BR112014029962B1 - Sementes artificiais compreendendo simbionte e método para a preparação das mesmas - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA GERAÇÃO EM LARGA ESCALA DE SEMENTES ARTIFICIAIS COMPREENDENDO SIMBIOTA. A presente invenção refere-se a novos métodos de seleção e reprodução de organismos, em organismos particulares que exibem comportamento simbiótico com simbiontes, como endófitos de fungos ou epífitas ou microbioma bacteriana em plantas, e aos novos organismos e simbiota desenvolvidos assim. Mais particularmente, a presente invenção proporciona sementes artificiais compreendendo simbiota, e métodos para a preparação e utilização de tais sementes artificiais, bem como plantas, sementes de plantas e outras partes das plantas derivadas de sementes artificiais ou plantas contendo simbiontes da presente invenção.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a novos métodos de seleção e reprodução genética de organismos, em organismos particulares que exibem comportamento simbiótico com simbionte, tais como endófitos fúngicos ou epífitos ou microbioma bacteriano em plantas, e a novos organismos e simbiota desenvolvidos assim.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O fenótipo de muitas espécies de gado, lavouras e pastagens depende da interação entre o genótipo do indivíduo e o genótipo de um simbionte. Plantas importantes, incluindo gramíneas forrageiras, legumes, árvores, arbustos e trepadeiras são comumente encontradas em associação com endófitos incluindo fungos, bactérias, vírus e micróbios. Similarmente, os animais importantes, incluindo gado, ovelhas, porcos, cabras, etc. têm tais endófitos presentes no seu intestino e rúmen.

[003] Ambas as propriedades hortícolas, agronômicas e veterinárias benéficas e prejudiciais resultam de tais associações, inclusive melhoraram a tolerância ao estresse hídrico e de nutrientes e resistência a pragas de insetos.

[004] Por exemplo, plantas de azevém podem mostrar uma melhor tolerância à seca e persistência se um endófito fúngico do genótipo correto coloniza a planta. Da mesma forma, em gramas, resistência a insetos pode ser fornecida pelos metabolitos específicos produzidos pelo endófito, em especial alcaloides lolina e peramina. Outros metabólitos produzidos pelo endófito fúngico, por exemplo, lolitrems e alcaloides de cravagem do centeio, podem ser tóxicos para os animais que pastam e reduzem o ataque dos insetos herbívoros.

[005] Variação considerável é conhecida por existir no perfil dos metabolitos de simbionte, tais como endófitos. Por exemplo, cepas de endófitos fúngicos que faltam uma ou ambas as toxinas animais foram introduzidos em variedades comerciais de azevém.

[006] Nos animais, os micro-organismos presentes no intestine são responsáveis por digestão do alimento do animal. Simbiota bovina de micróbios do rúmem pode ser importante em, por exemplo, melhorar da eficiência de conversão alimentar e redução da produção de metano. Em ruminantes, a digestão bem-sucedida de alimentação de má qualidade pode depender de ter um perfil do microbioma do rúmen específico.

[007] Marcadores genéticos moleculares, tais como marcadores de repetição de sequência simples (SSR) foram desenvolvidos como testes de diagnóstico para distinguir entre taxa simbionte e detectar a variação genética dentro de taxa. Os marcadores podem ser usados para discriminar cepas simbióticas com diferentes perfis de toxina.

[008] No entanto, continua a existir uma necessidade por métodos para identificar, isolar e/ou caracterizar os organismos que exibem comportamento simbiótico com simbionte, tais como endófitos. Dificuldades na reprodução artificial dessa simbiota limitam a sua utilidade. Por exemplo, muitos dos novos endófitos que se sabe são benéficos para agricultura baseada em pasto exibem baixa frequência de inoculação e são menos estáveis em plasma germinativo de elite.

[009] Além disso, em técnicas tradicionais de reprodução, por exemplo, em gramíneas forrageiras, como azevém perene e festuca, variedades de gramíneas são criadas usando técnicas de cruzamento clássicas e genótipos de capim são selecionados por suas características superiores, depois de monitorar seu desempenho durante um período de vários anos. Os genótipos de capim selecionados que formam a variedade experimental são então inoculados com um único endófito e as associações de endófitos de grama resultantes são avaliadas para quaisquer características favoráveis tais como resistência a insetos. As variedades sintéticas experimentais individuais implementando um único endófito nelas são então avaliadas por desempenho agronômico e desempenho animal resultante por animais pastando ao longo de um período de anos. Este processo de avaliação pode revelar que o único endófito sendo implantado nas diferentes variedades sintéticas experimentais pode não mostrar estabilidade vegetativo e/ou intergeracional em algumas destas variedades ou o perfil desejado de alcaloide conferido pelo único endófito pode variar entre diferentes variedades sintéticas deixando de conferir níveis adequados de resistência a insetos ou causar toxicoses animais. Seria um avanço significativo na técnica se este processo consumidor de tempo puder ser acelerado ou de outra forma melhorado.

[0010] Por conseguinte, é um objetivo da presente invenção superar, ou pelo menos aliviar, uma ou mais das dificuldades ou deficiências relacionadas com a técnica anterior.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] Pedidos de patente dos Estados Unidos depositados em 1 de junho de 2012 e 07 de setembro de 2012, intitulados "Novel Organisms", cujas descrições completas são aqui incorporadas por referência, descrevem métodos de implantação de vários simbionte em vários organismos e para selecionar uma melhor compatibilidade e desempenho simbiótico inicial no processo de reprodução. Isso é, combinações genotípicas de organismos simbionte são criadas e selecionadas para características desejadas incluindo melhor compatibilidade e desempenho de simbiota ab initio. Para facilitar este processo, os requerentes têm desenvolvido métodos para criação em larga escala de simbiota através de métodos de produção e inoculação de sementes artificiais.

[0012] Em conformidade, em um primeiro aspecto da presente invenção, é proporcionado um método para a preparação de sementes artificiais, cujo método inclui:

[0013] proporcionar uma fonte de sementes de plantas;

[0014] submeter as sementes (s) a uma etapa de esterilização em superfície;

[0015] isolar embrião (s) de semente da semente (s) esterilizada na superfície; e

[0016] revestir o embrião (s) com um revestimento para formar semente artificial (s).As sementes podem ser de qualquer planta adequada. A planta pode ser um grama, de preferência um grama perene, legume, videira, arbusto, árvore, erva, flor, arbusto ou matagal. O método de acordo com este aspecto da presente invenção é particularmente aplicável às ervas e leguminosas.

[0017] As sementes podem ser esterilizadas na superfície por qualquer técnica apropriada. Preferivelmente, as sementes são esterilizadas por tratamento com um ácido tal como ácido clorídrico e agente de branqueamento, tal como hipoclorito de sódio. De preferência, os tratamentos com ácido e agente de branqueamento são executados sequencialmente. O tratamento com ácido pode ser por um período de desde 1 hora a 24 horas, de preferência durante a noite. O tratamento com um agente de branqueamento pode ser por um período de 5 minutos a 1 hora, de preferência cerca de 20 minutos. O tratamento com um agente de branqueamento pode ser realizado duas vezes em dias sucessivos, com as sementes sendo lavadas depois de cada tratamento, por exemplo, utilizando água destilada estéril e armazenadas a cerca de 4 a 30 °C, de preferência cerca de 24 °C.

[0018] Os embriões podem ser isolados das sementes tratadas por técnicas conhecidas dos versados na técnica.

[0019] Em uma modalidade preferida, os embriões podem ser tratados para criar um ou mais pontos de entrada para o simbionte, por exemplo, endófito. Por exemplo, o embrião pode ser perfurado ou danificado de outro modo na sua superfície, por exemplo, por raspagem ou ataque químico, para facilitar a entrada do simbionte. Em uma modalidade particularmente preferida, uma agulha hipodérmica ou similar pode ser usada para criar perfurações únicas ou múltiplas na superfície do embrião.

[0020] O revestimento pode ser de qualquer tipo adequado para encapsular o embrião, incluindo alginato, ágar, Polyco 2133, carbóxi metil celulose, carragenina, gelrite, guargum, pectato de sódio, goma de tragacanto e similares. Em uma modalidade preferida, o revestimento é o alginato, mais particularmente, o alginato de cálcio.

[0021] Em uma modalidade preferida, os embriões podem ser misturados com o revestimento e as gotas de revestimento contendo embriões individuais colocadas em uma solução de polimerização, tal como solução de cloreto de cálcio, de preferência com agitação, para formar sementes artificiais. Sementes artificiais podem ser cobradas na sequência de cerca de 1-60 minutos de agitação, de preferência depois de aproximadamente 15 minutos, mexendo.

[0022] Em uma modalidade preferida, os embriões podem ser inoculados com um simbionte, tais como um endófito fúngico antes do revestimento. Em uma forma preferida, os embriões podem ser diretamente inoculados com micélio de endófito.

[0023] Alternativamente, em uma modalidade particularmente preferida, os embriões isolados podem ser revestidos com uma camada de revestimento contendo simbionte, tal como uma camada de revestimento contendo endófito fúngico.

[0024] Nesta modalidade, a etapa de inoculação pode incluir:

[0025] proporcionar uma fonte de embriões de sementes;

[0026] inocular os embriões com um ou mais simbionte, como endófitos fúngicos; e

[0027] revestir o embrião inoculado (s) com um revestimento para formar semente artificial (s).Alternativamente, a etapa de inoculação pode incluir:proporcionar uma fonte de embriões de sementes; e revestir os embriões com um revestimento contendo simbionte, tais como endófitos fúngicos para formar semente artificial (s).

[0028] Em uma modalidade preferida, as sementes podem ser duplamente revestidas com uma segunda camada de revestimento. De preferência, a segunda camada de revestimento é o alginato, mais preferivelmente alginato de cálcio, mesmo mais de preferência, alginato de cálcio colorido. Em uma modalidade preferida, as sementes artificiais com a primeira camada de revestimento podem ser secas ao ar antes do revestimento com a segunda camada.

