente, Cinza: perfil de alcaloides não determinado, *Os perfis são tomados a partir dos dados publicados, G+ = cluster genético/gene presente, G- = cluster genéti- co/gene ausente, PG+ = cluster genético/gene parcialmente presente A Tabela 17 mostra novos endófitas de festuca (NEA16, NEA 8, IMEA19, NEA20, NEA21 e NEA23) com perfis de toxinas favoráveis.

Tabela 17 - Novos endófitas de festuca (NEA16, NEA18, NEA19, NEA20, NEA21 e NEA23) com perfis de toxinas favoráveis e atividades anti-fúngicas observadas em bioensaios. * Endófita comercial de controle

[000457] Uma análise genotípica dos novos endófitas de festuca NEA23 e NEA21 é mostrada na Figura 37. Exemplo 10 - Verificação e Caracterização de Endófitas do Azevém perene Os objetivos foram: 1. Identificação e caracterização de novos endófitas do azevém perene para avaliação no germoplasma. 2. Desenvolvimento e avaliação de associações otimizadas entre novos endófitas e germoplasma de elite.

Estratégias experimentais 1. Identificação e caracterização de novos endófitas do azevém perene para avaliação em germoplasma proprietário

[000458] Atividade: Estabelecimento de uma 'biblioteca' proprietária de novas cepas de endófitas • Compilação do germoplasma alvo • Análise genotípica de amostras de germoplasma • Análise metabolômica de amostras de germoplasma • Isolamento e inoculação de cultura fúngica • Análise metabolômica de plantas inoculadas • Avaliação da estabilidade do endófita 2. Desenvolvimento e avaliação de associações otimizadas entre novos endófitas e germoplasma de elite Atividade: Liberação de novos endófitas no processo de aprimoração do germoplasma • Inoculação em larga escala de endófitas selecionados • Análise genética de associações selecionadas de hos- pedeiro-endófita • Análise fenotípica de associações selecionadas de hospedeiro-endófita

[000459] O perfil de toxinas desejado de endófitas do azevém perene é mostrado na Figura 6.

[000460] Os requisitos do resultado para estabilidade do endófita são como se segue: Estabilidade Intergeracional • Máximo < 5% de perda por geração • Idealmente 2 a 3% de perda por geração Estabilidade de armazenamento das sementes • 3 anos em semente

[000461] Estabelecimento de compilação de germoplasma de azevém para verificação e identificação de endófitas e estabelecimento de 244 acessos.

[000462] A Figura 40 mostra a análise genotípica do conteúdo de endófita em acessos de uma compilação de germoplasma de azevém alvo.

[000463] A Figura 41 mostra a análise do conteúdo de endófita em acessos de uma compilação de germoplasma de azevém alvo. Gene-ticamente única; produção de toxina dentro de limites requeridos com base em previsão genotípica. Isolamento de culturas fúngicas de associações selecionadas de azevém-endófita • Culturas in vitro de candidatos de endófitas estabelecidos e genótipos confirmados • Criopreservação de longo termo de culturas de endófi- tas estabelecidos

Tabela 18 - Isolamento de culturas fúngicas a partir de associações selecionadas de azevém-endófita Exemplo 11 - Inoculação isogênica de endófitas do azevém perene

Tabela 19 - Estabelecimento de culturas de meristema para um painel de hospedeiros diversos de azevém perene

[000464] A Figura 42 mostra uma determinação de 'semelhança' de cultivar do genótipo de planta hospedeira isogênica • Bronsyn e Tolosa (96 indivídos) foram avaliados para di-versidade genética usando 58 marcadores de SSR de azevém perene • Cultivares de Bronsyn e Tolosa facilmente discriminados

[000465] A Figura 43 mostra uma determinação de 'semelhança' de cultivar do genótipo de planta hospedeira isogênica. 96 genótipos de Impact, Bealey e Barsandra foram avaliados para diversidade genética usando 56 marcadores de SSR derivados do azevém perene.

[000466] A Figura 44 mostra o desenvolvimento de um teste genético molecular do painel de hospedeiros para QC de associações de hos- pedeiro-endófita. • Um painel de 5 marcadores de SSR do azevém perene foi identificado para distinguir os diferentes genótipos do painel de hospedeiro • Plenas capacidades de QC para planta hospedeira iso- gênica bem como endófita

[000467] A Figura 45 mostra a inoculação de endófitas candidatos em culturas de meristema de painel de hospedeiros de azevém diversos. Regeneração de Associações Isogênicas Maduras de Azevém- Endófita • Escore quantitativo usado para avaliar a frequência de inoculação de endófita • 3 marcadores de SSR de diagnóstico são usados para determinar a presença e a identidade de endófita e as amostras são classificadas em uma escala de 0 a 3 • Escore quantitativo também é usado para testar a pureza das sementes e para teste de presença e identidade de endófita Escore quantitativo Alelos presentes e de tamanho correto para Ioci SSR dados

Tabela 20 - Escore quantitativo usado para avaliar a frequência de inoculação de endófita • Frequência de inoculação média de 15% através de to das as combinações de endófita-hospedeiro Taxas de sucesso da inoculação

Tabela 21 - Percentagem de sucesso das inoculações

Tabela 22 – Número de sucesso das inoculações

Tabela 23 - Número total de inoculações testadas

[000468] A Figura 46 mostra os endófitas selecionados. Estabilidade vegetativa de endófita em genótipos de painel de hospedeiros de azevém de prioridade • As plantas foram re-amostradas 6 a 12 meses (linha superior) depois de inoculação inicial e novamente depois de 2 anos e 3 anos (linha inferior) depois de inoculação inicial • Endófita NEA11 altamente estável através de todas as plantas hospedeiras • NEA12 apresenta graus variáveis de estabilidade

Tabela 24 - Estabilidade vegetativa do endófita em genótipos de painel de hospedeiros de azevém de prioridade Inoculações isogênicas de Azevém perene

[000469] Os endófitas NEA10 e NEA12 são recalcitrantes para inoculação, com baixas frequências de sucesso da inoculação

[000470] NEA10 é somente compatível com Impact e Bronsyn

[000471] NEA12 é somente compatível com Impact, Barsandra e Tolosa A. Número de inoculações realizadas

B. Número de inoculações testadas

[000472] Os endófitas NEA3, NEA2 e E34 não foram inoculados com sucesso

[000473] E1 é amplamente compatível A. Número de inoculações realizadas

B. Número de inoculações testadas

C. Número de sucesso das inoculações

D. Percentagem de sucesso das inoculações

Tabela 26 - Inoculações isogênicas de Azevém perene

[000474] Estabilidade vegetativa do endófita E1 em genótipos de painel de hospedeiros de azevém de prioridade

Tabela 27 - Estabilidade vegetativa do endófita E1 em genótipos de painel de hospedeiros de azevém de prioridade. As plantas foram re-amostradas 6 a 12 meses depois de inoculação inicial (linha inferior). Sumário da Estabilidade do Endófita em Associações de Hospedeiro isogênico - Foram observados efeitos específicos de hospedeiro e endófita - Identificadas associações de hospedeiro-endófita estáveis para novos endófitas, estabelecendo associações do inventor - por exemplo, Impact - NEA10; Tolosa - NEA12; Barsandra - E1 - Efeitos significativos de genótipo x genótipo (G x G) sa-lientam a importância da reprodução para simbiotas - - Bronsyn e Impact apresentaram maiores taxas de su cesso de inoculação - melhor faixa de compatibilidade - E1 apresenta altas taxas de sucesso de inoculação e tem compatibilidade intermediária - Os endófitas NEA11, NEA10 e ST são altamente estáveis ao longo do tempo - Problemas de estabilidade vegetativa com NEA12 - Ênfase na manutenção e na caracterização de associ- ações altamente valiosas Exemplo 12 - Perfil metabólico de associações de hospedeiro isogênico – endófita

Tabela 28 - Perfil metabólico de associações de hospedeiro iso- gênico - endófita

[000475] Perfil metabólico em profundidade de novas associações de hospedeiro isogênico-endófita

[000476] A Figura 47 mostra uma caracterização detalhada dos known knowns e seus precursores.

[000477] Procedimento: 1. Estabelecer metodologias ára análise semi-quantitativa de alcaloides conhecidos (LEPJ) 2. Comparar perfis de alcaloides (LEPJ) semi-quantitativos de plantas hospedeiras E+ versus E- 3. Compare perfis de alcaloides semi-quantitativos para di-versos endófitas em um hospedeiro isogênico 4. Avaliar a estabilidade do perfil de alcaloides (LEPJ) de endófitas selecionados através de diferentes hospedeiros isogênicos

[000478] Os genótipos dos hospedeiros foram confirmados usando o teste de identificação de painel de hospedeiros (Figura 48). Foram testadas dez replicatas de cada associação de hospedeiro-endófita. • Duas plantas positivas para endófita confirmadas divi didas em 4 replicatas • Plantas aparadas regularmente para estimular o perfi- lhamento • 2 anos depois (primeira coluna da tabela 29) - Plantas replantadas to 10 replicatas • 2 meses depois (segunda coluna da tabela 29) - Plantas positivas para endófita replantadas para 15 replicatas • O estado de endófita foi testado usando marcadores de SSR

Tabela 29 - Estado do endófita

[000479] As Figuras 49 e 50 mostram o perfil metabólico em profundidade de novas associações de hospedeiro isogênico-endófita. • Dez replicatas por associação de hospedeiro-endófita (20*10 = 200 amostras). • Esquema em bloco randomizado completo • Dois órgãos (pseudocaule e folhas) foram colhidos depois de 6 semanas de crescimento sob condições controladas • Depois de 6 semanas de re-crescimento houve uma segunda colheita • Suprimento de água: 50 mL /dia • 14 horas de iluminação (620 mmo/m-2s-1 de intensidade da luz) /21°C • 10 horas de escuridão/16°C

Resultado:

[000480] Determinar o padrão de variação metabólica entre endófi- tas, plantas hospedeiras e tipos de órgãos. Preparação de amostras ^ Análise LC/MS ^ perfis de alcaloides LEPJ Análise QQQ Análise do caminho de alcaloides Isolamento de alcaloides e caracterização quantitativa Estudo corrente: Material de pseudocaule liofilizado 50 mg de pó liofilizado Extraído duas vezes em 1 mL de metanol : água (80:20, v:v)

[000481] A Figura 51 mostra LEPJ: os known knowns.

[000482] A Figura 52 mostra a massa precisa de LEPJ.

Tabela 30 - massa precisa de LEPJ

[000483] As Figuras 53 e 54 mostram a identificação de LEPJ.

[000484] A Figura 55 mostra a quantificação de LEPJ.

[000485] A Figura 56 mostra uma comparação de perfis se- mi-quantitativos de alcaloide (LEPJ) de plantas hospedeiras E+ versus E-.

[000486] A Figura 57 mostra uma comparação de perfis se- mi-quantitativos de alcaloide para diversos endófitas em um hospedeiro isogênico (Imp04).

[000487] A Figura 58 mostra uma avaliação da estabilidade do perfil de alcaloides (LEPJ) de endófitas selecionados através de diferentes hospedeiros isogênicos. • Efeitos significativos de genótipo x genótipo (G x G) sa-lientam a importância da reprodução para simbiota • A produção do alcaloide LEPJ específica varia entre di-ferentes endófitas inoculados no mesmo hospedeiro isogênico • por exemplo, NEA11 inoculado em Impact (Imp04) pro- duz mais peramina e menos ergovalina do que NEA10 inoculao no mesmo genótipo do hospedeiro • A produção do alcaloide LEPJ varia entre diferentes plantas hospedeiras abrigando o mesmo endófita indicando efeitos do genótipo do hospedeiro • por exemplo, ergovalina não foi detectada em Bealey (Bea02) e Barsandra (San02) inoculados com ST e NEA11 e foi detectada em quantidades relativamente elevadas em Bronsyn (Bro08) inoculado com os mesmos endófitas

[000488] Avaliação de um endófita que corresponde às especificações e é estável através de grupos de germoplasma.

[000489] O conteúdo gênico pode ser usado para prever a presen- ça/ausência de lolitrem B

[000490] LC-MS semi-quantitativa pode ser usada para avaliar quan tidades relativas de LEPJ através de grupos de germoplasma • NEA12 forma associações estáveis com alguns panos de fundo de germoplasma, produz J através dos hospedeiros avaliados, não produz LEP e apresenta atividade anti-fúngica de amplo espectro • NEA11 é um endófita altamente compatível que produz relativamente menos P, e mais E do que ST através de uma gama de panos de fundo de hospedeiros, mas não LJ • E1 é um endófita altamente compatível que não produz LEPJ em Imp04, mas produz J em Bro08 • NEA10 forma associações estáveis dentro de um pano de fundo de hospedeiro limitado e produz mais E e menos P do que NEA11 (e por inferência ST)

(penúltima coluna da primeira linha) não-N. lolii (segunda coluna da segunda linha) N°. de Acesso no GenBank Produção de metabólitos em planta Lolitrems Produção de metabólitos em planta Peramina Produção de metabólitos em planta Álcaloides do Ergot Produção de metabólitos em planta Álcaloides da Loline Tabela 31 - LC-MS semi-quantitativa usada para avaliarasqde LEPJ através de grupos de germoplasma Análise do caminho • Caminhos biossintéticos de Lolitrem B e da ergovalina são conhecidos em N. lolii • Realizar análise do caminho para determinar se dele- ções de genes resultam em alterações na produção de precursores de known knowns (LPEJ) e fluxo direto para síntese de outras toxinas conhecidas

[000491] A Figura 59 mostra a biossíntese de lolitrem B.

[000494] A Figura 61 mostra uma análise do caminho biossintético de Lolitrem B.

[000495] A Figura 62 mostra o caminho de paspalinina - A tremorgen.

[000496] A Figura 63 mostra uma análise do caminho de: paspalinina - A tremorgen.

[000497] A Figura 64 mostra a presença de lolitrem e paspalinina em simbiota.

[000498] A Figura 65 mostra que Peramina está presente em planta em quantidades traço na ausência de um endófita produtor de peramina. Exemplo 13 - Efeito do endófita sobre a performance do symbiotum

[000499] A avaliação do efeito do endófita sobre a performance do symbiotum em pano de fundo de hospedeiro isogênico é feita através de medições: • do número de Perfilhos • do peso dos broto • do peso da raiz • do comprimento da raiz • da proporção de raiz para broto

[000500] A Figura 66 mostra o procedimento usado para avaliar mo-dificações para o fenótipo do hospedeiro mediadas pelo endófita.

[000501] A Figura 67 mostra o efeito do endófita sobre a performance do symbiotum.

[000502] ANOVA • Significativos efeitos do endófita sobre todos os traços medidos • Sem efeitos combinados significativos de endófita/nitrato • Nenhum efeito do nitrato sobre a estabilidade vegetativa do endófita

Tabela 40 - Avaliação de efeito do endófita sobre a performance do symbiotum em pano de fundo de hospedeiro isogênico através de me- dições de: Coluna 3: número de Perfilhos; Coluna 4 Peso fresco de rebentos (g); Coluna 5: Comprimento da Raiz (cm); Coluna 6: Peso fresco de raiz (g).

[000503] Oito replicatas por associação isogênica foram avaliadas para performance fenotípica.

[000504] As plantas foram cultivadas em potes de areia por 4 semanas para se estabelecerem.

[000505] Os tratamentos foram aplicados na semana 4: Estiagem e alagamento Colheita 1 em 8 semanas Colheita 2 em 12 semanas

[000506] A Figura 68 mostra as plantas antes da colheita T1.

[000507] A Figura 69 mostra a performance conforme medida pelo número de perfilhos.

[000508] Houve importantes efeitos de genótipo x genótipo (G x G) • Significativa variação entre plantas hospedeiras • Importantes efeitos do endófita sobre a performance

[000509] Isto salienta a importância de reprodução e seleção desde o início de simbiota. Exemplo 14 - Sequenciamento de pesquisa de genoma de endófitas Progresso na Performance de Diferentes Plataformas de Sequen- ciamento Roche 454 • leituras de 400 a 500 bp • 1 milhão de leituras por operação • cobertura de 12x

[000510] Illumina GAIIx • 150 bp de leituras de extremidades pareadas • 8 alamedas por célula de fluxo • 20 milhões de leituras de extremidades pareadas por alameda • 12 amostras por alameda • cobertura de 10x por amostra

[000511] Illumina HiSeq 2000 • 100 bp de leituras de extremidades pareadas • 8 alamedas por célula de fluxo • 2 células de fluxo por operação • 250 milhões de leituras de extremidades pareadas por alameda • 24 amostras por alameda • cobertura de 20 a 30x por amostra Análise de Pangenoma de Endófitas de Neotyphodium Análise de Sequência Usando a Plataforma de Sequenciamento 454

[000512] Dez genomas sequenciados N. lolii e não-N. lolii

[000513] Gerado um genoma de referência para N. lolii

[000514] Caracterizada arquitetura nuclear, incluindo o conteúdo genético

[000515] Identificados polimorfismos intra-específicos, salientando a importância do sequenciamento de diferentes genomas de N. lolii

[000516] Identificadas relações entre diversidade metabólica e per- da-ganho genético para algumas toxinas

[000517] Comparação com a forma sexual relacionada revelou perda genétida de ambas as linhagens como uma fonte de diversidade feno- típica

[000518] Comparação da sequência do genoma mitocondrial com outro membro das Clavicipitaceae revelou que é altamente conservada, com diferenças no tamanho do genoma devido a indels em regiões intergênicas e intrônicas

[000519] A Figura 70 mostra a análise de sequência usando a plata- forma de sequenciamento 454. Análise de Sequência Usando a Plataforma de Sequenciamento Illumina

[000520] 23 cepas de endófitas de azevém perene sequenciadas: • 16 N. lolii • 3 Lp TG-2 • 4 não-N. lolii

[000521] Construção do genoma de referência - ST

[000522] Típicos de diversidade de endófitas de azevém perene para análise do pan-genoma

[000523] Endófitas comerciais atuais

[000524] NEA2, NEA3, NEA4, AR1

[000525] Endófitas futuros (potencialmente) comerciais

[000526] NEA10, NEA11, NEA12, E1

[000527] Análise de diversidade genética dentro de cluster

[000528] Endófitas de origens geográficas distintas • ST (Grasslands Samson) - NAe (Marrocos) e C9 (Espanha)

[000529] Endófitas de mesma origem geográfica • NEA12 (França) - 15310 e 15311

[000530] A Figura 71 mostra a análise de sequência usando a plataforma de sequenciamento Illumina.

[000531] A Figura 72 mostra um sumário dos genomas sequencia- dos de endófitas de azevém perene.

[000532] A Figura 73 mostra um sumário dos genomas sequencia- dos de endófitas de azevém perene. Atividades de Pesquisa Chave • Incorporação de dados de GAII e de HiSeq para montagem e mapa de uma gama diversa de cepas de endófitas e genes • Conclusão da montagem da sequência do genoma de referência para endófita ST • Análise de sequência do genoma de alta resolução de cepas "idênticas" • Análise de sequência do pan-genoma de cepas de endó- fitas representando a diversidade de endófitas de azevém perene Refinamento do Genoma de Referência Tóxico Padrão de N. lolii e Análise de Pangenoma • Até recentemente todo o sequenciamento do genoma de endófita foi realizado usando a plataforma Roche 454 • Atualmente existem dados de sequência adicionais dis-poníveis a partir de uma plataforma independente (Illumina GAII e Hi- Seq2000) para um grande número de espécies e cepas de endófitas • Isto é útil uma vez que os dois métodos usam química de sequenciamento fundamentalmente diferente portanto uma pode ser usada para complementar a outra □ N. lolii ST (N. lolii Standard Toxic) é a cepa de referência para a qual nós temos a maioria dos dados de sequência de 454 • Quais ganhos existem usando ambos os grupos de dados para este endófita?

[000533] As Figuras 74 a 78 mostram leituras de Illumina v contigs do 454. A Figura 74 mostra que em geral os dados do Illumina confirmam os dados do 454. A Figura 75 mostra que os dados do Illumina podem corrigir para erro de homo-polímero do 454. A Figura 76 mostra que dados do Illumina de outras cepas identificam SNPs de cepas específicas. A Figura 77 mostra que dados do Illumina de outras espécies identificam haplotipos de genes duplicados/triplicados, por exemplo, FEtc7-58. A Figura 78 mostra genes em "triplicata" por exemplo, FEtc7-58. Visualização e Análise Gráficas Interativas: Nível de Leitura

[000534] A Figura 79 mostra display de cobertura de 454 FLX v 454 Titanium v Illumina GAII.

[000535] A Figura 80 mostra display de cobertura de 454 FLX v 454 Titanium v Illumina GAII v Hi Seq.

[000536] A Figura 81 mostra a correção de Homo polímero: vista gráfica

[000537] A Figura 82 mostra a correção de Homo polímero: vista de bases

[000538] A Figura 83 mostra a classe de Pan-genome SNP (Pan-genoma de polimorfismos de nucleotídeo único): vista gráfica, nível de leitura

[000539] A Figura 84 mostra 77 rodadas de sequenciamento inde-pendente, ordenadas por similaridade. Estas podem apresentar poli-morfismos de nucleotídeo único comuns.

[000540] A Figura 85 mostra que rodadas de sequenciamento inde-pendente também podem apresentar deleções específicas de cepas.

[000541] A Figura 86 mostra que rodadas de sequenciamento inde-pendente podem prever modificações de aminoácidos a partir de dados de polimorfismos de nucleotídeo único. Uso de Dados do Illumina para Refinar a Montagem de Sequência 454 Método • Gerar uma montagem usando Newbler (software de montagem de Roche) e refinar usando informação dos dados de se-quência do Illumina (par gêmeo (mate pair), profundidade de leitura, etc) e dados de montagem do Newbler (ligações entre contigs, contigs altamente similares) • Algumas Definições: - => 'Contig: Sequência reunida inequívoca contínua 'Andaime (Scaffold): Sequência contendo mais de um Contig cujas conexões e orientações em relação umas às outras são conhecidas, mas as quais são conectadas por sequência ambíguas N5 'N50: Extensão de contig no qual 50% da extensão reunida total está contida em contigs mais longos do que esta extensão

[000542] A Figura 87 mostra que o número de contigs diminui com as operações de refinamento da montagem.

[000543] A Figura 88 mostra que N50 aumenta com operações de refinamento da montagem.

[000544] A Figura 89 mostra que o refinamento da montagem diminui o número de scaffolds, e contigs "não empilhados (unscaffolded)" únicos.

