CN108823135A - 一种提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基及发酵条件 - Google Patents

一种提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基及发酵条件 Download PDF

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Abstract

一种提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基及发酵条件，涉及海洋褐色杆菌的发酵培养基及发酵条件。所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基的原料配方按质量百分比为：葡萄糖0.1％、酵母膏0.4％、工业海盐2.5％、MgSO40.015％，pH值6.0～8.0。将海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的种子液接种至锥形瓶中，该锥形瓶中装有已消毒灭菌的发酵培养基，再将锥形瓶置于恒温摇床上发酵培养，发酵培养基为所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基。

Description

一种提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基及 发酵条件
技术领域
本发明涉及海洋褐色杆菌的发酵培养基及发酵条件，尤其是涉及一种提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基及发酵条件。
背景技术
伴随着养殖业的快速发展，集约化程度的提高以及沿海水质的日益恶化，水产养殖动物爆发性病害日益增多。为抗生素及化学药物的应用在一定程度上缓解和控制了水产生物病害的发生和蔓延，但随之而来的弊端也日渐显露。它不仅违背人们所倡导的健康养殖宗旨，同时也干扰养殖环境及水生动物微生态平衡，导致水产动物对病原微生物的易感性，更严重的是病原菌的耐药性增强，使得水产养殖病害防治工作越加困难。另外，抗生素在水生动物体内的残留、富集，使得水产品质量降低，成为了水产品销售量和出口贸易量的限制因素。
水产动物疾病“防胜于治”。益生菌制剂是通过调整水产养殖动物微生态失调、保持微生态平衡、提高动物健康水平或增进健康状态，以及促进这些生理菌群生长繁殖的生物制品，具有安全环保、无毒害、无残留、无耐药性、防治病原、保健营养等特点，已广泛应用于饲料和养殖环境的改良中，具有广阔而光明的前景。目前水产养殖上应用的益生菌制剂多是由畜禽类微生态制剂衍生而来，也有少量来源于养殖水产动物，由于使用对象生态习性的差异，并不能完全适用于海水养殖动物，其益生效果也受到限制。现今，益生菌制剂已建立了国际通用的质量标准，包括菌种来源(正常微生物类群的成员)、活菌数、安全性及生态效应都具有严格的标准。因此，开发海水养殖动物特有的，功能性强，针对性高，具有自主知识产权的益生菌制剂有助于提升海水养殖产品质量及规范海水动物饲用益生菌的使用。
菌种是水产养殖动物用益生菌制剂质量控制的源头，是产量、质量和效果的重中之重。益生菌制剂的国际通用质量标准规定：益生菌制剂的生产菌株必须是正常微生物群落的成员或其生长促进菌种。它们在自然生态环境中必须无毒、无害，原则是这些菌种来源于自然生态环境，再回归于自然环境。而目前我国所应用于水产动物用的菌种多来源于陆生环境，而水生环境中水产动物肠道内的微生物群落与陆生环境有所不同，其与水环境及宿主自身持续的发生着相互作用。因此，消化道微生物区系的组分一般是从水体和饵料当中获得，并能在消化道微生态环境中定植、存活、增殖。而其他部分来源于水生环境的益生菌制剂也并不适应海水养殖动物的生物特性和养殖环境，在菌种的作用机理及对环境的影响等方面的研究也较为滞后，无法达到预期效果。
海洋褐色杆菌Phaeobacter sp.AP1220，分离自鲍肠道，对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、轮虫弧菌、迟钝爱德华氏弧菌等水产致病菌均具有抗菌活性。在前期研究中，对壳长3cm的杂色鲍幼鲍投喂含AP1220益生菌的配合饲料，养殖成活率较对照组提高24.38％；壳长增长率比对照组提高16.7％；体重增长率较对照组提高34.34％，获得了良好的养殖效果；攻毒实验结果表明，饲喂含益生菌饲料的鲍成活率比饲喂未添加益生菌饲料的鲍成活率提高了30.65％。目前，对益生菌的研究包括两个方面：其一，筛选优良菌株，构建庞大的益生菌资源库。其二，对于已知的有益菌株，通过研究优化其培养条件，降低培育成本、提高菌株产量与活性，具有重要的现实意义。发酵培养基成分及培养条件是工业化大规模生产益生菌制剂的前提。本发明优化了海洋褐色杆菌AP1220的发酵培养基及发酵条件，为海水养殖动物益生菌制剂的工业化生产提供理论依据与技术支持。
本申请人在中国专利ZL201210016016.2公开一种用于鲍养殖的肠道益生菌粉及其制备方法，其中给出的海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220，已于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5254。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基。
本发明所要解决的技术问题之二在于提供一种提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵条件。
所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基的原料配方按质量百分比为：葡萄糖0.1％、酵母膏0.4％、工业海盐2.5％、MgSO4 0.015％，pH值6.0～8.0。
所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵条件如下：
将海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的种子液接种至锥形瓶中，该锥形瓶中装有已消毒灭菌的发酵培养基，再将锥形瓶置于恒温摇床上发酵培养，发酵培养基为所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基。
所述海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的种子液的接种量可为1％。
