CN109456914A - 一种水产养殖用耐低温乳酸菌及其应用 - Google Patents

一种水产养殖用耐低温乳酸菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐低温乳酸菌的发酵生产、扩培方法及其应用，属于饲料添加剂、水产养殖和微生物技术领域。本发明是将肠膜明串珠菌菌种活化后接种到液体培养基中进行发酵，得到耐低温乳酸菌的菌剂产品，将该耐低温乳酸菌的菌剂产品接种到扩培培养基中可进行规模扩培得到扩培菌剂产品。本发明的耐低温乳酸菌的菌剂产品拌入水体养殖动物饲料，可促进水体中鱼、虾、蟹类肠道菌群平衡，提高饲料利用率。本发明的耐低温乳酸菌的菌剂产品和扩培菌剂产品在低温和常温下均可按照一定的比例泼洒到养殖水体，使用周期广，在鱼、虾、蟹育苗期至生长期均可使用。本发明耐低温乳酸菌的菌剂产品及扩培菌剂产品的使用可提高水产养殖动物育苗期存活率，促进水体养殖动物的生长，并能分解鱼、虾、蟹类残饵及排泄物等有机质，改善养殖水体水质。

Description

一种水产养殖用耐低温乳酸菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种水产养殖用耐低温乳酸菌及其应用，属于饲料添加剂、水产养殖和微生物技术领域。
背景技术
近几十年来，我国的水产养殖业飞速发展，已成为我国国民经济的一个支柱产业。但随着水产养殖业的发展和集约化水平不断提高，水生动物疫情和病虫害问题随之显现。抗生素和化学药物的应用在一定时期内解决了疾病的控制问题，但长期使用这些药物也导致了养殖环境菌群平衡被破坏、水产食品安全等一系列问题。因此水产养殖业要实现健康、快速发展必须走可持续的绿色发展之路。
近年来，益生菌剂以其无毒害、无污染、无残留等优点，在水产养殖中得到了广泛的应用，包括了饲料添加剂、池塘水质净化剂等方面的应用。大量的研究表明，乳酸菌通过降解碳水化合物生成乳酸和其他有机酸，使养殖动物肠道内pH值下降，从而抑制有害菌繁殖，提高免疫力，同时乳酸菌可分解残饵、粪便及水中有机质，改良水质，抑制有害菌的繁殖，调节菌藻平衡。
春季是虾、蟹类育苗期，但受到低温季节限制，一般市场上使用的水产用乳酸菌菌剂产品发酵温度需在30-35℃左右，10℃以下几乎不生长，所以在春秋季节的低温条件不利于常规乳酸菌菌剂产品中乳酸菌的生长使得其无法有效使用。因此，寻找优良的耐低温乳酸菌的菌剂产品对养殖显得尤为重要。
本发明的菌剂产品在5-37℃范围内均可使用，本发明的菌剂产品利用其代谢作用可改善水体养殖动物内部肠道环境，促进饲料的转化吸收，增强抵抗力，同时可起到净化水质作用，减少病害的发生，大大提高了养殖的综合效益，意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种水产养殖用耐低温乳酸菌的菌剂产品及扩培菌剂产品的生产方法及应用。
本发明使用的菌株是由发明人分离筛选出的1株耐低温乳酸菌肠膜明串珠菌及市售安琪牌高活性干酵母组成。本发明的一种水产养殖用耐低温乳酸菌的菌剂产品由肠膜明串珠菌和液体培养基制成，其中该菌已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.15405，保藏日期为2018年03月01日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，生物保藏的分类命名：肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides。该菌是由泡菜样品中分离得到的一株生长繁殖能力强和发酵产酸能力强的耐低温乳酸菌，为革兰氏阳性球菌，不运动，无芽孢，兼性厌氧菌，生长温度范围广（2℃-37℃），耐酸性极强。本发明的扩培菌剂产品是由一定比例组成的耐低温乳酸菌的菌剂产品和安琪牌高活性干酵母作为母菌液加扩培培养基在低温条件下扩培发酵得到。
本发明所述的一种水产养殖用耐低温乳酸菌的菌剂产品及扩培菌剂产品的生产方法如下：
1、制备如权利要求1所述耐低温乳酸菌的菌剂产品方法，其特征在于该耐低温乳酸菌的菌剂产品的制备方法按以下步骤实现：（1）将权利要求1中所述的肠膜明串珠菌接种于固体培养基上进行活化；（2）挑取活化好的菌种的单菌落接种于液体培养基上，在温度30℃条件下培养48小时；（3）把（2）中培养好的菌种接种到发酵罐中30℃发酵24小时，制成菌体悬液，菌液中活菌数≧4×109 CFU /mL，即制备完成耐低温乳酸菌菌剂产品，对耐低温乳酸菌的菌剂产品进行质检，合格后灌装，阴凉干燥处保存。其中步骤（1）中固体培养基为每1000mL由蛋白胨10.0 g ，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g ，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0 g ，葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g ，吐温80 1.0 mL ，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0 g ，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0 g ，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g ，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g ，琼脂18.0 g和1000 mL蒸馏水组成。