[000545] A Figura 90 mostra que o número médio de bases por contig aumenta com o refinamento da montagem. Status Corrente de Montagem de Sequência do Genoma de Referência de Endófita ST => 2.494 contigs, totalizando 33.804.495 bp - => 1.496 destes contigs em 449 scaffolds, maior de 395.697 bp, total de 25.953.091 bp => 998 contigs não empilhados únicos, contendo 7.851.404 bp - => Programa de previsão genética Augustus prevê 10.821 genes codificando proteína => genoma de referência ST proporciona uma base para geração do pangenoma de outros N. lolii e fungos relacionados. Revisão do Status de Endófita Candidato Processo de avaliação prévia do candidato: - Identificados acessos E+ (77) - Identificados genótipos de endófita novos e geneticamente diversos - Identificados 42 candidatos a endófita primário submetidos a perfil metabólico em pano de fundo de hospedeiro endógeno - Eliminados candidatos a endófita produtor de lolitrem B (29) - Eliminados genótipos de endófita em duplicata (5) - Identificados 8 candidatos a endófita primário para avanço

a = níveis desprezíveis em pano de fundo endógeno b = incapaz de isolar a partir de planta de fonte original c = inoculado em painel isogênico porém instável d = recalcitrante a inoculação em painel isogênico

[000546] Candidatos com perfil adequado avançados no programa

[000547] Candidatos com perfil adequado não avançados devido a problemas de estabilidade

[000548] Candidatos com perfis inadequados aparentes Tabela 41 - Revisão do Status de Endófita Candidato

[000549] Potencial para considerar endófitas 15931 e F2 em novo paradigma de estabelecimento em larga escala de simbiota de gramí- nea-endófita para seleção desde o início. Exemplo 15 - Visão geral de geração de novas cepas variantes de endófita de Neotyphodium do inventor através de mutagênese

[000550] O objetivo deste trabalho foi para criar novas variantes do endófita do azevém perene, Neotyphodium lolii, através de indução de poliploidização e mutagênese, com propriedades desejáveis tais como bioatividades reforçadas (por exemplo, atividade antifúngica), e/ou capacidade de colonização de planta alterada e estabilidade de asso-ciações de hospedeiro gramínea - variante de endófita (por exemplo, crescimento in vitro alterado), e/ou performance de crescimento alterada (por exemplo, reforçado vigor da planta, reforçada tolerância à estiagem, reforçada eficiência do uso de água) de associações de hospedeiro gramínea - variante de endófita correspondentes. Estas associações de hospedeiro gramínea - variante de endófita são referidas como novas associações de gramínea - endófita do "inventor". Estratégias experimentais para a geração e a caracterização de novas cepas variantes de endófita de Neotyphodium do inventor através de mutagênese

[000551] As atividades experimentais portanto incluíram: 1. Estabelecimento de triagens fenotípicas para novas associações de gramínea - endófita do "inventor" tais como: • Reforçada tolerância ao estresse biótico • Reforçada tolerância à estiagem e reforçada eficiência do uso de água • Reforçado vigor da planta 2. Geração direcionada (isto é, poliploidização e mutagênese de raios X) e caracterização (isto é, bioensaios anti-fúngicos, taxa de creci- mento in vitro, sequenciamento de pesquisa de genoma [GSS]) de novos endófitas do 'inventor' 3. Reprodução de associações de gramínea - endófita do "inventor • Liberação de endófitas do inventor no processo de de-senvolvimento do germoplasma de gramíneas (por exemplo, azevém perene). Estabelecimento de triagens fenotípicas para novas associações de gramínea - endófi do "inventor"

[000552] A avaliação de reforçada tolerância ao estresse biótico usando NEA12 é mostrada nas Figuras 92 e 93. A Figura 92 mostra bioensaios in vitro para avaliar a atividade anti-fúngica de endófitas de Neotyphodium. A Figura 93 mostra um teste de folha destacada para avaliar a resistência à ferrugem da coroa (Puccinia coronata f.sp. lolii).

[000553] A avaliação de reforçada tolerância à estiagem e reforçada eficiência do uso de água é mostrada na Figura 94. Isto envolveu triagens de testes de estufa e de campo para tolerância à estiagem, so- brevida e recuperação, recrescimento depois de estiagem, perfil metabólico e dissecção de múltiplos traços (com base em avaliações e medições associadas com a morfologia da planta, a fisiologia da planta e a bioquímica da planta).

Geração de genótipos de N. lolii do "inventor"por poliploidização

[000554] Isto envolveu a criação de nova variação em endófitas de Ne- otyphodium sem o uso de tecnologia transgênica. Colchicina tem sido usada amplamente e com sucesso para o dobramento de cromossomas em plantas, por exemplo, azevém perene. Inibe a segregação do cro-mossoma durante a mitose induzindo autopoliploidização (dobramento de cromossomas; see A Figura 95). Isto possibilita a geração de novos endófitas através de indução de dobramento de cromossomas e pode ser aplicável à produção de endófitas poliploides artificiais.

[000555] O fluxo de trabalho experimental para dobramento de cro-mossomas é mostrado na Figura 96.

[000556] Calibrações por citometria de fluxo para avaliar o teor de DNA em endófitas de Neotyphodium são mostradas na Figura 97. Os picos indicam teor de DNA nuclear relativo.

[000557] Análise por citometria de fluxo das cepas NEA12 é mostrada na Figura 98 e na Tabela 42. 1. ST é altamente estável, amplamente compatível. 2. NEA12 produz somente JANTHITREM. 3. AR1 produz somente PERAMINA.

[000558] Tabela 42: Cepas de endófitas (cepas de endófitas ST, NEA12 e AR1) tratadas com colchicina submetidas a tratamentos com colchicina (em diferentes concentrações de colchicina em %) levando à recuperação de colônias de endófita (no. de colônias) usadas para análise por citometria de fluxo

[000559] Análise do crescimento in vitro de cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh

[000560] Análise da taxa de crescimento of cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12 em cultura in vitro depois de 8 semanas é mostrada na Figura 99. Em uma triagem inicial, análise de variância identificou duas cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh (NEA12dh17 e NEAdh4) apresentando taxa de crescimento in vitro significativamente diferente para o endófita NEA12 de controle:

[000561] NEA12dh17 cresce significativamente mais rápido (p<0,01**)

[000562] NEA12dh4 cresce significativamente mais lento (p<0,05*)

[000563] Análise da taxa de crescimento de cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh em cultura in vitro durante 5 semanas é mostrada na Figura 100. Em uma triagem de validação, t-testes de Student identificaram duas cepas de endófitas variantes de Ne- otyphodium NEA12dh (NEA12dh17 e NEA12dh15) apresentando taxa de crescimento in vitro significativamente diferente para o endófita NEA12 de controle:

[000564] NEA12dh17 cresce significativamente mais rápido (p<0.01**)

[000565] NEA12dh15 cresce significativamente mais lento (p<0.01**) Bioensaios anti-fúngicos de cepas de endófitas variantes de Ne- otyphodium NEA12dh

[000567] Uma lista de patógenos fúngicos (causando uma gama de doenças fúngicas e infectando uma gama de diferentes hospedeiros ve-getais) que foram incluídos em bioensaios anti-fúngicos usados para analisar cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh para avaliar seu espectro de atividades anti-fúngicas é mostrada na Tabela 43.

Tabela 43: Patógenos fúngicos (causando uma gama de doenças fúngicas e infectando uma gama de diferentes hospedeiros vegetais) incluídos em bioensaios anti-fúngicos para analisar cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh para avaliar seu espectro de atividades anti-fúngicas

[000568] Bioensaios anti-fúngicos de cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12 são mostrados nas Figuras 101 e 102. Vinte cepas NEA12dh foram triadas para alterações na atividade anti-fúngica. Quatro cepas NEA12dh (isto é, dh5, dh6, dh13 e dh14) foram identificadas como tendo maior atividade anti-fúngica comparadas com NEA12. Sequenciamento de pesquisa de genoma e análise de sequência de cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh

[000569] Cepas endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh com reforçada atividade anti-fúngica, apresentando taxa de crescimento in vitro mais rápida e maior teor de DNA foram submetidas a sequencia- mento de pesquisa de genoma (GSS). Dados de sequência foram gerados para 10 cepas NEA12dh e para a cepa de controle NEA12 (salientada em azul na Tabela 44).

Tabela 44: Lista de cepas de endófitas variantes de Neotyphodi- um NEA12dh apresentando atividade anti-fúngica diferente [maior do que o controle ou igual ao controle (padrão, Std)] e crescimento in vitro diferente [mais lento do que o controle, mais rápido do que o controle ou igual ao controle (padrão, Std)] comparadas com a cepa de controle NEA12

[000570] Dados de sequenciamento de pesquisa de genoma (GSS) obtidos para cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh derivadas a partir de cepa de controle NEA12 tratada com colchicina (salientado em azul na Tabela 44) foram analisados como se segue: • Montagem de novo dos dados de GSS da cepa de controle NEA12 - para agir como uma sequência do genoma de referência para a análise das cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh • Mapear as leituras de sequência de dados de GSS das cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh para a sequência do genoma de referência NEA12 • Identificar regiões potencialmente duplicadas, isto é, regiões com cobsertura de sequência maior do que a esperada • Identificar sequências genéticas que podem ter sido du-plicadas

[000571] Análise da profundidade de leitura de GSS de cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh é mostrada na Figura 103. Análise de contigs de sequência que pareceram ter profundidade de leitura maior do que a esperada indica que não ocorreu nenhum evento de duplicação importante (com a exceção de eventos de ge- noma inteiro). Os padrões de profundidade de leitura através destes contigs não são idênticos entre as cepas. Isto sugere que há diferenças entre as cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh e a cepa de controle NEA12.

[000572] Análise de montagens de sequências de GSS para as cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh e a cepa de controle NEA12 é mostrada na Tabela 45.

Tabela 45: Análise de montagens de sequências de GSS para a NEA12dh

[000573] Cepas de endófitas variantes de Neotyphodium e a cepa de controle NEA12

[000574] Foram realizadas montagens de sequência de novo inde-pendentes usando parâmetros idênticos aos usados na montagem da sequência do genoma para a cepa de endófita de controle NEA12. Di-ferenças na estatística de montagem de sequência podem indicar di-ferenças genômicas entre as cepas. Dados de GSS obtidos para as cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh e usados nas montagens de sequência revelam menos bases incorporadas na montagem de sequência e produzem mais contigs de sequência.

[000575] Números aumentados de contigs de sequência menores podem ser causados por replicação do movimento de transposon.

[000576] O mapeamento de leituras da análise de sequência para a montagem da sequência do genoma de NEA12 é mostrado na Figura 104. Apesar de não desejarmos ser restringidos pela teoria, se os ge- nomas forem os memos não seria esperada nenhuma diferença no mapeamento de leituras do número de sequência para a sequência do genoma de referência. Cepas endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh variam de 35 a 70% de mapeamento de leituras de sequência até contigs de sequência de NEA12 > 5 kb de tamanho. Existem diferenças entre as sequências do genoma das cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh e a cepa de controle NEA12. Sumário de resultados sobre geração e caracterização de novas cepas de endófitas variantes de Neotyphodium do inventor através de mutagênese à base de tratamento com colchicina

[000577] Alterações na profundidade de leitura de sequência foram analisadas em cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh comparadas com a cepa de controle NEA12. Apesar de não terem sido detectados eventos de duplicação de sequência do genoma parciais grandes, a ocorrência de eventos de duplicação de genoma completo nas cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh não pode ser excluída com base na análise de sequência de GSS.

[000578] Montagens de sequências de novo foram realizadas de modo independente sobre dados de GSS obtidos a partir das cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh. Diferenças na estatística da montagem de sequências indicam que modificações genômicas foram causadas pelo tratamento com colchicina nas cepas de endófi- tas variantes de Neotyphodium NEA12*. O número de leituras de sequências do mapeamento de cepas de endófitas variantes de Ne- otyphodium NEA12dh para a sequência do genoma de referência de NEA12 varia entre as cepas. Todas as análises de dados de GSS realizadas sobre as cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh indicam diferenças genômicas.

[000579] Em resumo, os novos endófitas do inventor que se seguem foram produzidos por tratamento com colchicina de endófitas NEA12: • Quatro cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12 (dh5, dh6, dh13 e dh14) com propriedades bioprotetoras re-forçadas (isto é, bioatividades anti-fúngicas); • Uma cepa de endófita variante (dh17) de Neotyphodium NEA12dh com maior taxa de crescimento in vitro do que a cepa de controle NEA12 (isto é, potencialmente com capacidade reforçada de estabilidade/colonização de hospedeiro); • Dez cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh (incluindo dh5, dh6, dh13, dh14 e dh17) e cepa de controle NEA12 submetidas a sequenciamento de pesquisa de genoma; e • Cinco cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh (incluindo dh5, dh13 e dh17) selecionadas e submetidas a inoculação isogênica em planta.

[000580] Inoculação isogênica em planta em azevém perene com cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh

[000581] As seguintes cepas de endófitas variantes de Neotyphodi- um NEA12dh e cepa de controle NEA12 foram usadas para inoculação isogênica em planta em azevém perene : NEA12 NEA12dh5 Alta atividade anti-fúngica NEA12dh13 Alta atividade anti-fúngica NEA12dh4 Lento crescimento NEA12dh15 Lento crescimento NEA12dh17 Rápido crescimento

[000582] Tabela 46: Inoculação isogênica de genótipos de azevém perene (IMP04 e TOL03) com cepas de endófitas variantes de Ne- otyphodium NEA12dh. Os números indicam o número de plantas de azevém perene dos dois genótipos submetidos a inoculação isogênica com as differentes cepas de endófitas variantes de Neotyphodium NEA12dh. Geração de genótipos de N. lolii do inventor por mutagênese de raios X

[000583] A geração de genótipos de endófitas de Neotyphodium do inventor por mutagênese de raios X oferece a oportunidade de criar novas cepas variantes de endófita com propriedades reforçadas, tais como reforçada estabilidade em hospedeiros de gramíneas, compatibilidade mais ampla de hospedeiro bem como aprimorados perfis de toxinas por exemplo, depois de eliminação, da produção do alcaloide prejudicial lolitrem B no endófita ST altamente estável e amplamente compatível.

[000584] Um tal novo endófita do inventor seria vantajoso em relação aos endófitas comerciais existentes, tais como AR1 e AR37, uma vez que seriam altamente estáveis e amplamente compatíveis e com perfil de toxinas ótimas.

[000585] A Figura 105 mostra um fluxo de trabalho experimental para mutagênese de raios X de cepas de endófitas.

[000586] A Figura 106 mostra o caminho biossintético de in- dol-diterpeno. Lolitrem B é a principal toxina que causa a vertigem do azevém (ryegrass staggers), uma doença de animais de pastoreio. Dez genes em 3 clusters genéticos são necessários para a biossíntese do lolitrem. Nós enfocamos a análise inicial sobre 3 genes Ltm, um de cada cluster genético. Foi planejada e implementada análise de PCR multiplex otimizada. Triagem de cepas de N. lolii irradiadas com raios X

[000587] Em uma triagem primária preliminar >5.000 colônias de N. lolii irradiadas com raios X estabelecidas como um recurso inicial de nova variação de endófitas de N. lolii induzida através de mutagênese de raios X e representando uma compilação de cepas de endófita de N. lolii mutagenizada - foram triadas por análise de PCR multiplex para a presença de genes Ltm alvo levando a uma identificação preliminar de ~140 colônias negativas para PCR de cluster genético de lolitrem B putativo (~2,5% de 5.000 colônias triadas). Em uma triagem secundária foi extraído DNA de alta qualidade (140 culturas líquidas) e foi conduzida análise de PCR. Esta identificou 2 mutantes de deleção putativos para um dos genes de lolitrem B (Itm J).

Tabela 47: Mutantes de deleção de gene Itm de N. lolii induzidos por irradiação com raios X putativos derivados a partir de irradiação com dose de 30 Gy. O número de colônias representa o único identificador do mutante de deleção de gene Itm induzido por irradiação com raios X putativo (isto é, 139-6 e 145-15). Preto representa resultado de PCR negativo para análise genética de Itm respectiva, cinza representa resultado de PCR positivo para análise genética de Itm respectiva. Bioensaios anti-fúngicos de cepas variantes de N. lolii do inventor irradiadas com raios X

[000589] Houve oito cepas variantes de N. lolii irradiadas com raios X (isto é, cepas variantes 1-35, 4-7, 7-22, 7-47, 123-20, 124-6, 139-6, 144-16 e 145-15 derivadas por mutagênese de raios X) e uma cepa de controle de N. lolii (isto é, cepa de endófita ST).

[000590] Cinco patógenos fúngicos (causando uma gama de doenças fúngicas e infectando uma gama de diferentes hospedeiros vegetais) foram incluídos em bioensaios anti-fúngicos usados para analisar as cepas variantes de N. lolii irradiadas com raios X, como se segue: ■ Bipolaris portulacae ■ Colletotrichum graminicola ■ Drechslera brizae ■ Phoma sorghina ■ Rhizoctonia cerealis

[000591] Não foi observada diferença significativa em atividades an- ti-fúngicas de cepas variantes de N. lolii irradiadas com raios X testadas comparadas com o espectro de atividades anti-fúngicas observado para a cepa de endófita de controle ST. Crescimento in vitro de cepas variantes de N. lolii irradiadas com raios X do inventor

[000592] Os resultados da análise da taxa de crescimento in vitro de cepas variantes de N. lolii irradiadas com raios X do inventor são mos-trados na Figura 107, com uma análise estatística de crescimento in vitro empreendida na semana 5 para as cepas variantes de N. lolii irradiadas com raios X comparadas com a cepa de controle ST, revelando diferenças significativas em taxas de crescimento in vitro como se segue: p< 0,05* (para cepa variante de N. lolii irradiada com raios X 139-6)

[000593] p<0,01 ** (para todos os outros mutantes) Sequenciamento de pesquisa de genoma de cepas variantes de N. lolii irradiadas com raios X do inventor

[000595] Oito cepas variantes ST de N. lolii irradiadas com raios X e cepa ST de controle correspondente foram submetidas a sequencia- mento de pesquisa de genoma (GSS), levando a cobertura de sequência do genoma de 46 vezes a 79 vezes para as diferentes cepas conforme mostrado na Tabela 48.

Tabela 48: Genome Cobertura de sequência de genoma obtida em sequenciamento de pesquisa de genoma para 8 cepas variantes ST de N. lolii irradiadas com raios X e cepa ST de controle correspondente

[000596] Detecção de variação de sequência do genoma em cepas variantes de N. lolii irradiadas com raios X do inventor

[000597] Resultados da análise para detectar variação de sequência do genoma em cepas variantes de N. lolii irradiadas com raios X são mostrados na Figura 109. Resultados correspondentes sobre a detecção de polimorfismos de nucleotídeo únicos (SNPs) são mostrados na Figura 110 e resultados sobre a detecção de pequenas inser- ções/deleções (INDELs) são mostrados na Figura 111. Diferenças em profundidade de leitura de sequência e tamanho de inserção de par em cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X são mostradas na Figura 112.

[000598] Resultados sobre análise de sequência para clusters genéticos Ltm são mostrados na Figura 108. Não foram encontradas dele- ções, grandes ou pequenas, nas sequências codificantes ou regula- doras de clusters genéticos Itm. Não foram encontradas SNPs, inserções ou translocações nas sequências codificantes ou reguladoras de clusters genéticos Itm. Espectro de modificações de sequências do genoma detectadas nas cepas variantes de N. lolii irradiadas com raios X

[000599] A Figura 113 mostra números de SNPs detectados em regiões gênicas de cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X. Há grandes diferenças no número de SNPs detectados nas cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X e comparadas com a cepa de controle ST. Todas as cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X têm acima do dobro do número de SNPs por Mb através de regiões gênicas comparadas com a cepa de controle ST. Cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X têm em média 6 SNPs por Mb, onde a cepa de controle ST tem 2 SNPs por Mb.

[000600] A Figura 114 mostra números de INDELs em regiões gêni- cas de cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X. Todas as cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X contêm mais indels em regiões gênicas do que a cepa de controle ST. A diferença nos números de indels entre as cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X e a cepa de controle ST é em média de 134 indels por Mb. Quando agrupadas por tratamento de irradiação (isto é, dose de irradiação aplicada e número de irradiações repetidas) parece haver um pico no número de indels em 10Gy*2 de tratamento, consistente com os resultados obtidos na análise de detecção de SNP.

[000601] A Figura 115 mostra o espectro de modificações de sequências do genoma sob a forma de deleções detectadas em cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X.

[000602] A Tabela 49 mostra exemplos de algumas destas deleções de sequência do genoma detectadas em cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X.

Tabela 49: Deleções detectadas em sequências do genoma de cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X. Negrito indica deleções confirmadas por alterações na cobertura de leituras de sequência. O restante são potenciais de- leções de transposon.

[000603] A cepa mutante de deleção variante de N. lolii irradiada com raios X no. 7_47, a qual foi gerada depois de dois tratamentos de irradiação de raios X em dose de 10 Gy (10 Gy*2) de N. lolii ST endó- fita, teve o maior número de deleções grandes. Anotação de sequências deletadas nos genomas de cepas mu- tantes variantes de deleção de N. lolii irradiadas com raios X

[000604] Cepa Mutante Variante de N. lolii Irradiada com Raios X 1_35:

[000605] Para a cepa mutante variante de N. lolii irradiada com raios X 1_35, as seguintes sequências deletadas no contig ST454Contig00831 com uma extensão de ~ 4.400 a 8.000 bp foi detectada, com esdta região de sequência do genoma contendo os dois genes previstos seguintes:

[000606] ST454contig00831_AUGUSTUS_gene_3318:6018 (847 letras)

[000607] ref |XP_386347.1 | proteína hipotética FG06171.1 [Gibbere- lla 660x0.0 gb|EAW12630.1| proteína de domínio DUF500 [Aspergillus NRRL 1]; 253 x 9e-66, e ST454contig00831_AUGUSTUS_ge ne_3958:4728 (183 letras); e

[000608] gb|EAW13545.1| 2,3-cíclico-nucleotídeo 2-fosfodiesterase [Aspergillus 32 x 2.4 Cepa Mutante Variante de N. lolii Irradiada com Raios X 7_47:

[000609] Para a cepa mutante variante de N. lolii irradiada com raios X 7_47, as seguintes sequências deletadas em ST454Contig01082, ST454Contig01131 e ST454Contig02985, com estas regiões de sequência do genoma não contendo genes previstos:

[000610] Query= ST454contig01082 length=9120 numreads=287

[000611] gb|AAA21442.1 | putative pol polyprotein [Magnaporthe grisea] 145 1e-32

[000612] Query= ST454contig02985 length=2414 numreads=99

[000613] gb|AAA21442.1 | putative pol polyprotein [Magnaporthe grisea] 92 2e-17 Índice de mutagênese de cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X

[000614] A Figura 116 mostra SNPs e Indels por Mb em regiões gê- nicas de cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X derivadas a partir de irradiação de raios X de N. lolii em diferentes níveis de irradiação. A cepa 1_35 tem uma deleção de 3,6 kb; A cepa 7_47 tem 3 deleções (4,2 kb, 1 kb, 0,6 kb de extensão). A cepa 124_6 tem uma duplicação parcial. As cepas 139_6 e 145_15 têm duplicações parciais.

[000615] Dado que o endófita ST tem aproximadamente 443,5 genes por Mb, usando tratamento com 10Gy*2, a taxa esperada de ocorrência de SNP/INDEL é de 0,33 por gene no genoma.

Sumário

[000616] Cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X foram analisadas para muitos tipos de variação de sequência do genoma isto é, deleções, SNPs, INDELs, inversões e translocações. SNPs, INDELs, deleções e duplicações foramo identifi- cdas nas sequências de pesquisa de genoma de cepas mutantes de deleção variantes de N. lolii irradiadas com raios X. Houve um pico aparente no número de SNPs e INDELs em cepas mutantes de dele- ção variantes de N. lolii irradiadas com raios X recuperadas a partir da administração de tratamento com irradiação de raios X de 10Gy*2 ao endófita de N. lolii ST. A cepa mutante de deleção variante de N. lolii irradiada com raios X 7_47 teve 3 grandes deleções. Foi demonstrado que este método de mutagênese à base de irradiação de raios X pode ser usado para criar novas cepas de endófitas de Neotyphodium do inventor, e ativadas: • foram triadas 5.000 cepas de endófitas variantes de N. lolii irradiadas com raios X derivadas a partir de irradiação com raios X de endófita de N. lolii ST; • foram identificadas 140 cepas mutantes endófitas variantes de N. lolii irradiadas com raios X putativas; • 9 cepas mutantes endófitas variantes de N. lolii irradia das com raios X foram submetidas a bioensaios anti-fúngicos; • 9 cepas mutantes endófitas variantes de N. lolii irradia das com raios X foram submetidas a testes de crescimento in vitro; • 9 cepas mutantes endófitas variantes de N. lolii irradia das com raios X foram submetidas a sequenciamento de pesquisa de genoma; • foram identificadas 2 cepas mutantes endófitas variantes de N. lolii irradiadas com raios X com deleções de gene (1_35 e 7_47); e • foram identificadas 3 cepas mutantes endófitas varian tes de N. lolii irradiadas com raios X com duplicações de gene (124_6, 139_6 e 145_15). Inoculação isogênica em planta em azevém perene com cepas mutantes endófitas variantes de N. lolii irradiadas com raios X

Tabela 50: Inoculação isogênica de genótipos de azevém perene (IMP04 e TOL03) com cepas mutantes endófitas variantes de N. lolii irradiadas com raios X. Os números indicam o número de plantas de azevém perene dos dois genótipos submetidos a inoculação isogênica com as diferentes cepas mutantes endófitas variantes de N. lolii irradiadas com raios X (isto é, ST-IRM 139-6, ST-IRM 145-15, ST-IRM 144-16, ST-IRM 1-35 e ST-IRM 7-47) e cepa de endófita de controle ST. Perfil metabólico de cepas de endófitas variantes de Neotypho- dium NEA12dh derivadas por tratamento com colchicina e derivadas por tratamento com irradiação de raios X

[000617] Resultados do perfil metabólico de cepas variantes de en- dófita NEA12dh derivadas por tratamento com colchicina são mostrados na Figura 117.