所述锥形瓶可为250mL锥形瓶，锥形瓶装有50mL已消毒灭菌的发酵培养基。
所述消毒灭菌的发酵培养基可置于120℃下消毒灭菌30min。
所述培养温度可为25～30℃，培养时间可24h，pH值6.0～8.0。
本发明通过优化发酵条件，提高了菌液的活菌细胞数量和抗菌活性。在优化条件下AP1220的OD630值从0.83提高至1.10，提高了32.53％；抑菌直径(以哈维氏弧菌Vibrioharveyi为病原菌指示菌)从初始1.62cm提高至1.75cm，增大了8.0％。有利于海洋褐色杆菌在后续海水动物饲料添加剂的配比，减少了使用成本。
附图说明
图1是本发明中海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的生长曲线。
图2是本发明中海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220种子液稀释标准曲线。
图3是本发明中不同碳源对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响图。
图4是本发明中不同氮源对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响图。
图5是本发明中不同无机盐对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响图。
图6是本发明中不同金属离子对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响图。
图7是本发明中不同温度对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响图。
图8是本发明中不同接种量对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响图。
图9是本发明中不同装液量对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响图。
图10是本发明中不同初始pH值对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响图。
图11是发酵培养基和发酵条件优化前后海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的比较图。
具体实施方式
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
本发明采用海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220，已于2011年09月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5254。
所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基的原料配方按质量百分比为：葡萄糖0.1％、酵母膏0.4％、工业海盐2.5％、MgSO4 0.015％，pH值6.0～8.0。
所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵条件如下：
将海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的种子液按1％接种量接种至250mL锥形瓶中，该锥形瓶中装有50mL已消毒灭菌的发酵培养基，再将锥形瓶置于恒温摇床上发酵培养，培养温度为25～30℃，pH值6.0～8.0，培养时间24h；发酵培养基为所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基。
所述消毒灭菌的发酵培养基可置于120℃下消毒灭菌30min。
以下给出具体实施例。
1、材料与方法
1.1菌株
海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220，由厦门大学海洋与地球学院分离保存。
1.2基础发酵培养基
以2216E液体培养基作为基础发酵培养基：蛋白胨5g/L、酵母膏1g/L、磷酸高铁0.01g/L、过滤陈海水1L。
1.3试验方法
1.3.1种子液培养
用接种环将-80℃保存的海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220接种于2216E固体培养基上，30℃培养48h进行活化。活化2次之后，从2216E平板上挑取一环单克隆海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220，接种于装有100mL 2216E液体培养基的250mL锥形瓶，200r/min、30℃摇床培养20h后备用。
1.3.2生长曲线的测定
将上述种子液接种于装有100mL基础培养基的250mL锥形瓶中，接种量为1％，200r/min、30℃摇床培养。每隔2h取样，以基础培养基为空白，测定发酵液在630nm条件下的吸光度。以培养时间为横坐标，OD630为纵坐标，绘制海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的生长曲线。
1.3.3海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630与生物量关系
选取对数末期的海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220菌液，使用灭菌纯水稀释至原浓度的0.2、0.4、0.6、0.8，分别测定稀释液与原液的OD630值。稀释液与原液采用稀释平板计数法，将菌液分别稀释至106、107、108三个浓度梯度，每个梯度涂布于3个2216E平板上，在30℃培养至菌落清晰可见后计数。以生物量为横坐标，以OD630值为纵坐标，绘制海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220OD630随生物量变化图，探究是否可以使用OD630值作为检测生物量的标准。
1.3.4海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220抑菌能力的测定
采用滤纸片法测定，具体步骤如下：
①在30℃、200rpm条件下，使用2216E液体培养基培养海洋褐色杆菌(Phaeobactersp.)AP1220菌液至对数末期。
②在37℃、200rpm条件下，使用LB液体培养基培养迟钝爱德华氏菌至OD值约为0.2至0.5。