步骤（2）中液体培养基每1000 mL由蛋白胨10.0 g ，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g ，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0 g ，葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0 g ，吐温80 1.0 mL ，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0 g ，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0g ，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g ，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g 和1000 mL蒸馏水组成。
2、制备如权利要求1所述扩培菌剂产品生产方法如下：
（1）根据权利要求1所述的扩培菌剂产品母菌液，其特征在于，由如下重量份的组分组成（每100 L扩培量）：
耐低温乳酸菌的菌剂产品 10 L；
安琪牌高活性干酵母 1 g；
其中，耐低温乳酸菌的菌剂产品中活菌数≧1×109 CFU/mL。
（2）制备如权利要求1所述扩培菌剂产品方法，其特征在于该扩培菌剂产品的制备方法按以下步骤实现（每100 L扩培量）：
a.将100升塑料白桶挪至室外阳光直射处（室外温度5以上），向桶内加入50 L左右的干净水（井水或自来水，自来水需晾晒一段时间防止自来水中的余氯对菌的生长产生影响）；b.将称好的扩培培养基、2公斤红糖、权利要求书1中的10 L耐低温乳酸菌的菌剂产品和1 g安琪牌高活性干酵母加入100 L白桶内，用干净的长棍搅拌均匀，然后向塑料白桶内注水至100 L体积，密封发酵7天至发酵液pH在4.5左右即可。其中步骤b中培养基每1000 mL由蛋白胨10.0 g ，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g ，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0 g ，葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g ，吐温80 1.0 mL ，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0 g ，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0 g ，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g ，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g 和1000mL蒸馏水组成。
3、权利要求1所述的耐低温乳酸菌菌剂产品使用方法，其特征在于：该菌剂可以拌喂或直接泼洒入养殖水体。具体使用方法：将权利要求1所述的复合益生菌剂按饲料重量的1%～2%添加到饲料中（可用干净的水将该复合益生菌剂稀释后再与饲料混拌均匀），每日添加2次，早晚各一次，菌剂与饲料需提前1-2小时预混，使菌剂完全浸入到待投喂的饲料中，投喂时直接将混拌均匀的饲料投喂即可，或将权利要求1所述的耐低温乳酸菌菌剂产品按5L/亩直接泼洒入养殖池塘。
4、权利要求1所述的扩培菌剂产品使用方法，其特征在于：将扩培好的菌剂直接泼洒入养殖水体，泼洒量一般5 L/亩，具体泼洒量视水质情况而定，水质较差时可适当增加泼洒量。
附图说明
图1、耐低温乳酸菌菌剂在低温条件的生长曲线及pH变化。
具体实施方式
实施例1：一种水产养殖用耐低温乳酸菌的菌剂产品及扩培菌剂产品的生产方法
1、耐低温乳酸菌的菌剂产品生产方法：
（1）将权利要求1中所述的肠膜明串珠菌接种于固体培养基上进行活化；（2）挑取活化好的菌种的单菌落接种于液体培养基上，在温度30℃条件下培养48小时；（3）把（2）中培养好的菌种接种到发酵罐中30℃发酵24小时，制成菌体悬液，菌液中活菌数≧4×109 CFU /mL，即制备完成耐低温乳酸菌菌剂产品，对耐低温乳酸菌的菌剂产品进行质检，合格后灌装，阴凉干燥处保存。其中步骤（1）中固体培养基为每1000 mL由蛋白胨10.0 g ，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g ，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0 g ，葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0g ，吐温80 1.0 mL ，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0 g ，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0 g ，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g ，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g ，琼脂18.0 g和1000 mL蒸馏水组成。步骤（2）中液体培养基每1000 mL由蛋白胨10.0 g ，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g ，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0 g ，葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g ，吐温80 1.0 mL ，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0 g ，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0 g ，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58g ，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g 和1000 mL蒸馏水组成。
