CN1019445B - 耐硝酸盐大豆 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种豆科植物，特别是涉及一种具有耐硝酸盐根瘤形成作用和的超级根瘤形成作用的大豆品种。本发明也涉及一种植物栽培方法，特别是涉及一种把耐硝酸盐根瘤形成作用和超极根瘤形成作用的特性引入驯化了的栽培品种的方法。具有耐硝酸盐根瘤形成作用的大豆在农学上是非常有用的，这是因为它们能在比传统的栽培品种更早的生长阶段就形成了有效根瘤，这种根瘤提高了土壤肥力，防止了生长的延迟性，并有助于减少对外界氮源的依赖。

Description

本发明一般涉及豆科植物，特别是涉及那些具有耐硝酸盐根瘤形成作用和超级根瘤形成作用之表现型的大豆品种的培育方法。

已发现了一些新颖的在遗传上变更了的、有着耐硝酸盐和超级根瘤形成作用的大豆植物。这些大豆植物在具有耐硝酸盐根瘤形成作用或超级根瘤形成作用的表现型方面是与野生型大豆和驯化了的栽培品种大豆有区别的。还发现一种植物栽培的方法，即一种把耐硝酸盐根瘤形成作用和超级根瘤形成作用的特性引入驯化了的栽培品种的方法。而且，还发现一种生产和选择耐硝酸盐植物和超级根瘤形成的植物的遗传学操作方法。具有耐硝酸盐根瘤形成作用的植物在农学上是非常有用的，这是因为它们能够在比传统的栽培品种更早的生长阶段就在含有内生的硝酸盐的土壤中生成了有效的根瘤。早期的根瘤形成促进了已经加入的任何土壤接种物的有效性，这就可防止生长的延迟，这种生长延迟通常是在植物成长期间在有效根瘤形成之前因内生的硝酸盐的减少而引起的。超极根瘤形成作用同样也促进了土壤接种物的有效性，并有助于减少对外界氮源的依赖。

耐硝酸盐的根瘤形成作用在这里被定义为在接种一定数量共生细菌的情况下，在具有限定硝酸盐含量的支承培养基中生长时，植物形成有效根瘤的能力。有效的根瘤是指那些能够发挥固氮作用的根瘤。固氮作用是一个使分子氮还原成生物学上有用形式的氮（如氨）的过程，该过程过去一直是通过乙炔的还原来测定的，这是因为催化分子氮还原作用的酶即固氮酶也能够催化乙炔的还原作用。 于是，还原乙炔的能力就被认为是与固定氮的能力相等的，并且是具有活性的固氮酶酶活性存在的特性。支承培养基是这样一个术语，这里被用来表示用于支承植物正常直立生长的任何物质，其中包括无限的土壤、沙、蛭石等等。共生微生物意指任何能够在适当的条件下生成有效根瘤的生物体，最典型的是指根瘤菌属细菌。接种量的共生微生物是指分布于支承培养基中，能让野生型或传统的栽培品种生成足够数目的根瘤以支持在基本上是无氮的支承培养基中植物正常生长的足够量的此生物体。

硝酸盐的含量被定义为每单位体积土壤中硝酸盐的量，这种土壤是通过施加一定浓度的硝酸盐溶液后得到的，于限定条件下提供给植物。硝酸盐的含量是根据所加入的溶液的浓度来定义的，这是因为土壤的干裂、硝酸盐吸收和其他这类因素会使得所测土壤的浓度不一样。例如5mM的硝酸盐含量，如已经所描述的，每天以1/4升的5mM（毫克分子浓度）KNO₃溶液浇灌生长在深为12″、直径为10″的罐中植物上而获得的。这样一种作业规程可提供一个比较稳定的硝酸盐含量，从而指出了要获得土壤中可溶物质的恒定浓度之困难。

超级根瘤形成作用被定义为当植物在接种量的共生细菌的支承培养基中生长时，各株植物形成有效根瘤的能力，即在根瘤的数量上和大小上都大于野生型植物，至少为野生型植物的两倍，超级根瘤形成的植物可能是耐硝酸盐的，但也不一定。超级根瘤形成作用的表现型可以在不存在外加硝酸盐的情况下观察到。

一般的野生型豆科植物和农学上被认为是重要的豆科作物的驯化的栽培品种，例如大豆，在土壤中硝酸盐含量低的情况下是不会形成有效根瘤的。在含有5.5mM（毫克分子浓度，以下相同）硝酸盐的土壤中，根瘤的大小和固定氮的能力与没有外加硝酸盐的基本上不含硝酸盐的土壤中生长的对照组豆科植物相比较，大大地降低 了。残留的硝酸盐通常也可在土壤中被发现，这种土壤上是进行轮作的，已施过肥的作物，例如玉米，在前一个季节种植。大豆通常是与施肥的作物进行轮作的，通过土壤中硝化细菌和有机物质的作用，可能会使土壤出现高的硝酸盐含量。某些土壤，尤其是那些火山发源地的土壤，其硝酸盐含量自然就很高。在这样的情况下，有效的根瘤形成作用就受到了阻止或推迟，直到残存于土壤的硝酸盐基本上被耗尽为止，这时植物生长的延迟性就可观察到了。这种有时伴随瞬间发黄现象的延迟性是因根瘤形成作用的推迟而造成的，在延迟期间和以后的阶段中，到达成熟所需的时间和对应力的敏感性都有害地影响了作物的最终产量。如果由于根瘤形成作用出现得迟而导致土壤中共生微生物群体的减少或无效，那么在种植过程中对土壤接种共生细菌的价值也就不大了。耐硝酸盐根瘤形成的表现型在农学上对防止或减少这样的不利影响是很有利的。

