CN114381394B - 一株贝莱斯芽孢杆菌株及水蛛饵料原料发酵剂 - Google Patents
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Abstract
一株贝莱斯芽孢杆菌株及水蛛饵料原料发酵剂。本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌的新菌株Bacillus velezensis XDY021,其保藏号为GDMCC No:62146。本发明还公开了由所述贝莱斯芽孢杆菌XDY021制备的水蛛饵料原料发酵剂。所述的贝莱斯芽孢杆菌株XDY021在发酵中产生多种抑菌蛋白和抗菌肽等物质,能够抑制其他杂菌的生长,达到抑制或杀灭其他杂菌效果,适合用于有杂菌污染的发酵底物。在应用中,该菌株发酵的发酵底物的发酵程度,包括底物粒径和水不溶物含量等恰好符合培养水蛛的要求,而且不会出现发酵过度或发酵不足的现象。
Description
技术领域
本发明涉及了一株贝莱斯芽孢杆菌。本发明同时还涉及了使用该贝莱斯芽 孢杆菌新菌株制备的生物制剂,尤其涉及由该贝莱斯芽孢杆菌新菌株制备的水 蛛饵料原料发酵剂。
背景技术
在珠江三角洲等地区,农民们称鱼苗开口诱饵为“水蛛”,“水蛛”主要 是轮虫和枝角类的统称。“水蛛”分为“细水蛛”和“大水蛛”:“细水蛛” 主要是指大小在0.2mm-0.5mm之间的轮虫和小分枝角,它们能通过60目筛网, 是刚孵化的小鱼苗(前5天)的主食。“大水蛛”主要是指枝角类,大小为0.5- 1.0mm,是苗期食物转化前的主要食物,根据鱼类种类,以大水蛛为主要食物 的时间约为6~15天。水产养殖特别是鱼苗养殖过程中,水蛛的需求量很大,但 一直以来水蛛主要还是天然生长,人工养殖水蛛是近几年才开始有人开始尝试。
据了解当前水蛛需求量最大的是培养加州鲈鱼、桂花鱼、南美白对虾等高 价值水产动物苗种,以及其他鱼类如四大家鱼鱼苗的鱼苗场,这些鱼苗场需要 外购水蛛来给喂养鱼苗,这些水蛛,大部分是天然池塘里或者大海里捕捞的, 捕捞后它们需要冰冻起来保藏,因此都是死水蛛,它们往往携带有多种病原微 生物或其他环境中残留的杂质,因此这些鱼苗场的鱼苗养殖的成活率大部分都 不高,一直都在20-50%,甚至更低。因此人工培养活水蛛来喂养鱼苗是提高鱼 苗场养殖成功率的重要出路之一。
人工培养活水蛛需要专用饵料,目前培养水蛛主要采用普通的鸡粪等粪便 类肥料,也有采用饲料原料来配制的例如水蛛乐等,这些饵料要么对水体污染 较大,残留毒素多,要么原料成本较高,因此利用食品工业的下脚料来作为生 产培养水蛛的专用饵料的原料成为开发水蛛专用饵料较好的选择。
腐竹厂在日常生产过程中会产生大量的下脚料等,这些下脚料用作饲料或 肥料,需要经过灭菌和发酵腐熟处理,不能直接用做饲料或肥料,传统方法实 现对这些下脚料,需要先行高温灭菌,再发酵腐熟,效率比较低,工艺比较复 杂,处理成本高;即使这样目前它们往往只能作为一些低端鱼类的辅助饵料。
要把腐竹厂等的含蛋白类下脚料发酵转化成培养水蛛的专用饵料,必须筛 选出适合发酵腐熟这些下脚料的专用菌株,目前常用的发酵饲料的菌株如枯草 芽孢杆菌、酿酒酵母等,用这些菌种用来发酵这些下脚料,往往发酵过头,把 大部分粗蛋白发酵成为水溶性的氨基酸或小肽,不适合用来喂养水蛛,因此必 须筛选一种发酵程度恰到好处的菌株,来发酵上述下脚料,使其转化为水蛛的 饵料原料。
发明内容
本发明的第一个目的是提供了一株贝莱斯芽孢杆菌的新菌株(Bacillusvelezensis)XDY021,其保藏号为GDMCC No:62146,该菌株在发酵中产生多种 抑菌蛋白和抗菌肽等物质,能够抑制其他杂菌的生长,达到抑制或杀灭其他杂 菌效果,适合用于有杂菌污染的发酵底物。在应用中,该菌株发酵的发酵底物 的发酵程度,包括底物粒径和水不溶物含量等恰好符合培养水蛛的要求,而且 不会出现发酵过度或发酵不足的现象。
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY021,已经于2021 年12月20日送广东省微生物菌种保藏中心保藏,保藏号为CDMCC No: 62146,保藏地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明的第二个目的是提供一种用上述贝莱斯芽孢杆菌XDY021制备的生 物制剂。具体涉及由所述贝莱斯芽孢杆菌XDY021制备的水蛛饵料原料发酵剂。
本发明第二个目的通过以下技术措施来实现:贝莱斯芽孢杆菌XDY021制 备的水蛛饵料原料发酵剂,由贝莱斯芽孢杆菌XDY021经厌氧或低氧发酵而得, 含有贝莱斯芽孢杆菌XDY021。
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌XDY021制备的水蛛饵料原料发酵剂,用于 发酵含蛋白下脚料和/或含糖下脚料,其发酵底物粒径大小、水不溶物含量等恰 好符合培养水蛛的要求,作为水蛛饵料培养水蛛。而且由于依然存在贝莱斯芽 孢杆菌XDY021,其发酵产物耐储藏,储藏过程中不会滋生其他杂菌,不会出 现胀气、膨胀等现象。