[000618] Resultados do perfil metabólico de cepas variantes de en- dófita de N. lolii ST derivadas por tratamento com irradiação de raios X são mostrados na Figura 118.

[000619] Os endófitas que se seguem foram cultivados sobre PDB por 3 semanas: • Cepa de endófita de controle de N. lolii ST • Cepa variante de endófita ST N. lolii derivada por trata-mento com irradiação de raios X 4-7 • Cepa variante de endófita ST N. lolii derivada por trata-mento com irradiação de raios X 139-6 • Cepa variante de endófita ST N. lolii derivada por trata-mento com irradiação de raios X 144-16 • Cepa variante de endófita ST N. lolii derivada por trata-mento com irradiação de raios X 145-15 e submetidoa a perfil metabólico usando LCMS em correspondente 1. Filtrado líquido 2. Extrato micelial

[000620] As cepas variantes de endófita ST N. lolii derivadas por tratamento com irradiação de raios X podem ser prontamente diferenciadas da cepa de controle N. lolii ST usando extratos de micélios ou filtrados isolados.

Exemplo 16 - Método para Produção em Larga Escala de Simbiota de Gramínea-Endófita (sementes artificiais)

[000621] O objetivo do trabalho foi desenvolver um método eficiente, robusto e de baixo custo para produção em larga escala de simbiota de gramínea endófita. O método deve ser: a) aplicável à inoculação de 10s a 100s de endófita em 100s a 1000s de genótipos de gramínea; b) aplicável a azevém perene, festuca alta e Brachiaria; e c) aplicável à inoculação de endófitas novos e do inventor com variação genética gerada de novo [isto é, mutagênese induzida (radiação ionizante, colchicina), mutagênese direcionada, transgênese, cisgênese, intragênese, etc.].

[000622] O método deve adicionalmente possibilitar a reprodução molecular, a seleção e a avaliação de simbiota de gramínea-endófita da geração seguinte desde o início [ao invés de reprodução e seleção de hospedeiro de gramínea seguidas por inoculação de endófita e avaliação de simbiota somente].

[000623] As estratégias experimentais - e etapas experimentais cor-respondentes - implementadas incluem: 1. Isolamento de embriões derivados de sementes de azevém perene em larga escala e produção de sementes artificiais A. Desenvolvimento de um método de esterilização superficial das sementes em larga escala, eficiente e de baixo custo; B. Desenvolvimento de um método de isolamento de embriões derivado de sementes em larga escala, eficiente e de baixo custo; C. Desenvolvimento de um método de produção de sementes artificiais em larga escala, eficiente e de baixo custo; D. Teste de frequência de germinação e estágios de ger-minação de sementes artificiais; E. Avaliação da presença de endófita em plântulas derivadas de sementes artificiais geradas com embriões isolados de sementes endófita-mais; 2. Inoculação de endófita em larga escala em sementes artificiais de azevém perene F. Desenvolvimento de um método de inoculação de endó- fita em larga escala, eficiente e de baixo custo, para sementes artificiais [com base em inoculação de embriões derivados de semente com micélio de endófita seguida por produção de sementes artificiais incluindo duplo/múltiplo revestimento (camada interna mais camada externa de endófita como 'pseudo-aleurona/endosperma) de sementes artificiais]; e E. Avaliação da presença de endófita em plântulas derivadas de sementes artificiais geradas com embriões isolados a partir de se- mentes endófita-menos inoculadas com novos endófitas. Isolamento de Embriões Derivados de Sementes de Azevém Perene em Larga Escala e Produção de Sementes Artificiais

[000624] Método de Esterilização Superficial das Sementes

[000625] O método de esterilização superficial das sementes implementado inclui as seguintes etapas:

[000626] Dia 1 : as sementes foram encharcadas em 10% de ácido sulfúrico O/N

[000627] Dia 2: tratadas com 10% de Domestos por 20 min e arma-zenadas a 24°C depois de lavagem com água destilada estéril

[000628] Dia 3: tratadas com 10% de Domestos por 20 min e arma-zenadas a 24°C depois de lavagem com água destilada estéril, seguida por isolamento de embriões [vide B) abaixo].

[000629] Foram conduzidos quatro experimentos independentes com 200 sementes cada um.

[000630] Não foi observada contaminação bacteriana ou fúngica.

Método de Isolamento de Embriões

[000631] Com base no sucesso do método de esterilização de semente [vide A) acima], 1,000 embriões derivados de sementes de azevém podem ser isolados por uma pessoa dentro de 4 horas.

Método de Produção de Sementes Artificiais

[000632] Revestimento com Alginato de Cálcio de Embriões de Azevém Perene em Sementes Artificiais

[000633] Revestimento com matriz de alginato de cálcio sem nu-trientes adicionados

[000634] Para o revestimento com alginato de cálcio de embriões de azevém perene em sementes artificiais usando um revestimento com matriz de alginato de cálcio sem nutrientes adicionados, foram em-preendidas as etapas que se seguem: • Os embriões foram recém isolados e misturados com solução a 3% de alginato de sódio • Gotas de alginato foram colocadas em 50 mM de solução de cloreto de cálcio enquanto agitando a 60 rpm. Cada gota contém um embrião. • Sementes artificiais foram coletadas depois de 15 min de agitação e lavadas com suficiente água destilada estéril

[000635] Sementes artificiais foram colocadas sobre meio de germinação MS ou MS + 1 mg/L de BAP.

[000636] A Figura 119 mostra sementes artificiais genadas através de revestimento com alginato de cálcio de embriões de azevém perene usando um revestimento com matriz de alginato de cálcio sem nutrientes adicionados. Revestimento com matriz de alginato de cálcio com nutrientes adicionados

[000637] Para o revestimento com alginato de cálcio de embriões de azevém perene em sementes artificiais usando um revestimento com matriz de alginato de cálcio com nutrientes adicionados, foram realizadas as seguintes etapas: • Os embriões foram recém isolados e misturados com solução a 3% de alginato de sódio em meio MS modificado consistindo em MS (sem CaCl2) + 750 mg/L de glutamina + 5 μM de CuSO 4 + 1,95 g/L de MES • Gotas de alginato (contendo embriões individuais) foram colocadas em 50 mM de solução de cloreto de cálcio enquanto agitando a 60 rpm. • Cada gota contém um único embrião isolado derivado de semente. • Sementes artificiais foram coletadas depois de 15 min de agitação e lavadas meticulosamente com meio de água destilada estéril • Sementes artificiais foram colocadas sobre placas de meio MS para germinação.

Revestimento com matriz de alginato de cálcio colorida

[000638] Para o revestimento com alginato de cálcio de embriões de azevém perene em sementes artificiais usando um revestimento com matriz de alginato de cálcio colorida com nutrientes adicionados, foram realizadas as seguintes etapas:

[000639] Os embriões foram recém isolados e misturados com com 3% de alginato de sódio em meio MS modificado consistindo em MS (sem CaCI2) + 750 mg/L de glutamina + 5 μM de CuSO4 + 1,95 g/L de MES

[000640] Diferentes corantes alimentares [isto é, 10 μL/mL de Queen Green (90610) ou Queen Pink (92330)] foram adicionados à solução de revestimento de alginato de sódio para colorir a matriz de revestimento deste modo estabelecendo base para demonstrar potencial para revestimento multi-camada.

[000641] Gotas de alginato (contendo embriões individuais) foram colocadas em 50 mM de solução de cloreto de cálcio enquanto agitando a 60 rpm.

[000642] Cada gota contém um único embrião isolado derivado de semente.

[000643] Sementes artificiais foram coletadas depois de 15 min de agitação e lavadas meticulosamente com meio de água destilada estéril.

[000644] Sementes artificiais foram colocadas sobre placas de meio MS para germinação.

[000645] A Figura 120 mostra revestimento com alginato de cálcio de embriões de azevém perene em sementes artificiais usando revestimento com matriz de alginato de cálcio colorida.

Iv) Revestimento com com múltiplas camadas de matrizes de al- ginato de cálcio

[000646] Para o revestimento com alginato de cálcio de embriões de azevém perene em sementes artificiais usando um revestimento com múltiplas camadas de matrizes de alginato de cálcio, foram realizadas as seguintes etapas: • Os embriões foram recém-isolados e misturados com 3% de alginato de sódio em meio MS modificado [consistindo em MS (sem CaCh) + 750 mg/L de glutamina + 5 μM de CuSO 4 + 1,95 g/L de MES] como a primeira camada de revestimento (camada A) para produzir sementes artificiais. • Gotas de alginato (contendo embriões individuais) foram colocadas em 50 mM de solução de cloreto de cálcio enquanto agitando a 60 rpm. Cada gota contém um único embrião isolado derivado de semente. • Sementes artificiais revestidas com a camada A foram coletadas depois de 15 min de agitação e lavadas meticulosamente com meio de água destilada estéril. O diâmetro médio da semente artificial recém-revestida com a camada A é de 4 mm. Sementes artificiais revestidas com a camada A foram colocadas em placa de Petri e deixadas para secar ao ar por 1 a duas horas em um gabinete de fluxo laminar. O diâmetro da semente artificial secada ao ar revestida com a camada A é de 2 mm. • Sementes artificiais secadas ao ar revestidas com a ca-mada A foram misturadas com 3% de alginato de sódio em meio MS modificado [consistindo em MS (sem CaCI2) + 750 mg/L de glutamina + 5 μM de CuSO4 + 1,95 g/L de MES] colorido com corante alimentar [isto é, 10 μL/mL de Queen Green (90610)] como a segunda camada de revestimento (camada B) para produzir sementes artificiais duplamente revestidas; seguindo o mesmo procedimento.

[000647] A Figura 121 mostra revestimento com alginato de cálcio de embriões de azevém perene em sementes artificiais usando revestimento com múltiplas camadas de matrizes de alginato de cálcio.

[000648] A Figura 122 mostra revestimento com alginato de cálcio de embriões de azevém perene em sementes artificiais usando revestimento com múltiplas camadas de matrizes de alginato de cálcio. Embriões de azevém perene derivados de semente recém isolados são colocados individualmente em cavidades de a) placas de 96 cavidades ou b) de 384 cavidades. Com o auxílio de uma seringa descartável, solução de alginato de sódio é adicionada às cavidades individuais e embriões únicos em soluções de alginato são carregados na seringa. Com o auxílio da seringa, embriões individuais revestidos com solução de alginato são gotejados em solução de CaCI2 polimerizante sob agitação para produção de sementes artificiais. O uso de placas de 96 cavidades é preferencial em relação à placa de 384 cavidades para produção de sementes artificiais de azevém perene.

Avaliação da Frequência de Germinação de Sementes Artificiais

[000649] De modo a avaliar a frequência de germinação de sementes artificiais, foram realizadas as seguintes etapas: Germinação de sementes, embriões e sementes artificiais de azevém perene cv. Bronsyn E- (livre de endófita, lote de sementes 2668)

[000650] A frequência de germinação de semente foi avaliada com-parativamente para (Figura 123): a. Sementes originais:1% de frequência de germinação sobre papel filtro b. Sementes esterilizadas superficialmente: 10% de frequência de germinação sobre papel filtro c. Embriões isolados: 48% de frequência de germinação sobre meio de germinação d. Sementes artificiais (com meio de germinação): 40% de frequência de germinação sobre meio MS Germinação de sementes, embriões e sementes artificiais de azevém perene cv. Bronsyn E+ (endófita plus, lote de sementes 2667)

[000651] A frequência de germinação de semente foi avaliada com-parativamente para (Figura 124): a) Sementes originais: 10% de frequência de germinação sobre papel filtro b) Sementes esterilizadas superficialmente: 30% de fre-quência de germinação sobre papel filtro c) Embriões isolados: 90% de frequência de germinação sobre meio de germinação d) Sementes artificiais (com meio de germinação): 81% de frequência de germinação sobre meio MS

[000652] A Figura 125 mostra a germinação de sementes artificiais e desenvolvimento de plântulas derivadas de sementes artificiais em azevém perene. Avaliação da Presença de Endófitas em Mudas Derivadas de Se-mentes Artificiais

[000653] De modo a avaliar a presença de endófita em plântulas derivadas de sementes artificiais, foram realizados os seguintes experimentos: Presença de endófita em plântulas derivadas de sementes e sementes artificiais de semente de azevém perene cv. Bronsyn E+ (endófita plus, lote de sementes 2667)

[000654] Vinte plântulas de sementes Bronsyn E+ (2667) germinadas sobre papel filtro foram transferidas para o solo.

[000655] Vinte e cinco plântulas de sementes artificiais germinadas geradas com embriões derivados de sementes Bronsyn E plus (2667) foram transferidas para o solo. Os embriões em sementes artificiais foram esterilizados usando tratamento durante a noite com 10% de H2SO4.

[000656] Depois de 6 semanas de crescimento de plântulas deriva- das de sementes e sementes artificiais, a presença de endófita foi ava-liada com base em teste de SSR endófita-específico.

[000657] Vinte plântulas de sementes Bronsyn E plus (2667; contendo endófita ST) germinadas sobre papel filtro foram transferidas para o solo, levando a 13 de 19 plântulas (68%) testando positivas para presença de endófita ST no teste de SSR endófita-específico.

[000658] Vinte e cinco plântulas de sementes artificiais germinadas geradas com embriões derivados de sementes Bronsyn E plus (2667) foram transferidas para o solo. Os embriões em sementes artificiais foram esterilizados usando tratamento durante a noite com 10% de H2SO4, levando a 19 de 23 plântulas (83%) testando positivas para endófita ST no teste de SSR endófita-específico, nitidamente indicando que os métodos para esterilização superficial das sementes, isolamento de embriões em larga escala, e produção de sementes artificiais com revestimento de alginato de cálcio não afetam negativamente a viabilidade de um endófita residente. Inoculação em Larga Escala de Endófitas em Sementes Artificiais de Azevém Perene

[000659] Foram desenvolvidos diferentes métodos para a inoculação em larga escala de endófitas em sementes artificiais de azevém perene, com exemplos dos métodos 1 a 3 descritos abaixo: Inoculação de Embrióes derivados de Sementes Isolados com Micélio de Endófita e Produção de Sementes Artificiais Infectadas com Endófita em Azevém Perene

[000660] Embriões de azevém perene derivados de sementes recém isolados são colocados individualmente em cavidades de a) placa de 96 cavidades e b) suspensão de micélios de endófita adicionada a cavidades individuais e deixada para secar ao ar parcialmente sob fluxo laminar antes de c) produção de sementes artificiais revestidas com camada de alginato de cálcio (Figura 26).

Método 1: Inoculação Direta de Embriões Isolados com Suspensão de Endófita Antes de Revestimento com Alginato de Ca

[000661] Método 1, a inoculação de embriões derivados de sementes isolados com micélio de endófita e produção de sementes artificiais infectadas com endófita em azevém perene, é baseada em inoculação direta de embriões isolados com suspensão de endófita antes de re-vestimento com alginato de cálcio como se segue:

[000662] Embriões recém isolados de azevém perene são incubados com suspensão de endófita (diluição de 1/16) por 30 minutos em temperatura ambiente em cavidades individuais de placas de 96 cavidades.

[000663] A suspensão de inoculação é removida da cavidade e os embriões inoculados são deixados para secar ao ar parcialmente sobre discos de papel filtro.

[000664] Sementes artificiais são produzidas (Figura 127) com embriões inoculados com endófita com meio de crescimento MS modificado [MS (sem CaCh) + 750 mg/L de glutamina + 5 μM de CuSO4 + 1,95 g de MES+ 1 mg/l de BAP] contendo alginato de sódio a 3%.

[000665] Sementes artificiais são deixadas para germinar sobre meio MS para germinação.

[000666] Embriões recém isolados de azevém perene são diretamente inoculados com suspensão de endófita (diluição a 1/8), secados ao ar parcialmente e em seguida revestidos com alginato de cálcio em cavidades individuais de placas de 96 cavidades.

[000667] Sementes artificiais de azevém perene diretamente inoculadas com endófita e em seguida revestidas com camada de alginato de cálcio são capazes de germinar sobre meio de germinação MS (Figura 128).

Método 2: Revestimento Direto de Embriões Isolados com Algi- nato de Ca Contendo Endófita

[000668] Método 2, a inoculação de embriões derivados de sementes isolados com micélio de endófita e produção de sementes artificiais infectadas com endófita em azevém perene, é baseada em revestimento direto de embriões isolados com camada de alginato de cálcio contendo endófita como se segue:

[000669] Embriões de azevém perene são recém isolados em suspensão de endófita (diluição a 1/16) em cavidades individuais de placas de 96 cavidades.

[000670] Meio MS modificado [MS (sem CaCI2) + 750 mg/L de glu- tamina + 5 μM de CuSO4 + 1,95 g de MES + 1 mg/l de BAP] com algi- nato de sódio em dupla concentração (6%) é adicionado às cavidades individuais para revestir os embriões com uma camada de alginato contendo endófita. Sementes artificiais são produzidas com embriões revestidos com camada de endófita (Figura 129). Sementes artificiais são deixadas para germinar sobre meio MS para germinação

[000671] Embriões de azevém perene são recém isolados e revestidos com suspensão de endófita (diluições a 1/8 ou a 1/16) com algi- nato de cálcio e em seguida adicionados para produzir uma camada de alginato contendo endófita revestindo os embriões em cavidades individuais de placas de 96 cavidades.

[000672] Depois de cultura, o desenvolvimento de endófita é observado a partir da camada de alginato contendo endófita usada para revestir os embriões isolados de azevém perene (independente da taxa de diluição da suspensão de endófita usada; Figura 130) demonstrando a viabilidade do endófita incluído na camada de revestimento de alginato de cálcio.

Método 3: Duplo Revestimento de Sementes Artificiais Geradas a partir de Embriões Isolados Inoculados com Endófita

[000673] Método 3, a inoculação de embriões derivados de sementes isolados com micélio de endófita e produção de sementes artificiais infectadas com endófita em azevém perene, é baseada em duplo re-vestimento de sementes artificiais geradas a partir de embriões isolados inoculados com endófita como se segue:

[000674] Embriões de azevém perene recém isolados são revestidos com uma suspensão de endófita (diluição a 1/16), misturada com al- ginato [6% de alginato de cálcio em meio MS modificado (sem CaCI2) + 750 mg/L de glutamina + 5 μM de CuSO4 + 1,95 g de MES+ 1 mg/l de BAP] para produzir uma primeira camada de revestimento contendo endófitas em cavidades individuais de placas de 96 cavidades.

[000675] Sementes artificiais com uma primeira camada de alginato contendo endófita revestindo embriões recém isolados de azevém perene são secadas por absorção sobre papel filtro em fluxo de ar laminar por 30 minutos e em seguida revestidas com uma segunda camada de alginato de 3% de alginato de cálcio sem quaisquer nutrientes.

[000676] Sementes artificiais duplamente revestidas com embriões de azevém perene revestidos com camada contendo endófita são em seguida germinadas sobre meio MS

[000677] O segundo revestimento com meio privado de nutrientes de sementes artificiais inoculadas com endófita tem o objetivo de reduzir o desenvolvimento de endófita durante a germinação e restringir o crescimento de endófita em íntima proximidade com o embrião de azevém perene isolado (Figura 131).

[000678] Sementes artificiais com uma primeira camada de alginato contendo endófita revestindo embriões recém isolados de azevém perene são secadas por absorção sobre papel filtro em fluxo de ar laminar por 30 minutos e em seguida revestidas com uma segunda camada de alginato de 3% de alginato de cálcio sem quaisquer nutrientes.

[000679] O crescimento de endófita é restringido principalmente para a camada interna de revestimento de alginato por um período de até 3 semanas (Figura 132). /

[000680] Embriões de azevém perene são recém isolados diretamente em suspensão de endófita (diluição a 1/8), e em seguida secados ao ar parcialmente e revestidos com uma primeira camada de al- ginato [3% de alginato de cálcio em meio MS modificado (sem CaCI2) + 750 mg/L de glutamina + 5 μM de CuSO4 + 1,95 g de MES+ 1 mg/l de BAP] em cavidades individuais de placas de 96 cavidades.

[000681] Sementes artificiais com embriões de azevém perene inoculados com endófita diretamente são armazenadas a 4 C durante a noite e em seguida revestidas com uma segunda camada de alginato de 3% de alginato de cálcio sem quaisquer nutrientes.

[000682] Sementes artificiais duplamente revestidas com embriões de azevém perene inoculados com endófita diretamente são em seguida germinadas sobre meio MS.

[000683] Sementes artificiais duplamente revestidas com embriões de azevém perene inoculados com endófita diretamente germinadas sobre meio MS apresentam taxas de germinação comparáveis ao lote de sementes original usado para isolamento de embriões (Figura 133). Avaliação da Presença de Endófitas em Mudas Derivadas de Se-mentes Artificiais com Embriões Derivados de Sementes Inoculados com Novos Endófitas

[000684] De modo a avaliar a presença de endófita em plântulas derivadas a partir de sementes artificiais com embriões derivados de sementes inoculados com novos endófitas (por exemplo, NEA11) usando o Método 1, foi realizado o seguinte experimento: Presença de endófita em plântulas derivadas de sementes artificiais produzidas com embriões de semente de azevém perene cv. Bronsyh E- (endófita minus, lote de sementes 2668) inoculados com novo endófita NEA11

[000685] Depois de 6 semanas de crescimento de plântulas derivdas de sementes artificiais, a presença de endófita foi avaliada com base em teste de SSR endófita-específico.

[000686] Vinte e três mudas de sementes artificiais germinadas geradas com embriões derivados de sementes Bronsyn E minus (2668) inoculados com NEA11 usando o Método 1 foram transferidas para o solo. 6 de 23 plântulas (isto é, 26%) testaram positivas para presença do endófita NEA11 no teste de SSR endófita-específico demonstrando o estabelecimento de simbiota (Tabela 51). A presença de endófita em simbiota estabelecido a partir de sementes artificiais germinadas geradas com embriões derivados de sementes de azevém perene inoculados com novo endófita NEA11 usando o Método 1 foi confirmada depois de 3 meses depois de transferência para o solo. Marcador de SSR

Tabela 51 - Avaliação da Presença de Endófitas em Mudas Derivadas de Sementes Artificiais com Embriões Derivados de Sementes Inoculados com Novos Endófitas

[000687] Inoculação em Larga Escala de Endófitas do Inventor em Sementes Artificiais de Azevém Perene

[000688] Inoculação em larga escala de endófitas do inventor derivados a partir de mutagênese induzida através de tratamento com colchicina (por exemplo, NEA12dh17) ou derivados a partir de muta- gênese de raios X (por exemplo, IRM1-35) em sementes artificiais de azevém perene é realizada usando os métodos 1 a 3 descritos acima.

[000689] Embriões recém isolados de azevém perene são incubados com suspensão de endófita do inventor (por exemplo, NEA12dh17, IRM1-35) (diluição a 1/16) por 30 minutos em temperatura ambiente em cavidades individuais de placas de 96 cavidades.

[000690] A suspensão de inoculação é removida da cavidade e os embriões inoculados são deixados para secar ao ar parcialmente sobre discos de papel filtro.

[000691] Sementes artificiais são produzidas com embriões inoculados com endófita do inventor com meio de crescimento MS modificado [MS (sem CaCh) + 750 mg/L de glutamina + 5 μM de CuSO4 + 1,95 g de MES+ 1 mg/l de BAP] contendo 3% de alginato de sódio.

[000692] Sementes artificiais são deixadas para germinar sobre meio MS para germinação.

[000693] Embriões recém isolados de azevém perene são diretamente inoculados com suspensão de endófita do inventor (por exemplo, NEA12dh17, IRM1-35) (diluição a 1/8), secados ao ar parcialmente e em seguida revestidos com alginato de cálcio em cavidades individuais de placas de 96 cavidades.