[0029] Em uma modalidade preferida, o método pode ainda incluir revestir sementes artificiais com uma segunda camada de revestimento, a referida segunda camada de revestimento de preferência contendo nutrientes adicionados adequados para sustentar o embrião e/ou simbionte.

[0030] Alternativamente, a segunda camada de revestimento pode não conter nutrientes adicionados, esta camada privada de nutrientes foi concebida para, por exemplo, reduzir endófito fora de crescimento durante a germinação e restringir crescimento de endófito em estreita proximidade com o embrião.

[0031] Em outro aspecto da presente invenção, proporciona-se uma semente artificial selecionada dentre o grupo consistindo em:

[0032] (a) um embrião de planta inoculado com um ou mais simbionte e revestido com um revestimento para encapsular o embrião; e

[0033] (b) um embrião de planta revestido com uma camada de revestimento contendo simbionte.Preferivelmente, a semente artificial é duplamente revestida com uma segunda camada de revestimento. A segunda camada de revestimento pode incluir nutrientes adicionados ou pode ser uma camada privada de nutriente, tal como aqui descrito.

[0034] De preferência, o embrião é a partir de uma planta selecionada a partir do grupo consistindo em gramíneas e leguminosas. De preferência, é isolado por técnicas como aqui descritas. De preferência, o embrião é tratado para criar um ou mais pontos de entrada para o simbionte.

[0035] Em uma modalidade particularmente preferida, simbionte pode ser um endófito fúngico.

[0036] Em uma outra modalidade particularmente preferida, a semente artificial pode ser produzida por um método tal como aqui anteriormente descrito.

[0037] Em uma modalidade preferida, o método da presente invenção pode incluir ainda cultivar as sementes artificiais para formar plântulas ou mudas; e triar as plântulas ou mudas para a presença de simbionte tal como a presença de endófito fúngico.

[0038] A etapa de cultivar as sementes artificiais pode ser realizada utilizando qualquer meio de crescimento adequado. Um meio de germinação, tais como MS (Murashige e Skoog), MS modificado ou MS + BAP (6-benzilamino purina) é particularmente preferido.

[0039] As mudas podem, por exemplo, ser selecionadas para específicas de simbionte, por exemplo, repetições de sequência simples específicas de endófito fúngicos (SSRS).

[0040] Um programa de descoberta de endófito de larga escala tem sido empreendido para estabelecer a "biblioteca" de cepas de endófito fúngico. Uma coleção de adesões de azevém perene e festuca tem sido estabelecida.

[0041] Os endófitos selecionados para inocular o embrião podem ser selecionados utilizando as técnicas descritas em um pedido de patente australiano depositado em 1 de junho de 2012, intitulado "Novel Endophytes", para requerente da presente invenção, a descrição completa é aqui incorporada por referência. Os novos endófitos aí descritos são particularmente preferidos.

[0042] A análise genética de endófitos nestas adesões levou à identificação de um número de cepas de endófitos novos. Essas novas cepas de endófitos são geneticamente distintas de cepas de endófitos conhecidas. Caracterização metabólica pode ser realizada para determinar o perfil de toxina destas cepas.

[0043] A detecção específica de endófitos em planta com marcadores microssatélites pode ser usada para confirmar a presença e identidade de cepas de endófitos artificialmente inoculadas em, por exemplo, plantas, linhagens de plantas, variedades de plantas e cultivares de plantas.

[0044] O plasma germinativo inoculado pode ser testado por análise genética e/ou perfil metabólico. Por exemplo, podem ser utilizadas técnicas de análise genética descritas no pedido provisório de patente australiana intitulado "Novel Endophytes".

[0045] Alternativamente, ou em adição, o plasma germinativo inoculado pode ser submetido à análise genética (caracterizada geneticamente) para demonstrar a diferença genética de simbiota de genótipo de simbionte conhecido e para confirmar a identidade de simbionte, por exemplo, endófito fúngico, cepas artificialmente inoculadas em, por exemplo, plantas, linhagens de planta, variedades de plantas e cultivares de plantas.

[0046] Por 'análise genética’ significa analisar o DNA nuclear e/ou mitocondrial de simbionte tais como o endófito fúngico.

[0047] Esta análise pode envolver a detecção da presença ou ausência de marcadores polimórficos, tal como repetições de sequências simples (SSRs) ou marcadores tipo combinação. SSRs, também chamados microssatélites, são baseados em um elemento central de 1-7 nucleotídeos, mais tipicamente um elemento central de 14 nucleotídeos, que é repetido em tandem. A matriz SSR está incorporada em sequências de DNA que flanqueiam complexos. Os microssatélites são pensados para surgir devido à propriedade de deslizamento de replicação, em que a enzima de DNA polimerase pausa e brevemente desliza em termos de seu molde, de modo que sequências adjacentes curtas são repetidas. Alguns motivos de sequências são mais propensos a deslizar do que os outros, dando origem a variações nos números relativos de loci de SSR com base em diferentes tipos de motivos. Uma vez duplicada, a matriz SSR pode expandir ainda mais (ou contrair), devido a novos deslizes e/ou troca de cromátides irmãs desigual. O número total de locais SSR é alto tal que, em princípio, tais loci são capazes de fornecer etiquetas para qualquer gene ligado.

[0048] SSRs são altamente polimórficas devido à variação no número de repetição e são herança codominante. A sua detecção é baseada na reação em cadeia polimerase (PCR), requerendo apenas pequenas quantidades de DNA e são adequadas para a automatização. Elas são ubíquas em genomas eucarióticos, incluindo fungos e plantas genomas, e verificou-se que ocorrem a cada 21-65 kb em genomas de plantas. Consequentemente, SSRs são marcadores ideais para uma ampla gama de aplicações, tais como análise de diversidade genética, identificação genotípica, mapeamento do genoma, mapeamento de traço e seleção assistida por marcadores.

[0049] Marcadores de SSR conhecidos que podem ser utilizados para investigar a diversidade do endófito em azevém perene são descritos em van Zijll de Jong et al. (2003) Genome 46 (2): 277-290.

[0050] Alternativamente, ou em adição, a análise genética pode envolver a sequenciamento genômico e/ou DNA mitocondrial e realizar comparações de sequências para analisar a variação genética entre simbionte, tais como endófitos fúngicos.

[0051] O symbiotum derivado da semente artificial estabelecido a partir do embrião inoculado de simbionte pode ser submetido à análise metabólica para identificar a presença de características metabólicas desejadas.

[0052] Por 'análise metabólica' significa analisar metabolitos, em particular toxinas, produzidos pelos simbiontes, como endófitos fúngicos. De preferência, isto é feito pela geração de plantas inoculadas em cada um dos simbionte e medição de níveis de toxina, por exemplo, resistência a pragas e/ou doenças, ou tolerância a estresse de água e/ou nutrientes na planta. Mais de preferência, isto é feito pela geração de plantas inoculadas isogenicamente para cada um dos simbiontes e medição de níveis de toxina na planta.

[0053] Por um "perfil genético e metabólico desejado" entende-se que o simbionte, tal como um endófito fúngico possui características genéticas e/ou metabólicas que resultam em um fenótipo benéfico em um organismo abrigando, ou de outra forma associado com o simbionte.

[0054] Tais propriedades benéficas incluem a tolerância ao estresse a água e/ou nutrientes, maior resistência a pragas e/ou doenças, tolerância ao estresse biótico melhorada, tolerância à seca melhorada, maior eficiência no uso da água, maior tolerância a temperaturas extremas, toxicidade reduzida, maior disponibilidade de nutrientes e aumento de vigor em, por exemplo, uma planta com o qual o simbionte está associado, relativamente a uma planta de controle sem simbionte ou contendo um simbionte de controle, tal como endófito tóxico padrão (ST).

[0055] Tais propriedades benéficas também incluir toxicidade reduzida da planta associada a animais no pasto.

[0056] Por exemplo, a tolerância a estresse a água e/ou nutrients pode ser aumentada em pelo menos cerca de 5%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 25%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 100%, em relação a um simbionte de controle, como endófito ST ou a uma planta sem simbionte de controle. De preferência, a tolerância ao estresse à água e/ou nutrientes pode ser aumentada por entre aproximadamente 5% e aproximadamente 50%, mais preferivelmente entre aproximadamente 10% e aproximadamente 25%, em relação a um simbionte de controle tal como endófito ST ou a uma planta de controle sem simbionte.

[0057] Por exemplo, a resistência de plantas a pestes e/ou doenças pode ser aumentada em pelo menos cerca de 5%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 25%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 100%, relativamente a uma planta de controle. De preferência, a resistência das plantas às doenças e/ou pragas pode ser aumentada por entre aproximadamente 5% e aproximadamente 50%, mais preferivelmente entre aproximadamente 10% e aproximadamente 25%, em relação a uma planta de controle.

[0058] Por exemplo, a eficiência do uso da água e/ou vigor da planta podem ser aumentados em pelo menos cerca de 5%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 25%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 100%, em relação a um controle, tais como simbionte endófito ST ou a uma planta de controle não simbiótica. De preferência, a tolerância a estresse a água e/ou nutrientes pode ser aumentada por entre aproximadamente 5% e aproximadamente 50%, mais preferivelmente entre aproximadamente 10% e aproximadamente 25%, em relação a um controle, tais como simbionte endófito ST ou a uma planta de controle não simbionte.

[0059] Por exemplo, toxicidade pode ser reduzida em pelo menos cerca de 5%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 10%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 25%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 100%, em relação a um simbionte de controle tal como endófito ST ou a uma planta controle sem simbionte. De preferência, a toxicidade pode ser reduzida entre aproximadamente 5% e aproximadamente 100%, mais preferivelmente entre aproximadamente 50% e aproximadamente 100% em relação a um simbionte de controle, tal como um endófito ST ou uma planta de controle não simbiótica.