从土壤中淋溶出来的硝酸盐迅速变成了河流和蓄水层的严重污染物。这种污染是由于对土壤连续施肥及雨水和罐溉水所致的来自土壤的淋溶而造成的。由于大豆通过氮固定作用所获得的氮大约占它们所要的总氮的70%，这就减少了对外加肥料的依赖，这也就有利于缓和污染的问题耐硝酸盐和超极根瘤形成的突变种减少了对外加肥料的依赖。

这里所公开的耐硝酸盐和超极根瘤形成作用的表现型可通过遗传变更来获得。这里所用的“遗传变更”这一术语包括了改变植物遗传型的任何方法，而不是指传统的杂交育种方法。这种遗传变更方法包括了但不限于诱变，随后选择所希望的表现型;在体外重组DNA（脱氧核糖核酸），随后转化及选择所需要的表现型;或这些消除，钝化，或改变现有植物基因功能或把新基因引入植物的其他方法，正如该技术领域中的普通技术人员根据这里所公开的发明思想可能会想到的。在野生的或驯化了的大豆栽培品种的群体中至今还 没有发现耐硝酸盐根瘤的形成。在本发明之前，人们还不知道或不理解遗传操作可获得一种耐硝酸盐根瘤形成的植物表现型，这是因为植物的和细菌的基因都参与了形成有效的根瘤，而涉及到共生现象的遗传操作的遗传学研究还只是限制在根瘤菌属。本发明的一个不寻常的特征是发现了可导致植物功能增强（如形成多于正常数目的有效根瘤）的突变作用。一般来说，增强植物功能的突变作用是一个“向上”的突变，在这里，突变型植物可得到比野生型植物更高的产量和更好的植物结构。由于植物功能的强化很难通过诱变达到，所以，这一公开了的诱变方法和选择方法对于要获得遗传学上加以变更的、植物功能增强的作物来说是很有用的。

在Advances in Nitgen Fixation Research 1984第597页上，E.Jacobsen揭示了一种用EMS诱变豌豆种子，在15m M KNO₃条件下选择，获得在外加硝酸盐存在下能形成根瘤的豌豆突变体，该突变性状的遗传背景是单基因的，并且是隐性的。

由西北农学院主编的从作物育种学（农业出版社，1981）第103页上例举诱变剂时指出，甲基磺酸乙酯（EMS）是一种主要的诱变烷化剂。

在Advances in Nitogen Fixation Research 1984第589页上，B.J.Carroll等人即本发明人公开了用各种诱变方法，包括使用γ射线，NaN₃，EMS，以及在4-5mM NO₃上选择，得到具有耐硝酸盐根瘤形成作用表型的大豆突变体。

在Proc    Nat1.Acad    Sci    USA    82∶4162-4166中，B.J    Carroll等人，即本案发明人公开了一种用EMS诱变剂得到耐硝酸盐根瘤形成作用表型的大豆突变体nts382的具体方法，并阐述了其可能的机制。

在Plant    Pbysiol    78'34-40中，本案发明人B.J.Carroll等人描述了获得的nts382大豆突变体的根瘤形成作用特性。该大豆突 变体具有耐硝酸盐和根瘤形成作用的表型。

本发明的目的在于提供获得具有耐硝酸盐和超极根瘤形成作用表型的大豆品种的育种方法，它包括将耐硝酸盐和超级根瘤形成作用的表型引入商业大豆栽培品种中，使新的大豆品种具有所希望的性状。

本发明概述了一个用于分离15个独立的耐硝酸盐大豆突变体品系诱变和选择方法，证实了耐硝酸盐表现型从一代到下一代的稳定性，并描述了具有耐硝酸盐表现型的大豆品系的特征。出乎意料的是，分离出的突变体也是超极根瘤的形成者。这里已经公开了一种种子诱变方法和耐硝酸盐植物以及超级根瘤形成植物的选择方法。这里所描述的诱变和选择方法可适用于各种野生型植物，尤其是适用于具有强化了的植物功能的突变体，在这里，所需要的表现型特征可耐应力。耐硝酸盐根瘤形成的表现型通常是隐性的性状，这种隐性的性状是根据孟德尔遗传定律分离的。超级根瘤形成作用已经在隐性的和显性（或半显性）的突变作用中被发现了，这种突变作用表现为单一的孟德尔式性状。因此，可用传统的植物育种技术把耐硝酸盐根瘤形成和超级根瘤形成的表现型引入商业的大豆栽培品种。本发明可通过将它应用于大豆cv布喇格（Glycine    Max    cv    Bragg）来作为实例证明;然而，它的操作原理可应用于其他的大豆栽培品种中，如“Williams”，并且不限于任何特定的大豆栽培品种，但是，它一般地被用于任何Glycine属大豆的各品种，无论是野生的，驯化的或两者的杂交种，这里所用的大豆这个术语被用来指物种Glycine    Max及其驯化了的栽培品种。

