CN101624234A - 养殖水体用微生物净水剂及其制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及“养殖水体用微生物水质净化剂及制备工艺”，属于动物养殖技术领域。由克雷伯氏菌(Klebsiella)AN－4、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、红螺菌(Rhodospirillum)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)组成。采用豆饼粉和糖蜜为原料，进行深层发酵，生产出含活菌数高，能有效净化水质的净水剂。该产品成本低廉、绿色环保，克服了当前水质净化剂稳定性差，抗逆性不强等问题，可用于大规模工业化生产，为水产养殖水体的净化提供一种新型微生物制剂。

Description

养殖水体用微生物净水剂及其制备工艺

技术领域

本发明涉及养殖水体用微生物净水剂及其制备工艺，属于动物养殖技术领域。

背景技术

研究表明，在当今水产养殖过程中，由于饵料利用率低，残饵、养殖动物粪便排放过多等问题，造成水体的富营养化和底泥的C、N、P富集污染以及底泥氧化还原电位降低。水体富营养化程度增加，会导致氨氮和亚硝酸盐超标，对水产动物产生毒害作用。大量养殖废水的排放给周边环境造成了巨大影响，水域环境恶化，赤潮频发，生态平衡和生物多样性也遭到破坏。养殖水域的水质下降也给我国渔业经济到来了巨大损失。因此，如何解决养殖水体中的氨氮污染问题，已成为净化养殖水体的研究热点。

微生物修复技术在水产养殖中主要应用于养殖环境的原位修复中，主要处理底泥的有机污染和水体的富营养化问题。研究证明，微生物应用到养殖水体中具有降解有机质，分解转化有害物质，稳定水体pH值，抑制病原微生物的作用。目前，市场上微生态制剂商品较多，其主要的有益菌有光合细菌、酵母菌类、芽孢杆菌类、放线菌、乳酸菌、硝化细菌、反硝化细菌、有效微生物菌群等。它们在水产养殖中的作用主要体现在营养特性、免疫特性和改善生态环境三个方面。应用于其他领域的微生态制剂虽然在水产养殖中取得一定成效，但这些菌株不是水体环境中的固有菌，不一定能在水体环境和养殖动物肠道中存活，更不一定能成功繁殖成为优势菌群来进行调节，研究认为添加的微生物很容易随着时间而逐渐消亡。同时，即使从养殖水体环境或水生动物肠道中分离出土著菌作为有益菌，同样也会因为缺乏足够成熟的理论指导而达不到预期的效果。另外，单一微生物可利用底物的种类有限，不能将水体中的有机物彻底降解，因此需要将不同微生物进行配伍，协同发挥作用。

当前，在养殖水体水质净化领域，已应用于生产的菌种有十多种，多为从国外进口或应用于畜禽的菌种。来源于养殖水体的土著菌很少。加强对来源于养殖水体微生物的基础研究，对于开发生产适合养殖水体使用的微生态制剂产品，进一步提高水产动物生存环境具有积极的现实意义。因此，本专利根据菌种的降解特性，复合了克雷伯氏菌、枯草芽孢杆菌、红逻菌和植物乳杆菌四种菌。其中，克雷伯氏菌AN-4为本实验室从淡水鱼养殖水体中分离筛选获得，对其生物特性已做了深入研究，掌握了菌株对有机物的降解特性；安全性试验结果表明，本产品所用克雷伯氏菌AN-4对水产动物无毒害和致病性。其它三种菌购自扬州绿科生物技术有限公司。该产品所用菌株净化水质的最佳作用条件符合水产养殖水环境条件要求，说明菌株适合在水产养殖中应用。目前，国内尚未有关于克雷伯氏菌应用于水质净化的报道和相关产品。克雷伯氏菌为本产品主要菌种，经过驯化具有很好的降解氨氮的作用，结合枯草芽孢杆菌和红螺菌抑制反硝化过程，能有效净化水质，辅以植物乳杆菌，可增强水产动物健康。中试产品已推广使用量15000公斤，推广面积超过15000亩，推广验证结果表明，该产品具有很强的水质调节作用，能大幅降低养殖水体有机污染物(如氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等)，应用该产品期间，池塘养殖水体有机污染物一直保持在较低水平，而且，停用后污染指标也不会出现反弹，这一点明显优于当前市场所售大部分水质调节剂产品，因此获得大量好评。整个高温季节应用该产品的养殖池，换水量明显减少，节约了水资源，减少了养殖水体对外部水环境的污染，符合可持续发展要求；同时，由于水质条件的改善，养殖动物生存环境好转，发病率、死亡率明显降低，药物的使用量大大减少，甚至是零使用，不但减少了污染，还符合食品安全要求，保证了产品质量，切实提高了养殖效益。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供“养殖水体用微生物净水剂及生成制备工艺”，通过筛选出能有效净化水质的细菌，辅以相关菌株形成互补作用，采用豆饼粉和糖蜜为原料，进行深层发酵，生产出含活菌数高，能有效净化水质的净水剂。该产品成本低廉、绿色环保，克服了当前水质净化剂稳定性差，抗逆性不强等问题，可用于大规模工业化生产，为水产养殖水体的净化提供一种新型微生物制剂。