作为本发明的一个实施例,贝莱斯芽孢杆菌XDY021制备的水蛛饵料原料 发酵剂由以下方法制备而成:
(1)接种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY021的新鲜培养物至装有 培养基的三角瓶中培养,制备XDY021菌液;
(2)以葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、氯化钠、硫酸锰和水为主要原 料配制培养基;
(3)取上述XDY021菌液接种至已灭菌的上述培养基中,在种子罐中进行 发酵培养,即得该贝莱斯芽孢杆菌制备的水蛛饵料原料发酵剂。
本发明步骤(2)中的培养基重量比为:蛋白胨1%-4%、酵母膏1%-4%、葡 萄糖0.5%-3%、KH2PO4 0.1%-2%、氯化钠0.1%-1.5%、硫酸锰0.01%-0.2%、加 纯净水至100%。
本发明步骤(1)中的摇瓶培养1-5天,步骤(3)中发酵罐培养1-5天,可厌氧 或低氧发酵。步骤(1)中的培养基与步骤(2)的培养基相同。
本发明步骤(3)中的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY021按照常规 的从0.1-50立方的发酵罐的发酵工艺及接种量培养,就可以实现本发明的目的。 但是作为本发明优选地,贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY021发酵液在 种子罐的接种量在发酵底物总质量的0.1~10%范围内。
本发明步骤(3)中,发酵为低氧发酵或厌氧发酵,发酵温度为30-45度,通 气量0-5m3/H。
附图说明
图1是贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY021的测序结果。
图2是试验一中未经贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY021发酵前的 发酵底物的显微图。
图3是试验一中经贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY021发酵后的发 酵底物的显微图。
具体实施方式
实施例一
贝莱斯芽孢杆菌XDY021的筛选:从广东省微生物研究所菌种保藏中心购 买了4株芽孢杆菌(XD05B-XD08B),1株酵母(XD05J),从广州百佳超市购 买了2株酵母(XD06J-XD07J),再从自然界分离筛选了4株芽孢杆菌 (XDY020-XDY023),3株酵母(XD05J-XD07J),然后将它们分别经3代含蛋 白下脚料和含糖下脚料构成的发酵底物的培养筛选,最后挑选出能将上述发酵 底物发酵成符合培养水蛛原料的菌株。
上述含蛋白下脚料包括:来自广东江门鹤山市鹤城镇南腐竹厂的腐竹渣, 来自广东江门鹤山市东古酱油厂的酱油渣,来自广东江门鹤山桃源花生油厂的 花生麸等;含糖下脚料包括:来自广东江门新会浩田陈皮厂的陈皮渣,来自广 东广州市东鹏食品饮料有限公司的茶叶渣,广西柳州安琪酵母厂的酵母渣等, 将这些原料按碳氮比10-35:1的比例配制(本发明的碳氮比按有机质:粗蛋白计, 下同),,作为本发明用于筛选菌种的发酵底物,具体配方见下表。
表一:发酵底物配方
上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的筛选方法:第一阶段:按表一配制发酵底物分别装入112个500ml的三角瓶中,每瓶装入300g,分别接种上述 的14种菌,每种菌接种8瓶,在35度的培养箱培养36小时后,分别进行细菌 总数的计数,挑选出总菌数≥107的4个菌株,它们是XDY020、XDY021、 XDY022、XDY023,证明这些菌株适合在这种底物上生长,继续做进一步的筛 选。第二阶段:将按表一配制的发酵底物装入32个500ml的三角瓶中,每瓶装 入300g,分别接种挑选出来的4种菌,每种菌接种8瓶,在35度的培养箱培 养36小时后,将发酵物用于水蛛的培养实验。
表二:不同菌株第七天的发酵产物检测结果记录
从表二可以看出,XDY021菌株的发酵产物中,1500-2200目粒径的发酵产 物数量最多,菌量适中。
培养试验:
将XDY020-023菌株发酵腐竹渣+酱油渣+陈皮渣的发酵产物用于培养水蛛 实验:在鹤山市新的生物制品有限公司的水蛛养殖试验场,设12个100L的水 蛛培养缸,分别加入80L水,并接种1L含有水蛛种源的水,分别将上述菌种 筛选方法第二阶段筛选出来的4种菌种发酵腐竹渣+酱油渣+陈皮渣(表一)的发 酵产物,添加时间为每天上午8:30,添加量为每个培养缸10ml,每个菌种的 培养物添加3个培养缸,每天观察水蛛的丰度,观察方法是在160倍显微镜下 计算每个视野水蛛的数量(每天的数量是三个培养缸的平均数取整数),第七天 收集水蛛,用100目筛网滤干水后称重,结果见表三所示。
表三:不同菌种发酵产物培养水蛛的效果记录表
组别 | 第一天 | 第二天 | 第三天 | 第四天 | 第五天 | 第六天 | 第七天 | 重量 |
XDY020 | 5 | 8 | 18 | 38 | 67 | 88 | 107 | 221g |