③LB固体培养基高温高压灭菌之后自然冷却至50℃左右，每100mL培养基加入1mL病原指示菌菌液，摇匀后立即制作平板。
④将直径6mm左右的无菌滤纸片轻轻贴在平板表面，每块平板分散放置3枚滤纸片。吹干待用。
⑤取1mL第一部制得的发酵液，在12000rpm、室温条件下离心1min。将上清液20μL滴加于滤纸片上。
⑥待上清液完全吸收以后，平板在30℃条件下倒置培养24h。
⑦测定抑菌圈直径。
1.3.5培养基组分的选择
①培养基碳源优化：将基础培养基中的蛋白胨替换为等量的淀粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，以不加碳源的培养基作为阴性对照、以基础培养基作为阳性对照。以1％接种量加入种子液，在30℃、200r/min条件下摇培24h。测定比较不同碳源对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响图。
②培养基氮源优化：将基础培养基中的酵母膏替换为等量的牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵，以上述实验的最优碳源代替基础培养基中的蛋白胨、以不加氮源的培养基作为阴性对照、以基础培养基作为阳性对照。以1％接种量加入种子液，在30℃、200rpm条件下摇培24h。测定比较不同氮源对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响图。
③培养基无机盐优化：将基础培养基中的陈海水替换为10‰NaCl、10‰KCl、10‰MgSO4、10‰CaCl2加单蒸水，以上述实验的最优碳源和氮源代替基础培养基中的蛋白胨和酵母膏、以不加无机盐的培养基作为阴性对照、以基础培养基作为阳性对照。以1％接种量加入种子液，在30℃、200rpm条件下摇培24h。测定比较不同无机盐对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响图。
④培养基金属离子优化：将基础培养基中的磷酸高铁替换为等量Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+，以上述实验的最优碳源、氮源和无机盐代替基础培养基中的蛋白胨、酵母膏和陈海水、以不加金属离子的培养基作为阴性对照、以基础培养基作为阳性对照。以1％接种量加入种子液，在30℃、200rpm条件下摇培24h。测定比较不同金属离子对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响图。
1.3.6培养基成分的正交优化
根据以上的实验结果，选择最优碳源、最优氮源、最优无机盐、最优金属离子四因素四水平设计正交实验。具体实验设计如表1所示。
表1海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220摇瓶正交试验设计
1.3.7培养条件的选择
根据1.3.6得到的实验结果配置培养基。
①培养温度优化：以1％接种量加入种子液，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃五种温度培养，在200rpm条件下摇培24h。测定比较不同温度对海洋褐色杆菌(Phaeobactersp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响。
②接种量优化：分别以1％、3％、5％、8％、10％接种量加入种子液，在最优温度、200rpm条件下摇培24h。测定比较不同接种量对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响。
③装液量优化：在250mL锥形瓶中分别加入20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL培养基，以最优接种量加入种子液，在最优温度、200rpm条件下摇培24h。测定比较不同装液量对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响。
④初始pH值优化：以最优接种量加入种子液，在最优温度、200rpm条件下摇培24h。测定比较不同初始pH值对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响。
2.结果与分析
2.1海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220生长曲线(见图1)
对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220进行生长曲线的绘制，可以看出在0～9h，菌体处于调整期生长缓慢；在9～24h时，进入对数生长期；在24h之后，生长速度降低，27h之后OD630值开始降低。因此后续实验选择20～24h作为最适种龄。
2.2海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220OD630值与生物量关系变化(图2)
稀释处理后的OD值变化结果见。结果显示，OD值与菌株生物量的线性关系较为明显，OD630随菌株生物量几乎等比例变化。OD630值可以作为检测海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220生物量变化的一个标准。
2.3培养基及发酵条件优化
2.3.1不同碳源对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响(见图3)
结果表面，以乳糖、葡萄糖和麦芽糖作为碳源时，具有最大的抑菌直径，且显著高于其他各组(P<0.05)，且当碳源时葡萄糖时，OD630值显著高于其他组(P<0.05)。因此，选择葡萄糖作为培养基碳源(图3)。
2.2.2不同氮源对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响(见图4)
结果表明，以酵母膏、乙酸铵作为氮源时，抑菌直径显著大于其他组(P<0.05)，以酵母膏、牛肉膏和硫酸铵作为氮源时，OD630值较大，且对比其他组差异显著(P<0.05)。因此，选择酵母膏作为培养基氮源(图4)。
2.2.3不同无机盐对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响(见图5)