根据本发明的方法，可以将耐硝酸盐根瘤形成和超级根瘤形成作用的表型引入商业的大豆栽培品种中，使之成为稳定的性状，因而得到具有更高的产量和更好植物结构的新的大豆品种。该新品种具有所希望的表型，并且可以结合其它农业学上有价值的性状，它 们能促进土壤接种物的有效性，防止生长的延迟，并有助于减少对外界氮源的依赖。

这里用来产生耐硝酸盐根瘤形成之表现型的遗传操作是诱变，随后是选择。人们将会懂得，其他的遗传操作，例如，重组DNA（脱氧核糖核酸，以下相同）技术的应用或转位因子的应用可用为遗传操作的代用方法。在尝试实验中，采用甲基磺酸乙酯（EMS），钠叠氮化合物和γ射线照射对种子进行诱变处理。EMS被认为是很理想的，因为它可最有效地产生叶绿素缺乏的突变体（Chl^-），而我们可以通过观察带有黄叶子或白叶子的植物来很容易地检测这种突变体。因为胚胎的诱变很有可能产生嵌合胚胎，这是由于在胚胎中存在着一个以上种系细胞，并且看起来很可能大多数突变体是隐性的，所以在M2这一代进行筛选。（受诱变因素支配的种子叫做M1代，这些种子生长出来的植物是M1植物，从M1所产生的种子叫做M2种子，从M2种子生长出来的植物叫做M2植物等等。种子家系是指在单株植物上收获下来的那些。因此，M2种子家系包括所有单个诱变种子的后代）。

选择了EMS诱变处理为理想的遗传操作方法之后，进行大规模的诱变处理和选择。M1种子是分二批用EMS进行诱变处理的，一批是以0.44%（v/v）EMS进行了4小时处理，另一批是以0.5%（v/v）EMS处理了6小时，然后再进行种植，对M1植物不进行耐硝酸盐根瘤形成的选择，然而，为了全面估计突变的频率和诱变致死现象，记录下成活率和Ch1突变的出现频率，在成熟时，M2种子家系被收集起来并加以分开保存，大批收获M2种子。

在选择过程中对各个M2家系进行分类有好几个优点，首先，这有可能识别出哪些突变体是从同一个突变中发生而来的。第二，如果一个所选定的变异体在它产生种子之前就失去了，那么，就有可能再回到指定的家系中去，从该家系中重新分离剩下的突变体个 体（姐妹株）。

为了选择耐硝酸盐的突变体，来自每一家系的10～12颗种子被种植在以水洗过的河沙作支承培养基的培养罐内2厘米的深处。植物在有硝酸盐和商品土壤接种物（USDA136）的情况下栽培5～7个星期，然后小心地从河沙中取出来，并用目视法筛选根瘤形成的程度。培养罐最初是每星期浇水3次，但是随着生长需求的增加，增加到每天浇水一次，在2500个M2的家系中，按照所述的方法，通过对25，000株以上的个体植株进行筛选，结果得到了15株耐硝酸盐的突变体。

用于选择的硝酸盐浓度是通过对亲代栽培品种布喇格（Bragg）的初步试验来确定的。图1表示了所获得的结果，测定了根瘤的新鲜重量，该重量表示了KNO₃水平在生长中的作用。在5～6mMKNO₃条件下，根瘤的大小明显地减少，在根瘤鲜重增加下各个植株耐性的少量增加将是明显的。选出的变异体表明，在5mMKNO₃存在的情况下，与野生型姐妹株和亲代栽培品种比较，其根瘤的增加很显著。由于选择过程既费时又麻烦，因此，只是那些靠目视观察明显显示出根瘤增加的个别植株数才被选中，同时也观察到许多额外增加的根瘤的变异体。我们可以通过进一步的分析，例如，通过测定乙炔的还原作用来揭示另外的耐硝酸盐变异体的存在，因为固氮能力的增加和个别根瘤的效率会产生一个耐硝酸盐的表现型。由于这些突变体至今还没有被叙述过，所以，本发明是通过对这些根瘤明显增加的突变体作特征描述来例证的。所选择的突变体及其野生型姐妹株根瘤数列于表1。耐硝酸盐突变体的野生型姐妹株所具有的根瘤数与布喇格（Bragg）的根瘤数没有明显的差别，突变体的根瘤数对nts66为6个根瘤/株，而对nts2062上升为370根瘤/株，就nts2062而言，作为植物生物量功能的根瘤数要比在相同条件下即5mM KNO₃中生长的野生型布喇格（Bragg）的植物多10 倍。把在硝酸盐中生长的突变体与在缺乏硝酸盐条件下生长的野生型进行比较，其差别也同样是明显的，在5mM KNO₃下生长的nts2062的根瘤数为在无硝酸盐情况下生长的野生型的根瘤数的4.5倍，而5mM KNO₃可引起野生型植物的各株根瘤数减少56%，在无硝酸盐的条件下，野生型所生成的根瘤数的数量最大。同样，对根瘤群的测定也表明，在硝酸盐中生长的nts2062所具有的根瘤群数为在硝酸盐中生长的野生型的12倍，而且为在无硝酸盐条件下生长的野生型的3.5倍。