[0060] Em uma modalidade preferida, toxicidade pode ser reduzida para uma quantidade insignificante ou toxicidade substancialmente nenhuma.

[0061] Em uma modalidade preferida, o simbionte, tal como um endófito fúngico pode apresentar um perfil de toxina desejado.

[0062] De preferência, o endófito é isolado de uma espécie de festuca, de preferência a festuca.

[0063] De preferência, o endófito é do gênero Neotyphodium, mais preferivelmente é de uma espécie selecionada dentre o grupo que consiste em N uncinatum, N coenophialum e N lolii, com maior preferência N coenophialum. O endófito pode também ser do gênero Epichloe, incluindo E typhina, E baconii e E festucae. O endófito pode também ser do grupo de fora de não-Epichloe. O endófito pode também ser de uma espécie selecionada dentre o grupo que consiste em FaTG- 3 e tipo FaTG-3, e FaTG-2 e tipo FaTG-2.

[0064] O endófito pode também ser do gênero Acremonium, incluindo A. implicatum e endófitos de gramíneas Brachiaria-Urochloa como descrito no pedido de patente australiano No. 2011902393 intitulado "Fungi" e métodos associados, para a presente requerente, a descrição completa é aqui incorporada por referência.

[0065] Por um ‘perfil de toxina desejado’ entende-se que o simbionte tal como um endófito produz significativamente menos alcaloides tóxicos, tais como ergovalina ou lolitrem B, em comparação com uma planta inoculada com um simbionte de controle, tal como endófito tóxico padrão (ST); e/ou significativamente mais alcaloides que conferem propriedades benéficas, tais como a melhoria da tolerância ao estresse à água e/ou nutrientes e uma melhor resistência a pragas e/ou doenças na planta cujo simbionte está associado, tais como peramina, N-formilolina, N-acetilolina e norlolina, mais uma vez, quando comparada com uma planta inoculada com um simbionte de controle, como ST ou com uma planta controle sem simbionte.

[0066] Em uma modalidade particularmente preferida, o endófito pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em E1, NEA10, NEA1 1 e NEA12, que foram depositados no Instituto de Medição Nacional em 5 de Janeiro de 2010, com os números de acesso V10 / 000001, V10 / 000002, V10 / 000003 e V10 / 000004, respectivamente, e são descritos no pedido de patente internacional PCT/AU2011/000020, a descrição completa deles é aqui incorporada por referência.

[0067] Em uma modalidade particularmente preferida, o endófito pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em NEA16, NEA17, NEA18, NEA19, NEA20, NEA21 e NEA23, que foram depositados no Instituto de Medição Nacional em 3 de Abril de 2012 com os números de acesso V12 / 001.413, V12 / 001414, V12 / 001415, V12 / 001416, V12 / 001417, V12 / 001418 e V12 / 001419, respectivamente, e são descritos em um pedido de patente australiana depositado em 1 de junho de 2012, intitulado ‘Novel Endophytos', para a presente requerente, toda a descrição é aqui incorporada por referência.

[0068] Em uma modalidade particularmente preferida, o endófito pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em Acremonium 1.1.A (1.1 A), 3.3.A (3.3 A), 5,1.B (5.1 B), 9.2.A (9.2 A) e 12.1.A (12.1 A), que foram depositados no Instituto de Medição Nacional em 15 de junho de 2011 com números de acesso V11/011370, V11/011371, V11/011372, 1373 V11/011/01 e V11374, respectivamente, os quais estão descritos no pedido de patente australiana No. 1.902.393 intitulado "Fungi and associated methods", para a requerente da presente invenção, toda a descrição é aqui incorporada por referência.

[0069] Tais endófitos podem ter um perfil de toxina desejado tal como aqui anteriormente descrito.

[0070] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o simbionte (s), tais como endófito (s) pode incluir uma variação genética, por exemplo, para melhorar a característica de introgressão do endófito em plantas, tais como ervas para melhorar a estabilidade vegetativa do symbiotum, estabilidade de intergeração do symbiotum, tolerância ao estresse abiótico (por exemplo, estresse hídrico) do symbiotum, tolerância ao estresse biótico (por exemplo, resistência a doenças) do symbiotum, a eficiência de utilização de nutrientes (por exemplo, a eficiência do uso de fósforo, a eficiência de uso de nitrogênio) do symbiotum.

[0071] A variação genética pode ser introduzida utilizando quaisquer técnicas convencionais, por exemplo, através de um ou mais de mutagênese, di / poliploidisação, mutagênese aleatória alvo; cisgênese; transgênese; intragênese.

[0072] Em uma modalidade preferida, o(s) endófito (s) pode(m) ser variantes de endófito como descrito em um pedido de patente australiano depositado em 01 de junho de 2012, intitulado "Designers Endophytes", para requerente da presente invenção, toda a descrição é aqui incorporada por referência.

[0073] Em uma modalidade particularmente preferida, o endófito pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em uma variante de endófito selecionada a partir do grupo que consiste em NEA12dh5, NEA12dh6, NEA12dh13, NEA12dh14, e NEA12dh17, que foram depositados no Instituto de Medição Nacional em 3 de abril de 2012 com a números de acesso V12 / 001408, V12 / 001409, V12 / 001410, V12 / 001411 e V12 / 001412, respectivamente.

[0074] Tais endófitos podem ter um perfil de toxina desejado tal como aqui anteriormente descrito.

[0075] De preferência, o organismo é inoculado com simbionte tal como um endófito por um método selecionado a partir do grupo que consiste em infecção, reprodução, cruzamento, hibridação e as suas combinações.

[0076] Em uma modalidade, a planta pode ser inoculada por inoculação isogênica. Isto tem a vantagem de que os efeitos fenotípicos de simbionte, como endófitos podem ser avaliados na ausência de efeitos genéticos específicos do hospedeiro. Mais particularmente, múltiplas inoculações de endófitos podem ser feitas em plasma germinativo das plantas, e plantas regeneradas transferidas para o solo ou outro meio de crescimento.

[0077] Em uma outra modalidade, uma "biblioteca" de plasma germinativo das plantas podem ser inoculada com múltiplos simbionte tal como endófitos. Isto tem a vantagem de permitir que as associações de endófitos com hospedeiro favorável deve ser estabelecida, identificada e selecionada, ab initio.

[0078] A identificação de um endófito do tipo de acasalamento oposto que é altamente compatível e estável em planta proporciona um meio para reprodução molecular de endófitos para azevém perene. De preferência, a planta pode ser infectada por hiperinoculação.

[0079] Fusão de hifas entre cepas de endófitos do tipo de acasalamento oposto proporciona um meio para o fornecimento de características favoráveis para a planta hospedeira, de preferência através de hiperinoculação. Tais cepas são de preferência selecionadas dentre o grupo incluindo uma cepa de endófitos que exibe as características favoráveis de alta frequência de inoculação e alta compatibilidade com uma vasta gama de plasma germinativo, preferivelmente azevém perene de elite e/ou plasma germinativo hospedeiro de festuca do talo e um endófito que exibe uma baixa frequência de inoculação e baixa compatibilidade, mas tem um perfil de toxina alcaloide altamente favorável.

[0080] As plantas infectadas com simbionte, por exemplo, infectadas com endófitos podem ser cultivadas por técnicas conhecidas. O versado na técnica pode facilmente determinar as condições de cultura apropriadas, dependendo da planta a ser cultivada.

[0081] A etapa de triagem pode incluir análise de metabolitos de plantas. Os metabólitos podem ser analisados por técnicas conhecidas tais como as técnicas cromatográficas ou espectrometria de massa, por exemplo, por HPLC ou LCMS. Em uma modalidade particularmente preferida, plantas infectadas com simbionte, por exemplo, infectadas com endófitos podem ser analisadas por espectrometria de massa de cromatografia líquida de fase reversa (CL). Este método de fase reversa pode permitir a análise de metabólitos específicos (incluindo lolinas, peramina, ergovalina, lolitrem e janthitrems, como janthitrem I, janthitrem G e janthitem F) em uma execução cromatográfica de LCMS de um único extrato de planta infectada com simbionte.

[0082] Em uma modalidade particularmente preferida, os endófitos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em NEA2, NEA3, NEA6, NEA10, NEA11, NEA12, E1, NEA17, NEA21, NEA23, NEA18, NEA19, NEA16, NEA20, NEA12dh5, NEA12dh6, NEA12dh13, NEA12dh14, NEA12dh17, NEA12-DsRed e IRM1-35.

[0083] Em uma outra modalidade particularmente preferida, a análise de LCMS incluindo EIC (cromatograma iônico extraído) pode permitir a detecção dos metabolitos de alcaloides a partir de pequenas quantidades de simbionte infectados, por exemplo, material vegetal infectado com endófito. Identidade de metabolito pode ser confirmada por comparação do tempo de retenção com aquele de toxinas puras ou extratos de plantas infectadas com endófitos com um perfil de toxina conhecido analisado sob substancialmente as mesmas condições e/ou por comparação de padrões de fragmentação de massa, por exemplo, gerada.

[0084] A análise genética pode ser realizada como descrito acima. As mudas podem, por exemplo, ser selecionadas para repetições de sequência de amostra específicas do simbionte (SSRs), por exemplo, específicas de endófito.

[0085] Alternativamente, ou em adição, as mudas podem ser testadas quanto à presença de simbiota favorável através de fenotipagem molecular. A fenotipagem molecular pode ser realizada utilizando os métodos descritos no pedido provisório de patente australiana depositado em 01 de junho de 2012, intitulado "Molecular phenotyping method", para a requerente da presente invenção, toda a descrição é aqui incorporada por referência.