2、扩培菌剂产品生产方法：
（1）根据权利要求1所述的扩培菌剂产品母菌液，其特征在于，由如下重量份的组分组成（每100 L扩培量）：
耐低温乳酸菌的菌剂产品 10 L；
安琪牌高活性干酵母 1 g；
其中，耐低温乳酸菌的菌剂产品中活菌数≧1×109 CFU/mL。
（2）制备如权利要求1所述扩培菌剂产品方法，其特征在于该扩培菌剂产品的制备方法按以下步骤实现（每100 L扩培量）：
a.将100升塑料白桶挪至室外阳光直射处（室外温度5以上），向桶内加入50 L左右的干净水（井水或自来水，自来水需晾晒一段时间防止自来水中的余氯对菌的生长产生影响）；b.将称好的扩培培养基、2公斤红糖、权利要求书1中的10 L耐低温乳酸菌的菌剂产品和1 g安琪牌高活性干酵母加入100 L白桶内，用干净的长棍搅拌均匀，然后向塑料白桶内注水至100 L体积，密封发酵7天至发酵液pH在4.5左右即可。其中步骤b中培养基每1000 mL由蛋白胨10.0 g ，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g ，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0 g ，葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g ，吐温80 1.0 mL ，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0 g ，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0 g ，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g ，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g 和1000mL蒸馏水组成。
实施例2：耐低温乳酸菌菌剂在低温条件的生长曲线及pH变化
试验方法：采用MRS液体培养基将耐低温乳酸菌菌剂在20℃条件下静止培养。监测其在20℃低温条件下随时间的生长浓度及pH变化，详见附图1。
实施例3 扩培菌剂产品生长及pH变化
试验方法：试验地点为江苏淮安，季节为春季。根据扩培菌剂产品生产方法操作步骤操作，将100 L白桶置于室外阳光能照射处，每天上午10点取样进行水温、pH、镜检等指标检测和记录，当pH下降至4.5左右时进行平板计数，周期七天。监测期间扩培菌剂水温为6~10℃。监测结果扩培菌剂pH值从初始的5.77，一周后降至4.45，最后的菌落计数为3.71亿CFU/mL，显微镜镜检结果表明视野内含有耐低温乳酸菌及酵母菌，其中耐低温乳酸菌为优势菌，长势很好。扩培菌剂产品生长pH变化如下：
时间 第0天 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天
pH 5.77 5.75 5.74 5.71 5.01 4.69 4.50 4.45
实施例4 江苏射阳某南美白对虾大棚养殖基地应用
2017年，江苏射阳某白对虾养殖基地开始使用本发明的耐低温乳酸菌的菌剂产品及扩培菌剂产品，从该基地挑选部分虾棚进行对比试验，平均每个虾棚0.6亩，水深1.2米，每个棚投苗5万尾，规格0.9厘米正大苗，养殖品种为南美白对虾，耐低温乳酸菌的菌剂产品及扩培菌剂产品主要使用方式为泼洒调水加拌料喂食。根据对比试验结果，坚持使用本发明的耐低温乳酸菌的菌剂产品及扩培菌剂产品的虾棚，相同时间内虾的生长速度明显增块，规格增加33%，产量增加25%。在总饲料使用量不变的情况下，可以提高养殖户养殖效益，减少养殖过程中其他药品使用，节约养殖成本。南美白对虾生长情况及日投料情况如下：
实施例5 江苏淮安韩桥某传统土塘养殖蟹塘使用
2017年江苏淮安韩桥某传统土塘养殖蟹塘自投放蟹苗开始使用本发明的耐低温乳酸菌的菌剂产品及扩培菌剂产品，该蟹塘面积250亩，水深1米，养殖品种为洪泽湖大闸蟹。该品牌螃蟹从蟹苗投放、饲养到成熟一直遵循天然饵料加冷冻鲜鱼喂养的原则，同时全程使用扩培菌剂产品配合耐低温乳酸菌的菌剂产品拌料增加螃蟹体质，提高螃蟹免疫力，并改善水体生态环境。从跟踪情况可以看出，与2016年未使用本发明菌剂的情况相比较，2017年使用本发明菌剂的使用可以提高螃蟹饵料系数，提高螃蟹的健康水平和抗病能力，增加产量，有效维持水体pH稳定。 螃蟹产量、投料及养殖水体pH情况如下：
日期 放苗数/亩 规格（平均） 产量 投料量 塘口pH
2016年 1000只 2母3公 160斤/亩 360斤/亩 平均≥9.0
2017年 1000只 2.5母3.5公 200斤/亩 300斤/亩 平均≤8.7

Claims (12)

1.一种水产养殖用耐低温乳酸菌的菌剂产品其特征在于该菌剂由肠膜明串珠菌和液体培养基制成。
2.其中该菌已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.15405。