[000694] Sementes artificiais de azevém perene inoculadas diretamente com endófitas do inventor (por exemplo, NEA12dh17, IRM1-35) e em seguida revestidas com camada de alginato de cálcio são capazes de germinar sobre meio de germinação MS levando ao estabelecimento de simbiota. A presença e a identidade de endófitas do inventor no simbiota gerado depois de inoculação em larga escala de endó- fitas do inventor inventor derivados a partir de mutagênese induzida através de tratamento com colchicina (por exemplo, NEA12dh17) ou derivados a partir mutagênese de raios X (por exemplo, IRM1-35) em sementes artificiais de azevém perene é demonstrada usando um teste de SSR endófita-específico. Inoculação em Larga Escala de Endófitas Transgênicos em Sementes Artificiais de Azevém Perene

[000695] A inoculação em larga escala de endófitas transgênicos de-rivados a partir de transformação genética de endófita NEA12 com plasmídeo contendo um gene quimérico para expressão do gene marcador fluorescente DsRed (por exemplo, NEA12-DsRed) em sementes artificiais de azevém perene é realizada usando o método 1 descrito acima.

[000696] Embriões de azevém perene recém isolados são incubados com suspensão de endófita transgênico (por exemplo, NEA12-DsRed) (diluição a 1/16) por 30 minutos em temperatura ambiente em cavidades individuais de placas de 96 cavidades.

[000697] A suspensão de inoculação é removida da cavidade e os embriões inoculados são deixados para secar ao ar parcialmente sobre discos de papel filtro.

[000698] Sementes artificiais são produzidas com embriões inoculados com endófita transgênico com meio de crescimento MS modificado [MS (sem CaCh) + 750 mg/L de glutamina + 5 μM de CuSO4 + 1,95 g de MES+ 1 mg/l de BAP] contendo 3% de alginato de sódio.

[000699] Sementes artificiais são deixadas para germinar sobre meio MS para germinação.

[000700] Embriões de azevém perene recém isolados são inoculados diretamente com suspensão de endófita transgênico (por exemplo, NEA12-DsRed) (diluição a 1/8), secados ao ar parcialmente e em seguida revestidos com alginato de cálcio em cavidades individuais de placas de 96 cavidades.

[000701] Sementes artificiais de azevém perene inoculadas diretamente com endófita transgênico (por exemplo, NEA12-DsRed) e em se- guida revestidas com camada de alginato de cálcio são capazes de ger-minar sobre meio de germinação MS levando ao estabelecimento de simbiota com endófitas transgênicos. A presença e identidade de endófi- tas transgênicos no simbiota gerado depois de inoculação em larga escala de endófita transgênico (por exemplo, NEA 2-DsRed) em sementes artificiais de azevém perene é demonstrada usando um teste de SSR endófita-específico e um teste de PCR transgene-específico. Inoculação em Larga Escala de Novos Endófitas em Sementes Artificiais de Festuca Alta

[000702] A inoculação em larga escala de novos endófitas de festuca alta (por exemplo, NEA17, NEA19, NEA20) em sementes artificiais de festuca alta é realizada usando o método 1 descrito acima. Embriões recém isolados de festuca alta são incubados com suspensão de novos endófitas de festuca (por exemplo, NEA17, NEA19, NEA20) (diluição a 1/16) por 30 minutos em temperatura ambiente em cavidades individuais de placas de 96 cavidades.

[000703] A suspensão de inoculação é removida da cavidade e os embriões inoculados são deixados para secar ao ar parcialmente sobre discos de papel filtro.

[000704] Sementes artificiais são produzidas com embriões inoculados com novo endófita com meio de crescimento MS modificado [MS (sem CaCb) + 750 mg/L de glutamina + 5 μM de CuSO 4 + 1,95 g de MES+ 1 mg/l de BAP] contendo 3% de alginato de sódio.

[000705] Sementes artificiais são deixadas para germinar sobre meio MS para germinação.

[000706] Embriões recém isolados de festuca alta são diretamente inoculados com suspensão de novos endófitas de festuca (por exemplo, NEA17, NEA19, NEA20) (diluição a 1/8), secados ao ar parcialmente e em seguida revestidos com alginato de cálcio em cavidades individuais de placas de 96 cavidades.

[000707] Sementes artificiais de festuca alta diretamente inoculadas com novos endófitas de festuca (por exemplo, NEA17, NEA19, NEA20) e em seguida revestidas com camada de alginato de cálcio são capazes de germinar sobre meio de germinação MS levando ao estabelecimento de simbiota. A presença e a identidade de novos en- dófitas no simbiota gerado depois de inoculação em larga escala de novos endófitas de festuca (por exemplo, NEA17, NEA19, NEA20) em sementes artificiais de festuca alta são demonstradas usando um teste de SSR endófita-específico.

Exemplo 17 - Método para Seleção de Simbiota Estável Estabilidade Geracional e Viabilidade de Endófitas de Azevém Perene

[000708] A experiência dentro da indústria de suprimentos genéticos de forragem (empresas comerciais de reprodução de sementes de plantas de pastagens orientadas tecnicamente) tem criado uma série de requisitos para estabilidade da presença de endófitas em colheitas de gramínea cultivadas a partir de lotes de sementes certificados. Em termos de estabilidade inter-geracional (isto é, a presença de endófita em um lote de sementes de uma geração de multiplicação varietal comparada com a geração de sua prole), o nível máximo de perda que pode ser gerado é de 5%, mas idealmente não mais de 2 a 3% de perda por geração. Além disso, devido aos requisitos para armazenamento em entreposto de lotes de sementes em larga escala, o endófita deve ser estável e viável (permitindo recolonização da muda germinada) em semente por no mínimo 3 anos depois da colheita.

[000709] Estratégias experimentais que podem ser aplicadas para identificar e preverf a estabilidade e a viabilidade intergeneracionais incluem: • O uso de tecnologia de marcador genético molecular, tais como testes de repetição de sequência simples (SSR) específica de endófita, para identificar a presença ou a ausência de endófita com base em um teste de PCR diagnóstico (presença versus ausência, e tamanho característico do produto de PCR gerado). Este teste é adequado para rastrear alterações na estabilidade em populações de plantas de sucessivas populações. No entanto, não confirma a viabilidade em semente. • PCR quantitativo (qPCR) é um método para detecção de expressão genética endófita-específica, e portanto é adequado para confirmação retrospectiva da viabilidade do endófita em semente, dada a germinação das plântulas.

[000710] Envelhecimento acelerado (AA) é um método artificial, baseado na aplicação de condições específicas de temperatura e umidade relativa (RH) (Gundel et at., 2009), que pode simular os efeitos de armazenamento de tempo mais longo sobre a viabilidade do endó- fita durante um curto período de tempo (Happ et al., 1993). Portanto os testes de envelhecimento acelerado são adequados para diferenciar a qualidade das sementes entre lotes de sementes de azevém perene aceitáveis comercialmente (Wang ef al., 2004) de modo a proporcionar um teste preditivo dentro de um frame de tempo adequado para decisões comerciais.

[000711] O objetivo do estudo em questão foi portanto desenvolver um método de envelhecimento acelerado para semente de simbiota de gramínea-endófita, o qual pode ser aplicado para classificação do mérito de endófitas com base em sua viabilidade prevista em semente armazenada. O método também é aplicável para seleção de simbiota estável com endófitas viáveis de longo termo para implantação como uma ferramenta em reprodução molecular da geração seguinte desde o início, seleção e avaliação de simbiota de gramínea-endófita [ao invés de reprodução e seleção de gramínea hospedeiro seguidas por inoculação de endófita e avaliação de symbiotum somente]. O método é aplicável a simbiota tanto de azevém perene quanto de festuca alta [diferentes panos de fundos genéticos de hospedeiro; diferentes endó- fitas].

[000712] O método de envelhecimento acelerado foi desenvolvido usando uma gama de níveis de umidade e tempos de tratamento de envelhecimento acelerado seguidos por diferentes tempos de arma-zenamento e condições (resumidos na Tabela 52), conforme aplicado a uma série de novas associações de endófita-gramínea (diferentes endófitas isto é, ST, AR1, NEA3, NEA2, NEA6 e AR37; Tabela 52) em um único pano de fundo genético (isto é, cv. Bronsyn).

Tabela 52 - Condições para envelhecimento acelerado

[000713] A Figura 134 mostra um esquema do processo de envelhe-cimento acelerado (AA). Em resumo: • Depois do tratamento: • 400 sementes (100 por replicação) por tratamento foram germinadas sem armazenamento • 400 sementes (100 por replicação) por tratamento foram colocadas em armazenamento • Depois de 14 dias de germinação, as plântulas foram contadas e a taxa de germinação foi registrada

[000714] As mudas foram cultivadas por 8 semanas antes de avaliar a presença de endófita

Tabela 53 - Cepas de endófitas inoculadas em sub-populações (não-isogênicas) de azevém perene cv. Bronsyn E = Ergovalina; L = Lolitrem B; P = Peramina

[000715] A Figura 135 mostra os resultados da taxa de germinação de sementes de azevém perene cv. Bronsyn contendo diferentes en- dófitas depois de tratamento de envelhecimento acelerado das sementes seguido por armazenamento das sementes.

[000716] Estes resultados indicaram que: • Não houve nenhum efeito da presença de endófita sobre a viabilidade das sementes de symbiotum [vide o tratamento de controle, sem envelhecimento acelerado (AA)] • Envelhecimento acelerado em alta umidade [isto é, 80% de de umidade relativa] e armazenamento em alta temperatura [isto é, 40°C] tem o maior impacto sobre a germinação [isto é, perda de germinação em 24 meses em armazenamento].

[000717] A Figura 136 mostra os dados correspondentes sobre a vi-abilidade do endófita em semente de azevém perene cv. Bronsyn com diferentes endófitas depois de tratamento de envelhecimento acelerado das sementes seguido por armazenamento das sementes.

[000718] Estes resultados indicaram que: • Envelhecimento acelerado [isto é, 80% de umidade relativa por 7 dias] é altamente informativo para previsão da viabilidade do endófita em sementes armazenadas • A viabilidade do endófita declina ligeiramente durante armazenamento por tempo médio [isto é, 14 meses] em temperatura ambiente • Armazenamento de semente em alta temperatura [isto é, 40°C] leva a um rápido declínio na viabilidade do endófita • A viabilidade dos novos endófitas NEA3, NEA2 e NEA6 é menor do que para ST, AR1 e AR37

[000719] O estudo foi em seguida estendido para avaliar a aplicabilidade do método de envelhecimento acelerado (AA) para previsão da viabilidade do endófita em semente armazenada para diferentes endó- fitas (isto é, ST, NEA10, NEA11, NEA12, E1 e AR1) em diferentes panos de fundos genéticos de hospedeiro (isto é, cvs. Bronsyn, Alto, Trojan e Bealey) (Tabela 54, Tabela 55).

Tabela 54 - Cepas de endófitas e cultivares de hospedeiros para en-velhecimento acelerado

Tabela 55 - Variações na condição para envelhecimento acelerado

[000720] A Figura 137 mostra as taxas de germinação de sementes de simbiota representando diferentes endófitas em diferentes panos de fundo genéticos de hospedeiros depois de tratamento de envelhecimento acelerado das sementes.

[000721] A Figura 138 mostra os valores de viabilidade de endófitas para diferentes endófitas em diferentes panos de fundo genéticos de hospedeiros depois de tratamento de envelhecimento acelerado das sementes.

[000722] Estes resultados indicaram que: • O tratamento de envelhecimento acelerado tem um alto impacto sobre a viabilidade do endófita. • O tratamento de envelhecimento acelerado a 100% de umidade relativa por 4 a 7 dias é altamente informativo para previsão da viabilidade do endófita em semente. • O envelhecimento acelerado permite a classificação dos endófitas com base na viabilidade através de uma gama de panos de fundo genéticos de hospedeiros distintos. • A ordem de classificação da classificação de viabilidade entre novos endófitas é E1 < NEA10 < NEA11 e NEA12.

[000723] A Figura 139 mostra os valores de viabilidade de endófitas de diferentes endófitas em diferentes panos de fundo genéticos do hospedeiro depois de tratamento de envelhecimento acelerado das sementes.

[000724] Foi portanto demonstrado que o tratamento de envelhecimento acelerado [isto é, 100% de umidade relativa por 4 dias ou por 7 dias] reduz a viabilidade do endófita deste modo possibilitando seu uso potencial como uma ferramenta de seleção para associações estáveis.

[000725] Estes resultados demonstram que o tratamento de enve-lhecimento acelerado pode ser usado para seleção de simbiota estável produzido por inoculação artificial. • O tratamento de envelhecimento acelerado oferece a oportunidade de ser aplicado como uma ferramenta de seleção para a estabilidade de simbiota • O tratamento de envelhecimento acelerado [isto é, 100% de umidade relativa por 4 a 7 dias] reduz a viabilidade do endófita, e portanto pode ser usado para contra-seleção altamente eficaz contra associações instáveis que se comprovariam problemáticas na prática comercial. • O tratamento de envelhecimento acelerado permite que simbiotas sejam classificados com base em sua estabilidade • Foi demonstrada identificação ou seleção de simbiotas estáveis para as seguintes combinações: NEA10 em Alto, NEA11 em Bealey, NEA12 em Trojan e em Alto.

[000726] O protocolo de envelhecimento acelerado (AA) é estendido para semente de associações de festuca alta-endófita, por extensão do protocolo para previsão da viabilidade de associação de hospedei- ro-endófita que foi desenvolvida para semente de azevém perene; inclusive testes de múltiplos endófitas de festuca (AR542 [MaxP™ /MaxQ™ /ArkPlus™]; E34; KY31) em um ou mais panos de fundo genéticos de festuca alta. As condições para envelhecimento acelerado estão descritas na Tabela 56 e simbiota de festuca alta- endófita avaliados estão descritos na Tabela 57.

Tabela 56 - Comparação de envelhecimento acelerado e armaze-namento

Tabela 57 - Simbiota de festuca alta - endófita submetido a trata-mentos para envelhecimento acelerado e armazenamento

[000727] Em conclusão: • Foi estabelecido um método para tratamento de envelhe-cimento acelerado [isto é, 80% a 100% de umidade relativa por 4 a 7 dias]. • O método permitiu a previsão da viabilidade do endófita em semente armazenada (com base em uma gama de endófitas avaliada em panos de fundo genéticos de único hospedeiro e de diferentes hospedeiros). • O método permitiu a classificação do mérito de novos endófitas de acordo com a viabilidade prevista em semente armazenada (com base em uma gama de endófitas avaliada em pano de fundo genético de único hospedeiro). • O método permitiu a seleção e classificação de simbiota de acordo com a estabilidade.

Exemplo 18 - Método para Rápida avaliação da Viabilidade do Endófita

[000728] Objetivo:

[000729] O objetivo do trabalho foi desnevolver um método rápido, confiável e barato para determinar a viabilidade do endófita em semente de azevém perene. Os requisitos do teste correspondente fo- ram definidos como se segue.

[000730] Requisitos do teste: 1. Rápida determinação - plântulas de 3 a 5 dias de idade 2. Robusto e confiável 3. Sensível o suficiente para usar a partir de semente úni- ca até lotes de sementes 4. Específico para endófitas de Neotyphodium (isto é, não detecta outros fungos) 5. Detecta somente endófita vivo Ensaio TaqMan à Base de Expressão Genética de Endófita Inicial

[000731] As etapas no esquema de teste foram como se segue:

[000732] Dados de sequências de transcriptoma disponíveis para plantas Bronsyn +/- ST (perfilhos de 6 semana de idade) foram usadas para identificar genes específicos de endófitas candidatos expressados em planta, através de análise de dados de sequências BLAST contra banco de dados contendo endófita, outros fungos, sequências genéticas de Brachypodium;

[000733] Cinco genes específicos de endófitas expressados em planta (perfilhos de 6 semanas de idade de plantas de azevém perene de Bronsyn) foram identificados - LtmJ e 4 proteínas não caracterizadas (7490, 8263, 0005, 2232);

[000734] Iniciadores foram designados para o teste TaqMan como se segue:

[000735] - iniciadores e sonda de DNA - amostras de endófitas tanto mortos quanto vivos serão amplificadas

[000736] - iniciadores e sonda de RNA - somente serão amplificadas amostras de endófitas vivos e viáveis

[000737] - Iniciadores para gene de planta Bronsyn GAPDH para avaliação de viabilidade de semente

[000738] - iniciadores e sonda de DNA - serão amplificadas semen tes tanto viáveis quanto não viáveis

[000739] - iniciadores e sonda de RNA - somente serão amplificadas sementes viáveis

[000740] A Figura 140 mostra iniciadores designados para o teste TaqMan. Funcionalidade do Iniciador TaqMan

[000741] A funcionalidade do iniciador TaqMan foi testada em amostras de:

[000742] - perfilhos de 6 semanas de idade de Bronsyn + ST

[000743] - perfilhos de 6 semanas de idade de Bronsyn endófita free como controle negativo

[000744] - micélio ST de cultura de endófita in vitro como controle positivo para permitir abordar as seguintes hipóteses experimentais:

[000745] Podem os transcriptos endófita-específicos [isto é, LtmJ e 4 proteínas não caracterizadas (7490, 8263, 0005 e 2232)] ser detectados em amostras de DNA e de RNA extraídas separadamente de mi- célio de endófita ST?

[000746] Pode o transcripto genético planta-específico [isto é, GA- PDH] ser detectado em amostras de RNA e de DNA extraídas separadamente de azevém perene leaf material?

[000747] Podem transcriptos endófita-específicos [isto é, LtmJ e 4 uncharacterised proteins (7490, 8263, 0005, 2232)] ser detectados em amostras de RNA e DNA extraídas separadamente a partir de material de folhas de azevém perene infectado com endófita [Bronsyn + ST]?

[000748] A Figura 141 mostra o teste de funcionalidade do iniciador TaqMan para o gene LtmJ endófita-específico • Não houve nenhum RNA em cultura de ST conforme esperado • Somente expressado em planta.

[000749] A Figura 142 mostra o teste de funcionalidade do iniciador TaqMan para o gene endófita-específico 7490

[000750] A Figura 143 mostra o teste de funcionalidade do iniciador TaqMan para o gene endófita-específico 8263

[000751] A Figura 144 mostra o teste de funcionalidade do iniciador TaqMan para o gene endófita-específico 0005

[000752] A Figura 145 mostra o teste de funcionalidade do iniciador TaqMan para o gene endófita-específico 2232

[000753] A Figura 146 mostra o controle do teste TaqMan o sem modelo.

[000754] A Figura 147 mostra o controle do teste TaqMan - Plant GAPDH.

[000755] Os resultados obtidos podem ser resumidos como se segue: • Os iniciadores LtmJ funcionam bem e LtmJ não é transcrito em cultura in vitro de endófita (ST) conforme esperado uma vez que o gene Ltm somente é expressado em planta • Iniciadores designados para os outros 4 genes endófi- ta-específicos codificando proteínas não caracterizadas e expressados em perfilhos de simbiota de gramínea - endófita estabelecidos todos funcionam (avaliação da viabilidade do endófita) Co-Extração de RNA/DNA a partir de Amostras Reunidas de Plantas de Azevém Perene lnfectadas com Endófita

[000756] Além disso, foram realizados experimentos usando amostras produzidas por co-extração tanto de DNA quanto de RNA em uma única etapa de: • Co-extração de tanto DNA quanto RNA em única etapa • perfilhos de 6 semanas de idade de azevém perene cv. Bronsyn + endófita ST • perfilhos de 6 semanas de idade de azevém perene cv. Bronsyn livre de endófita • epicótilos isolados de 7 dias de idade derivados por se-mentes em germinação (amostras reunidas) de azevém perene cv. Bronsyn + endófita ST. • Teste de iniciadores TaqMan sobre DNA/RNA co-extraídos

[000757] - Teste de iniciadores para genes endófita-específicos 7490 e 0005 expressados em planta. • É a amostra de DNA/RNA co-extraídos de qualidade su-ficiente para iniciadores/sondas funcionarem? • Os genes de teste endófita-específicos expressados em epicótilos de 7 dias de idade de simbiota de gramínea - endófita permitem avaliação da viabilidade do endófita em planta cedo?

[000758] A Figura 148 mostra Detecção em Amostras Reunidas de DNA/RNA Co-Extraídos para o Gene Endófita-Específico 7490.

[000759] A Figura 149 mostra Detecção em Amostras Reunidas de DNA/RNA Co-Extraídos para o Gene Endófita-Específico 0005.

[000760] A Figura 150 mostra um controle (não modelo) para Detecção em Amostras Reunidas de DNA/RNA Co-Extraídas. Co-Extração de RNA/DNA a partir de Epicótilos Individuais de 10 Dias de Idade Derivados de Sementes em Germinação

[000761] Além disso, foram realizados experimentos usando amostras produzidas por co-extração tanto de DNA quanto de RNA em uma única etapa de: • epicótilos de 10 dias de idade isolados derivados de se-mentes em germinação (sementes individuais) • epicótilos de 7 dias de idade isolados derivados de se-mentes em germinação (sementes reunidas)

[000762] Estas amostras foram usadas para testar os iniciadores TaqMan designados em DNA/RNA co-extraídos, especificamente para testar iniciadores designados para genes endófita-específicos 7490, 0005 e 2232 expressados em planta para responder a seguinte questão:

[000763] Pode ser detectada expressão do gene de teste endófi- ta-específico em amostras de RNA/DNA co-extraídos de epicótilos in-dividuais de 10 dias de de isolados derivados de sementes em germi-nação?

[000764] A Figura 151 mostra a detecção em amostras de DNA/RNA co-extraídas de epicótilos de 10 dias de idade individuais do gene en- dófita-específico 2232.

[000765] A Figura 152 mostra a detecção em amostras de DNA/RNA co-extraídas de epicótilos de 10 dias de idade individuais do gene en- dófita-específico 7490.

[000766] A Figura 153 mostra a detecção em amostras de DNA/RNA co-extraídas de epicótilos de 10 dias de idade individuais do gene en- dófita-específico 0005.

[000767] A Figura 154 mostra um controle (não modelo) para detecção em amostras de DNA/RNA co-extraídas de epicótilos de 10 dias de idade individuais. Expressão de Gene Endófita-Específico É Detectável em Estágios de Desenvolvimento Mais Precoces?

[000768] Além disso, de modo a avaliar se a expressão de gene endófita-específico é detectável em estágios de desenvolvimento mais precoces, foram realizados experimentos usando amostras produzidas por co-extração tanto de DNA quanto de RNA em uma única etapa de: • epicótilos de 7 dias de idade isolados derivados de se-mentes em germinação (reunidos) • epicótilos de 5 dias de idade isolados derivados de se-mentes em germinação (reunidos) • epicótilos de 3 dias de idade isolados derivados de se-mentes em germinação (reunidos)

[000769] Estas amostras foram usadas para testar os iniciadores TaqMan designados em DNA/RNA co-extraídos, especificamente para testar iniciadores designados para genes 7490, 0005 e 2232 endófi- ta-específicos expressados em planta para responder a seguinte questão: • São os genes endófita-específicos expressados mais cedo do que 7 dias?

[000770] A Figura 155 mostra a detecção em DNA/RNA co-extraído de epicótilos reunidos de 3, 5 e 7 dias de idade do gene endófi- ta-específico 2232.

[000771] A Figura 156 mostra a detecção em DNA/RNA co-extraído de epicótilos reunidos de 3, 5 e 7 dias de idade do gene endófi- ta-específico 7490.

[000772] A Figura 157 mostra a detecção em DNA/RNA co-extraído de epicótilos reunidos de 3, 5 e 7 dias de idade do gene endófi- ta-específico 0005. Expressão de Gene Endófita-Específico É Detectável em Estágios de Desenvolvimento Anteriores em uma Única Semente em Germinação Integral?

[000773] Além disso, para avaliar se a expressão de gene endófi- ta-específico é detectável em estágios de desenlvimento anteriores (< 3 dias) em uma amostra de uma única semente em germinação integral, foram realizados experimentos usando amostras produzidos por co-extração de DNA e RNA de amostras de semente única de:

[000774] - epicótilos de 3 dias de idade isolados derivados de se mentes em germinação (controle)

[000775] - únicas sementes em germinação integrais de 3 dias de idade (isto é, semente inteira individual incluindo epicótilo)

[000776] - únicas sementes em germinação integrais de 2 dias de idade (isto é, semente inteira individual incluindo epicótilo)

[000777] - únicas sementes em germinação integrais de 1 dia de idade (isto é, semente inteira individual incluindo epicótilo).