图2显示出5mM KNO₃条件下生长的nts2062和在0，4及6mM KNO₃条件下生长的布喇格（Bragg）的根瘤新鲜重量，作为植物大小（鲜重）的函数。这些数据表明，在5mM KNO₃中栽培的nts2062，其每株植物生物量的根瘤的鲜重要大于在无硝酸盐条件下生长的野生型布喇格（Bragg）。图4也显示出相当于在5mM KNO₃中培养的3株nts2282数据条目，与nts2062相反，这三个数据条目接近于在无硝酸盐条件下生长的布喇格（Bragg）的数值。而且，在5mM KNO₃中栽培的nts2062和nts2282的野生型姐妹株也接近于在4～6mM KNO₃中栽培的亲代栽培品种布喇格（Bragg）所获得的数值。

在nts382中也发现有根瘤数多的植株，图3显示在不同生长条件下nts382与布喇格（Bragg）的比较情况。随着硝酸盐浓度的提高，nts382的每株根瘤数实际上也提高了，而对布喇格（Bragg）来说，其根瘤数却减少了。支承培养基中其他含氮化合物的作用也得到了证明，5.5mM的氨的存在也减少了每株植株的根瘤数;然而，突变体所继续生成的根瘤数显著多于野生型的根瘤。氨的作用可以全部地或部分地根据吸收了大量铵离子的根部的PH变化来加以说明。当对每克植物鲜重根瘤数进行测定时，就可发现，nts382这一品种的根瘤数在高达5mM KNO₃时仍然保持不变，而野生型的根 瘤数却减少了。尿素和氨的存在减少了突变体和野生型的根瘤数，但是在这样的条件下，突变型自然能够形成根瘤而野生型却不能。

乙炔还原试验可用来估计氮的固定作用。乙炔转化为乙烯是可通过气相色谱来测定的。整株的植物放置在1040ml的6%（V/V）的乙炔气氛密封罐中培养40分钟，然后，这些籽苗再次被种植下去并一直生长到成熟。在某些实验中，用突变型和野生型分离下来的根瘤作实验，而不用整株植物作实验。图5显示出种植后6个星期野生型和nts2062之间的乙炔还原速率的比较。在无硝酸盐条件下栽培的野生型大豆中，每株植物和每个植物生物量的固氮酶活性大约为在5mM KNO₃中生长的野生型的16倍。通过比较我们发现，在5mM KNO₃中栽培的nts2062固氮酶的活性大约是在同样条件下生长的野生型的10倍。在种植后的6个星期收获时，在硝酸盐中生长的nts2062的固氮酶的活性大约为在无硝酸盐条件下生长的野生型的55%。突变型品系nts2264的固氮酶活性为野生型姐妹株的4倍。作为表示每株nts2264鲜重的数据的变异体固氮酶的活性大约为野生型固氮酶活性的6倍，它部分地反映了突变型的尺寸较小。同样的数值从突变型nts382和nts1116中也可得到。对nts382和布喇格（Bragg）进行比较的数据如图5所示。对野生型来说，在2.75mM的KNO₃浓度下固氮酶的活性急剧地下降，在5.5mM的KNO₃浓度下降得更多。相反，nts382的固氮酶活性仍然保持不变，或随着KNO₃浓度上升到5.5mM时活性增加了。然而值得注意的是观察到了下列现象，虽然在5.5mM尿素（总N为11mM）下野生型和突变型的固氮酶活性都降低了，然而nts382固氮酶的活性仍然比野生型高许多倍。

图6显示出，nts2062中每克根瘤鲜重的固氮酶活性（比固氮酶活性），这种活性是与同等条件下栽培的野生型活性相同的。在5.5mM KNO₃中栽培的nts2062和野生型的比固氮酶活性大约为 无氮条件下栽培的野生型的2%。在各个实验中，其他两种高根瘤品系：nts382和nts1007的培养物也显示了相同的趋势。在硝酸盐上生长的布喇格（Bragg）、nts382和nts1007的比固氮酶活性没有明显的差异。

表现出耐硝酸盐表现型的植物一般来说小于野生型姐妹株和亲代栽培品种布喇格（Bragg）。例如，突变型nts246和nts1007明显地比各自的野生型姐妹株要短得多，其叶面积也小得多。所得数据如表2所示。将几个nts品系的组合数据与其野生型姐妹株相比较，而这些野生型姐妹株被选为对照物，这是因为它们比没有受到突变的布喇格（Bragg）野生型作对照物更好。这些组合数据表明，在种植后的大约6个星期，突变型与其野生型姐妹株相比长到其高度的84%，具其叶面积的大约80%。同样的趋势也可以从植物鲜重的测定中反映出来，突变体的平均重量略小于野生型姐妹株。虽然对某些品系如nts2282来说平均重量的差别是不显著的。

我们对nts382和野生型布喇格（Bragg）在生长过程中根瘤形成的速率作了研究比较，两者都接种根瘤菌USDA110，放在砂砾中生长，每天浇灌加有5.5mM KNO₃或5.5mMKCl的营养培养基。在一定的间隔，一些试验植物从培养罐取出以确定每株植物的根瘤数，其结果如表3所示。在植物生长的整个过程中，nts382根瘤形成的速率显著高于野生型速率，在有硝酸盐存在和没有硝酸盐存在时，情况都是一样的。这些结果也证明了：所观察到的表现型是与接种根瘤菌的菌株特异性无关的，这里由于用USDA110和USDA136给nts382接种，产生相似的效果。