[0086] Neste método, mudas podem ser rastreadas para a presença de simbiota favorável através de fenotipagem molecular. As mudas podem, por exemplo, ser avaliadas para a produção melhorada de alcaloides e/ou razão de carboidrato solúvel em água melhorado para proteína. Tais técnicas podem utilizar um ensaio enzimático, ensaio colorimétrico, SSR, marcadores e/ou outras técnicas de análise metabolômica. Tais análises podem ser semi- ou substancialmente automatizadas.

[0087] Assim, o método pode incluir selecionar simbiota para a presença de características desejáveis, o referido método incluindo fenotipagem molecular de uma população de simbiota.

[0088] Em uma modalidade preferida, o método pode incluir a avaliação da população de simbiota para produção de alcaloides e/ou razão de carboidrato solúvel em água (WSC) para proteína. De preferência, esta avaliação é efetuada utilizando um ou mais métodos selecionados a partir do grupo consistindo em ensaios enzimáticos, ensaios colorimétricos, marcadores de SSR e análise metabolômica.

[0089] Em uma modalidade preferida, a avaliação da produção de alcaloides inclui a medição do perfil de alcaloides e/ou o conteúdo na população. Alcaloides preferidos incluem peramina, lolitrem B e ergovalina. Em uma modalidade preferida, alcaloides podem ser inferidos através de marcadores de SSR e detectados por análise metabolômica, mais preferivelmente uma combinação de marcador SSR e análise metabolômica é utilizada.

[0090] Em uma outra modalidade preferida, razão de WSC para proteína pode ser avaliada. WSC pode ser quantificada utilizando um ensaio enzimático. Em uma modalidade preferida, as concentrações individuais de sacarose, glicose, frutose e frutanos podem ser determinadas. A proteína pode ser quantificada utilizando um ensaio colorimétrico.

[0091] Em uma modalidade particularmente preferida, a proteína pode ser quantificada por um método que inclui:

[0092] extrair proteínas da simbiota usando um álcali, tal como NaOH, de preferência uma solução de NaOH fraca;

[0093] quantificação de proteínas, utilizando um ensaio colorimétrico, tal como ensaio de Bradford.

[0094] Detecção pode ser realizada, por exemplo, utilizando um leitor de placas.

[0095] A simbiota pode ser de qualquer forma adequada, incluindo embriões inoculados, sementes de plantas, sementes em germinação, mudas, plântulas, plantas, etc.

[0096] De preferência, as sementes são derivadas de plantas, infectadas por simbionte por exemplo, infectadas com endófitos, por exemplo, simbiota de planta / endófito.

[0097] No método de acordo com este aspecto da presente invenção, a etapa de triagem pode incluir selecionar as sementes artificiais acelerando envelhecimento, que é descrito em um pedido de patente australiano depositado em 01 de junho de 2012, intitulado "Method for selection of stable symbiota", para a presente requerente, toda a descrição é aqui incorporada por referência.

[0098] Esse pedido de patente descreve um método para avaliar a compatibilidade e/ou estabilidade de simbiota de simbionte de planta, como simbiota de planta / endófito, o referido método, incluindo:

[0099] proporcionar uma fonte de sementes, incluindo simbionte, tal como embriões de plantas inoculados por endófitos fúngicos; e

[00100] selecionar as sementes e/ou seus descendentes para a compatibilidade e/ou estabilidade da associação de planta / simbionte (isto é, simbiota), tais como simbiota de endófito fúngico de planta através da aplicação de envelhecimento acelerado na mesmo.No processo de envelhecimento acelerado, as sementes artificiais, ou os seus descendentes, podem ser submetidos a condições de deterioração, de preferência por meio de alta temperatura e/ou aumento do teor de umidade. Em uma modalidade particularmente preferida, as sementes podem ser expostas a um ambiente de alta umidade relativa. Por exemplo, as sementes podem ser expostas a temperaturas de cerca de -20 a 50 °C, de preferência 10 a 45 °C, mais preferivelmente de 15 a 40 °C, ainda mais preferivelmente de 25 a 40 °C e/ou a níveis de umidade de aproximadamente 60% a 100%, de preferência 80% a 100% por períodos de, por exemplo, cerca de 1 a 30 dias, preferivelmente de 2 a 10 dias, mais preferivelmente 4 a 7 dias.

[00101] Envelhecimento acelerado reduz simbionte, por exemplo, viabilidade de endófito isto é, permite contrasseleção de associações instáveis e permite a classificação de simbiota com base na sua estabilidade.

[00102] Preferivelmente, o método inclui ainda a etapa de submeter as populações de simbiota selecionadas a uma rápida simbionte, tal como ensaio de viabilidade de endófito fúngico.

[00103] Por conseguinte, o método da presente invenção pode ainda incluir avaliar a compatibilidade e/ou estabilidade de uma associação simbiótica de planta (isto é, symbiotum) tal como a simbiota de endófito fúngico de planta incluindo:

[00104] proporcionar uma fonte de sementes, incluindo simbionte por exemplo embriões de plantas inoculados por endófitos fúngicos;

[00105] selecionar as sementes e/ou os seus descendentes para a compatibilidade e/ou estabilidade da associação planta / simbionte (isto é symbiotum), tal como simbiota de endófito fúngico de planta através da aplicação de envelhecimento acelerado ao mesmo; esubmeter as populações de simbiota selecionadas a uma rápida simbionte, tal como ensaio de viabilidade endófito fúngico.

[00106] A etapa de ensaio de viabilidade de acordo com este aspecto da presente invenção pode incluir:

[00107] cultivar as sementes para gerar plântulas, mudas ou sementes em germinação;

[00108] extrair o DNA e/ou RNA das plântulas, mudas ou sementes em germinação; e

[00109] submeter o DNA e/ou RNA extraído a um ensaio para gene (s) específico de simbionte expresso em planta, tal como gene (s) específico de endófito fúngico (s).Preferivelmente, as sementes são derivadas de plantas inoculadas por simbionte, tais como plantas inoculadas por endófitos fúngico.

[00110] Preferivelmente, as sementes são sementes artificiais, como aqui anteriormente descritas.

[00111] As sementes podem ser de qualquer planta adequada. A planta pode ser um grama, de preferência um perene grama, legume, videira, arbusto, árvore, erva, flor, arbusto ou matagal. O método de acordo com este aspecto da presente invenção é particularmente aplicável à ervas e leguminosas.

[00112] O ensaio de viabilidade de endófito rápido é descrito em um pedido de patente australiano depositado em 01 de junho de 2012, intitulado "Method for rapid endophyte viability assessment", para a requerente da presente invenção, toda a descrição é aqui incorporada por referência.

[00113] Preferivelmente, as sementes são cultivadas durante um período relativamente curto de tempo, de modo que uma rápida avaliação da viabilidade de simbionte, tal como viabilidade de endófito fúngico pode ser obtida. Preferivelmente, as sementes são cultivadas durante cerca de 1 a 10 dias, mais preferivelmente 3 a 10 dias, mais preferivelmente 3 a 7 dias, mais preferivelmente 3 a 5 dias.

[00114] Os candidatos descobriram que genes específicos de simbionte, por exemplo, específico de endófito, são expressos neste período de tempo, permitindo que avaliação da viabilidade de simbionte em planta anterior.

[00115] Em uma forma preferida, o DNA / RNA pode ser extraído das folhas de plântulas, mais preferivelmente a partir do epicótilo, hipocótilo ou rebentos embrionários semelhante das mudas. No caso das gramíneas, o DNA / RNA pode ser extraído a partir de perfilhos. Em uma outra forma preferida, o DNA / RNA pode ser extraído a partir de sementes em germinação completa.

[00116] De preferência, o RNA e DNA podem ser coextraídos, de preferência, em uma única etapa. De preferência, o DNA / RNA pode ser extraído de 1 a 10 dias de idade, de preferência 3 a 10 dias de idade, mais preferivelmente 3 a 7 dias de idade, mais preferivelmente 3 a 5 dias de idade do epicótilo, ou rebentos hipocótilos embrionários de plântulas semelhantes, a fim de acelerar o processo.

[00117] O ensaio pode ser um ensaio utilizado para amplificar e quantificar simultaneamente uma molécula de DNA / RNA alvo no DNA / RNA extraído. Preferivelmente o ensaio é um ensaio de reação em cadeia polimerase em tempo real quantitativa (Q-PCR / q-RT-PCR), ou reação em cadeia polimerase cinética (KPCR) ensaio. Em uma forma preferida particularmente, o ensaio pode ser um ensaio de TaqMan ou semelhante.

[00118] Os genes específicos de simbionte tal como genes específicos de endófitos podem ser de qualquer tipo adequado. De preferência, ele é apenas, ou principalmente, altamente expresso na planta. Genes de endófitos fúngicos que codificam as proteínas 7490, 8263, 0005 e 2232, são particularmente preferidos.

[00119] Iniciadores foram concebidos para a amplificação do gene (s) alvo, por métodos conhecidos dos versados na técnica.

[00120] As sementes podem ser de qualquer planta adequada. A planta pode ser um grama, de preferência um perene grama, legume, videira, arbusto, árvore, erva, flor, arbusto ou matagal. O método de acordo com este aspecto da presente invenção é particularmente aplicável às ervas e leguminosas.

[00121] De preferência, as sementes são derivadas de plantas infectadas por simbionte tais como plantas infectadas com endófitos fúngicos por exemplo, simbiota de planta / endófito.

[00122] O método de acordo com este aspecto da presente invenção pode ainda incluir submeter as populações de simbiota selecionadas a fenotipagem para avaliação do desempenho de simbiota e/ou manutenção das características desejadas; e selecionar simbiota para policruzamento para gerar uma variedade de simbiota sintético, por exemplo, por policruzamento.

[00123] Por exemplo, a variedade de simbiota selecionado pode ser submetida a um ensaio de identificação de simbionte, tal como um ensaio de identificação de endófito, seguido por policruzamento para gerar uma semente de próxima geração. Opcionalmente, as etapas acima podem ser repetidas para confirmar a estabilidade de simbiota, características desejadas, simbionte por exemplo, a identidade de endófito fúngico e/ou simbionte por exemplo incidência de endófito fúngico na próxima geração de sementes.