[000778] e para confirmar que há suficiente sinal de uma única semente em germinação integral e que o teste pode ser realizado sobre 100 únicas sementes em germinação integrais individualmente para permitir uma avaliação quantitativa da viabilidade do endófita em nível de %. Validação do Teste

[000779] A validação do teste é realizada avaliando:

[000780] expressão do gene endófita-específico a ser detectado em simbiota com novos endófitas isto é, endófitas diferentes de ST por exemplo, AR1, AR37, NEA2, NEA6, NEA10, NEA11, NEA12 e E1 ;

[000781] expressão do gene endófita-específico a ser detectado em simbiota com diferentes panos de fundos genéticos de hospedeiro isto é, azevém perene de, por exemplo, genótipos Bronsyn e Alto;

[000782] Além disso, para validação do teste, os resultados do teste rápido quantitativo (isto é, teste à base de expressão do gene endófi- ta-específico em nível de única semente em germinação integral; 3 a 10 dias) são comparados com testes de detecção de colonização do hospedeiro por endófita e estabelecimento de simbiota (isto é, teste à base de detecção de DNA do endófita corrente a nível de planta de 6 semanas de idade).

[000783] Além disso, o teste desenvolvido para simbiota de azevém perene - endófita é avaliado para sua aplicabilidade com iniciadores designados para detecção de expressão de gene endófita-específico em simbiota de festuca alta - endófita isto é, sementes de diferentes endófitas (por exemplo, E3, E77. E79 e E80) em diferentes panos de fundo genéticos de festuca alta (por exemplo, BarOptima, BarSelect e BarElite), bem como em associações de gramínea - endófita de endó- fitas de Acremonium em gramíneas de Brachiaria e Urochloa.

Exemplo19 - Fenotipagem Molecular como Ferramenta em Re-produção Desde o Início I

[000784] Foram observados efeitos significativos de genótipo x genó- tipo (G x G) no processo de identificação de associações estáveis de hospedeiro-endófita para novos endófitas.

[000785] As associações do inventor são compatívei, estáveis e podem ser selecionadas em um nível populacional para fenótipos adicionais (performance, produção de alcaloides, etc.). Por exemplo, associações particularmente estáveis foram observadas nas seguintes combinações (variedade de azevém - novo endófita): • Impact - NEA10 • Tolosa - NEA12 • Bealey - E1

[000786] Os objetivos do estudo foram portanto desenvolver fenoti- pagem molecular como uma ferramenta em reprodução e seleção de simbiota desde o início, com base nas seguintes etapas: • Implantação de múltiplos endófitas através de membros de múltiplas populações de gramíneas hospedeiras • Perfil metabólico de relevante teor de alcaloides. • Seleção com base na performance de simbiotas indivi-duais.

[000787] De modo a identificar plantas individuais dentro de uma população com ótima produção de alcaloides, 80 plantas de uma única população da variedade Bealey de azevém perene, a qual contém uma mistura de duas cepas de endófitas distintas (NEA2 e NEA6) foram submetidas a um perfil semi-quantitativo metabólico. Variação do perfil de alcaloides e o conteúdo foi observado através da população de plantas (Fig. 158). Foi observado que as duas cepas de endófitas apresentam perfis de alcaloides de características diferentes: NEA2 foi previamente descrito (van Zijll de Jong et al. 2008) como produzindo lolitrem B, não produzindo ergovalina e níveis moderados de peramina, enquanto NEA6 produz baixos níveis de lolitrem B, moderada er- govalina e moderada peramina. Identificação de plantas produtoras de lolitrem B dentro da população confirmou a presença de NEA2 (em uma maioria das plantas) ao invés de EA6.

[000788] A Figura 158 mostra o perfil metabólico de uma população de simbiotas de azevém perene - endófita

[000789] O estudo foi em seguida estendido para identificar plantas individuais dentro de uma população com perfis de toxinas favoráveis (alto teor de peramina, baixo teor de ergovalina, sem/baixo teor de loli- trem B). Um teste de identidade genética à base de análise de SSR foi crucial para identificação de presença e identidade de endófita e para permitir seleção precisa. Variação genética dentro da planta hospe- deira pareceu influenciar os perfil de toxinas favoráveis dentro de um sub-grupo caracterizado por um único genótipo de endófita (por exemplo, NEA6), conforme mostrado por variação quantitativa através de um grupo de plantas produtoras de peramina (Figura 159, Tabela 58). Os dados podem ser usados para processos de reprodu- ção/seleção.

abela 58 - marcador de SSR análise de amostras selecionadas

[000790] Em resumo, este estudo demonstrou: 1. Desenvolvimento de um método de fenotipagem molecular para produção de alcaloides (P/E/L) como uma ferramenta para reprodução molecular desde o início de simbiota de azevém perene - endófitas. 2. Desenvolvimento de método de fenotipagem molecular em prova de conceito de seleção desde o início de simbiota de azevém perene - endófita consistindo em dois endófitas em uma população de hospedeiros de gramínea. 3. Seleção eficaz de sub-população de simbiotas de azevém perene - endófita consistindo em genótipos de dois endófitas e múltiplos hospedeiros de gramínea para ótima produção de alcaloides (P/E/L).

Exemplo 20 - Fenotipagem Molecular como Ferramenta em Re-produção Desde o Início II

[000791] A reprodução de gramíneas forrageiras corrente não examina uma ampla gama de compostos ou moléculas, em grande parte devido a restrições de custo. Reprodução aprimorada de forragens através da aplicação de fenotipagem molecular do simbiota para apri-morada qualidade da forragem pode proporcionar cultivares forrageiros com perfil de nutrientes para ruminantes de elite.

[000792] O objetivo deste trabalho foi desenvolver protocolos de fe- notipagem molecular de alto rendimento e de baixo custo que possam ser usados como uma ferramenta em reprodução de simbiota. Isto foi realizado através das seguintes etapas: • Quantificação da qualidade da forragem, medida por proporção de carboidratos solúveis em água (em inglês, WSC) : proteína

[000793] - Espera-se que proporção aprimorada de carboidratos so lúveis em água : proteína aumenta a produtividade bem como reduza o impacto ambiental do sistema de cultivo • Seleção com base na performance de simbiotas individuais Identificação de Plantas Individuais Dentro de uma População com Ótima Proporção de Carboidratos Solúveis em Água : Proteína

[000794] A Figura 160 mostra os resultados de fenotipagem molecular de uma população de simbiotas para permitir reprodução e seleção desde o início. Quantificação de Carboidratos Solúveis em Água

[000795] Existem vários métodos para a quantificação de carboidratos solúveis em água em amostras de plantas, no entanto nenhum foi amplamente adotado em reprodução de forragens devido a várias li-mitações no rendimento e no custo.

[000796] O protocolo desenvolvido se baseia em um teste enzimático, com o aprimoramento chave sendo a aplicação de automação robótica ao processamento de amostras que proporciona o seguinte sistema: • Rápido e semi-automatizado • Proporciona concentrações individuais para glicose, sa-carose, frutose e fructanos • Preciso, com aplicação demonstrada em azevém perene • Demonstrada correlação do método enzimático com os resultados de HPLC

[000797] A Figura 161 mostra a produção de glicose-6-fosfato a partir de glicose.

[000798] A Figura 162 mostra a presença de carboidratos solúveis em água em uma população de simbiotas.

[000799] O protocolo foi desenvolvido e exemplificado pelo seguinte experimento: • Uma compilação de c. 1000 genótipos de azevém perene x 4 replicatas clonais com 3 replicatas técnicas foi amostrada no estágio de três folhas a partir de um teste de campo estabelecido. • As amostras foram tratadas com calor e em seguida liofi- lizadas antes de serem processadas através da canalização se- mi-automatizada de extração de carboidratos e determinação enzimá- tica do teor de glicose, frutose, sacarose e fructano. • 400 plantas por dia processadas usando este protocolo. • Plantas com níveis de carboidratos alto e baixo foram identificadas e em seguida foram levadas adiante para uma etapa de reprodução de prova de conceito experimental

[000800] A Figura 163 mostra a quantificação de proteínas.

[000801] Pode ser realizada medição de proteínas usando vários métodos atualmente, no entanto nenhum tem sido amplamente adotado em reprodução de forragens devido a várias limitações no rendimento e no custo.

[000802] O protocolo desenvolvido se baseia em um ensaio colori- métrico estabelecido, com o aprimoramento chave sendo a aplicação de automação robótica para processamento de amostras, que propor- ciona o seguinte sistema: • Medição da proteína da planta verdadeira • Método de quantificação colorimétrico • Teste extensivo de diferentes tampões de extração e métodos colorimétricos identificou o presente método como o mais ideal - extração com NaOH fraco e quantificação usando teste de Bradford, detecção usando leitora de placas.

Realizações

[000803] Em resumo, foi obtido o seguinte: 1. Um método de fenotipagem molecular automatizada para carboidratos solúveis em água e proteína total foi desenvolvido como uma ferramenta para reprodução molecular desde o início de simbiota de azevém perene - endófita; 2. Estes métodos de fenotipagem molecular foram implan-tados em triagens de prova de conceito através de grandes populações de azevém perene; 3. Uma sub-população de plantas de azevém perene com maiores níveis de carboidratos solúveis em água foi selecionada em uma etapa de reprodução de 'prova de conceito' Exemplo 21 - Método para Identificação do Endófita em Simbiota Teste de Volume de Semente vs. Planta Individual para Presença, Identidade e Incidência de Endófita

[000804] Oito linhagens de azevém perene foram testadas para presença, identidade e proporção de endófitas NEA2/NEA6 usando marcadores de SSR. 85 plantas por linhagem 23x10 volumes de sementes por linhagem

Sumário • NEA2 foi identificado como o endófita predominante em Bealey NEA2/NEA6 • As proporções de NEA2/NEA6 em Bealey não se alteraram durante o período de 2002 a 2011. • Foram observadas proporções iguais a grossos modo de NEA2/NEA6 em Trojan. • Teste de perfilhos é um método robusto para avaliação de forma inequívoca da presença, identidade e incidência de endófita. • Determina exata percentagem de incidência de cepa de endófita específica em cada linhagem. • Identifica plantas livres de endófita. • Teste de semente em volume é um método indicativo para avaliar a incidência de endófita. • Determina a proporção relativa de cada endófita em uma linhagem particular. • Não permite identificar indivíduos livres de endófita.

[000805] Pureza Genética de Linhagens de Azevém perene lnocula- das com Endófita • Amostras de semente de cinco linhagens • Codificadas como Lp513, Lp539, Lp613, Lp660, Lp667 • Múltiplos volumes de sementes (23 por linhagem) anali-sados com 3 marcadores • Capacidade de diagnóstico para discriminar ST, NEA2, NEA6 • Lp513, Lp613 - contêm NEA6 > NEA2 a. Lp660 - contém NEA2, ST, NEA6 traço • Lp667 - contém ST, NEA6 • Lp539 - contém ST somente

[000806] Relação com avaliações anteriores de incidência de NEA2, NEA6?

[000807] Origem de incursões de endófita ST? Realizações 1. Métodos estabelecidos para determinar a presença, a identidade e a incidência de endófita em amostras de perfilhos individuais 2. Métodos estabelecidos para determinar a presença, a identidade e a incidência de endófita em amostras de semente em volume. Exemplo 22 - Método para caracterização do conteúdo alélico em genótipos de simbiotas

Método para Caracterização do Conteúdo Alélico em Genótipos de Hospedeiros

[000808] Ferramentas de marcadores à base de SNP foram desenvolvidas em azevém perene, transferidas para azevém italiano e desenvolvidas em festuca alta.

[000809] Foram desenvolvidos catálogos de cultivares extensivos de diversidade genética e a relação entre germoplasma disponível.

[000810] Foram estabelecidos viveiros de reprodução clonal e geno- tipados para auxiliar com decisões de reprodução.

[000811] Foram desenvolvidas ferramentas de marcadores à base de SNP para co-genótipo de planta hospedeira e endófita.

[000812] Foram desenvolvidas ferramentas de SNP para avaliar a pureza do lote de sementes e o conteúdo de endófita sobre c. 1.000 sementes em um sistema de teste à base de sequência.

[000816] Co-genotipagem do simbiota foi desenvolvida e exemplifi cada. Protocolo: - Triturar 2,5 g de semente - Extrair DNA - Realizar 384 PCRs sobre DNA - Reunir produtos de PCR - Ligar sobre adaptores Illumina - Amplificar amostra - Sequenciar sobre o illumina HiSeq2000 - pico de 1 a 2% em uma única alameda - Processar dados usando uma canalização de duas etapas criada em LINUX - Analisar dados usando um par de scripts R personalizados

[000813] As Figuras 164 e 165 mostram a diversidade genética e a relação entre germoplasma. Genotipagem por Sequenciamento

[000814] Protocolos em desenvolvimento - aplicação de custos reduzidos de sequenciamento para: - Saturar genoma com marcadores moleculares - Baixo custo por amostra - Alto rendimento possível - Dados de sequência de genoma vão auxiliar o desenvol-vimento - Estudo inicial em milho e cevada - 24.186 marcadores mapeados sobre o mapa genético de cevada b. 200.000 marcadores desenvolvidos em milho • Protocolo publicado - Elshire et al May 2011 PlosOne • 96 códigos de barras personalizados iniciais desenvolvi dos internamente.

[000815] A Figura 166 mostra genotipagem por sequenciamento.

[000816] A Figura 167 mostra o procedimento para genotipagem por sequenciamento.

Programa de Seleção de Reprodução

[000817] Com expansão de séries de dados disponíveis para programas de reprodução, a seleção de plantas vai precisar de ferramentas computacionais sofisticadas para máximo ganho.

Método do Programa:

[000818] Seleção de um sub-grupo de indivíduos fenotipicamente de elite que conservam todas as variantes alélicas.

Esquema do Programa:

[000819] O usuário define o tamanho de um sub-grupo para selecio nar.

[000820] O programa seleciona um sub-grupo de indivíduos que preservam toda a variação alélica vista na população.

[000821] O programa seleciona para o tamanho do sub-grupo de in-divíduos de elite definido pelo usuário.

[000822] Resultados identidades das plantas, valor de fenótipo médio e número de alelos faltando.

[000823] O valor de fenótipo é um único número, mas podem ser gerados valores compostos.

[000824] Exemplo: Seleção de 150 plantas a partir de 1.000 plantas - tempo de processamento de c. 1 hora. Esquema Potencial para Sub-Seleção de Cultivares • A partir de cultivares representados no viveiro clonal PG one50 e LP443 foram escolhidos para sub-seleção. • Selecionar para cultivar interno com base na performance fenômica e ou marcadores associados, enquanto mantendo as fre-quências alélicas da população global. • É esperado que cerca de 6% de plantas de elite seriam identificadas, enquanto cerca de 20 a 30 indivíduos seriam necessários para conservar a diversidade da população. • Traço alvo na tentativa inicial foi qualidade - digestibili- dade e WSC. • Identificadas coortes de plantas do viveiro que seriam po- licruzadas. • Cruzamento realizado - sementes colhidas e contadas - germinação a seguir. • Teste de subseleção PG one50 vs PG one50 bem como subseleção de LP443 vs LP443 a seguir. • Aplicação propícia a muitos traços maior sucesso prova-velmente com maiores herdabilidades. Realizações 1. Métodos estabelecidos para genotipagem de simbiota a partir de amostras de tecido de folha. 2. Métodos estabelecidos para genotipagem de simbiota a partir de amostras em volume de semente. 3. Ferramentas de reprodução computacional estabelecidas para seleção de indivíduos de elite enquanto preservando diversidade genética em uma população.

Exemplo 23 - Seleção genômica em Espécies de Plantas Forrageiras Resumo

[000825] Seleção genômica (GS) é um novo método poderoso para exploração de polimorfismos de sequências de DNA em aprimoramento de animais domésticos e plantas de colheita, através da previsão de valores de reprodução com base em todos os marcadores distribuídos em todo o genoma. Gramíneas forrageiras e leguminosas, as quais suportam uma ampla gama de indústrias pastorais globais, proporcionam importantes alvos para implementação de seleção genômi- ca, uma vez que muitos traços alvo chave para aprimoramento são difíceis ou caros de medir, e são medidos tardiamente no ciclo de vida de candidatos de seleção. Uma série de fatores biológicos que variam através da gama de espécies de candidatos, tais como modo reprodutivo e arquitetura do genoma poliploide, apresentam tanto desafios quanto oportunidades para a seleção genômica. Os atributos genéricos de programas de reprodução de forragem são descrito, junto com o estado de recursos genômicos para um grupo de espécies representativas (azevéns). É descrito um esquema de reprodução para azevém incorporando seleção genômica, permitindo duas operações de seleção para traços agronômicos chave dentro de um período de tempo previamente necessário para uma única operação, potencialmente levando a dobramento da taxa de ganho genético para semelhantes características. Uma extensão extremamente limitada de de-sequilíbrio de ligação, a qual é o principal desafio para implementação de seleção genômica em reprodução de azevém, é tratada. A estratégia também incorpora recentes avanços na tecnologia de sequencia- mento de DNA para minimizar os custos.

[000826] Uma abordagem alternativa é usar simultaneamente todos os marcadores distribuídos amplamente no genoma para prever valores de reprodução, em uma abordagem conhecida como seleção ge- nômica (GS) (Meuwissen et al. 2001). A GS usa um painel de marcadores os quais são suficientemente densos de tal modo que se espera que todos os QTLs estejam em LD com no mínimo um lócus marcador. Existem duas vantagens da seleção genômica em reaação à MAS. Em primeiro lugar, toda a variância genética pode ser potencialmente capturada pelos marcadores, uma vez que os efeitos dos marcadores não precisam exceder o limiar de significância de modo a serem usados para preverem o valor de reprodução. Em segundo lugar, os efeitos dos marcadores não são tendenciosos para cima por múltiplos testes. Isto está em contraste com efeitos dos marcador obtidos a partir de GWAS: devido ao grande número testado, é provável que sejam os marcadores com termos de erro favoráveis que excedam o limiar de significância (Beavis 994).

[000827] De modo a implementar seleção genômica, uma população de indivíduos de referência tanto com genótipos quanto com fenótipos conhecidos é usada para derivar uma equação de previsão a qual prevê valores de reprodução estimada genômica (GEBVs) a partir de genótipos de marcadores. Esta equação de previsão pode ser então usada para estimar valores de reprodução para candidatos de seleção para os quais tenham sido obtidos genótipos, mas potencialmente não fenótipos. Em estudos de simulação a precisão do GEBV (a correlação do GEBV com o valor de reprodução verdadeiro, o qual determina a taxa de ganho genético) para candidatos de seleção pode ser tão elevada quanto 0,85 (Meuwissen et al. 2001). a prática, ainda não foram reportados valores de precisão tão grandes quanto este, embora pre-cisões de GEBV até 0,71 tenham sido reportadas em gado bovino leiteiro Holstein-Friesian (Van Raden et al. 2009).

[000828] A implicação da dispobilidadede GEBVs para programas de aprimoramento pode ser profunda. Seleção genômica permite que sejam tomadas decisões de seleção precisas cedo no ciclo de vida do organismo alvo, no preço somente de genotipagem com o painel de marcadores. Segue-se que o impacto de seleção genômica sobre a taxa de ganho genético será o maior para traços os quais são ou: • Caros ou difíceis de medir, tais como qualidade da erva em forragens ou qualidade do grão em cereais. • Mensuráveis somente por dano significativo ou destruição do indivíduo, tais como resistência por infecção por nematódeos em cereais, portanto evitando reprodução subsequente a partir daquele indivíduo. • Expressados tarde na vida, tais como produção dos grãos da colheita, ou depois do indivíduo ter sido selecionado para reprodução, tais como sobrevivência ou persistência vegetativa.

[000829] O valor potencial da seleção genômica para reprodução de plantas da colheita foi reconhecido (Heffner et al. 2009; Janninck et al. 2010). Em forragens, a produção e a qualidade da forragem são os traços chave para aprimoramento da forragem, e suportam a conversão alimentar em quantidades de unidade de carne ou leite. Estas ca-racterísticas proporcionam bons candidatos para seleção genômica, uma vez que necestam de medição cara e/ou destrutiva no fim da vida. Traços tais como persistência em campo também são de interesse óbvio. Este artigo proporciona uma revisão do conhecimento atual relevante para as perspectivas para a seleção genômica em forragens, e descreve possíveis estratégias para implementação.

Biologia de Espécies Alvo

[000830] Ao considerar as perspectivas para aplicação de princípios de seleção genômica para espécies forrageiras, devem ser considerados aspectos relevantes de biologia tais como modo reprodutivo, estado poliploide e interações simbióticas. Estes fatores podem diferir significativate das propriedades da polinização cruzada, espécies animais diploides para as quais a abordagem foi pioneira. As principais espécies de pastagens para uso corrente e futuro em agricultura pastoral Australiana são classificadas com respeito a estes múltiplos fatores biológicos na Tabela 63, e é feito comentário sobre as implicações de cada fator para aplicação de seleção genômica em seções subse-quentes.

1.1 Classificação taxonômica

[000831] Uma série de espécies de plantas são importantes para agricultura pastoral global, a maioria pertencente ou às famílias das gramíneas (Poaceae) ou das leguminosas (Fabaceae). Gramíneas e leguminosas ou são cultivadas separadamente, ou em combinação como espécies associadas em um pasto misto. As espécies de gra- míneas de pastagens temperadas mais importantes são membros do complexo de espécies Lolium-Festuca (azevéns e festucas), dois gêneros intimamente relacionados presentes dentro da tribo Poeae da sub-família de gramíneas de estação fria Pooideae. Em contraste, várias espécies de gramíneas de pastagens de estação quente (membros dos gêneros Brachiaria, Paspalum, Eragrostis e Pennisetum) pertencem a várias tribos dentro da sub-família Panicoideae.

[000832] As espécies de estação fria chave pertencem predominan-temente aos gêneros Medicago (medics, incluindo alfalfa [Medicago sativa L]) e Trifolium (trevos, incluindo trevo branco [Trifolium repens L] e trevo vermelho [Trifolium pretense L.]) dentro da tribo Trifolieae das Fabaceae subtipo Hologalegina. Existem também uma série de legu-minosas de pastagens de estação quente agronomicamente importantes, incluindo membros dos gêneros Chamaecrista, Macroptilium, Stylosanthes, Centrosema e Desmodium.

1.2 Modo reprodutivo

[000833] A maioria das espécies forrageiras de clima temperado (com a exceção de trevo subterrâneo, T. subterraneum L.) apresentam exogamia obrigatória (alogamia), dependente de polinização cruzada. Exemplos incluem azevém perene, azevém italiano, festuca alta, fes- tuca do prado (Festuca pratensis Huds. syn. L. pratense), trevo branco e alfalfa. A inibição de endogamia é devida a sistemas de auto-incompatibilidade (SI) geneticamente controlados, nos quais interações incompatíveis entre pólen e estigma surgem a partir de corres- pondência específica de alelos de locus de SI em tecidos reprodutivos masculinos e femininos.

[000834] Sistemas SI Gametofíticos (GSI), nos quais o fenótipo do gameta masculino é determinado unicamente por seu própro genótipo haploide, são característicos de gramíneas forrageiras e leguminosas. Para algumas espécies de gramíneas de pastagens tais como azevém perene, SI contribui para um alto nível de heterozigosidade e hetero-geneidade, de tal modo que a diversidade intra-populacional tipicamente excede a variabilidade inter-populacional (Guthridge et al. 2001 : Wang et al. 2009). Isto é importante para perspectivas de sucesso da aplicação de seleção genômica nestas espécies, conforme discutido abaixo. O limitado conhecimento do conteúdo de alelos SI para genó- tipos específicos é um potencial obstáculo para o desenvolvimento varietal direcionado, especialmente para cultivares de base restrita (Gu- thridge et al. 2001), os quais são baseados em pequenos números de clones de base. Os efeitos sobre a fertilidade e a produção de sementes e limitações sobre a permutação de variantes genéticas benéficas são mais agudos sob auto-fertilização, ou cruzamentos entre genóti- pos reproduzidos proximamente (close-bred) tais como irmãos completos (full-sibs). No contexto de implementação de GS, exogamia obrigatória leva a altos níveis de heterozigosidade genotípica e taxas de polimorfismo que provavelmente são maiores do que em espécies de gado (por exemplo, The Bovine HapMap Consortium 2009) às quais tem sido aplicada seleção genômica com sucesso.