XDY021 | 5 | 8 | 20 | 48 | 90 | 124 | 179 | 323g |
XDY022 | 5 | 7 | 16 | 36 | 83 | 113 | 146 | 240g |
XDY023 | 5 | 6 | 17 | 37 | 78 | 111 | 155 | 284g |
从表二和表三可以看出XDY021菌株培养的水蛛从丰度,到产量都是最高的。
经连续5次的重复实验,最终选择水蛛丰度最高,水蛛产量最高的菌株为 XDY021,将该菌株送华南农业大学分子遗传实验室进行DNA测序(见图1), 结果证明该菌株是一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的菌株。
实施例二
(1)制备XDY021菌液:接种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY021 的新鲜培养物至装有培养基的16个500ml三角瓶中,在35℃的水浴摇床中培 养48h,搅拌转速为20-50rpm。此步骤中的培养基与步骤(2)的培养基相同。
(2)培养基的制作:以葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、氯化钠、硫酸 锰和水为主要原料配制培养基,它们的质量百分比为:
蛋白胨2%、酵母膏3%、葡萄糖2%、KH2PO4 0.6%、氯化钠0.6%、硫酸 锰0.02%,水余量。
(3)取上述XDY021菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中,调整起始 pH至6,在100L种子罐中进行厌氧发酵5天,至终点pH为4.5,即得该贝莱 斯芽孢杆菌制备的水蛛饵料原料发酵剂。
实施例三:
(1)制备XDY021菌液:接种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY021 的新鲜培养物至装有培养基的16个500ml三角瓶中,在38℃的生化培养箱培 养48h。此步骤中的培养基与步骤(2)的培养基相同。
(2)培养基的制作:以葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、氯化钠、硫酸 锰和水为主要原料配制培养基,它们的质量百分比为:
蛋白胨3%、酵母膏2.5%、葡萄糖2%、KH2PO4 0.5%、氯化钠0.4%、硫酸 锰0.04%,水余量。
(3)取上述XDY021菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中,调整起始 pH至6,在100L种子罐中进行低氧发酵5天,通气量为0.3m3/h,至终点pH 为4.5,即得该贝莱斯芽孢杆菌制备的水蛛饵料原料发酵剂。
实施例四:
(1)制备XDY021菌液:接种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY021 的新鲜培养物至装有培养基的20个500ml三角瓶中,在38℃的生化培养箱培 养48h。此步骤中的培养基与步骤(2)的培养基相同。
(2)培养基的制作:以葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、氯化钠、硫酸 锰和水为主要原料配制培养基,它们的质量百分比为:
蛋白胨3.5%、酵母膏2.5%、葡萄糖3%、KH2PO4 0.5%、氯化钠0.1%、硫 酸锰0.01%,水余量。
(3)取上述XDY021菌液接种至经过高温灭菌的上述培养基中,调整起始 pH至6,在100L种子罐中进行厌氧发酵5天,至终点pH为4.7,即得该贝莱 斯芽孢杆菌制备的水蛛饵料原料发酵剂。
试验例一
将实施例二中的所筛选出来的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY021菌株(XDY021菌株)制成的水蛛饵料原料发酵剂,在鹤山市新的生物制品有限公 司位于鹤山市桃源镇中心村交通石场的实验基地进行发酵物的处理实验。按表 一的比例配制500g腐竹渣+酱油渣+陈皮渣的混合料,加入400ml纯净水,充 分混合均匀后,经过胶体磨研磨成浆料后,检测其菌群情况,发现有酵母、不 同类型的芽孢杆菌、大肠杆菌、霉菌等15种菌种左右,没有一种菌处于优势菌 种(图2)。
各取300g置入三个500ml的三角瓶中,分别加入XDY021菌株制成的水蛛 饵料原料发酵剂30ml,在恒温摇床培养72小时后,搅拌转速为20-50rpm,再 次检测菌群情况,发现三个三角瓶的发酵产物中95%以上的菌都是贝莱斯芽孢 杆菌,其他杂菌不到5%(见表四),基本看不到大肠杆菌,霉菌等存在,该实 验证明,贝莱斯芽孢杆菌制备的水蛛饵料原料发酵剂,能有效抑制其他杂菌的 生长(图3);经查证贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY021在生长过程 中会产生抗菌肽和抑菌蛋白等物质来抑制其他杂菌生长。
表四:下脚料发酵前后不同菌类比例检测结果