结果表明，有当无机盐成分为海盐、CaCl2和KCl时，海洋褐色杆菌(Phaeobactersp.)AP1220才能够生长，这三组在抑菌能力上并无明显的差异(P>0.05)，而在OD630值方面，海盐实验组与CaCl2实验组显著高于其他组(P<0.05)，由于工业海盐的成本要远低于工业氯化钙，为了有利于后期的大规模生产，后续实验选择工业海盐作为培养基无机盐(图5)。
2.2.4不同金属离子对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响(见图6)
结果表明，当金属离子成分为Fe6+、Fe3+、Mg2+和阴性对照时，有较高的抑菌活性，其中当金属离子成分为Mg2+时，OD630值在以上各组中最高，且存在显著性差异(P<0.05)。因此，选择Mg2+作为培养基金属离子(图6)。
2.2.5海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220摇瓶正交试验结果(见表2)
表2海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220正交实验结果
注：k1～k4表示各因素水平下OD630的平均值；R表示极差。
正交实验结果见表2，葡萄糖和酵母膏的极差值最大，可知碳源和氮源作为海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220生长的主要影响因素。无机盐浓度次之，但也有较大的影响。由均值k得出，葡萄糖0.1％、酵母膏0.4％、工业海盐2.5％、MgSO4 0.015％为最适培养基组合，以此进行后续培养条件的优化。
2.2.6不同温度对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响(见图7)
结果表明，在培养温度为20～30℃范围内时，菌株具有最高的OD630值和最大的抑菌直径，且两项指标都显著高于温度较高的2组(P<0.05)。其中，培养温度为25℃时，OD630值和抑菌直径都略大于20℃和30℃。因此，选择25℃作为培养温度(图6)。
2.2.7不同接种量对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响(见图8)
接种量的变化对菌株抑菌能力几乎没有影响，各实验组抑菌直径大小无显著性差异(P>0.05)。但当接种量为1％时，OD630值显著高于其他各组(P<0.05)。因此，选择1％作为接种量(图8)。
2.2.8不同装液量对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响(见图9)
结果表明，装液量对菌株的生长不存在影响，后续实验可以选择尽量多的装液量来提高产量(图9)。
2.2.9不同初始pH值对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的影响(见图10)。
结果表明，当培养基初始pH值为6.0～8.0时，菌液有显著高于其他两组的OD630值(P<0.05)。当初始pH值为7.0～9.0时，有最大的抑菌直径，且具有显著性的差异(P<0.05)。同时，pH为8.0时，两项指标都略大于pH＝7.0时。因此，选择初始pH值为8.0(图10)。
微生物发酵是一个复杂的生理生化过程，当菌体处于不同营养条件时，会直接影响菌体的生理代谢。要提高海洋褐色杆菌的活菌数量和抗菌活性，必须对发酵条件进行优化。本发明对海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220发酵条件进行优化，通过单因素和正交优化法确定了其最佳发酵产蛋白酶和芽孢的发酵培养基，该发酵培养基的原料配方为：葡萄糖0.1％、酵母膏0.4％、工业海盐2.5％、MgSO4 0.015％。培养条件为将海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220种子液按1％接种量接种至250，L锥形瓶中，该锥形瓶中装有50mL已消毒灭菌的所述的发酵培养基；之后将所述锥形瓶置于恒温摇床上进行发酵培养，培养温度25～30℃、pH值6.0～8.0、培养时间24h。通过发酵培养基及发酵条件优化，极大的提高了菌体细胞数量及抗菌活性。本发明在优化条件下海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630值从0.83提高至1.10，提高32.53％；抑菌直径(以哈维氏弧菌Vibrioharveyi为病原菌指示菌)从初始1.62cm提高至1.75cm，增大了8.0％。
发酵培养基和发酵条件优化前后海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的OD630和抑菌直径的比较图参见图11。

Claims (6)

1.一种提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基，其特征在于其原料配方按质量百分比为：葡萄糖0.1％、酵母膏0.4％、工业海盐2.5％、MgSO4 0.015％，pH值6.0～8.0。
2.如权利要求1所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵条件，其特征在于其发酵方法如下：
将海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的种子液接种至锥形瓶中，该锥形瓶中装有已消毒灭菌的发酵培养基，再将锥形瓶置于恒温摇床上发酵培养，发酵培养基为所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵培养基。
3.如权利要求2所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵条件，其特征在于所述海洋褐色杆菌(Phaeobacter sp.)AP1220的种子液的接种量为1％。
4.如权利要求2所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵条件，其特征在于所述锥形瓶为250mL锥形瓶，锥形瓶装有50mL已消毒灭菌的发酵培养基。
5.如权利要求2所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵条件，其特征在于所述消毒灭菌的发酵培养基是置于120℃下消毒灭菌30min。
6.如权利要求2所述提高海洋褐色杆菌活菌数量和抗菌活性的发酵条件，其特征在于所述培养温度为25～30℃，培养时间24h，pH值6.0～8.0。
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