[000835] Apomixia representa um modo de reprodução diferente, no qual o desenvolvimento embrionário prossegue na ausência de uma contribuição paterna de uma célula ovo não reduzida. Os produtos da apomixia são portanto clones do genótipo materno. Um sistema de propagação partenogênico é altamente atraente para os melhoristas de plantas, devido à capacidade de preservar e multiplicar genótipos de elite (Spielman et al. 2003). A apomixia é geralmente associada com hibridação e/ou poliploidia, e a expressão do traço é geralmente incompleta, de tal modo que é obtida uma mistura de produtos de ferti-lização sexual e assexual a partir de uma única planta. Também é ob-servada variação dentro da espécie, com genótipos diploides totalmente sexuais e genótipos poliploides apomíticos facultativos dentro de uma única população. Gramíneas de estação quente apomíticas as quais são alvo para melhoramento genético incluem várias espécies de Brachiaria (capim braquiária), Paspalum (dallis grass) e Pennisetum (parentes do milheto pearl millet cultivado), bem como Eragrostis cu- tvula (Schrad.) Nees (weeping lovegrass) (Pessino et al. 1999). Para seleção genômica, a seleção no nível do diploide sexual alógamo para ótimos genótipos pode ser ligada de modo muito eficaz com propagação em larga escala baseada em transição para um nível partenogê- nico, poliploide.

[000836] As espécies alvo também variam em termos de costume de crescimento anual ou perene, a maioria sendo perenes de vida curta ou longa. Esta propriedade é potencialmente vantajosa para seleção genômica, uma vez que replicatas clonais de um único indivíduo to-talmente genotipado podem ser avaliadas para múltiplos traços através de uma série de ambientes distinto, proporcionando confiança aumentada na avaliação fenotípica para derivação de GEBVs. A propagação partenogênica de genótipos únicos através de apomixia pode permitir que seja obtida uma qualidade similar de informação.

1.3 Poliploidia

[000837] Para alopoliploides, os quais derivam de eventos de hibri- dização entre grupos taxonômicos distinto, os efeitos mais importantes sobre a viabilidade de seleção genômica são duplos; o desafio signifi-cativo apresentado para o processo de verificação e validação de SNP; e a necessidade de testar de modo confiável SNPs associados com polimorfismos causais se as mutações referidas somente segre-garem a partir de um único sub-genoma (Kaur et al. 2012). O precedente surge devido a um requisito de distinguir entre SNPs genuínos (variantes homólogos entre alelos dentro de um sub-genoma), variantes de sequência homólogos (HSVs) (surgindo entre loci correspondentes em cada sub-genoma) e variantes de sequência parálogos (PSVs) (surgindo entre genes duplicados tanto dentro quanto entre sub-genomas) (Hand et al. 2008; Lawless et al. 2009). Soluções parciais para este problema foram estabelecidas para trevo branco alote- traploide (2n = 4x = 32) (Hand et al. 2008) e festuca alta alohexaploide (2n = 6x = 42) (Hand et al. 2010), com base na profundidade de se- quenciamento (Margulies et al. 2005), e comparações com grupos ta- xonômicos de progenitores diploides (2x) para previsão de estrutura de sub-genoma.

[000838] Espécies forrageiras autopoliploides, tipicamente surgindo a partir de eventos de dobramento de cromossomas dentro de único grupo taxonômico, incluem alfalfa e variedades de azevéns geradas artificialmente, bem como espécies tais como dactilo (Dactylis glomerate L), trifólio pé de pássaro (Lotus corniculatus L.) e gramínea smooth brome (Bromus inermis L). Embora a verificação de SNP em au- topoliploides seja provavelmente menos complexa do que para alopo- liploides, pode-se esperar que surjam desafios adicionais para estudos de GS devido a requisitos para genotipagem quantitativa (determinação de dosagem alélica), reconstrução de haplotipo precisa e verificação de ligação genética de marcador-traço.

1.4 Associações simbióticas de planta-micróbio

[000839] Tanto gramíneas de pastagens quanto leguminosas formam associações simbióticas mutuamente benéficas com espécies microbi-anas assexuais. Esquemas para implementação de seleção genômica podem portanto se projetados para co-seleção de simbiota alvo adap- tado, de modo a otimizar a compatibilidade e a estabilidade das associ-ações. As endófitas de gramíneas melhor caracterizadas são espécies fúngicas da ordem Ascomycota e da família Claviceptaceae. as gramí- neas temperadas, relações anamorfas-teleomorfas, devido à presença e à ausência de um estado sexual, são observadas entre membros dos gêneros Neotyphodium e Epichloê, Endófitas de Neotyphodium conferem efeitos benéficos à gramínea hospedeira através de dissuação de herbívoros invertebrados e aperfeiçoamento da tolerância ao estresse abiótico, em troca de proteção física e nutrição.

[000840] Espécies de leguminosas formam interações simbióticas com uma gama de espécies proteobacterianas, a maioria pertencente à ordem Rhizobiales. Os rizóbios são sequestrados dentro de nódulos especializados sobre as raízes de plantas leguminosas, e realizam a fixação biológica de nitrogênio atmosférico (N2) em amônio (NH4+) em um ambiente de oxigênio limitado (Sessitsch et al. 2001).

1.5 Traços alvo

[000841] A produção e a qualidade da erva são os traços de produção primários para espécies forrageiras. O último é essencialmente controlado por variação para digestibilidade (associada com teor de polímero de lignina e celulose nas paredes celulares) e disponibilidade de carboidratos oligossacarídicos para provisão de energia para o animal de pastoreio (Cogan et al. 2005). Outros aspectos de qualidade incluem redução da distensão abdominal em ruminantes, associada com dietas de leguminosas ricas em proteínas e melhoradas pela presença de taninos condensados. Características de resistência ao estresse biótico incluem respostas a patógenos virais, bacterianos e fúngicos, e a pragas de invertebrados. Exemplos incluem o vírus do mosaico da alfalfa (AMV) tanto de alfafa quanto do trevo branco e o patógeno da coroa de azevéns (Puccinia coronata f.sp. lolii) (Dracatos et al. 2010). Traços relacionados com estresse abiótico incluem tole- rância a alagamento (Pearson et al. 2010) e estiagem em gramíneas forrageiras, e a toxicidade por alumínio, deficiência de fósforo e estresse salino em trevos. A capacidade de produzir quantidades suficientes de semente viável é importante tanto para variedades de leguminosas de pastagens quanto para gramíneas. Todos estes traços são bons alvos para seleção genômica, devido aos requisitos para medição trabalhosa, cara, destrutiva ou tardia no ciclo de vida. Estrutura e Objetivos de Programas de Reprodução de Planta em Pastagens

[000842] Muitas formas diferentes de programa de reprodução têm sido implementadas para espécies de plantas de pastagens. Um esquema genérico, o qual descreve a maioria das características relevantes de semelhantes programas de reprodução, é representado na Fig. 168. A maioria das atividades comerciais tem sido baseada em uma estratégia que se inicia com o estabelecimento de uma população de base de até 10.000 indivíduos, seguido por multiplicação de semente dentro das famílias, gerando até 100.000 indivíduos para seleção de massa. É usada avaliação para persistência sob pressão de pastagem ou avaliação visual (como plantas espaçadas no campo) para sub-seleção com uma redução por um fator de 10 no número de genótipos avaliados. Um grupo de sobreviventes de até 1.000 clones parentais potenciais é submetido a avaliação posterior para características de performance chave tais como produção e persistência. A determinação do valor de reprodução parental pode ser obtida através do uso de uma série de métodos experimentais (Vogel e Pedersen 1993). Em teste de progênie de meio-irmãos (HSPT), a progênie de um genó- tipo selecionado derivado maternalmente é avaliada em testes fenotí- picos replicados para minimizar variação ambiental contraditória, obtendo informação sobre a capacidade de combinação geral (GCA) do gerador. Teste de progênie de irmãos completos (full-sib) (FPST) me de a capacidade de combinação específica (SCA) de um genótipo pa-rental através da identificação de famílias derivadas de cruzamento de par superior. Seleção dentro de e entre família (WBFS) envolve esta-belecimento de múltiplos policruzamento (inter-cruzamentos aleatórios entre indivíduos selecionados), colheita e aumento do volume de números iguais de sementes de cada planta mãe, e estabelecimento e avaliação de viveiros de progênie de meio-irmãos de plantas espaçadas replicadas para características de produção chave.

[000843] Depois de seleção de genótipos de base (SynO), é gerada uma população sintética 1 (Syn1), geralmente por policruzamento, menos comumente por combinação de semente F1 de cruzamentos entre cada gerador em uma estrutura de dialelo. O número de indivíduos de base pode variar a partir de tão baixo quanto 4 para azevém perene (embora mais altos para o azevém italiano), até 50 a 100 para espécies poliploides tais como gramínea de trigo de altura e alfalfa (Bray and Irwin 1999). Populações Sintéticas 2 (Syn2) são em seguida obtidas por multiplicação de Syn1, através de colheita de semente a partir de geradores maternais fertilizados dentro de uma única nuvem de pólem comum. As populações Syn2 são em seguida reunidas em múltiplos ambientes para traços chave, levando à seleção de uma população para liberação comercial como uma variedade.

[000844] Programas de reprodução comerciais que implementam versões específicas deste esquema genérico tipicamente envolverão dois ciclos de recombinação genética seletiva e seleção/avaliação subsequentes dentro de um período de 6 a 9 anos (Fig. 168). Dado o frame de tempo prolongado para estes estágios, existem maiores oportunidades para aceleração do ganho genético com base em estratégias de GS. No entanto, é provável que a implementação de GS em programas de reprodução de forragem comerciais necessite de maiores modificações estruturais de modo a explorar totalmente a tecnologia, no mínimo no estágio de desenvolvimento existente das tecnologias genômicas. Nos sistemas atuais, clones de base raramente têm sido retidos, e detalhes da estrutura da linhagem geralmente não têm sido registrados, impedindo o cálculo de valores de reprodução estimada à base do pedigree. O valor de genótipos individuais neste paradigma tem sido relativamente baixo, limitando a oportunidade de aplicar estratégias que dependem de análise de genotipa- gem e/ou caracterização fenotípica caras. Uma transição para reprodução à base do pedigree (ou no mínimo o uso de informação de marcador para capturar a estrutura do pedigree) através da avaliação de viveiro clonal de genótipos específicos é portanto uma importante etapa para a implementação de GS em reprodução de plantas de pastagens.

Requisitos para aplicação de GS à reprodução de azevéns

[000845] Das principais espécies forrageiras, o azevéns e a alfalfa atualmente possuem uma série de recursos genéticos e genômicos mais bem desenvolvidos. No entanto, como os sistemas genéticos dos azevéns são sem dúvida mais similares (como exogamia, grupo ta- xonômico diploide) aos dos animais domésticos, estas espécies pro-porcionam um caso de teste potencial para o desenvolvimento de es-tratégias de seleção genômica em forragens. De modo a este objetivo ser realizado, devem ser superadas uma série de limitações chave.

1.6 Disponibilidade de polimorfismos de sequência

[000846] Seleção genômica requer um painel de polimorfismo de sequência distribuído em todo o genoma capaz de teste genotípico através de um grande número de indivíduos em custo razoável. Os SNPs foram estabelecidos como o marcador de escolha para a aplicação de seleção genômica na maioria das espécies, dada a elevada abundância no genoma, e a disponibilidade de tecnologias de detecção precisas e baratas. No entanto, outros tipos de marcadores mole- culares também podem ser usados teoricamente para seleção genô- mica contanto que satisfaçam os critérios descritos acima.

[000847] O desenvolvimento de recursos genômicos para o azevém perene até recentemente tem sido relativamente lento comparado com espécies de cereais importantes tais como o arroz, o milho, o trigo e a cevada. A verificação de SNPs em larga escala iniciais para o azevém perene foi realizada através de seleção funcional de sequências gené-ticas, geração de amplicon a partir de geradores de famílias de ma-peamento de irmãos completos, seguida por clonagem, sequencia- mento, alinhamento e validação através do uso de um teste de trans-missão Mendeliano (Cogan et al. 2006). Este método foi aplicado a genes de múltiplas classes funcionais, detectando altos níveis de diversidade de nucleotídeos a partir de números limitados de haplótipos amostrados. O consenso de estudos de verificação de múltiplos SNPs (Cogan et al. 2006; Xing et al. 2007; Dracatos et al. 2008; Dracatos et al. 2009; Brazauskas et al. 2010; Fiil et al. 201 ) é que a frequência de SNPs tipicamente varia entre 1 por 20 a 150 bp, dependendo da identidade genética e do número de genótipos. O sequenciamento de DNA de amplicons gene-específicos reunidos de múltiplos (c. 500 genóti- pos) sugere adicionalmente um alto valor médio 'global' de entre 1 por 20 a 25 bp (Cogan et al. 2010a).

[000848] Tem sido implementada uma série de abordagens para produzir maiores números de SNPs com distribuição em todo o geno- ma, em uma abordagem inicial, grupos de genes candidatos foram selecionados e amplicons reunidos a partir destas regiões foram se- quenciados usando a plataforma Roche GS FLX de segunda geração. SNPs derivados foram formatados para genotipagem usando o teste Illumina GoldenGate™ de ligação-amplificação de oligonucleotídeos 384-plex (Cogan et al. 2010c). Uma abordagem que permite a verificação de um maior número de SNPs, com cobertura de genoma mais ampla, se baseia em genômica comparativa para selecionar regiões de éxon que são distribuídas regularmente através do genoma do azevém para sequenciamento reunido. 'Prova de conceito' para esta atividade veio de mapeamento genético de em fina escala e mapeamento físico dos loci de SI (Shinozuka et al. 2010). Uma estratégia mais geral acarretou a exploração de dados de mapeamento físico do trigo para pão, para o qual sintenia conservada com o azevém perene foi previamente definida (Jones et al. 2002a), para alinhar com o ge- noma do esboço de B. distachyon, e portanto usam modelos genéticos de Brachypodium espaçados regularmente para ESTs de azevém or- tólogos selecionados para desenho de amplicon e sequenciamento reunido (Cogan et al. 201 Od).

[000849] Métodos de redução de complexidade também são úteis para pesquisar todo o espaço genético, usando métodos tais como filtração de C0t e hipometilação (Forster et al. 2010). Coletivamente, as atividades de verificação descritas acima proporcionaram cerca de 20.000 loci de SNPs previstos, suficientes para suportar um esquema inicial para um chip de genotipagem à base de oligonucleotídeos de alta densidade integrado, análogo aos usados em estudos de seleção ge- nômica e de GWAS do gado. No entanto, o dramático aumento na potência de tecnologias de sequência atuais sugere que o sequencia- mento de genoma completo per se, acoplado com comparação entre genótipos contrastados, é agora uma via maior custo benefício para verificação de SNPs de todo o genoma. A montagem completa de um genoma de Poaceae complexo ainda é altamente desafiadora para plataformas de segunda geração (Gupta 2008). No entanto, a montagem do espaço genético como contigs de unigene é agora viável com base em sequenciamento com Illumina Hi-Seq, o qual proporcionou cobertura de c. 60 X do genoma do azevém perene (Cogan et al. 2011).

[000850] No futuro próximo, é provável que a verificação de SNPs e subsequente genotipagem em espécies tais como azevéns, venha a convergir através de uma transição de métodos de genotipagem por si só para métodos de 'genotipagem por sequenciamento' (GBS) (Huang et al. 2009,, Elshire et al. 2011). Por exemplo, o método de DNA associado a sítio de restrição (RAD) (Baird ef al., 2008) proporciona acesso a uma série de polimorfismos de sequência essencialmente ilimitada através de sequenciamento de segunda geração de representações de complexidade reduzida de genótipos específicos (Wang et al. 2011). É provável que esta abordagem seja essencial para o azevém e para outras espécies forrageiras, de modo a obter os grandes números de marcadores e baixo custo de genotipagem que são necessários dadas as estruturas das populações e as práticas de reprodução correntes para estas colheitas.

1.7 O desafio de limitado LD em azevéns

[000851] Duas questões chave para o desenho de qualquer experimento de seleção genômica são o número de SNPs requeridos, e o número de indivíduos que devem ser genotipados e fenotipados na população de referência de modo a prever GEBVs para candidatos de seleção com precisão útil. A resposta em ambos os casos depende criucialmente da extensão do LD nas espécies alvo. O LD é comu- mente medido pela estatística r2, a qual também pode ser interpretada como a proporção de variância explicada por um SNP o qual tem uma associação com um QTL. A extensão do LD de todo o genoma é em grande parte determinada pelo tamanho da população eficaz no passado, particularmente em espécies exogâmicas com um grande Ne. A expectativa de r2 é 1 4-V+] onde Ne é tamanho da população eficaz e c é a distância do mapa entre loci em Morgans (Sved 1971). Meuwissen (2009) demonstrou por simulação que para obter valores de reprodução estimada genômica (GEBV) muito precisos, são necessários 10*Ne*L marcado- res, onde L é a extensão do genoma em Morgans. Se as estimativas de Ne não estiverem disponíveis, e tiver sido estimado r2 entre marcadores, Calus et al. (2008) demonstraram que GEBV com uma precisão maior do que 0,7 pode ser previsto contanto que r2 entre marcadores adjacentes estivesse em média acima de 0,27. Dado este limiar como uma diretriz, quais são as perspectivas para seleção genômica no azevém perene?

[000852] Resultados de múltiplos estudos do desequilíbrio da ligação (LD) (Ponting et al. 2007; Auzanneau et al. 2007; Xing et al. 2007, Fiil et al. 2011) revelaram um padrão de decaimento tipicamente rápido, acima de menos de 1 kb. Por exemplo, Ponting et al. (2007) demonstraram que LD, conforme medido por r2, decaiu para menos de 0,27 dentro de 1000 bp na maioria dos tipos de população (incluindo ecoti- pos e cultivares). Fiil et al. (2011) também viram que LD decaiu rapidamente dentro dos genes representativos, embora alguns genes tenham apresentado taxas de decaimento muito mais lentas.

[000853] Tanto a frequência de polimorfismo extremamente elevada, quanto o rápido decaimento de LD, sugerem um valor de Ne passado muito grande para o azevém perene. Para comparação, nos seres humanos, o LD decai para 0,27 em aproximadamente 25 kb, portanto é provável que Ne para o azevém seja maior do que as dezenas de milhares estimadas para a população humana (por exemplo, Tenesa et al. 2007). No gado bovino, o LD decai para 0,27 em aproximadamente 50 kb, e os tamanhos da população ancestral são da ordem de 2000 a 3000 (Bovine Hap Map Consortium 2009). Estas comparações sugerem que marcadores muito densos serão necessários para implementar seleção genômica em azevéns. Estratégias para lidar com este problema são discutidas abaixo.

[000854] Deve ser observado que o padrão de LD no azevém é muito diferente daquele observado em colheitas como o milho, para as quais o LD dentro de grupos heteróticos, e mesmo através de germo- plasma altamente diverso, é extensivo (Van Inghelandt et al. 201 1 ; Yan et al. 2009). Esta propriedade possibilita a estimativa precisa de GEBVs; por exemplo, Riedelshiemer et al. (2012) reportaram precisões de GEBV de 0,72 para biomassa no milho usando uma série de 56.110 SNPs, ao passo que Albrecht et al. (2012) reportaram precisões de GEBV de 0,72 a 0,74 para produção de grãos na progênie de cruzamento de teste, usando somente 1.152 SNPs.

[000855] O segundo elemento para desenho de um experimento de seleção genômica é determinar o número de indivíduos totalmente fe- notipados e genotipados que são necessários na população de referência. A precisão de GEBVs em indivíduos sem fenótipo próprio pode ser derivada deterministicamente e depende do número de indivíduos genotipados e fenotipados na população de referência, da hereditariedade do traço, e do número de loci que afetam o traço (Goddard 2008; Daetwyler et al. 2008). Considerando que pouco conhecimento está disponíveis com referência ao número de loci que afetam a maioria dos traços agronomicamente importantes, a equivalência entre o número de loci e o número de segmentos de cromossomos independentes na população é uma hipótese conservadora, e esta pode ser calculada a partir de Ne e L. Esta previsão determinística sugere que são necessárias grandes populações de referência para prever GEBVs precisos, particularmente para traços de baixa hereditariedade (Fig. 169), e também está de acordo com precisões que têm sido obtidas em experimentos de reprodução de gado bovino leiteiro (Hayes et al. 2009). Mais uma vez, dado que é provável que Ne seja muito grande em populações de azevém, a previsão determinística indicaria que populações de referência extremamente grandes (e impraticáveis) seriam necessárias para implementar seleção genômica para o azevém, na ausência de qualquer estratégia para reduzir o LD. Portanto as es- tratégias referidas se tornaram um componente chave da implementação de seleção genômica para azevéns. Além disso, é importante reconhecer que a seleção genômica pode proporcionar ganhos mesmo se a densidade do marcador não for tão elevada quanto os valores sugeridos, e o tamanho da população de referência for menor do que o desejado, contanto que alguma estrutura esteja presente dentro da população (tal como, por exemplo, se cruzamentos de irmãos completos ou meio irmãos (half-sib) forem comuns). Marcadores de SNP também podem ser usados para rastrear o pedigree da população e a herança de grandes blocos cromossômicos de geradores e outros ancestrais recentes. Habier et al (2006) demonstraram que uma considerável proporção da precisão do GEBV foi na realidade derivada destas fontes, particularmente quando Ne foi contraído recentemente, uma vez que deve ter ocorrido na maioria dos programas de reprodução de forragem. Na estratégia resumida abaixo, é especificamente explorada uma redução artificial em Ne e portanto uma extensão aumentada de LD. Estratégias para Aplicação de Seleção Genômica para Programas de Reprodução de Forragem

[000856] Conforme descrito acima, evidência experimental sugere que o LD no azevém perene é limitado, e são necessárias estratégias para mitigar este efeito de modo a implementar seleção genômica de modo eficaz. Uma estratégia é considerar o LD o qual existe dentro de famílias (dentro das quais Ne é muito pequeno), o qual é equivalente ao uso de informação de ligação para prever o GEBV. Algoritmos os quais usam LD e ligação simultaneamente para prever o GEBV já estão disponíveis (Meuwissen e Goddard 2004). Além disso, embora necessitando de demonstração definitiva, é previsto declínio recente nos valores de Ne para espécies forrageiras, devido a um foco no uso de grupos de germoplasmas específicos dentro de programas de re- produção. Isto é uma vantagem para a seleção genômica, uma vez que é necessária a avaliação de menos segmentos de cromossoma na população de referência (embora efeitos de endogamia devam ser tratados cuidadosamente). Se o declínio em Ne foi suficientemente grande para permitir o uso de populações de referência de tamanho prático somente pode ser respondido através de interpretação de dados experimentais, e esta é uma das primeiras questões que serão tratadas quando dados de SNPs de todo o genoma se tornam disponíveis. Independente do resultado, o esquema apresentado aqui começa com uma redução adicional de Ne.

[000857] Será agora descrito um potencial esquema de seleção ge- nômica para o azevém o qual em grande parte explora informação dentro da família para previsões genômicas (Figura 170). Uma característica chave de nosso esquema é uma redução no intervalo entre gerações, o qual nos programas de reprodução existentes é geralmente muito longo, porque somente variedades completadas ou conjuntos de germoplasma recém acessados são geralmente usados para a geração de cruzamentos de primeira fase (vide a Figura 168). Uma oportunidade para acelerar o ganho genético com seleção genômica através de encurtamento do intervalo entre gerações pode ser obtida através da introdução de genótipos de elite da primeira rodada de seleção diretamente na segunda rodada de seleção e nas rodadas de seleção subsequentes. A identidade de genótipos de elite a incluir neste estágio se basearia em GEBVs para traços tais como rendimento, qualidade e persistência da relva.