[00124] Por conseguinte, em um outro aspecto da presente invenção, é provido o simbiota melhorado incluindo uma ou mais plantas contendo um ou mais simbiontes tais tal como endófitos fúngicos produzidos utilizando o método descrito acima.

[00125] A planta pode ser um grama, árvore, flor, erva, arbusto ou arbusto, videira ou legume, ou um produto da mesma.

[00126] As etapas do método descritas acima podem ser repetidas para desenvolver gerações posteriores de sementes ou plantas de simbiota.

[00127] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona uma planta, semente de planta ou outra parte de planta derivada de uma planta ou semente artificial contendo simbionte da presente invenção e estavelmente infectada com um simbionte, tal como um endófito fúngico.

[00128] De preferência, a célula de planta, planta, semente de planta ou outra parte de planta é uma grama, mais preferivelmente uma forragem, relva ou erva bioenergia, tais como aquelas do gênero Lolium e Festuca, incluindo L. perenne e L. arundinaceum e dos gêneros Brachiaria e Urochloa, incluindo B. brizantha, B. decumbens, B. humidicola e U. mosambicensis.

[00129] Por "célula de planta" entende-se qualquer célula de autopropagação delimitada por uma membrana semipermeável e contendo plastídeos. Tal célula também requer uma parede celular se for desejada mais propagação. Células de plantas, como aqui utilizado, incluem, sem limitação, culturas de sementes em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecidos de calos, folhas, raízes, rebentos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos.

[00130] Tal como aqui utilizado, exceto quando o contexto exige de outra forma, o termo "compreende" e variações da palavra, tais como "compreendendo", "compreendem" e "compreendido", não pretende excluir outros aditivos, componentes, números inteiros ou etapas.

[00131] A referência a qualquer técnica anterior na especificação não é, e não deve ser tomada como um aviso ou qualquer forma de sugestão de que esta técnica anterior forma parte do conhecimento geral comum na Austrália ou em qualquer outra jurisdição ou que esta técnica anterior possa razoavelmente esperar que seja determinada, entendida, e considerada como relevante por uma pessoa versada na técnica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES NAS FIGURAS:

[00132] A Figura 1 mostra as sementes artificiais geradas através do revestimento de alginato de Ca de embriões de azevém perene usando um revestimento com matriz de alginato de Ca, sem adição de nutrientes.

[00133] A Figura 2 mostra o revestimento de alginato de Ca de embriões de azevém perene em sementes artificiais utilizando revestimento com matriz de alginato de Ca colorida. Sementes artificiais de azevém perene coloridas com Queen Green (90.610); a) sementes artificiais secas ao ar; b) sementes artificiais semeadas em meio de germinação. Sementes artificiais de azevém perene coloridas com a Queen Pink (92.330); c) sementes artificiais secas ao ar; d) sementes artificiais semeadas em meio de germinação.

[00134] A Figura 3 mostra revestimento alginato de Ca de embriões azevém perene em sementes artificiais utilizando revestimento com várias camadas de matriz de alginato de Ca, a) sementes artificiais de azevém perene revestidas com primeiro revestimento de (camada não colorida) camada de alginato de Ca (A) com adição de nutrientes, b) sementes artificiais de azevém perene revestidas com duas camadas de alginato de Ca (primeira camada A; não colorida mais segunda camada B; colorida com Queen Green) com nutrientes adicionados; c) sementes artificiais duplamente revestidas colocadas em meio de germinação.

[00135] A Figura 4 mostra revestimento alginato de Ca de embriões azevém perene em sementes artificiais utilizando revestimento com várias camadas de matriz de alginato de Ca, a) - c) Seções transversais de sementes artificiais de azevém perene revestidas com primeiro revestimento de (não colorida) camada de alginato de Ca (camada A) e segundo revestimento com camada alginato de Ca colorida com Queen Pink ou Queen Green cor (camada B). d) - e) Seções transversais de sementes artificiais de azevém perene revestidas com primeiro revestimento de (não colorida) camada de alginato de Ca (camada A) e segundo revestimento com camada de alginato de Ca colorida com Queen Green (camada B).

[00136] A Figura 5 mostra a germinação de sementes, embriões e sementes artificiais de azevém perene cv. Bronsyn E- (endófito livre, 2668 lotes de sementes). a) sementes originais: 1% de frequência de germinação em papel de filtro; b) sementes esterilizadas em superfície: 10% de frequência de germinação em papel de filtro; c) embriões isolados: 48% de frequência de germinação em meio de germinação; d) sementes artificiais (com meio de germinação): 40% de frequência de germinação em meio MS.

[00137] A Figura 6 mostra a germinação de sementes, embriões e sementes artificiais de perene cv azevém. Bronsyn E + (endófito plus, 2.667 lotes de sementes). a) Sementes originais: 10% de frequência de germinação em papel de filtro; b) sementes esterilizadas em superfície: 30% de frequência de germinação em papel de filtro; c) embriões isolados: 90% de frequência de germinação em meio de germinação; d) sementes artificiais (com meio de germinação): 81% de frequência de germinação em meio MS.

[00138] A Figura 7 mostra a germinação de sementes artificiais e desenvolvimento de mudas derivadas de sementes artificiais em azevém perene.

[00139] A Figura 8 mostra embriões derivados de sementes recentemente isoladas de azevém perene colocadas individualmente em poços de a) 96 poços e b) suspensão de micélio de endófito adicionada a poços individuais e permitidas a parcialmente secar ao ar sob um fluxo laminar antes de c) produção de sementes artificiais revestidas com uma camada de alginato de Ca.

[00140] A Figura 9 mostra as sementes artificiais produzidas por um método.

[00141] A Figura 10 mostra que germinação de sementes artificiais produzidas por método 1.

[00142] A Figura 11 mostra as sementes artificiais produzidas pelo método 2.

[00143] A Figura 12 mostra as sementes artificiais produzidas pelo método 2 com excrescência de endófito.

[00144] A Figura 13 mostra as sementes artificiais produzidas pelo método 3.

[00145] A Figura 14 mostra as sementes artificiais produzidas pelo método 3 com excrescência de endófito

[00146] A Figura 15 mostra germinação de sementes artificiais produzidas pelo método 3.

[00147] A Figura 16 mostra suspensões de endófitos em diferentes taxas de diluição.

Exemplo 1 - Método de Produção em Grande Escala de Simbiota de Endófito de Capim (sementes artificiais)

[00148] O objetivo do trabalho foi desenvolver um método eficiente, robusto e de baixo custo para a produção em larga escala de simbiota de endófito de capim. O método deve ser:

[00149] a) aplicável à inoculação de 10s - 100s de endófito em 100s - 1000s de genótipos de capim;

[00150] b) aplicável ao azevém perene, festuca e Brachiaria; e

[00151] c) aplicável à inoculação de novos e projetos de endófitos com variação genética gerada de novo [isto é, mutagênese induzida (radiação ionizante, colchicina), mutagênese direcionada, transgênese, cisgênese, intragênese, etc.].

[00152] O método deverá permitir reprodução molecular ad initio de próxima geração, seleção e avaliação de simbiota de endófito de capim [em vez de reprodução e seleção de capim hospedeiro seguido de inoculação de endófito e avaliação de simbiota somente].

[00153] As estratégias experimentais - e as etapas experimentais correspondentes - implementadas incluem:

1. Isolar de embrião derivado de sementes de azevém perene em grande escala e produção de sementes artificiais

[00154] A. Desenvolver um método de esterilização em superfície de semente de baixo custo, em larga escala, eficiente;

[00155] B. Desenvolver um método de isolamento de embrião derivado de semente de baixo custo, em larga escala, eficiente;

[00156] C. Desenvolver um método de produção de semente artificial de baixo custo, em larga escala, eficiente;

[00157] D. Testar estágios de frequência e germinação de sementes artificiais;

[00158] E. Avaliar presença de endófito em mudas derivadas de sementes artificiais geradas com embriões isolados de sementes de endófitos plus;

2. Inoculação de endófito em grande escala em sementes artificiais de azevém perene

[00159] F. Desenvolver um método de inoculação de endófito para sementes artificiais de baixo custo, em larga escala e eficiente [com base em inoculação de embrião derivado de sementes com micélio de endófito seguido pela produção de sementes artificiais, incluindo o revestimento duplo / múltiplo (camada interna mais endófito, camada externa como 'pseudoaleurona / endosperma') de sementes artificiais]; e

[00160] G. Avaliar presença de endófito em mudas derivadas de sementes artificiais geradas com embriões isolados de sementes de endófito-minus inoculadas com novos endófitos.

Isolamento de Embrião Derivado de Sementes de Azevém Perene em Grande Escala e Produção de Sementes Artificiais A) Método de Esterilização em Superfície de Semente

[00161] O método de esterilização em superfície de sementes implementado inclui as seguintes etapas:

[00162] Dia 1: sementes foram embebidas em ácido sulfúrico a 10% durante a noite.

[00163] Dia 2: tratadas com 10% de Domestos por 20 min e armazenadas a 24 °C após lavagem com água destilada estéril.

[00164] Dia 3: tratadas com 10% de Domestos por 20 min e armazenadas a 24 °C após lavagem com água destilada estéril, seguido por isolamento do embrião [vide B) abaixo].

[00165] Quatro experimentos independentes foram conduzidos com 200 sementes cada um.

[00166] Nenhuma contaminação de bacteriana ou fungo foi observada.

A) Método de Isolamento de Embrião

[00167] Com base no método de esterilização em superfície de sementes bem-sucedido [vide A) acima], 1.000 embriões derivados de sementes de azevém pode ser isolados por uma pessoa dentro de 4 horas.