在0、2.75和5.5mM的KNO₃三种情况下，把nts382与野生型布喇格（Bragg）进行比较，测定每株植物的根瘤数，根瘤鲜重占根部的鲜重的百分比，以及用每克植物鲜重乙炔还原率表示的固氮能力，结果如表4所示。除了每棵植物根瘤数高得多和每株植物根瘤 鲜重重得多的这样一种超级根瘤形成表现型的特征之外，在研究中的所有硝酸盐含量下，nts382固氮能力大于野生型。在研究所有的nts突变体中，在硝酸盐中生长的每株植物的固氮能力和每株植物的鲜重都大于野生型姐妹株。反之，在无硝酸盐存在的情况下，在收获时，野生型的每株植物的固氮酶活性大于在硝酸盐中生长的nts2062。在硝酸盐中生长的野生型植物和nts2062的比固氮酶活性是相同的，在这两种情况下，它们都是在无氮条件下生长的野生型植物固氮酶活性的20%。对在5mM KNO₃中培养的nts382和nts1007的分离下来的根瘤进行比固氮酶活性的测定，再与有硝酸盐和无硝酸盐条件下生长的野生型植物进行比较，也显示出同样的趋势。对nts382进行更详细的分析表明，它的表现行为相似于nts2062。这些结果表明，这些nts突变体是能够使用内源固定的氮和外源硝酸盐这两种物质的，这是一个在农学上具有重大意义的事件。

耐硝酸盐突变体的遗传表明，它们中的绝大多数但不是全部是表现为孟德尔隐性的。M2代突变体的出现频率（这里能检测到的隐性突变体必定是纯合体）不仅是正常孟德尔纯合隐性出现频率（3∶1）的作用，而且也是遗传学有效细胞数（GECN）的作用。GECN是胚胎中所含有的种系细胞数的度量，它们中的任何一个细胞都可以产生成熟的植物，假如它们中的每一个细胞都具有成为成熟植物的同样的可能性的话。例如，如果GECN＝1，那么M2的分离比将是3∶1;假如GECN是2，那么分离比就会是7∶1;假如GECN＝3，则分离比就将是11∶1，等等。通过观察隐性耐硝酸盐突变体的分离比来进行判断，大豆的GECN就可估计在3～5之间。于是这就可推论：M2分离比显著低于11∶1可以表明突变体不是隐性的。隐性进一步的证据还可通过测定M3植物的分离比来提供。假如突变体是隐性的，那么，它在M2一代中的表现仅仅在纯合体中将是明显的， 而它的M3后代则不该分离。另一方面，假如M3这一代中存在分离，我们就可以推定：突变体是显性的或半显性的，例如，就nts246而言，在M2家系的10个成员中观察到2个耐硝酸盐植株，而且，在M3这一代中，两个分离株中有一个产生了野生型分离子，从而表明它在M2中是杂交种。于是在迄今分离的15个耐硝酸盐品系中，唯独nts246代表了显性的或半显性的突变。

根据它们的遗传行为和在硝酸盐存在下根瘤形成的特性，迄今所分离的耐硝酸盐大豆品种可以被划分成4个互补群。由nts246所代表的互补群1，表现的特征是显性或半显性，它的行为表现为超级根瘤形成。（超级根瘤形成被定义为，将在没有外加硝酸盐的条件下生长的突变体与野生型比较时，其根瘤数和根瘤块的大小至少为野生型的两倍）。互补群2的代表是nts品系382、2062、1116和1007。这互补群中的突变体是隐性的，具有超级根瘤形成的作用，在有硝酸盐和无硝酸盐的情况下，每株植物的固氮率等于或大于野生型，而固氮酶的比活性基本上是等于野生型的，互补群3的代表是nts65，这互补群3的突变体是隐性的，在5mM硝酸盐存在下呈现正常的根瘤数，但是，根瘤的大小增加了，即每株植物的根瘤块大于野生型的根瘤块。互补群4的代表是品系nts97和225，突变体是隐性的。在5mM的硝酸盐中生长的植物的根瘤块等于或大于在无硝酸盐条件下生长的野生型，因此，它们的特征是中间型的。另外根瘤常常在外围根部发现，而较少在主根中发现，这表明这些品种的根瘤形成是在植物生长的后期，是对硝酸盐水平的适应性反应。

关于某些突变体具有超级根瘤形成的表现型的发现是出乎意料的。超级根瘤形成作用与耐硝酸盐作用的区别在于前者在无外加硝酸盐的条件下是十分显著的。因此，某些但不是所有的超级根瘤形成者是耐硝酸盐的。如果通过筛选在无硝酸盐条件下生长的M2植物来选择超级根瘤形成的植物，那么，也能分离出缺乏耐硝酸盐特 性的超级根瘤形成的品系。