[000858] Outra característica do esquema é o uso de GBS. Embora a formatação à base de chip dos loci de SNP atualmente conhecidos para genotipagem altamente multiplexada seja viável logisticamente, é improvável que os custos de ajustes do projeto (devido ao tamanho relativamente pequeno do estudo internacional e da comunidade de desenvolvimento) e os custos de processamento correntes (corres-pondentes a várias centenas de dólares por amostra) sejam aceitáveis para espécies forrageiras. Em contraste, amostras multiplexadas com código de barras na plataform Illumina Hi-Seq podem potencialmente proporcionar dados de SNP de alta densidade na faixa de preço por volta de uma ordem de magnitude inferior (por exemplo, cerca de 20 dólares por amostra), com os custos provavelmente para declinar mais no futuro próximo (Elshire et al. 2011). Dada a provisão de dados de um sistema de genotipagem "Aberto", o grande número de polimorfismos necessários para permitir seleção genômica se tornaria prontamente acessível. Estabelecimento da população de base

[000859] 1. O esquema começa com a avaliação do germoplasma de elite disponível. Isto é realizado por estabelecimento de um viveiro em campo de plantas espaçadas incorporando genótipos individuais (cerca de 1.000) de múltiplas fontes de germoplasma de elite, com um nível moderado de replicação clonal (por exemplo, de quatro vezes), para obter cerca de 4.000 rametes. A avaliação fenotípica direta de genótipos no viveiro é realizada para rendimento, qualidade da forragem e outros traços os quais podem ser medidos neste estágio (Fig. 170, box A). Como muitas variedades de elite correntes de azevém perene têm uma base restrita, sendo derivadas de um pequeno número de geradores (4 a 6), a inclusão de germoplasma comercial vai predispor a uma redução do Ne desde o início.

[000860] 2. Seleção das 150 plantas de melhor performance é realizada com base nos dados do viveiro, aumentados por dados históricos sobre a performance de genótipos de elite e índices de diversidade maximizados para cruzamento de par, de modo a reduzir o Ne. É feita uma série de 'cruzamentos iniciais' pareados entre estes indivíduos superiores selecionados. De modo a permitir previsão mais precisa dos valores de reprodução entre séries de progênies, e a reduzir mais o Ne, 50 genótipos são designados como geradores 'bígamos', uma vez que cada um é acoplado a dois geradores 'monógamos' selecionados separadamente. Este procedimento obtém 50 pares de famíli- cas F1, cada par sendo meio-irmãoes com base no gerador bígamo comum (Fig. 170, box B)

[000861] 3. GBS dos 150 geradores é realizado com base em um método de sequenciamento de redução da complexidade (por exemplo, Baird et al. 2008; Elshire et al. 2011) para identificar variação de SNPs em todo o genoma dentro do grupo parental. (Fig.3, box B) Avaliação e seleção de mini-pasto

[000862] 4. Semente de cada família de irmãos completos é colhida para estabelecimento de mini-pastos para avaliação1 da persistência, da resistência a doenças e da performance em um ambiente de pasto (de modo a possibilitar a estimativa de efeitos de competição). Mini-pastos de plantas espaçadas são estabelecidos contendo 100 genó- tipos F1 de cada família, com 10 cm de espaçamento em uma área de 1 m2, correspondendo a 10.000 genótipos de plantas no total2. Dependendo de limitações logísticas, cada mini-pasto específico para família F1 pode ser replicado para avaliação adicional. Por exemplo, replicação tripla necessitaria do estabelecimento de 30.000 genótipos de plantas distinas em mini-pastos. A avaliação fenotípica é realizada para as famílias F1 no mini-pasto ajustando para traços alvo (por exemplo, rendimento, qualidade, resistência a doenças e persistência) (Figura 3, box C). O grande número de plantas no mini-pasto pode necessitar de somente análise genotípica usando testes de SNP de baixa densidade (por exemplo, testes 384-plex Illumina GoldenGate™ assays), uma vez que pode ser usada imputação para inferir seus ge- nótipos nos SNPs identificados na etapa 3. Habier et al. (2009) demonstraram que este processo pode ser realizado de modo muito pre- ciso se os geradores forem genotipados para os marcadores densamente espaçados, como é o caso neste exemplo (para o qual geradores foram genotipados para um número muito grande de loci por GBS).

[000863] 1A capacidade de obter suficiente semente para estabelecimento de mini-pastos é baseada na seguinte estimativa: número de sementes produzidas por um único perfilho reprodutivo = 50; o número de perfilhos reprodutivos por planta pode ser tão elevado quanto 50 (plantas cultivadas em pote grande) ou tão baixo quanto 4, mas cerca de 10 é tomado como uma expectativa mínima razoável quando clones são preparados para cruzamento; portanto o número de sementes produzidas por planta = cerca de 500; portanto o número de sementes produzidas por cruzamento de par típico = 1.000; taxa de germinação mínima = 75%; portanto 500 a 750 germinantes potenciais disponíveis.

[000864] 2Devido à probabilidade de efeitos de borda pronunciados, uma guarda de plantas de uma variedade genérica seria estabelecida em torno de cada série de 10 x 10.

[000865] 5. Usando os dados imputados e dados de performance de plantas individuais dos mini-pastos, equações de previsão de SNPs para persistência, efeitos de competição e outros traços são atualizados (Figura 170, box C).

[000866] 6. Uma nova população parental com 150 genótipos é sele cionada (usando GEBVs para todos os traços) da primeira rodada (a partir de 30.000, em uma frequência de seleção de 0,5%), os quais são mantidos com replicação mínima de modo a mitigar a perda de plantas (Figura 170, box D). Estes indivíduos são submetidos a GBS conforme descrito na etapa 3.

Etapa de Avaliação do Viveiro

[000867] 7. O cruzamento destes indivíduos selecionados é realizado na rodada seguinte do ciclo de seleção, de modo a produzir uma po-pulação de viveiro de total reposição de 4.000 rametes (Fig. 170, box B). Estes indivíduos são genotipados usando o painel de marcadores de baixa densidade, são imputados genótipos e são calculados GEBVs para persistência e resistência a doenças. Estes dados são combinados com GEBVs para produção e qualidade da forragem (as quais incluem informação do registro dos próprios indivíduos), e 150 indivíduos são selecionados para produzir progênie para a etapa de mini-pasto.

[000868] As etapas 4 a 7 conforme descrito acima podem ser repetidas com avaliação periódica do ganho genético. Quando suficiente ganho genético tinha sido realizado de modo a distinguir claramente uma nova 'pré-variedade', então pode ocorrer desvio de um sub-grupo dos 150 genótipos selecionados em desenvolvimento de população sintética. Um total de 16 genótipos (c. 10% de intensidade de seleção) pode ser escolhido para derivar 4 grupos de policruzamento de quatro genótipos parentais cada, com base na performance prevista e na distância genética, para produzir pré-variedades de base restrita. Será usada avaliação multi-sítio para medir atributos fenotípicos tais como produção, qualidade e persistência destas sintéticas (Figura 3, box E).

[000869] Este esquema tem a intenção de proporcionar máximo ganho genético através de rápida ciclagem da atividade de cruzamento com base em previsões de seleção genômica, particularmente para persistência e resistência a doenças. Em contraste com o esquema apresentado na Fig.1, ocorrem recombinação e seleção como parte de cada ciclo, ao invés de ser de modo intermitente dentro de um período mais prolongado. Os principais requisitos logísticos, os quais são para estabelecimento e avaliação do mini-pasto, podem ser reduzidos por uma estratégia mais radical, na qual semente de todos os cruzamentos de pares iniciais é reunida e semeada em um único teste espaçado fechado em larga escala. Indivíduos de elite seriam então identificados por avaliação fenotípica e atribuídos a cruzamento de origem através de análise genotípica à base de SNPs de baixa densidade.

[000870] Embora a derivação de GEBVs venha a reduzir os requisitos para fenotipagem em escala completa, além de durante a primeira rodada de seleção, é previsto que a retenção dos genótipos parentais e a manutenção do viveiro de plantas espaçadas viria a permitir o re-finamento de previsões através da avaliação de traços adicionais, ou o monitoramento de longo termo de traços previamente medidos. O valor de um sistema de viveiro de plantas espaçadas também seria reforçado através da avaliação de efeitos de genótipo x ambiente (G x E). Este objetivo idealmente seria realizado através do estabelecimento de replicatas clonais em diferentes ambientes alvo, e GEBVs seriam então gerados para cada ambiente.

[000871] Um dos objetivos chave deste esquema proposto é reforçar a importância de genótipos individuais durante a prática da reprodução, os quais tenham sido tradicionalmente desprezíveis comparados com a população como um todo. Retenção, caracterização fenotípica intensiva e uso em uma estrutura de pedigree totalmente registrada (baseada no genótipo de SNP) vai proporcionar no mínimo parte deste objetivo.

Conclusões

[000872] Embora espécies forrageiras tenham sido relativamente pouco desenvolvidas em termos de reprodução molecular comparadas com outras plantas de colheitas importantes, a implementação de seleção genômica tem o potencial de proporcionar maiores avanços, es-sencialmente através da capacidade de completar múltiplas rodadas de seleção dentro do tempo usado convencionalmente para rodadas únicas. Este resultado é possível se GEBVs precisos puderem ser previstos para traços tais como persistência e resistência a doenças. Informação sobre estes traços é obtida atualmente somente depois de potenciais candidatos de seleção terem até cinco anos de idade. No entanto, se seleção genômica estiver para ser implementada em es-pécies forrageiras, devem ser superados uma série de desafios. As deficiências relativas de recursos de marcadores de DNA, e a influência de estruturas de genoma poliploide para algumas espécies, constituem o primeiro desafio. Barreiras para a disponibilidade de marcadores desaparecerão rapidamente à medida que o GBS se tornar mais barato, enquanto métodos reforçados para análise genotípica de ge- nomas poliploides também têm sido desenvolvidos (Gidskehaug et al. 2011).

[000873] Os dois principais desafios restantes são a extensão muito limitada de LD em espécies forrageiras tais como azevéns, e as restritas oportunidades para implementar seleção genômica nos programas de reprodução atuais. Nesta revisão, o primeiro fator é tratado através do uso tanto de informação de de ligação dentro das famílias para aumentar a precisão da previsão de GEBV, quanto, a longo termo, de redução do Ne em populações por reprodução de variedades de elite. Efeitos correlacionados indesejáveis de depressão de endogamia sob os esquemas referidos podem ser conciliados através da incorporação de medidas de diversidade genômica dentro dos critérios de seleção (por exemplo, Pryce et al. 2012). Para tratar o segundo fator, foi proposto um esquema de reprodução o qual permite seleção genômica para acelerar o ganho genético através de compressão da duração da rodada de seleção. No entanto, a implementação deste esquema iria exigir significativa reestruturação dos esquemas de reprodução atuais.

[000874] Embora sistemas de avaliação à base de campo e à base de estufa usando critérios de avaliação largamente visuais tenham sido suficientes para permitir aprimoramento varietal até o momento, o uso eficaz de sistemas de reprodução molecular também é dependente de acesso a valores fenotípicos mais precisos e detalhados (Furbank et al. 2009; Houle et al. 2010), por exemplo, os proporcionados por medições 'por toda a vida' do crescimento da planta e da performance a partir de estufa automatizada e plataformas fenômicas de análise de imagem. A quantificação precisa de variação fenotípica usando tecnologias de última geração é um desafio importante e uma oportunidade para a reprodução de forragem (Walter et al. 2012).

Exemplo 24 - Seleção genômica de associações de plan- ta-simbioma

[000875] Métodos de seleção artificial são dependentes de um processo de duas etapas: em primeiro lugar, recombinação para produzir novas organizações de elementos genéticos, e em segundo lugar, amostragem diferencial de genótipos recém gerados com base em seleção fenotípica superior. Simbiontes assexuais (por exemplo, endó- fitas, bactérias) não participam dos eventos de recombinação durante reprodução sexual da planta hospedeira. A geração de variabilidade em pares de hospedeiro-simbionte é portanto de natureza combinatorial, e a potência da seleção genômica para expressão favorável da associação simbiótica vai depender da capacidade de produzir uma gama de combinações pareadas tão ampla quanto possível entre ge- nótipo de hospedeiro e genótipo de simbionte. O espaço de diversidade potencial para co-seleção com o simbionte pode ser estimatado como: [Número de grupos de germoplasmas alvo] x [Número de genó- tipos de simbiontes distintos]. Como este número é muito grande, é desejável amostragem seletiva para máxima diversidade de simbion- tes usando um algoritmo genético.

[000876] Simbiontes os quais se reproduzem sexualmente (por exemplo, alguns fungos) proporcionam uma oportunidade adicional para selecionar simbiontes dentro de populações para a maior parte do efeito benéfico sobre a planta hospedeira. Aqui, seriam necessárias caracterização genômica e subsequente seleção genômica de simbio- ntes. A natureza combinatorial permaneceria no mínimo tão complexa, mas pode aumentar potencialmente para: [Número de grupos de ger- moplasmas alvo] x [Número de genótipos de simbiontes distintos] x [Número de variantes dentro de grupo de genótipos de simbiontes].

[000877] Os métodos referidos também são aplicáveis no caso de hospedeiros os quais diferem em potencial para atrair populações de simbiontes (tanto quantidade quanto diversidade). Portanto, pode ser usada seleção genômica para determinar a afinidade do hospedeiro com espectros de simbiontes, a diversidade e a quantidade.

[000878] Os métodos referidos também são aplicáveis para co-seleção de simbioses de leguminosa-rhizobia, simbioses com mycorrhizae, interações favoráveis de genoma de hospedei- ro-simbionte e interações ambientais de hospedeiro-simbionte.

Exemplo 25 - Microbiomas de folha e raiz em gramínea temperada: Azevém perene (Loiium perenne)

[000879] Plantas de Lolium perenne clonal, ambas com e sem o en- dófita fúngico Neotyphodium lolii tóxico padrão (Standard Toxic Ne- otyphodium lolii) foram cultivadas em 6 soluções hidropônicas diferentes representando diferentes condições nutricionais. Não estava presente nenhuma fonte de carbono, de modo que o endófita deve crescer em carbono da planta.

[000880] Depois de 3 semanas de tratamento com reposição bi-semanal de meio de modo a manter as concentrações iônicas, as plantas foram lavadas para remover meio residual e as raízes e as folhas foram rapidamente congeladas em N2 líquido. Foi extraído o RNA de folhas e raízes de 5 plantas em replicata por tratamento ( 20 amostras).

[000881] Este RNA foi usado para construir bibliotecas de seq de cDNA RNA as quais foram analisadas por análise RNAseq (sequen- ciamento por llummina HiSeq). As bibliotecas foram analisadas usando blastn e um único hit do banco de dados registrado por leitura de se- quência. O banco de dados csultado continha genes nucleares de planta, um cloroplasto de planta representativo, e genoma mitocondri- al, o endófita fúngico nuclear e genoma mitocondrial, e sequências re-presentando outros fungos, bactérias, algas, insetos e rhizaria. Um segundo banco de dados continha aproximamente 120.000 sequências denominadas 16S. Hits foram registradas como estando acima de um corte de 80% de identidade e 40 bp de sobreposição e agrupados quanto a sua origem.

[000882] A grande maioria de leituras mapeou para sequências de banco de dados de planta. No entanto leituras significativas mapearam para as outras classes de organismos. A Figura 171 mostra a percentagem de leituras totais mapeadas mapeando para algas, bactérias, fungos (diferentes de endófita), insetos e rhizaria nas folhas e raízes de plantas livres de endófita e contendo endófita no meio hidropônico total. Isto revela um maior nível de micro-organismos associados com raízes comparadas com folhas.

Exemplo 26 - Análise do microbioma de 16S em azevém perene {Lolium perenne)

[000883] Plantas de Lolium perenne clonal, tanto com quanto sem Neotyphodium lolii tóxico padrão foram cultivadas em 6 soluções hi- dropônicas diferentes representando diferentes condições nutricionais.

[000885] Depois de 3 semanas de tratamento com reposição bi-semanal de meio de modo a manter as concentrações iônicas, foi extraído o RNA a partir de folhas e raízes de 5 plantas em replicata por tratamento. Este RNA foi usado para construir bibliotecas de seq de cDNA RNA as quais foram analisadas por sequenciamento por llummina HiSeq.

[000884] As leituras destas bibliotecas foram analisadas usando blastn e um único hit do banco de dados registrado por leitura de sequência. Neste caso o banco de dados consistiu de 117101 sequên- cias de 16S rRNA. As sequências de rRNA são usadas para identificar bactérias taxonomicamente. Um hit foi contado acima de um limite de 98% de identidade e 40 bp. Os hits foram contados por sequência do banco de dados por biblioteca e foi criada uma matriz de contagens de hits por sequência do banco de dados por biblioteca analisada. Se-quências do banco de dados foram extraídas se houverem hits regis-trados em no mínimo 10 bibliotecas diferentes.

[000885] Estas sequências do banco de dados foram classificadas taxonomicamente usando o classificador do Ribiosomal Database Project http://rdp.cme.msu.edu/ e agrupadas de modo a mostrar a distribuição taxonômica dos micro-organismos representados no micro- bioma do Lolium perenne. Como o cloroplasto da planta é de origem microbiana, sequências de cloroplasto da planta estão presentes no banco de dados de sequências 16S. Mapeamento de leituras para estas sequências não foram incluídos no sumário taxonômico.

[000886] A Figura 172 mostra matches contadas (hit de 16S blastn >98% de identidade ao longo de uma sobreposição de >40bp; mapeamento >10 amostras). 11.000 a 164.000 leituras foram atribuídas a 16S por amostra. Distribuição de 2774 filos bacterianos (cloroplasto não-vegetal).

Exemplo 27 - Microbiomas de folha e raiz em azevém perene (Lotium perenne)

[000887] Plantas de Lolium perenne clonal, tanto com quanto sem Neotyphodium lolii tóxico padrão foram cultivadas em 6 soluções hi- dropônicas diferentes representando diferentes condições nutricionais.

[000888] Depois de 3 semanas de tratamento com reposição bi-semanal de meio de modo a manter as concentrações iônicas, foi extraído o RNA a partir de folhas e raízes de 5 plantas em replicata por tratamento. Este RNA foi usado para construir bibliotecas de seq de cDNA RNA as quais foram analisadas por sequenciamento por llummina HiSeq.

[000889] As leituras destas bibliotecas foram analisadas usando blastn e um único hit do banco de dados registrado por leitura de sequência. Neste caso o banco de dados consistiu de 117101 sequências de 16S rRNA. As sequências de rRNA são usadas para identificar bactérias taxonomicamente. Um hit foi contado acima de um limite de 98% de identidade e 40 bp. Os hits foram contados por sequência do banco de dados por biblioteca e foi criada uma matriz de contagens de hits por sequência do banco de dados por biblioteca analisada. A matriz de contagens de 16S para sequências de 16S que tinha hits em 10 ou mais bibliotecas foi analisada quanto à soma das contagens para cada sequência do banco de dados por órgão da planta. Estas somas foram as próprias somadas por classe taxonômica de bactérias.

[000890] A Figura 173 plota a soma por classe bacteriana de contagens lidas a partir de folhas e raízes respectivamente. Isto revela que algumas classes de bactérias são predominantemente encontradas nas folhas (por exemplo, Cianobactérias) ou raízes (por exemplo, Es- fingobactérias) ao passo que outras classes são encontradas tanto nas folhas quanto nas raízes (por exemplo, Gamaproteobactérias). 470 sequências 16S tinham hits em no mínimo 10 bibliotecas de folhas e 10 de raízes.

Exemplo 28 - Microbiomas de folha e raiz em azevém perene (Lo!ium perenne). Metagenômica revela diferenças na predominância de espécies bacterianas em microbiomas de broto e raiz

[000891] Plantas de Lolium perenne clonal, tanto com quanto sem Neotyphodium lolii tóxico padrão foram cultivadas em 6 soluções hi- dropônicas diferentes representando diferentes condições nutricionais.

[000892] Depois de 3 semanas de tratamento com reposição bi-semanal de meio de modo a manter as concentrações iônicas, foi extraído o RNA a partir de folhas e raízes de 5 plantas em replicata por tratamento. Este RNA foi usado para construir bibliotecas de seq de cDNA RNA as quais foram analisadas por sequenciamento por llummina HiSeq.

[000893] As leituras destas bibliotecas foram analisadas usando blastn e um único hit do banco de dados registrado por leitura de sequência. Neste caso o banco de dados consistiu de 117101 sequências de 16S rRNA. As sequências de rRNA são usadas para identificar bactérias taxonomicamente. Um hit foi contado acima de um limite de 98% de identidade e 40 bp. Os hits foram contados por sequência do banco de dados por biblioteca e foi criada uma matriz de contagens de hits por sequência do banco de dados por biblioteca analisada. Os valores de contagens nesta matriz (presente em no mínimo 10 amostras) foram transformadas log para base 2 e esta matriz foi carregada no software the MultiExperimentViewer (parte da suite de softwares da TM4 www.tm4.org). Esta matriz log transformada foi usada para agrupamento (clustering) hierárquico das séries de amostras usando ligação média com correlação de Pearson, e a ordem das amostras otimizadas.

[000894] Isto produziu a árvore de amostras mostrada na Figura 174. O agrupamento (clustering) demonstra que a matriz de contagens bacterianas das raízes contém uma assinatura que pode classificar o estado nutricional das associações de planta-microbioma (isto é, simbiota). Além disso o microbioma bacteriano das folhas nitidamente diferencia raízes de folhas (isto é, diferentes bactérias são predominantes em diferentes órgãos, por exemplo folhas versus raízes). No entanto o microbioma bacteriano das folhas não classifica o estado nutricional (agrupamento (clustering) hierárquico de contages bacterianas classifica tratamentos de raízes mas não tratamentos de folhas). Exemplo 29 - Microbiomas de folha e raiz em azevém perene (Lolium perenne). Diferenças na predominância de espécies bac- terianas dependendo do estado nutricional do symbiotum

[000895] Plantas de Lolium perenne clonal, tanto com quanto sem Ne- otyphodium lolii tóxico padrão foram cultivadas em 6 soluções hidropôni- cas diferentes representando diferentes condições nutricionais.

[000896] Depois de 3 semanas de tratamento com reposição bi-semanal de meio de modo a manter as concentrações iônicas, foi extraído o RNA a partir de folhas e raízes de 5 plantas em replicata por tratamento. Este RNA foi usado para construir bibliotecas de seq de cDNA RNA as quais foram analisadas por sequenciamento por Ilummina HiSeq.

[000897] As leituras destas bibliotecas foram analisadas usando blastn e um único hit do banco de dados registrado por leitura de sequência. Neste caso o banco de dados consistiu de 117101 sequências de 16S rRNA. As sequências de rRNA são usadas para identificar bactérias taxonomicamente. Um hit foi contado acima de um limite de 98% de identidade e 40 bp. Os hits foram contados por sequência do banco de dados por biblioteca e foi criada uma matriz de contagens de hits por sequência do banco de dados por biblioteca analisada. Os valores de contagens nesta matriz foram transformadas log para base 2 e esta matriz foi carregada no software the MultiExperimentViewer (parte da suite de softwares da TM4 www.tm4.org). As sequências 16S foram em seguida usadas para análise por Cluster Affinity Search Technic usando correlação de Pearson e um limite de 0,75. Os clusters resultantes foram em seguida agrupados hierarquicamente individualmente usando ligação média com correlação de Pearson e a ordem das sequências 16S foi otimizada.

[000998] Isto produziu 1036 clusters. Destes clusters 11 continham mais de 10 genes e continham 47% dos genes na matriz. Exemplos de 2 destes 11 clusters são mostrados nas Figuras 175 e 176. Estas mostram sequências bacterianas (cluster5) cuja abundância é aumentada em resposta a alguns tratamentos hidropônicos de baixo teor de amônia, e sequências bacterianas (cluster2) cuja abundância é reprimida em resposta a tratamento de baixo teor de amônia e baixo teor de nitrato. Exemplo 30 - Microbiomas de folha e raiz em azevém perene (Lolium perenne). Análise do metagenoma de microbioma bacteria- no em simbiota revela uma gama de espécies bacterianas conhecidas por serem fixadoras de N e fitoestimuladoras de gramíneas

[000999] Plantas de Lolium perenne clonal, ambas com e sem Ne- otyphodium lolii Standard Toxic (tóxico padrão) foram cultivadas em 6 soluções hidropônicas diferentes representando diferentes condições nutricionais.