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE SEMENTE ARTIFICIAL Revestimento com alginato de Ca de Embriões de Azevém Perene em Sementes artificiais i) Revestimento com matriz de alginato de Ca sem adição de nutrientes

[00168] Para o revestimento com alginato de Ca de embriões de azevém perene em sementes artificiais, utilizando um revestimento com matriz de alginato de Ca, sem adição de nutrientes, as etapas seguintes foram realizadas: • Embriões foram recentemente isolados e misturados com uma solução de alginato de sódio a 3%. • Gotas de alginato foram colocadas em 50 mM de solução de cloreto de cálcio, com agitação a 60 rpm. Cada gota contém um embrião. • Sementes artificiais foram recolhidas após 15 min de agitação e lavadas com água destilada esterilizada o suficiente. • Sementes artificiais foram colocadas em meio de germinação MS ou MS + 1 mg/L de BAP.

[00169] A Figura 1 mostra as sementes artificiais geradas através do revestimento de alginato de Ca de embriões de azevém perene usando um revestimento com matriz de alginato de Ca, sem adição de nutrientes.

ii) Revestimento de matriz de alginato de Ca com adição de nutrientes

[00170] Para o revestimento de alginato de Ca de embriões de azevém perene em sementes artificiais, utilizando um revestimento com matriz de alginato de Ca com nutrientes adicionados, as etapas seguintes foram realizadas: • Embriões foram recentemente isolados e misturados com alginato de sódio a 3% em meio MS modificado, que consiste em MS (sem CaCI2) + 750 mg/L de glutamina + 5μM de CuSO 4 + 1,95 g/L de MES. • Alginato em gotas (contendo embriões individuais) foram colocados em 50 mM de solução de cloreto de cálcio, com agitação a 60 rpm. • Cada gota contém um único embrião isolado derivado de sementes. • Sementes artificiais foram recolhidas após 15 min de agitação e cuidadosamente lavadas com água destilada estéril. • Sementes artificiais foram colocadas em placas de meio MS para a germinação.

iii) Revestimento com matriz de alginato de Ca colorida

[00171] Para o revestimento de alginato de Ca de embriões de azevém perene em sementes artificiais utilizando um revestimento com matriz de alginato de Ca colorida com nutrientes adicionados, as seguintes etapas foram realizadas:

[00172] Os embriões foram recentemente isolados e misturados com alginato de sódio a 3% em meio MS modificado, que consiste em MS (sem CaCI2) + 750 mg/L de glutamina + 5μM de CuSO 4 + 1,95 g/L de MES.

[00173] Diferentes corantes alimentares [isto é, 10 μL/ml de Queen Green (90610) ou Queen Pink (92330)] foram adicionados à solução de revestimento de alginato de sódio para colorir a matriz de revestimento estabelecendo assim estabelecendo a base para demonstrar potencial para o revestimento de multicamada.

[00174] Gotas de alginato (contendo embriões individuais) foram colocadas em 50 mM de solução de cloreto de cálcio, com agitação a 60 rpm.

[00175] Cada gota contém um único embrião isolado derivado de sementes.

[00176] Sementes artificiais foram recolhidas após 15 min de agitação e cuidadosamente lavadas com água destilada estéril.

[00177] Sementes artificiais foram colocadas em placas de meio MS para a germinação.

[00178] A Figura 2 mostra o revestimento de alginato de Ca de embriões de azevém perene em sementes artificiais utilizando revestimento com matriz de alginato de Ca colorida.

iv) Revestimento com múltiplas camadas de matriz de alginato de Ca

[00179] Para o revestimento de alginato de Ca de embriões de azevém perene em sementes artificiais, utilizando um revestimento com múltiplas camadas de matriz de alginato de Ca, as etapas seguintes foram realizadas: • Embriões foram recentemente isolados e misturados com alginato de sódio a 3% em meio MS modificado [consistindo em MS (sem CaC2) + 750 mg/L de glutamina + 5μM de CuSO4 + 1,95 g/L de MES], tal como a primeira camada de revestimento (camada A ) para fazer as sementes artificiais. • Gostas de alginato (contendo embriões individuais) foram colocadas em 50 mM de solução de cloreto de cálcio, com agitação a 60 rpm. Cada gota contém um único embrião isolado derivado de sementes. • Sementes artificiais revestidas com camada A foram recolhidas após 15 min de agitação e cuidadosamente lavadas com água destilada estéril. O diâmetro médio da semente artificial recentemente revestida com camada A é de 4 mm. Sementes artificiais revestidas com camada A foram colocadas em placa de Petri e deixadas secar ao ar durante 1-2 horas em um gabinete de fluxo laminar. O diâmetro da semente artificial seco ao ar revestido com camada A é de 2 mm. • Sementes artificiais secas ao Ar revestidas com camada A foram misturadas com alginato de sódio a 3% em meio MS [consistindo em MS (sem CaCI2) + 750 mg/L de glutamina + 5μM de CuSO4 + 1,95 g/L de MES] coloridas com corante alimentar [isto é, 10 μL/ml Queen Green (90610)] como a segunda camada de revestimento (camada B) para fazer sementes artificiais com duplamente revestidas; seguindo o mesmo procedimento.

[00180] A Figura 3 mostra revestimento de alginato de Ca de embriões de azevém perene em sementes artificiais usando revestimento com múltiplas camadas de matriz de alginato de Ca.

[00181] A Figura 4 mostra o revestimento de alginato de Ca de embriões de azevém perene em sementes artificiais usando revestimento com múltiplas camadas de matriz de alginato de Ca.

[00182] Embriões derivados de sementes recentemente isoladas de azevém perene são colocados individualmente em poços de a) placas de 96 poços ou b) de 384 poços. Com o auxílio de uma seringa descartável, solução de alginato de sódio é adicionada aos poços individuais e embriões individuais em soluções de alginato são carregados na seringa. Com a ajuda da seringa embriões individuais revestidos com uma solução de alginato são deixados em uma solução de CaCI2 para polimerização, sob agitação, para a produção de sementes artificiais. O uso de placa de 96 poços é preferido em relação à placa de 384 poços para a produção de sementes artificiais de azevém perene.

AVALIAÇÃO DE FREQUÊNCIA DE GERMINAÇÃO DE SEMENTES ARTIFICIAIS

[00183] A fim de avaliar a frequência de germinação de sementes artificiais, as seguintes etapas foram realizadas:

Germinação de sementes, embriões e sementes artificiais de azevém perene cv. Bronsyn E (endófito livre, 2668 lotes de sementes)

[00184] Frequência de germinação das sementes foi comparativamente avaliada para (Figura 5):

[00185] a) Sementes originais: 1% de frequência de germinação em papel de filtro;

[00186] b) Sementes esterilizadas em superfície: 10% de frequência de germinação em papel de filtro;

[00187] c) Embriões isolados: 48% de frequência de germinação em meio de germinação;

[00188] d) Sementes artificiais (com meio de germinação): 40% de frequência de germinação em meio MS.

Germinação de sementes, embriões e sementes artificiais de perene azevém cv. Bronsyn E + (endófito plus, 2667 lotes de sementes)

[00189] Frequência de germinação das sementes foi comparativamente avaliada para (Figura 6):

[00190] a) Sementes originais: 10% de frequência de germinação em papel de filtro;

[00191] b) sementes esterilizadas em superfície: 30% de frequência de germinação em papel de filtro;

[00192] c) Embriões isolados: 90% de frequência de germinação em meio de germinação;

[00193] d) Sementes artificiais (com meio de germinação): 81% de frequência de germinação em meio MS.

[00194] A Figura 7 mostra a germinação de sementes artificiais e desenvolvimento de mudas derivadas de sementes artificiais de azevém perene.

AVALIAÇÃO DE PRESENÇA DE ENDÓFITO EM MUDAS DERIVADAS DE SEMENTES ARTIFICIAIS

[00195] A fim de avaliar a presença de endófito em mudas derivadas de sementes artificiais, as seguintes experiências foram realizadas:

Presença de endófito em mudas derivadas de sementes e sementes artificiais de sementes de perene azevém cv. Bronsyn E + (endófito plus, 2.667 lotes de sementes)

[00196] Vinte mudas de sementes de Bronsyn E + (2667) germinadas em papel de filtro foram transferidas para o solo.

[00197] Vinte e cinco mudas de sementes artificiais germinadas geradas com embriões derivados de sementes Bronsyn E plus (2667) foram transferidas para o solo. Os embriões nas sementes artificiais foram esterilizados utilizando tratamento com 10% de H2SO4 durante a noite.

[00198] Após seis semanas de excrescência de mudas derivadas de sementes e sementes artificiais, presença endófito foi avaliada com base no teste de SSR específico de endófito.

[00199] Vinte mudas de sementes germinadas de Bronsyn E plus (2667; contendo endófito ST) em papel de filtro foram transferidas para o solo, levando a 13 de 19 mudas (68%) com teste positivo para presença de endófito ST no teste de SSR específico endófito.

[00200] Vinte e cinco mudas de sementes germinadas artificiais geradas com embriões derivados de sementes de Bronsyn E plus (2667) foram transferidas para o solo. Os embriões em sementes artificiais foram esterilizados utilizando tratamento com 10% de H2SO4 durante a noite, levando a 19 de 23 mudas (83%) com teste positivo para endófito ST no teste de SSR específico de endófito, indicando claramente que os métodos para isolamento de embriões de esterilização em superfície de sementes, em larga escala, e produção de sementes artificiais com revestimento de alginato de Ca não afetam negativamente a viabilidade de um endófito residente.