耐硝酸盐根瘤形成的表现型与那种不能利用硝酸盐的情况之区别在于后者与野生型相比，对于硝酸盐的作用无反应或反应较小，这取决于突变体的渗透程度。如果将这样一种突变体中根瘤鲜重作为植物鲜重的函数在图2作图比较，人们就可看到对硝酸盐利用得不够的突变体的曲线会落在0mM和6mM    KNO之间生长的野生型行为的范围内。即这种突变体品系的各个植株在图2上作图，将位于在各种硝酸盐的含量中培养的布喇格（Bragg）（或者其他野生型的祖先）的直线中间。这些适当品系之间的确切位置将取决于硝酸盐同化作用突变体是否是渗透的。对nts2062和其他超级根瘤形成的突变体来说，情况都不是这样，这是因为它们在缺少硝酸盐的条件下生长时，它们产生的根瘤大于野生型，品系nts382也显示出具有一种典型的超级根瘤形成者的行为，即在所有硝酸盐含量的条件下，这种行为表现在每克植物所形成的根瘤的鲜重大于野生型。而且，直接的实验已表明nts382能够同化硝酸盐。于是，耐硝酸盐的根瘤形成和超级根瘤形成表现型是与硝酸盐利用的不足以及硝酸盐同化的不足有着区别的。

耐硝酸盐根瘤形成的大豆品种和超级根瘤形成的大豆品种可以采用商业上的野生型栽培品种作为野生型起始材料产生出来。已通过举例的方法描述了如布喇格（Bragg）和Williams这样的野生型品种;然而其他的商业性栽培品种也可以被用作祖先品系。一旦通过上述的诱变和选择获得了带有所需要的表现型性状的品种，那么，最好是通过传统的植物育种方法把这一性状转移到其他商业上的栽培品种中去，这样就可获得一种把希望的表现型（耐硝酸盐，超级根瘤形成）和其他有价值的农学性状结合在一起的新品种。

所希望的商业上的栽培品种可以通过传统的植物杂交作用与具有耐硝酸盐根瘤形成或超级根瘤形成的表现型的突变型品种进行杂 交。突变体的亲代是用作雄性亲代较好还是被用作雌性亲代较好，这个问题很容易通过杂交测试来确定或通过比较两种方法的群体杂交的结果来确定。当突变体是隐性时，其F1子代的植物就显示出野生型根瘤形成的特性。F1杂交种自交产生了F2杂交种，在这F2杂交种中，在一部分F2植物上将再现隐性的表现型。然后对F2杂交种亲代进行选择，以便保留具所希望的表现型的那些，或者是耐硝酸盐的根瘤形成或者是超级根瘤形成，所用的选择方法必须是适合于和专门用于这种所希望的表现型的，正如例子2所描述的那样。然后，F2植物与商业上的亲本栽培品种进行回交，在选择品系时重复刚刚描述的步骤，所述的品系将所希望的商业性栽培品种亲代的农学品系与耐硝酸盐或超级根瘤形成的表现型相结合。在任何情况下的选择都是按照前述的用于诱变程序的方法进行的。

本发明的特殊方面及其特征将通过以下的实例来作进一步的说明。

实施例1.植物种子的EMS诱变：

由于EMS即使处在挥发性状态（气态）也具有很高的诱变性，因此，在进行所有的操作程序时都要使用通风橱、氯丁橡胶手套和蒸气收集器。EMS诱变需要一个充满活力的旺盛胚胎。这最好是通过在用EMS处理之前将种子置于用空气鼓泡的水中，或者在用EMS处理之前将种子放在自来水龙头下进行冲洗来进行。

只有那些用预实验确定过的具有高度成活力的种子才能被使用。对种子（5，000作为最小数量）计数，并包在塑料线织成的包里（每袋1000颗种子，微细滤网的塑料网效果非常好）。

种子袋放在容器内，并用自来水龙头冲洗种子达12小时（28℃）。

然后将种子转移到浓度为0.1MKH₂PO₄、pH值为6.0（1升/1000粒种子）的溶液中去，加入甲基磺酸乙酯（EMS）（Sigma），最 终得到0.5%（V/V）的浓度。这种溶液用空气鼓泡（搅拌和充气），烟雾用蒸气收集器去除掉，蒸气收集器的溶液为2%的氢氧化钾（W/V）加10%（W/V）的硫代硫酸钠。凡是涉及到EMS处理的所有步骤都要在通风橱中进行。

暴露于EMS6个小时以后，停止充气，诱变剂溶液通过一根与诱变容器底部的龙头连接的皮带管轻轻地倒入同样的容器以进行钝化作用。钝化作用容器里已有新鲜制备的浓缩KOH-硫代硫酸钠溶液，见以下EMS钝化溶液。将龙头关上，诱变室充满了水。空气通过这诱发室以便能搅拌几分钟，然后，清洗液轻轻地倒入钝化容器。冲洗种子（仍在清洗过的诱变容器中）3小时，然后，在钓鱼线协助下拿掉种子袋，在龙头下再用水冲洗种子1小时。钝化溶液也用空气鼓泡搅拌几小时，然后，随着大量的水流到通风橱的洗涤槽中。

种子从种子袋取出，并立刻种下。对种子进行处理的操作程序只有通风条件很好的地方才能进行，同时必须带上防护手套。采用了两种种植法：（a）田间种植：直接将种子种到犁沟中，然后迅速浇水：（b）罐中种植：在直径为10英寸、深度为1英寸的罐（填满砂和加些缓慢释放的肥料）中，每罐种植10～14粒大豆种籽。种子铺到预先填满砂的罐表面，然后另外覆盖上大约2cm的砂。用头发吹风机使种子干燥以便从实验室运到田间的企图增加了种子的损失。