技术方案：

本发明所述的微生物水质净化剂的制备方法，其步骤为：

(1)复合微生物制剂选用菌种。复合微生物制剂由克雷伯氏菌AN-4(Klebsiella，)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，代号CICC 10074)、红螺菌(Rhodospirillum，代号ACCC02976)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，ACCC 10643)组成。克雷伯氏菌AN-4由本实验室筛选获得，NCBI登录号为EU888474，枯草芽孢杆菌、红螺菌和植物乳杆菌从扬州高邮绿科生物有限公司购买。

(2)克雷伯氏菌AN-4和枯草芽孢杆菌分别接入三角瓶(培养基：蛋白胨10g/mL，牛肉膏5g/mL，NaCl 5g/mL。接种比例1％)，振荡培养24h。红螺菌接入克氏瓶(培养基：NH₄Cl 1g，MgCl₂ 0.2g，酵母膏0.1g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl2g，H₂O 900mL，灭菌的0.1g/mL NaHCO₃ 50mL，50mL灭菌酒精。接种比例1％)中，在生化培养箱中光照培养48h。克雷伯氏菌AN-4菌液浓度为10⁸cfu/mL，枯草芽孢杆菌菌液浓度为10⁸cfu/mL，红螺菌菌液浓度为10⁹cfu/mL。

(3)将上述培养好的克雷伯氏菌AN-4、枯草芽孢杆菌和红螺菌菌液按体积比40％、30％、30％混合，制成原液。再将原液按体积比1％的比例接入种子罐活化种子液，克雷伯氏菌AN-4、枯草芽孢杆菌和红螺菌发酵用种子罐培养基的配方g/L为：豆饼粉12，红糖8，可溶性淀粉2，酵母膏0.5，K₂HPO₄ 1，KH₂PO₄ 2，MgSO₄0.5，MnSO₄0.01，CaCO₃ 0.03，NaCl 0.5，并调节pH为7.0；接种后在温度为37℃，压力0.05Mpa，通气量体积比1∶1和200-300r/min搅拌条件下，培养8-10h；达到如下指标：菌体生长整齐；处于对数生长期；含菌量2亿个/mL；无杂菌污染，OD₅₆₂值0.4，即可移种至发酵罐内发酵培养；

(4)菌液发酵工艺

发酵罐培养基g/L：豆饼粉10，糖蜜12，可溶性淀粉2，酵母膏0.5，K₂HPO₄ 1，KH₂PO₄ 2，MgSO₄ 0.5，MnSO₄ 0.01，CaCO₃ 0.03，NaCl 0.5，pH7.0-7.5左右，灭菌后总体积不得超过罐容积的70％，在0.11Mpa压力下灭菌30min；

采用体积比5-10％接种量接入种子液，发酵培养条件：温度37℃，搅拌速度180-200r/min，罐压0.05Mpa，移种后4h内通气量为1∶0.7-0.8，以后逐渐增大至1∶1，一般发酵培养周期为18-24h，即可放罐，获得的发酵菌液杂菌污染≤0.3％；含菌量≥30亿个/ml；OD₅₆₂≥0.8；

(5)水质净化剂微生物复合。

植物乳杆菌发酵用培养基(g/L)：麦根4，磷酸氢二钾0.5，硫酸铵0.5，豆饼粉0.5，玉米淀粉水解糖5，碳酸钙5，pH 6.5，31℃厌氧发酵72h。含菌量≥20亿个/ml。