INOCULAÇÃO DE GRANDE ESCALA DE ENDÓFITOS EM SEMENTES ARTIFICIAIS DE AZEVÉM PERENE

[00201] Foram desenvolvidos diferentes métodos para a inoculação em larga escala de endófitos em sementes artificiais de azevém perene, com exemplos de métodos de 1 a 3 descritos abaixo:

Inoculação de Embriões Isolados Derivados de Semente com Micélio de Endófito e Produção de Sementes Artificiais Infectadas pelo Endófito em Azevém Perene

[00202] Embriões derivados de sementes recentemente isoladas de azevém perene são colocados individualmente em poços de a) de 96 poços e b) suspensão de micélio de endófito adicionada aos poços individuais e deixada parcialmente secar ao ar sob um fluxo laminar antes de c) produção de sementes artificiais revestidas com camada de alginato de Ca (Figura 8).

Método 1: Inoculação Direta de Embriões Isolados com Suspensão de Endófito antes de Revestimento com Alginato de Ca

[00203] Método 1, inoculação de embriões isolados derivados de sementes com micélio de endófito e produção de sementes artificiais infectadas com endófitos em azevém perene, baseia-se na inoculação direta de embriões isolados com endófito antes da suspensão de revestimento de alginato de Ca como se segue:

[00204] Embriões recentemente isolados de azevém perene são incubados com a suspensão de endófito (diluição 1/16) durante 30 minutos à temperatura ambiente em poços individuais de placas de 96 poços.

[00205] Suspensão de inoculação é removida do poço e embriões inoculados são autorizados a parcialmente secar ao ar sobre os discos de papel de filtro.

[00206] Sementes artificiais são produzidas (Figura 9) com embriões inoculados com endófitos com 3% de alginato de sódio contendo meio de crescimento MS modificado [MS (sem CaC2) + 750 mg/L de glutamina + 5μM de CuSO4 + 1,95 g de MES + 1 mg/L de BAP].

[00207] Sementes artificiais são permitidas germinar em meio MS para a germinação.

[00208] Embriões recentemente isolados de azevém perene são diretamente inoculados com suspensão de endófito (diluição 1/8), parcialmente secos ao ar e, em seguida, revestidos com o alginato de Ca, em poços individuais de placas de 96 poços.

[00209] Sementes artificiais de azevém perene diretamente inoculadas com endófito e, em seguida, revestidas com uma camada de alginato de Ca são capazes de germinar no meio de germinação MS (Figura 10).

Método 2: Revestimento Direto de Embriões Isolados com Camada de Alginato de Ca Contendo Endófito

[00210] Método 2, a inoculação de embriões isolados derivados de sementes com micélio de endófito e produção de sementes artificiais infectadas com endófitos em azevém perene, baseia-se no revestimento direto de embriões isolados, com camada de alginato de Ca contendo endófito como se segue:

[00211] Embriões de azevém perene são recém-isolados com suspensão de endófito (diluição 1/16) em poços individuais de placas de 96 poços.

[00212] Duas vezes a concentração de alginato de sódio (6%) do meio MS modificado [MS (sem CaCh) + 750 mg/L de glutamina + 5μM de CuSO4 + 1,95 g de MES + 1 mg/L de BAP] é adicionada aos poços individuais para revestir embriões com uma camada de alginate contendo endófito.

[00213] Sementes artificiais são produzidas com embriões revestidos de camada de endófito (Figura 11).

[00214] Sementes artificiais são permitidas germinar em meio MS para a germinação.

[00215] Embriões de azevém perene são recentemente isolados e revestidos com suspensão de endófito (diluição 1/8 ou 1/16) com o alginato de Ca, em seguida, adicionados para gerar uma camada de alginato contendo endófito revestindo os embriões em poços individuais de placas de 96 poços.

[00216] Após cultura, excrescência de endófito é observada a partir da camada de alginato contendo endófito utilizada para revestir os embriões isolados de azevém perene (independentemente da taxa de diluição de suspensão de endófito utilizada, Figura 12), demonstrando a viabilidade do endófito incluído na camada de revestimento de alginato de Ca.

Método 3: Revestimento Duplo de Sementes Artificiais Geradas de Embriões Isolados Inoculados de Endófito

[00217] Método 3, inoculação de embriões isolados derivados de sementes com o micélio de endófito e produção de sementes artificiais infectadas com endófitos em azevém perene, baseia-se no duplo revestimento de sementes artificiais geradas a partir de embriões isolados inoculados com endófitos como se segue:

[00218] Embriões recentemente isolados de azevém perene são revestidos com uma suspensão de endófito (diluição 1/16), misturado com alginato [6% de alginato de Ca em meio MS modificado (sem CaCh) + 750 mg/L de glutamina + 5μM de CuSO4 +1,95 g de MES + 1 mg/L de BAP] para gerar uma primeira camada de revestimento contendo endófitos em poços individuais de placas de 96 poços.

[00219] Sementes artificiais com uma primeira camada de revestimento de alginato contendo endófito revestindo embriões recentemente isolados de azevém perene são secos em blot em papel de filtro em um fluxo de ar laminar durante 30 minutos e, em seguida, revestidas com uma segunda camada de alginato de 3% de alginato de Ca sem quaisquer nutrientes.

[00220] Sementes artificiais duplamente revestidas com embriões revestidos de camada contendo endófito de azevém perene são então germinadas em meio MS.

[00221] Segundo revestimento com meio desprovido de nutrientes de sementes artificiais inoculadas com endófito visa reduzir excrescência de endófito durante a germinação e restringir o crescimento de endófito em estreita proximidade com embrião isolado de azevém perene (Figura 13).

[00222] Sementes artificiais com uma primeira camada de alginato contendo endófito recentemente revestindo embriões isolados de azevém perene são secas em blot em papel de filtro em um fluxo de ar laminar durante 30 minutos e, em seguida, revestidas com uma segunda camada de alginato de 3% de alginato de Ca sem quaisquer nutrientes.

[00223] Crescimento endófito é restrito principalmente à camada de revestimento interna de alginato por um período de até 3 semanas (Figura 14).

[00224] Embriões de azevém perene são recentemente isolados diretamente na suspensão de endófito (diluição 1/8), em seguida, parcialmente seco ao ar e revestido com uma primeira camada de alginato [3% de alginato de Ca em meio MS modificado (sem CaCl2) + 750 mg/L de glutamina + 5μM de CuSO4 + 1,95 g de MES + 1 mg/L de BAP] em poços individuais de placas de 96 poços.

[00225] Sementes artificiais com embriões inoculados diretamente em endófitos de azevém perene são armazenadas a 4 °C durante a noite e, em seguida, revestidas com uma segunda camada de alginato de 3% de alginato de Ca sem quaisquer nutrientes.

[00226] Sementes artificiais duplamente revestidas com embriões diretamente inoculados com endófito de azevém perene são então germinadas em meio MS.

[00227] Sementes artificiais duplamente revestidas com embriões diretamente inoculados com endófito de azevém perene germinadas em meio MS mostraram taxas de germinação comparáveis ao lote original sementes de utilizadas para o isolamento de embriões (Figura 15).

Avaliação de Presença de Endófito em Mudas Derivadas de Sementes Artificiais com Embriões Derivados de Sementes Inoculados com Endófitos Novos

[00228] A fim de avaliar a presença de endófito em mudas derivadas de sementes artificiais com embriões derivados de sementes inoculados com os novos endófitos (por exemplo NEA11), utilizando o método 1, o seguinte experimento foi realizado:

Presença de Endófito em Mudas Derivadas de Sementes Artificiais Produzidas com Embriões de Sementes de Azevém Perene cv. Bronsyn E- (menos endófito, 2668 lotes de sementes) inoculadas com Novo Endófito NEA11

[00229] Após seis semanas de excrescência de mudas derivadas de sementes artificiais, presença de endófito foi avaliada com base no teste de SSR específico de endófito.

[00230] Vinte e três mudas de sementes germinadas artificiais geradas com embriões derivados de sementes de Bronsyn E Minus (2668) inoculados com NEA11 utilizando o método 1 foram transferidas para o solo. 6 de 23 mudas (isto é, 26%) foram positivas para o teste para presença de endófito NEA11 no teste de SSR específico de endófito demonstrando o estabelecimento de simbiota (Tabela 1). Presença de endófito em simbiota estabelecida a partir de sementes germinadas artificiais geradas com embriões derivados de sementes de azevém perene inoculados com novo endófito NEA11 utilizando o Método 1 foi confirmada depois de 3 meses após a transferência para o solo.Tabela 1 - Avaliação de Presença de Endófito em Mudas Derivadas de Sementes Artificiais com Embriões Derivados de Sementes Inoculadas com Novos Endófitos

INOCULAÇÃO EM GRANDE ESCALA DE ENDÓFITOS MODELOS EM SEMENTES ARTIFICIAIS DE AZEVÉM PERENE

[00231] Inoculação em grande escala de derivados de endófitos modelos de mutagênese induzida por tratamento com colchicina (por exemplo, NEA12dh17) ou derivados de mutagênese de raios X (por exemplo, IRM1-35) em sementes artificiais de azevém perene é realizada utilizando métodos de 1 a 3 acima descrito.

[00232] Embriões recentemente isolados de azevém perene são incubados com a suspensão (diluição 1/16) de endófito modelo (por exemplo, NEA12dh17, IRM1-35) durante 30 minutos à temperatura ambiente em poços individuais de placas de 96 poços.

[00233] Suspensão de inoculação é removida do poço e embriões inoculados são permitidos a parcialmente secar ao ar sobre os discos de papel de filtro.

[00234] Sementes artificiais são produzidas com os embriões modelos inoculados com endófitos com 3% de meio de crescimento MS contendo alginato de sódio modificado [MS (sem CaC2) + 750 mg/L de glutamina + 5μM de CuSO4 + 1,95 g de MES + 1 mg/L de BAP].

[00235] Sementes artificiais são colocadas para germinar em meio MS para a germinação.

[00236] Embriões recém-isolados de azevém perene são diretamente inoculados com suspensão (diluição 1/8) de endófito modelo (por exemplo, NEA12dh17, IRM1-35), parcialmente secos ao ar e, em seguida, revestidos com o alginato de Ca, em poços individuais de placas de 96 poços.