[001000] Depois de 3 semanas de tratamento com reposição bi-semanal de meio de modo a manter as concentrações iônicas, foi extraído o RNA a partir de folhas e raízes de 5 plantas em replicata por tratamento. Este RNA foi usado para construir bibliotecas de seq de cDNA RNA as quais foram analisadas por sequenciamento por llummina HiSeq. As leituras destas bibliotecas foram analisadas usando blastn e um único hit do banco de dados registrado por leitura de sequência. Neste caso o banco de dados consistiu de 117101 sequências de 16S rRNA. As sequências de rRNA são usadas para identificar bactérias taxonomicamente. Um hit foi contado acima de um limite de 98% de identidade e 40 bp. Os hits foram contados por sequência do banco de dados por biblioteca e foi criada uma matriz de contagens de hits por sequência do banco de dados por biblioteca analisada.

[001001] Esta matriz foi filtrada para mostrar mapeamento de leituras para sequências anotadas como espécies de Azospirillum. O mapea-mento de contagens para estas 12 sequências por biblioteca são mos- tradas na Figura 177. As espécies de Azospirillum são conhecidas por associarem com plantas monocotiledôneas, e também por fixarem ni-trogênio atmosférico e produzirem fitormônios (fitestimulantes de gra- míneas). Pode ser visto que no mínimo uma das 12 espécies tem contagens que aumentam em amostras de baixo teor de amônia, onde a fixação do nitrogênio atmosférico seria de utilidade para plantas as-sociadas com as bactérias que fixam o nitrogênio. Portanto, as espécies de Azospirillum foram induzidas em número sob baixo teor de nitrogênio. Exemplo 31 - Microbiomas de folhas e raízes em Antarctic hairgrass (Deschamsia Antarctica). Metagenômica revela o mi- crobioma bacteriano de diversas plantas

[001002] Plantas de Deschampsia antartica, de dois acessos diferentes (Da2 e Da17) foram cultivadas em 6 soluções hidropônicas diferentes representando diferentes condições nutricionais. Estas foram usadas para examinar bactérias abundantes nos microbiomas das folhas e raízes através de metagenômica.

[001003] Depois de 3 semanas de tratamento com de reposição bi-semanal de meio para manter as concentrações de íons, foi extraído o RNA de folhas e raízes de 5 replicatas de plantas por tratamento. Este RNA foi reunido e usado para construir bibliotecas de seq de cDNA RNA as quais foram analisadas por sequenciamento por llummina HiSeq.

[001004] As leituras destas bibliotecas foram analisadas usando blastn e um único hit de banco de dados registrado por leitura de sequência. Neste caso o banco de dados consistiu de 117101 sequências de rRNA 16S. As sequências de rRNA são usadas para identificar taxonomicamente bactérias em plantas cultivadas sob diferentes regimes nutricionais. Um hit foi contado acima de um limiar de 98% de identidade e 40 bp. Os hits foram contados por sequência do banco de dados por biblioteca e foi criada uma matriz de contagens de hits por sequência do banco de dados por biblioteca analisada. As sequências de banco de dados foram extraídas se a contagem de hit por biblioteca analisada foi maior do que ou igual a 100 contagens.

[001005] Estas sequências de bancos de dados foram classificadas taxonomicamente usando o classificador do Ribiosomal Database Project http://rdp.cme.msu.edu/ e agrupadas para mostrar a distribuição taxonômica dos micróbios representados no microbioma de folha e raiz de Deschampsia antartica em todos os filos bacteri- anos (Figura 178). Foram identificadas 203 sequências 16S de 7109 sequências. Exemplo 32 - Microbiomas de folhas e raízes em Antarctic hairgrass (Deschamsia antarctica). Metagenômica revela diferenças na predominância de espécies bacterianas nos microbiomas de folhas e raízes

[001006] Plantas de Deschampsia antartica, de dois acessos diferentes (Da2 e Da17) foram cultivadas em 6 soluções hidropônicas diferentes representando diferentes condições nutricionais.

[000909] Depois de 3 semanas de tratamento com de reposição bi-semanal de meio para manter as concentrações de íons, foi extraído o RNA de folhas e raízes de 5 replicatas de plantas por tratamento. Este RNA foi reunido e usado para construir bibliotecas de seq de cDNA RNA as quais foram analisadas por sequenciamento por llummina HiSeq.

[001007] As leituras destas bibliotecas foram analisadas usando blastn e um único hit de banco de dados registrado por leitura de sequência. Neste caso o banco de dados consistiu de 117101 sequências de rRNA 16S. As sequências de rRNA são usadas para identificar taxonomicamente bactérias. Um hit foi contado acima de um limiar de 98% de identidade e 40 bp. Os hits foram contados por sequência do banco de dados por biblioteca e foi criada uma matriz de contagens de hits por sequência do banco de dados por biblioteca analisada. As se-quências de banco de dados foram extraídas se a contagem de hit por biblioteca analisada foi maior do que ou igual a 100 contagens.

[001008] Esta matriz de contagens foi modificada, por cada sequência do banco de dados por valor de contagem da biblioteca sendo dividido pelo valor de contagens médias para aquela sequência através de todas as bibliotecas. Esta matriz modificada foi carregada no software the MultiExperimentViewer (parte da suite de softwares da TM4 www.tm4.org) e usada para agrupamento (clustering) hierárquico das sequências 16S usando ligação média com correlação de Pearson.

[001009] O mapa de calor mostrado na Figura 179 mostra diferenças na predominância de espécies bacterianas nas folhas e raízes. Exemplo 33 - Microbiomas de folhas e raízes em Antarctic hairgrass (Deschampsia antarctica). Diferenças na predominância de espécies bacterianas nos microbiomas de folhas e raízes de-pendendo do estado nutricional do symbiotum

[001010] Plantas de Deschampsia antartica, de dois acessos diferentes (Da2 e Da17) foram cultivadas em 6 soluções hidropônicas diferentes representando diferentes condições nutricionais.

[001011] Depois de 3 semanas de tratamento com de reposição bi-semanal de meio para manter as concentrações de íons, foi extraído o RNA de folhas e raízes de 5 replicatas de plantas por tratamento. Este RNA foi reunido e usado para construir bibliotecas de seq de cDNA RNA as quais foram analisadas por sequenciamento por llummina HiSeq.

[001012] As leituras destas bibliotecas foram analisadas usando blastn e um único hit de banco de dados registrado por leitura de sequência. Neste caso o banco de dados consistiu de 117101 sequências de rRNA 16S. As sequências de rRNA são usadas para identifi- car taxonomicamente bactérias. Um hit foi contado acima de um limiar de 98% de identidade e 40 bp. Os hits foram contados por sequência do banco de dados por biblioteca e foi criada uma matriz de contagens de hits por sequência do banco de dados por biblioteca analisada. As sequências de banco de dados foram extraídas se a contagem de hit por biblioteca analisada foi maior do que ou igual a 100 contagens.

[001013] Esta matriz de contagens foi modificada, por cada sequência do banco de dados por valor de contagem da biblioteca sendo dividido pelo valor de contagens médias para aquela sequência através de todas as bibliotecas. Esta matriz modificada foi carregada no software the MultiExperimentViewer (parte da suite de softwares da TM4 www.tm4.org) e usada para agrupamento (clustering) hierárquico das sequências 16S usando ligação média com correlação de Pearson.

[001014] A Figura 180 mostra uma região ampliada do mapa de calor, mostrando diferenças na predominância de espécies bacterianas em resposta a diferente estado nutricional nas amostras de raízes. Exemplo 34 - Microbiomas de folhas e raízes em Antarctic hairgrass (Deschampsia antarctica). Diferenças na predominância de espécies bacterianas nos microbiomas de folhas e raízes de-pendendo do estado nutricional do symbiotum

[001015] Plantas de Deschampsia antartica, de dois acessos diferentes (Da2 e Da17) foram cultivadas em 6 soluções hidropônicas diferentes representando diferentes condições nutricionais.

[001016] Depois de 3 semanas de tratamento com de reposição bi-semanal de meio para manter as concentrações de íons, foi extraído o RNA de folhas e raízes de 5 replicatas de plantas por tratamento. Este RNA foi reunido e usado para construir bibliotecas de seq de cDNA RNA as quais foram analisadas por sequenciamento por llummina HiSeq.

[001017] As leituras destas bibliotecas foram analisadas usando blastn e um único hit de banco de dados registrado por leitura de sequência. Neste caso o banco de dados consistiu de 117101 sequências de rRNA 16S. As sequências de rRNA são usadas para identificar taxonomicamente bactérias. Um hit foi contado acima de um limiar de 98% de identidade e 40 bp. Os hits foram contados por sequência do banco de dados por biblioteca e foi criada uma matriz de contagens de hits por sequência do banco de dados por biblioteca analisada. As sequências de banco de dados foram extraídas se a contagem de hit por biblioteca analisada foi maior do que ou igual a 100 contagens.

[001018] Esta matriz de contagens foi modificada, por cada sequência do banco de dados por valor de contagem da biblioteca sendo dividido pelo valor de contagens médias para aquela sequência através de todas as bibliotecas. Esta matriz modificada foi carregada no software the MultiExperimentViewer (parte da suite de softwares da TM4 www.tm4.org) e usada para agrupamento hierárquico das sequências 16S usando ligação média com correlação de Pearson.

[001019] A Figura 181 mostra uma região ampliada do mapa de calor, mostrando diferenças na predominância de espécies bacterianas em resposta a diferente estado nutricional nas amostras de folhas. As espé-cies bacterianas predominantes em microbioma de folhas são predomi-nantemente as Cianobactérias. As espécies bacterianas diferem em resposta ao nitrogênio nas folhas (isto é, baixo teor de nitrogênio). Exemplo 35 - Microbiomas de folhas e raízes em Antarctic hairgrass (Deschampsia antarctica). Análise do metagenoma do microbioma bacteriano em simbiota revela uma gama de espécies bacterianas conhecidas por serem fixadores de N e fitoestimula- dores de gramíneas

[001020] Plantas de Deschampsia antartica, de dois acessos diferentes (Da2 e Da17) foram cultivadas em 6 soluções hidropônicas diferentes, representando diferentes condições nutricionais.

[000924] Depois de 3 semanas de tratamento com de reposição bi-semanal de meio para manter as concentrações de íons, foi extraído o RNA de folhas e raízes de 5 replicatas de plantas por tratamento. Este RNA foi reunido e usado para construir bibliotecas de seq de cDNA RNA as quais foram analisadas por sequenciamento por llummina HiSeq.

[001021] As leituras destas bibliotecas foram analisadas usando blastn e um único hit de banco de dados registrado por leitura de sequência. Neste caso o banco de dados consistiu de 117101 sequências de rRNA 16S. As sequências de rRNA são usadas para identificar taxonomicamente bactérias. Um hit foi contado acima de um limiar de 98% de identidade e 40 bp. Os hits foram contados por sequência do banco de dados por biblioteca e foi criada uma matriz de contagens de hits por sequência do banco de dados por biblioteca analisada. As sequências de banco de dados foram extraídas se a contagem de hit por biblioteca analisada foi maior do que ou igual a 100 contagens.

[001022] Esta matriz de contagens foi modificada, por cada sequência do banco de dados por valor de contagem da biblioteca sendo dividido pelo valor de contagens médias para aquela sequência através de todas as bibliotecas. Esta matriz modificada foi carregada no software the MultiExperimentViewer (parte da suite de softwares da TM4 www.tm4.org) e usada para agrupamento hierárquico das sequências 16S usando ligação média com correlação de Pearson.

[001023] A Figura 182 mostra uma região ampliada do mapa de calor, mostrando espécies de Azospirillum agrupadas juntas. Estas bactérias são conhecidas por associarem com plantas monocotile- dôneas, e também por fixarem nitrogênio atmosférico e produzirem fitormônios (fitoestimulador de gramíneas). É demonstrado que estas bactérias são mais predominantes em soluções de nutrientes bom baixo teor de nitrogênio em amostras de raízes. Portanto, espécies de Azospirillum foram induzidas em número sob baixo teor de nitrogênio.

Exemplo 36 - Sumário

[001024] Estes exemplos demonstram que a metagenômica de simbiomas de gramíneas revela microbiomas endo/epifíticos complexos e diversidade de espécies em microbiomas de gramíneas. Também existe variação no microbioma entre espécies de gramí- neas, entre raízes e brotações, e através das condições ambientais. O perfil de microbioma revela diversidade de espécies para reforço da performance de simbiomas, perfis de microbioma através dos genótipos e ambientes, monitoramento do microbioma e inoculação do microbioma.

Exemplo 37 - Maximização da performance de ruminantes através de seleção genômica para ótima interação de genomas de ruminantes individuais e perfis da microflora do rúmen

[001025] Os ruminantes são únicos em sua capacidade para tornar forragem de baixa qualidade em carne, leite e fibra. Esta capacidade única é uma consequência do rúmen, um órgão do trato digestivo o qual é hospedeiro para vastas multitudões de bactérias e outros micro-organismos. O perfil de micro-organismos do rúmen pode ser obtido tomando uma amostra de fluido do rúmen, ou alternativamente por perfis das fezes, e contando a abundância de espécies, por exemplo, através de sequenciamento metagenômico. Este perfil difere entre espécies de ruminantes e entre indivíduos. Diferenças no perfil do rú- men podem ser associadas com diferenças na eficiência de conversão alimentar, na composição do leite e nos resultados de saúde. Portanto, a seleção para maximizar a performance fenotípica de ruminantes pode ser realizada através de seleção genômica para ótimo genoma do ruminante individual por perfil do rúmen. Como o número de micro-organismos no rúmen ser muito grande, e o número de genes nos genomas de ruminantes é de aproximadamente 20.000, é necessário um algoritmo genético para priorizar a combinação de amostras baseada em diversidade.

Exemplo 38 - Método de inoculação com endófita em azevém perene

[001026] Este exemplo descreve o aumento da frequência de inoculação com endófita depois de puncionamento de embriões isolados de azevém perene com uma agulha hipodérmica antes de inoculação usando o método 1 (inoculação direta) ou o método 2 (revestimento com camada de alginato de Ca contendo endófita).

[001027] Embriões isolados a partir de sementes de azevém perene foram inoculados com endófita NEA11 usando um ou outro dos métodos 1 ou 2, com suspensões de endófitas em diferentes taxas de diluição (1/4, 1/8, 1/16; vide a Figura 183) submetidas, com e sem ferimento dos embriões com uma agulha hipodérmica. O puncionamento dos embriões antes da inoculação aumentou muito a eficiência da inoculação, demons-trado por detecção de endófita à base de SSR em simbiota de 6 semanas de idade recuperado a partir de sementes artificiais derivadas de embriões inoculados (vide a Tabela 64). Endófita Detectado

[001028] Método 1: lnoculação Direta de Embriões isolados com Suspensão de Endófitas Antes de Revestimento com Alginato de Ca

[000933] Método 2: Revestimento Direto de Embriões isolados com Camada de Alginato de Ca Contendo Endófita Tabela 64: Número e frequência de plantas de azevém perene inoculadas com endófita recuperadas depois de diferentes métodos de tratamento de inoculação com endófita

Exemplo 39 — Método de inoculação com endófita em azevém perene e festuca alta

[001029] Este exemplo descreve o aumento da frequência de inoculação com endófita depois de puncionamento de embriões isolados de azevém perene (L. perenne) e festuca alta (F. arundinacea) com uma agulha hipodérmica antes de inoculação usando o método 1 (inoculação direta) ou o método 2 (revestimento com camada de alginato de Ca contendo endófita).

[001030] Método 1: lnoculação Direta de Embriões isolados com Suspensão de Endófitas Antes de Revestimento com Alginato de Ca

[001031] Método 2: Revestimento Direto de Embriões isolados com Camada de Alginato de Ca Contendo Endófita

[001032] Embriões isolados a partir de sementes de diferentes variedades foram inoculados com diferentes endófitas (NEA11 e NEA17) usando um ou outro dos métodos 1 ou 2, com e sem ferimento dos embriões com agulha hipodérmica. O puncionamento dos embriões antes da inoculação aumentou muito a eficiência da inoculação, demonstrado por detecção de endófita à base de SSR em simbiota de 6 semanas de idade recuperado a partir de sementes artificiais derivadas de embriões inoculados (vide a Tabela 65).

Tabela 64: Número e frequência de plantas de azevém perene e de festuca alta inoculadas com endófita recuperadas depois de diferentes métodos de tratamento de inoculação com endófita Exemplo 40 - Um método para verificar o genótipo do hospedeiro por interação do perfil microbioma em gado bovino leiteiro

[001033] Aqui, foi descrito um método para mapear regiões do ge- noma do hospedeiro que afetam o perfil microbiano do rúmen, e ilustram isto com um exemplo.

Métodos

[001034] O método consiste em testar de modo eficaz grandes números de polimorfismos de DNA do hospedeiro para seu efeito sobre perfis do microbioma do rúmen.

[001035] Um perfil do microbioma do rúmen consiste, para cada vaca, das contagens de leituras de sequência derivadas de uma amostra de rúmen que mapeiam para qualquer uma das espécies, ou contigs de um conjunto de metagenoma do rúmen, ou sequências 16S (por exemplo, vide Brulc et al. 2009, Hess et al. 2011).

[001036] O mapeamento da matriz de contagens por vaca para cada um de n contigs ou espécies, ou conjuntos parciais de espécies, pode ser então tratado como fenótipos em uma ampla associação de ge- noma com polimorfismos de DNA do próprio genoma dos hospedeiros, de modo que um modelo pode ser ajustado aos dados:

[001037] onde para cada contig/espécie/conjunto de espécies parciais, y é o vetor de contagens para m vacas, mu é a média, X é m x 1 vetor do projeto atribuindo o genótipo do hospedeiro para o registro, e e é um vetor de efeitos residuais aleatórios.

[001038] Como é provável que n, o número de contigs/espécies ou conjuntos de espécies parciais seja grande, a potência para identificar polimorfismos de DNA no genoma do hospedeiro pode ser aumentada considerando associações através dos contigs/espécies/conjuntos parciais. Isto pode ser feito de modo eficaz conduzindo o estudo de ampla associação de genoma para cada contig, em seguida acumulando a informação de todos os contigs, tomando a região mais significativa para cada contig, e em seguida avaliando a proporção de vezes através de todos os contigs que a região é a mais significativa. Isto pode identificar reguladores de hospedeiros principais de perfis de mi- crobioma do rúmen. Isto pode ser feito em janelas deslizantes de 100 kb, de modo a considerar o efeito de desequilíbrio de ligação altamente variável em populações de gado bovino.

Exemplo

[001039] Os dados foram de 15 vacas leiteiras Holstein -Fresian, pastando na estação de pesquisa DPI Ellinbank. Cada vaca tinha ge- nótipos para 624.930 SNP, da série Illumina Bovine HD.

[001040] Amostras de rúmen foram colhidas de cada uma das vacas durante um experimento de medição de metano. Foi extraído o DNA para cada amostra, e foram preparadas bibliotecas de fragmentos ale- atórios de 300bp. Em seguida foi realizado sequenciamento de extre-midade pareada no Illumina HiSeq. As leituras de sequência foram mapeadas para o conjunto do metagenoma do rúmen (8092 contigs) descrito por Hess et al. 2011.

[001041] São mostrados estudos de ampla associação de cinco ge- nomas de exemplo (para cinco contigs diferentes) na Figura 184.

[000948] Foi identificada uma região sobre o cromossoma 21 que pode ser um regulador principal de perfis de microbioma do rúmen, uma vez que está associada com contagens de leituras de sequência em 3 dos cinco contigs. Referências Albrecht, T, V. Wimmer, H.J. Auinger, M. Erbe, C. Knaak, M. Ouzunova, H. Simianer, and C.C. Schon, 2011 : Genome-based prediction of testcross values in maize. Theor. Appl. Genet. 123, 339-350. Auzanneau, J., C. Huyghe, B. Julier, and P. Barre, 2007: Linkage disequilibrium in synthetic varieties of perennial ryegrass. Theor. Appl. Genet. 92, 837-847. Baird, N.A., P.D. Etter, T.S. Atwood, M.C. Currey, A.L. Shiver, Z.A. Lewis, E.U. Selker, W.A. Cresko, and E.A. Johnson, 2008: Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers. PLoS One 3, e3376. Beavis W.D., 1994: QTL analysis: power, precision and accuracy. ln: A. Paterson (ed.) Molecular Dissection of Complex, Traits, 145-162. CRC, Boca Raton, Louisiana, USA. Braazauskas, G., I. 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Claims (10)

1. Método para produzir uma planta aprimorada, caracteri-zado pelo fato de que inclui: (i) fornecer uma biblioteca de germoplasma de planta; e uma biblioteca de simbiontes; (ii) inocular a biblioteca de germoplasma de planta com um ou mais simbiontes selecionados a partir da biblioteca de simbiontes para gerar simbiontes; (iii) selecionar, triar e/ou avaliar o germoplasma ou simbiota inoculado quanto à(s) característica(s) de simbiota desejada(s); e (iv) subsequentemente identificar, cultivar ou usar o simbi- ota que exibe as características desejadas para produzir a planta aprimorada, sendo que: a referida biblioteca de germoplasma inclui centenas a mi-lhares de genótipos; a referida biblioteca de simbiontes inclui dezenas a centenas de genótipos; a referida etapa (iii) inclui uma etapa de análise genética e/ou análise metabólica; e o referido germoplasma de planta está presente como em-brião; e a referida etapa de inoculação inclui revestimento do referido embrião com uma camada de revestimento que contém simbionte para formar uma semente artificial; sendo que o simbionte é selecionado de um ou mais dentre fungos, vírus, bactérias e outros micróbios; e sendo que a planta é uma gramínea ou leguminosa.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o(s) simbionte(s) inclui(em) uma variação genética sele- cionada para aprimorar a introgressão da característica do simbionte.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a variação genética é introduzida por meio de um ou mais mutagênese aleatória, di-poli-ploidização, mutagênese direcionada, cisgênese; transgenese; e intragênese.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que organismo tem compatibilidade simbiótica com um endófito.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o embrião é tratado para criar um ou mais pontos de entrada para o simbionte.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa de triagem (iii) inclui triagem de sementes arti-ficiais e/ou seus descendentes quanto à compatibilidade e/ou estabili-dade por meio de envelhecimento acelerado e seleção de simbiotas que exibem as características desejadas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que inclui ainda submeter o simbiota selecionado a um teste rápido de viabilidade de endófitos.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que inclui: (i) fornecer uma biblioteca de germoplasma de planta; e uma biblioteca de endófitos e/ou epífitas e/ou microbiomas associados a plantas; (ii) inocular a biblioteca de germoplasma de planta com um ou mais endófitos e/ou epífitas e/ou microbiomas associados a plantas selecionados a partir da biblioteca para gerar simbiotas; (iii) selecionar, triar e/ou avaliar o germoplasma ou simbiota inoculado quanto à(s) característica(s) de simbiota desejada(s); e (iv) subsequentemente identificar, cultivar ou usar o simbi- ota que exibe as características desejadas para produzir a planta aprimorada.

9. Método para seleção genômica de associações de plan- ta-simbionte, caracterizado pelo fato de que inclui: (i) fornecer uma biblioteca de amostras de ácido nucleico da referida associação de planta-simbionte obtida por meio de um método de acordo com a reivindicação 1; (ii) analisar as referidas amostras usando metagenômica para obter um perfil genético para cada amostra; (iii) selecionar associações de planta-simbionte com um perfil genético e metabólico desejado; (iv) fornecer uma associação de planta-simbionte; (v) submeter a referida associação de planta-simbionte a uma ou mais condições ambientais; e (vi) preparar uma biblioteca de amostras de ácido nucleico de cada uma das associações de planta-simbionte ambientalmente tratadas.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido simbionte é um microbioma bacteriano.

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