M1这一代生长出来了，并与无诱变处理的对照作物作了活力比较，记录下存活数以总体估计生存能力，而诱变性却可以通过观察叶绿素缺乏的扇状变异的频率来估计。未来嵌合体植物上可贴上标签以便作进一步的分析。

让种子生长到完全成熟。从每一株植物收集M2一代的种子，并分别装袋。M2家系种子的分别收集可便于测定GECN（遗传学上有效细胞数），也有利于更快筛选。例如，可以肯定的是，M2筛选 中分离的任何突变体与任何其他的突变体是有区别的。当失去了一株已选好的植物时，那么就有可能再回到原来的家系中去选择一棵姐妹株。

EMS钝化溶液

将8克KOH溶解于400ml的HO（这将会稳定硫代硫酸盐）中。再加40克的硫代硫酸钠并使之溶解，先使所有的颗粒浸泡24小时，然后把这些颗粒放置于通风橱中流动水中（这时自然可以闻到难闻的味道）也可在蒸汽收集器中使用这一钝化溶液。虽然EMS被认为经上述溶液处理是基本上钝化的，但没有测量残存的EMS的浓度。

实施例2筛选耐硝酸盐突变体

M2家系种植到沙罐中（每个罐一个家系），用商业上的泥炭接种物进行培植，生长4～6个星期。植物用含有5mMKNO的标准培养液进行浇灌。为了保证稳定的硝酸盐浓度的水平，在每次浇灌时，这些罐（直径为10英寸，深度为1英尺）用大约1.4升的溶液加以冲洗，罐最初是每星期冲洗3次，以后随着植物生长的需要，冲洗次数也相应增加。所有的植物都是很小心地从砂中取来并且用目视法进行筛选以了解根瘤形成的程度和分离情况（取决于GECN）;这也就是说，如果GECN＝1时，突变体为3∶1，如果GECN＝2时突变体为7∶1，当GECN＝3时，突变体是11∶1，当GECN＝4时，突变体为15∶1（假定是隐性的突变）。M2家系也可筛选出Ch1（叶绿素缺乏）。这一参数有助于估计GECN和诱变的效率。

对超级根瘤形成表现型的选择是以同样的方式进行的，只是KNO不包括在浇灌的溶液中。

突变体选择程序的流程图

1.nts    382    8.nts    1007

2.nts    206    9.nts    97

3.nts    2282    10.nts    183

4.nts    246    11.nts    225

5.nts    65    12.nts    501

6.nts    1116    13.nts    733

7.nts    2264    14.nts    739

15.nts    761

人们将会认识到，与耐硝酸盐特性和超级根瘤形成有关的生物化学的和生理学的性状不可能被这里所公开的发明资料所详细描述 尽。因此，这就有可能采用其他的选择方法，如采用更节省时间的或与一定种类的耐硝酸盐或超级根瘤形成的突变体密切有关的方法，这样的选择方法或检测方法可以与这里所公开的技术一样来使用。同样，更进一步的研究可以解释附加的互补群。所有这些附加资料被认为是对本发明的技术的一种累积和补充，而且是属于权利要求的范围之内的。

Glycine    Max    cv·布喇格（Bragg）nst382的种子被存放在农业遗传高级研究实验室的仓库里，地址是：威斯康星洲麦迪逊城东布凯路5649号（5649    East    Buckeye    Road    Madison，Wisconsin    53716），在专利申请尚未获得批准的等待期间，任何政府官员想要接近仓库中的材料是允许的，但这样的政府官员必须是在c·f·r·1.14和35USC下被委以权利的。对此保存的材料公开利用程度的所有限制将根据本专利的批准而被无条件地排除。

仓库中的材料或能生长的复制品在整个专利的有效期间被保存在上述所给出的地址中。

在迄今所分离的许多品系中。品系nts382之所以被选中库存起来，这是由于它可作为耐硝酸盐根瘤形成表现型和超级根瘤形成的表现型例证。这种贮存物可进一步例证本发明，但它不打算要以任何方式来限制本发明的范围。