3.本发明的扩培菌剂产品，其特征在于它由一定比例组成菌剂产品和市售安琪牌高活性干酵母作为母菌液加扩培培养基在低温条件下扩培发酵得到。
4.根据权利要求1所述的扩培菌剂产品母菌液，其特征在于，由如下重量份的组分组成（每100 L扩培量）：
耐低温乳酸菌的菌剂产品 10 L；
安琪牌高活性干酵母 1 g；
其中，耐低温乳酸菌的菌剂产品中活菌数≧1×109 CFU/mL。
5.制备如权利要求1所述耐低温乳酸菌的菌剂产品方法，其特征在于该耐低温乳酸菌的菌剂产品的制备方法按以下步骤实现：（1）将权利要求1中所述的肠膜明串珠菌接种于固体培养基上进行活化；（2）挑取活化好的菌种的单菌落接种于液体培养基上，在温度30℃条件下培养48小时；（3）把（2）中培养好的菌种接种到发酵罐中30℃发酵24小时，制成菌体悬液，菌液中活菌数≧4×109 CFU /mL，即制备完成耐低温乳酸菌菌剂产品，对耐低温乳酸菌的菌剂产品进行质检，合格后灌装，阴凉干燥处保存。
6.其中步骤（1）中固体培养基为每1000 mL由蛋白胨10.0 g ，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g ，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0 g ，葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g ，吐温80 1.0mL ，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0 g ，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0 g ，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g ，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g ，琼脂18.0 g和1000 mL蒸馏水组成。
7.步骤（2）中液体培养基每1000 mL由蛋白胨10.0 g ，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g ，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0 g ，葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g ，吐温80 1.0 mL ，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0 g ，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0 g ，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g ，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g 和1000 mL蒸馏水组成。
8.制备如权利要求1所述扩培菌剂产品方法，其特征在于该扩培菌剂产品的制备方法按以下步骤实现（每100 L扩培量）：
（1）将100升塑料白桶挪至室外阳光直射处（室外温度5以上），向桶内加入50 L左右的干净水（井水或自来水，自来水需晾晒一段时间防止自来水中的余氯对菌的生长产生影响）；（2）将称好的扩培培养基、2公斤红糖、权利要求书1中的10 L耐低温乳酸菌的菌剂产品和1 g安琪牌高活性干酵母加入100 L白桶内，用干净的长棍搅拌均匀，然后向塑料白桶内注水至100 L体积，密封发酵7天至发酵液pH在4.5左右即可。
9.其中步骤（2）中所述的扩培培养基每1000 mL由蛋白胨10.0 g ，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g ，柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0 g ，葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g ，吐温801.0 mL ，乙酸钠（CH3COONa·3H2O）5.0 g ，磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O）2.0 g ，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g ，硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g 和1000 mL蒸馏水组成。
10.权利要求1所述的耐低温乳酸菌的菌剂产品使用方法，其特征在于：该耐低温乳酸菌的菌剂产品可以拌喂或直接泼洒入养殖水体。
11.具体使用方法：将权利要求1所述的耐低温乳酸菌的菌剂产品自3月份投苗期开始至养殖动物上市按饲料重量的1%～2%添加到饲料中（用干净的水将该耐低温乳酸菌的菌剂产品稀释后再与饲料混拌均匀），每隔15天拌一个周期，每一次拌料周期为3-5天，每日一次，菌剂与饲料需提前1-2小时预混，投喂时直接将混拌均匀的饲料投喂即可，或将权利要求1所述的耐低温乳酸菌菌剂产品按5 L/亩直接泼洒入养殖池塘，每隔15天泼洒一次。
12.权利要求1所述的扩培菌剂产品使用方法，其特征在于：将扩培菌剂产品直接泼洒入养殖水体，泼洒量一般5 L/亩，具体泼洒量视水质情况而定，水质较差时可适当增加泼洒量。
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