试验例二
用实施例二、三、四的水蛛饵料原料发酵剂,分别发酵发酵底物:
按表一的比例配制500g腐竹渣+酱油渣+陈皮渣的混合料,加入400ml纯 净水,充分混合均匀后,经过胶体磨研磨成浆料后,各取300g置入三个500ml 的三角瓶中,分别加入实施例二、三、四的水蛛饵料原料发酵剂30ml,在恒温 摇床培养72小时后用于水蛛养殖试验,搅拌转速为20-50rpm。
在鹤山市新的生物制品有限公司的水蛛养殖试验场,设12个100L的水蛛 培养缸,分别加入80L水,并接种1L含有水蛛种源的水,将12个培养缸分成 三组,每组四个缸,分别加入实施例二、三、四所制备的发酵剂的发酵产物, 添加时间为每天上午8:30,添加量为每个培养缸10ml,每天观察水蛛的丰度, 观察方法是在160倍显微镜下计算每个视野水蛛的数量(每天的个数是四个培 养缸的平均数取整数),第七天观察水蛛数量后收集水蛛,用100目筛网滤干 水后称重,结果见表五。
表五:不同发酵方法制备的生物制剂发酵产物的应用效果
表五的结果说明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)XDY021分别经三种发酵方式所得的水蛛饵料原料发酵剂的对发酵底物的发酵效果的差异不大。
试验例三
取实施例二、三、四的水蛛饵料原料发酵剂用真空袋抽真空后封口包装, 放置到40度的恒温烘箱中进行耐储存实验,储存15天后未见产品有胀气或膨 胀现象,证明该发酵剂中的XDY021菌继续抑制其他产气杂菌的生长,发酵物 具有良好的耐储性和商品属性。
Claims (7)
1.一株贝莱斯芽孢杆菌的新菌株Bacillus velezensis XDY021,其保藏号为GDMCCNo:62146。
2.由权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌XDY021制备的水蛛饵料原料发酵剂,其特征是,由贝莱斯芽孢杆菌XDY021经厌氧或低氧发酵而得,含有贝莱斯芽孢杆菌XDY021;所述发酵采用的培养基各组分质量百分比为:蛋白胨1%-4%、酵母膏1%-4%、葡萄糖0.5%-3%、KH2PO40.1%-2%、氯化钠0.1%-1.5%、硫酸锰0.01%-0.2%、加纯净水至100%。
3.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌株XDY021制备的水蛛饵料原料发酵剂,其特征是,由以下方法制备而成:
(1)接种贝莱斯芽孢杆菌XDY021的新鲜培养物至装有培养基的三角瓶中培养,制备XDY021菌液;
(2)以葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、氯化钠、硫酸锰和水为主要原料配制培养基;
(3) 取所述XDY021菌液接种至已灭菌的上述培养基中,在种子罐中进行发酵培养,即得贝莱斯芽孢杆菌制备的水蛛饵料原料发酵剂。
4.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌株XDY021制备的水蛛饵料原料发酵剂,其特征是,所述步骤(2)中的培养基各组分质量百分比为:蛋白胨1%-4%、酵母膏1%-4%、葡萄糖0.5%-3%、KH2PO40.1%-2%、氯化钠0.1%-1.5%、硫酸锰0.01%-0.2%、加纯净水至100%。
5.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌株XDY021制备的水蛛饵料原料发酵剂,其特征是,所述步骤(1)中的摇瓶培养1-5天,所述步骤(3)中发酵罐培养1-5天。
6.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌株XDY021制备的水蛛饵料原料发酵剂,其特征是,所述步骤(3)中的贝莱斯芽孢杆菌XDY021发酵液在种子罐的接种量在发酵底物总质量的0.1~10%范围内。
7.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌株XDY021制备的水蛛饵料原料发酵剂,其特征是,所述步骤(3)中,发酵为低氧发酵或厌氧发酵,发酵温度为30-45℃,通气量0-5m3/H。
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CN113755358A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-12-07 | 山西农业大学 | 一种贝莱斯芽孢杆菌zj1菌株和发酵液制备及使用方法 |
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2021
- 2021-12-30 CN CN202111651577.5A patent/CN114381394B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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