(6)将上述制备出来的复合微生物与植物乳杆菌发酵液按体积比17∶3混合均匀，加入体积比0.1％的保护剂(脱脂牛奶+质量体积比5％海藻糖)，包装即可。

有益效果

该产品对养殖水体氨氮有很好的降解效果。实验结果见图1、图2，对照和实验组数据均为两池塘数值得平均数。对照池的氨氮含量由开始的0.04mg/L增长到0.09mg/L左右，增长率超过100％，而实验池氨氮由0.05mg/L降到0.03mg/L左右，降解效果显著。

亚硝酸盐降解程度虽然没有氨氮显著，但该产品可维持亚硝酸盐含量在较低水平，并不增长。对照池亚硝酸盐含量由0.1mg/L增长到0.15mg/L左右，而实验池由0.12mg/L降到0.1mg/L以下。

本中试产品已推广使用量15000公斤，推广面积超过15000亩，推广验证结果表明，该产品具有很强的水质调节作用，能大幅降低养殖水体有机污染物(如氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等)，应用该产品期间，池塘养殖水体有机污染物一直保持在较低水平，而且，停用后污染指标也不会出现反弹，这一点明显优于当前市场所售大部分水质调节剂产品，因此获得大量好评。

整个高温季节应用该产品的养殖池，换水量明显减少，节约了水资源，减少了养殖水体对外部水环境的污染，符合可持续发展要求；同时，由于水质条件的改善，养殖动物生存环境好转，发病率、死亡率明显降低，药物的使用量大大减少，甚至是零使用，不但减少了污染，还符合食品安全要求，保证了产品质量，切实提高了养殖效益。

附图说明

图1、图2为本专利产品对养虾池水体氨氮和亚硝酸盐氮净化效果。

图3为微生物净水剂生产工艺

具体实施方式

(1)复合微生物制剂选用菌种。复合微生物制剂是由克雷伯氏菌(Klebsiella)AN-4、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，代号CICC 10074)、红螺菌(Rhodospirillum，代号ACCC02976)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum，ACCC 10643)组成的。克雷伯氏菌AN-4由本实验室筛选获得并对外提供，NCBI登录号为EU888474，枯草芽孢杆菌、红螺菌和植物乳杆菌从扬州高邮绿科生物有限公司购买。

(2)克雷伯氏菌AN-4和枯草芽孢杆菌分别接入三角瓶(培养基：蛋白胨10g/mL，牛肉膏5g/mL，NaCl 5g/mL。接种比例1％)，振荡培养24 h。红螺菌接入克氏瓶(培养基：NH₄Cl 1g，MgCl₂ 0.2g，酵母膏0.1g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 2g，H₂O 900mL，灭菌的0.1g/mL NaHCO₃ 50mL，50mL灭菌酒精。接种比例1％)中，在生化培养箱中光照培养48h。克雷伯氏菌AN-4菌液浓度为10⁸cfu/mL，枯草芽孢杆菌菌液浓度为10⁸cfu/mL，红螺菌菌液浓度为10⁹cfu/mL。

(3)将上述培养好的克雷伯氏菌AN-4、枯草芽孢杆菌和红螺菌菌液按体积比40％、30％、30％混合，制成原液。再将原液按体积比1％的比例接入种子罐活化种子液，克雷伯氏菌AN-4、枯草芽孢杆菌和红螺菌发酵用种子罐培养基的配方g/L为：豆饼粉12，红糖8，可溶性淀粉2，酵母膏0.5，K₂HPO₄ 1，KH₂PO₄ 2，MgSO₄0.5，MnSO₄0.01，CaCO₃ 0.03，NaCl 0.5，并调节pH为7.0；接种后在温度为37℃，压力0.05Mpa，通气量体积比1∶1和200-300r/min搅拌条件下，培养8-10h；达到如下指标：菌体生长整齐；处于对数生长期；含菌量2亿个/mL；无杂菌污染，OD₅₆₂值0.4，即可移种至发酵罐内发酵培养；

(4)菌液发酵工艺

发酵罐培养基g/L：豆饼粉10，糖蜜12，可溶性淀粉2，酵母膏0.5，K₂HPO₄ 1，KH₂PO₄ 2，MgSO₄ 0.5，MnSO₄ 0.01，CaCO₃ 0.03，NaCl 0.5，pH7.0-7.5左右，灭菌后总体积不得超过罐容积的70％，在0.11Mpa压力下灭菌30min；