表1：在5mMKNO，中栽培了5～7个星期的Bragg，nts突变体/变异体和野生型姐妹株的根瘤数。除了注明的以外，以下的数据都是就M2植物而言的。

根瘤数植物^-1（±S.E.）

所选择的家系    突变体/变异体    野生型姐妹株

Bragg^a- 19±11

382    146±24    26±12

1007    179±12    13±12

1116^b79±20 -

246^b115±15 8±17

733    213±26    18±14

183    269±21    19±17

65^c16 9±17

97^d120 32±21

225^d75 17±12

501^d251 19±17

2062    370±26    38±12

a.亲代栽培品种

b.取自M3植物的数据

c.二种nst植物，两者均有16个根瘤

d.仅仅取自一棵植物的nts突变体/变异体的数据。

表2

所选择的家系    表现型    高度（cm）±    叶面积±S.E

S.E

246    突变体    22.6±2.4    162±15

姐妹株    35.5±2.5    227±10

比率（m/s）    0.64    0.71

1007    突变体    36.4±20    158±12

姐妹株    36.9±1.6    206±13

比率（m/s）    0.78    0.77

382    突变体    43.5±6.0    166±16

姐妹株    52.7±1.3    281±3

比率（m/s） 0.83^＊0.59

＊没有显著的差异

表3

在NO^＊ ₃存在下，nst382的根瘤形成作用与Bragg野生型的根瘤形成作用

若干天（+S.D）以后每颗植物的根瘤

1    9天    15天    22天    29天

Bragg（+KCl）    6±4    22±10    27±14    39±6

nts382（+KCl）    54±17    103±35    294±70    320±48

Bragg（+5.5mMKNO₃） 5±12 9±4 19±8 22±11

nts382（+5.5mMKNO₃） 63±19 380±43 483±114 693±142

＊用USDA110接种，在砂砾中生长，每天浇灌加有添加物（5.5mM的KNO₃，或KCl）的营养介质。

表4

nts-382突变体特性的概况（1984年4月）

品系^＊氮源 每株植物的 根瘤鲜重 固氮能力

根瘤数    （根鲜重    （n摩尔

的%） C₂H₄分钟^-1

克植物鲜

重）

Bragg    0mM（KCl    37    8    6.12

对照）

nts382    0mM（KCl    339    49    9.50

对照）

Bragg 2.75mMKNO₃27 2 0.60

nts382 2.75mMKNO₃474 60 13.54

Bragg 5.5mMKNO₃25 1 0.33

nts382 5.5mMKNP₃783 69 9.73

＊在砂中生长的，用CB1809（＝USDA136）接种;每天冲洗，在4星期以后收获。

Claims (16)

1、一种生产具有耐硝酸盐根瘤形成作用表型的大豆育种方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(a)使具有耐硝酸盐根瘤形成作用表型的大豆突变体与第二亲代大豆品种杂交；

(b)回收F1杂交种后代植物；

(c)使所述F1杂交种进行自交；

(d)选择具有耐硝酸盐根瘤形成作用表型的F2杂交种植物以鉴定耐硝酸根瘤形成作用的杂交种；及

(e)使耐硝酸盐杂交种与第二亲代大豆品种进行回归性地回交并重复步骤(b)，于是获得具有耐硝酸盐根瘤形成作用表型的大豆品种。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于选择耐硝酸盐的步骤包括使F1植物在5mM硝酸盐水平存在下生长。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于选择耐硝酸盐根瘤形成作用包括检查F2植株的根部，把每株上的根瘤和每株上的根瘤块与基本相同的培养条件下，在5mM硝酸盐水平下生长的第二亲代品种进行比较。

4、如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的大豆品种在权利要求1的程序之后，重复权利要求1的（c）和（d）步骤。

5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于具有耐硝酸盐根瘤形成作用表型的大豆突变体是选自一组突变体品种，所述的这组突变体品种能被分类成相同的遗传互补作用组，如nts382，nts2062，nts2282，nts65，nts1116，nts2264，nts1007，nts97，nts183，nts225，nts501，nts733，nts739或nts761。

6、根据权利要求4所述的方法，其特征在于具有耐硝酸盐根瘤形成作用表型的大豆突变体是选自一组突变体品种，所述的这组突变体品种能被分类成相同的遗传互补作用组，如nts382，nts2062，nts1116或nts1007。

7、根据权利要求4所述的方法，其特征在于具有耐硝酸盐根瘤形成作用表型的大豆突变体可被分类成如nts246相同的遗传互补作用组。

8、如权利要求1所述的方法，其特征在于具有所述耐硝酸盐根瘤形成作用表型的突变体也具有超级根瘤形成作用。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征是对超级根瘤形成作用的选择包括对F2植物的根部进行检查，把每株上的根瘤数和每株上的根瘤块与在基本上相同的培养条件下生长的第二亲代品种进行比较。

10、根据权利要求8所述的方法，其特征在于选择超级根瘤形成作用表型的步骤中包括使F1植株在5mM硝酸盐水平下生长。

11、如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的大豆品种在权利要求8的程序之后，再依照权利要求8的（c）和（d）步骤重复处理。

12、根据权利要求11所述的方法，其特征是具有超极根瘤形成作用表型的大豆突变体可被分类成如同nts246一样相同的遗传互补作用组。

13、根据权利要求11所述的方法，其特征是具有超级根瘤形成作用表型的大豆突变体是选自一组突变体品种，所述的这一组突变体品种能够被分类成相同的遗传互补作用组，如同nts382、nts2062、nts1116或nts1007。

14、根据权利要求11所述的方法，其特征是选择超级根瘤形成作用的步骤包括对F2植物的根部进行检查，把每株上的根瘤数和每株上的根瘤块与在基本上相同的条件下生长的第二亲代品种进行比较。

15、根据权利要求11所述的方法，其特征在于选择超级根瘤形成作用的步骤包括使F1植物在5mM硝酸盐水平下生长。

16、根据权利要求11所述的方法，其特征在于选择耐硝酸盐根瘤形成作用的步骤包括检查F2植物的根部，把每株上的根瘤数和根瘤块与在基本上相同的培养条件下，在5mM硝酸盐水平下生长的第二亲代品种作比较。

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