[00237] Sementes artificiais de azevém perene inoculadas diretamente com endófitos modelo (por exemplo, NEA12dh17, IRM1 - 35) e, em seguida, revestidas com camada de alginato de Ca são capazes de germinar em meio de germinação levando à criação de simbiota. Presença de endófito modelo e identidade na simbiota gerada na seguinte inoculação em grande escala de derivados de endófitos modelo de mutagênese induzida por tratamento com colchicina (por exemplo, NEA12dh17) ou derivados de mutagênese de raios X (por exemplo, IRM1-35) em sementes de azevém perene artificiais é demonstrada usando um teste de SSR específico de endófitos.

INOCULAÇÃO EM GRANDE ESCALA DE ENDÓFITOS TRANSGÊNICOS EM SEMENTES ARTIFICIAIS DE AZEVÉM PERENE

[00238] Inoculação em larga escala de endófitos transgênicos derivados de transformação genética de endófito NEA12 com plasmídeo contendo um gene quimérico para a expressão do gene marcador fluorescente DsRed (por exemplo NEA12-DsRed) em sementes artificiais de azevém perene é realizada utilizando o método 1 descrito acima.

[00239] Embriões recentemente isolados de azevém perene são incubados com suspensão (diluição 1/16) de endófito transgênico (por exemplo, NEA12-DsRed) durante 30 minutos à temperatura ambiente em poços individuais de placas de 96 poços.

[00240] Inoculação de suspensão é removida do poço e embriões inoculados são permitidos a parcialmente secar ao ar sobre os discos de papel de filtro.

[00241] Sementes artificiais são produzidas com embriões inoculados com endófitos transgênicos com 3% de meio de crescimento MS modificado contendo alginato sódio [MS (sem CaC2) + 750 mg/L de glutamina + 5μM de CuSO4 + 1,95 g de MES + 1 mg/L de BAP].

[00242] Sementes artificiais são permitidas germinar em meio MS para a germinação.

[00243] Embriões recentemente isolados de azevém perene são diretamente inoculados com suspensão (diluição 1/8) de endófito transgênico (por exemplo, NEA12-DsRed), parcialmente secos ao ar e, em seguida, revestidos com o alginato de Ca, em poços individuais de placas de 96 poços.

[00244] Sementes artificiais de azevém perene inoculadas diretamente com endófito transgênico (por exemplo, NEA12-DsRed) e, em seguida, revestidas com camada de alginato de Ca são capazes de germinar em meio de germinação levando ao estabelecimento de simbiota com endófitos transgênicos. Presença de endófito transgênico e identidade na simbiota gerada após a inoculação em larga escala de endófito transgênico (por exemplo, NEA12-DsRed) em sementes artificiais de azevém perene é demonstrada através de um teste de PCR específico de transgene e SSR específico de endófito.

INOCULAÇÃO EM GRANDE ESCALA DE NOVOS ENDÓFITOS EM SEMENTES ARTIFICIAIS DE FESTUCA ALTA

[00245] Inoculação em larga escala de novos endófitos de festuca alta (por exemplo, NEA17, NEA19, NEA20) em sementes artificiais de festuca é realizada utilizando o método 1 descrito acima.

[00246] Embriões recentemente isolados de festuca são incubados com suspensão (diluição 1/16) de novos endófitos de festuca (por exemplo, NEA17, NEA19, NEA20) durante 30 minutos à temperatura ambiente em poços individuais de placas de 96 poços.

[00247] A suspensão de inoculação é removida do poço e embriões inoculados são permitidos a parcialmente secar ao ar sobre os discos de papel de filtro.

[00248] Sementes artificiais são produzidas com novos embriões inoculados com endófitos com 3% de meio de crescimento MS modificado contendo alginato de sódio [MS (sem CaCl2) + 750 mg/L de glutamina + 5μM de CuSO4 + 1,95 g de MES + 1 mg/L de BAP] .

[00249] Sementes artificiais são permitidas germinar em meio MS para a germinação.

[00250] Embriões recentemente isolados de festuca são diretamente inoculados com suspensão (diluição 1/8) de novos endófitos de festuca (por exemplo NEA17, NEA19, NEA20), parcialmente secos ao ar e, em seguida, revestidos com o alginato de Ca, em poços individuais de placas de 96 poços.

[00251] Sementes artificiais de festuca alta inoculadas diretamente com novos endófitos de festuca (por exemplo, NEA17, NEA19, NEA20) e, em seguida, revestidas com camada de alginato de Ca são capazes de germinar em meio de germinação levando ao estabelecimento de simbiota. Presença de novo endófito e identidade na simbiota gerada seguinte à inoculação em larga escala de novos endófitos de festuca (por exemplo, NEA17, NEA19, NEA20) em sementes artificiais de festuca alta é demonstrada utilizando um teste de SSR específico de endófitos.

Exemplo 2 - Método de inoculação de endófito em azevém perene

[00252] Este exemplo descreve melhoramento da frequência de inoculação de endófito seguinte à punção de embriões isolados de azevém perene com uma agulha hipodérmica antes da inoculação pelo método 1 (inoculação direta) ou método 2 (revestimento com endófito contendo camada de alginato de Ca).

[00253] Os embriões isolados a partir de sementes de azevém perene foram inoculados com endófito NEA11 usando ambos os processos 1 ou 2, com suspensões de endófitos em diferentes taxas de diluição (1/4, 1/8, 1/16; vide Figura 16) sujeitas, com e sem ferimento de embriões com uma agulha hipodérmica. Perfuração dos embriões antes da inoculação grandemente melhorou eficiência de inoculação, demonstrada pela detecção de endófito baseada em SSR em simbiota de seis semanas de idade recuperada de sementes artificiais derivadas de embriões inoculados (vide Tabela 2).ENDÓFITO DETECTADO

[00254] Método 1: Inoculação Direta de Embriões Isolados com Suspensão de Endófito antes de revestimento com alginato de Ca

[00255] Método 2: Revestimento Direto de Embriões Isolados com Camada de Alginato de Ca Contendo Endófito Tabela 2: Número e frequência de plantas de azevém perene inoculadas com endófito recuperado depois de diferentes métodos de tratamento de inoculação de endófito

Exemplo 3 - Método de inoculação de Endófito em azevém perene e festuca alta

[00256] Este exemplo descreve melhoramento da frequência de inoculação de endófito após punção de embriões isolados de azevém perene (L perenne) e festuca alta (F. arundinacea) com uma agulha hipodérmica antes da inoculação pelo método 1 (inoculação direta) ou método 2 (revestimento com endófito contendo camada de alginato de Ca).

[00257] Método 1: Inoculação Direta de Embriões Isolados com Suspensão de Endófito antes de Revestimento de Alginato de Ca

[00258] Método 2: Revestimento Direto de Embriões Isolados com Camada de Alginato de Ca contendo Endófito

[00259] Os embriões isolados de sementes de diferentes variedades foram inoculados com diferentes endófitos (NEA11 e NEA17), usando os métodos 1 ou 2, com e sem ferimento de embriões com agulha hipodérmica. Perfuração dos embriões antes da inoculação melhorou grandemente eficiência de inoculação, demonstrada pela detecção de SSR baseada em endófito em simbiota de seis semanas de idade recuperada de sementes artificiais derivadas de embriões inoculados (vide Tabela 3). Tabela 3: Número e frequência de azevém perene inoculado por endófito e plantas de festuca altas recuperadas após diferentes métodos de tratamento de inoculação de endófito.

Claims (19)

1. Método para a preparação de semente(s) artificial(ais), caracterizado pelo fato de que inclui: proporcionar uma fonte de semente(s) de planta; submeter a(s) sementes(s) a uma etapa de esterilização de superfície; isolar embrião(ões) de semente a partir da(s) semente(s) com superfície esterilizada; inocular o(s) embrião(ões) com um ou mais simbiontes; e revestir o(s) embrião(ões) inoculado(s) com um revestimento para formar semente(s) artificial(ais),

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o embrião é diretamente inoculado com micélio de endófito.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as sementes artificiais incluem ainda uma segunda camada de revestimento.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a segunda camada de revestimento inclui nutrientes adicionados.

5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a segunda camada de revestimento é uma camada desprovida de nutriente.

6. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as sementes são de uma espécie de gramínea.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que uma população de embriões é inoculada com uma população de simbiontes, de modo que as associações simbióticas no hospedeiro favorecido podem ser identificadas.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que inclui ainda: crescer as sementes artificiais para formar mudas ou plântulas; e triagem das mudas ou plântulas para a presença de simbionte.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a etapa de triagem inclui triagem das sementes artificiais e/ou dos seus descendentes para compatibilidade e/ou estabilidade por envelhecimento acelerado e selecionando os simbiontes que exibem característica(s) desejada.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que inclui ainda submeter os simbiontes selecionados a um ensaio rápido de viabilidade de endófito.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o simbionte é um fungo endófito.

12. Método de acordo com qualquer uma das em reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o embrião é tratado para criar um ou mais pontos de entrada para o simbionte.

13. Semente artificial, caracterizada pelo fato de que consiste em um embrião de planta inoculado com um ou mais simbiontes e revestido com um revestimento para encapsular o embrião.

14. Semente artificial de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a referida semente artificial é revestida com uma segunda camada de revestimento.

15. Semente artificial de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a referida segunda camada de revestimento inclui nutrientes adicionados.

16. Semente artificial de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a referida segunda camada de revestimento é uma camada desprovida de nutriente.

17. Semente artificial de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizada pelo fato de que o embrião é a de uma espécie de gramínea.

18. Semente artificial de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 17, caracterizada pelo fato de que o simbionte é um fungo endófito.

19. Semente artificial de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 18, caracterizada pelo fato de que o embrião é tratado para criar um ou mais pontos de entrada para o simbionte.