采用体积比5-10％接种量接入种子液，发酵培养条件：温度37℃，搅拌速度180-200r/min，罐压0.05Mpa，移种后4h内通气量为1∶0.7-0.8，以后逐渐增大至1∶1，一般发酵培养周期为18-24h，即可放罐，获得的发酵菌液杂菌污染≤0.3％；含菌量≥30亿个/ml；OD₅₆₂≥0.8；

(5)水质净化剂微生物复合。

植物乳杆菌发酵用培养基(g/L)：麦根4，磷酸氢二钾0.5，硫酸铵0.5，豆饼粉0.5，玉米淀粉水解糖5，碳酸钙5，pH 6.5，31℃厌氧发酵72h。含菌量≥20亿个/ml。

(6)将上述制备出来的复合微生物与植物乳杆菌发酵液按体积比17∶3混合均匀，加入体积比0.1％的保护剂(脱脂牛奶+5％海藻糖)，包装即可。

室外养殖池验证试验地点为高邮南美白对虾养殖池，选取4个养殖池塘，两个对照组，两个实验组。实验组投放试验微生态水质调节剂，实验期间每天取水样一次，检测氨氮、亚硝酸盐、溶解氧pH、透明度、温度等水质指标，并观察记录各池塘养殖动物发病和死亡情况，到年底比较各池塘经济效益。试验安排在高温季节(7、8月份)进行，具体分组见表1。

表1微生态水质调节剂生产验证分组

地点	养殖对象	试验池数	池塘面积	实验处理
					高邮	南美白对虾	4	20-30亩	各两个对照池两个试验池

实验结果见图1、图2，对照和实验组数据均为两池塘数值得平均数。对照池的氨氮含量由开始的0.04mg/L增长到0.09mg/L左右，增长率超过100％，而实验池氨氮由0.05mg/L降到0.03mg/L左右，降解效果显著。说明该产品对养殖水体氨氮有很好的降解效果。对照池亚硝酸盐含量由0.1mg/L增长到0.15mg/L左右，而实验池由0.12mg/L降到0.1mg/L以下。亚硝酸盐降解程度虽然没有氨氮显著，但该产品可维持亚硝酸盐含量在较低水平，并不增长。

本产品已推广使用量15000公斤，推广面积超过15000亩，推广验证结果表明，该产品具有很强的水质调节作用，能大幅降低养殖水体有机污染物(如氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等)，应用该产品期间，池塘养殖水体有机污染物一直保持在较低水平，而且，停用后污染指标也不会出现反弹，这一点明显优于当前市场所售大部分水质调节剂产品，因此获得大量好评。整个高温季节应用该产品的养殖池，换水量明显减少，节约了水资源，减少了养殖水体对外部水环境的污染，符合可持续发展要求；同时，由于水质条件的改善，养殖动物生存环境好转，发病率、死亡率明显降低，药物的使用量大大减少，甚至是零使用，不但减少了污染，还符合食品安全要求，保证了产品质量，切实提高了养殖效益。

Claims (3)

1、一种养殖水体用微生物水质净化剂，是由克雷伯氏菌(Klebsiella)AN-4、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、红螺菌(Rhodospirillum)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)组成的。

2、根据权利要求1所述一种养殖水体用微生物水质净化剂，其制备方法为，

1)克雷伯氏菌AN-4和枯草芽孢杆菌分别接入三角瓶，其培养基为：蛋白胨10g/mL，牛肉膏5g/mL，NaCl 5g/mL，接种比例体积比1％，振荡培养24h；红螺菌接入克氏瓶，其培养基为：NH₄Cl 1g，MgCl₂ 0.2g，酵母膏0.1g，K₂HPO₄ 0.5g，NaCl 2g，H₂O 900mL，灭菌的0.1g/mL NaHCO₃ 50mL，50mL灭菌酒精，接种比例体积比1％，在生化培养箱中光照培养48h；获得克雷伯氏菌AN-4菌液浓度为10⁸cfu/mL，枯草芽孢杆菌菌液浓度为10⁸cfu/mL，红螺菌菌液浓度为10⁹cfu/mL；

2)将上述培养好的克雷伯氏菌AN-4、枯草芽孢杆菌和红螺菌菌液按体积比40％、30％、30％混合，制成原液；

再将原液按体积比1％的比例接入种子罐活化种子液，克雷伯氏菌AN-4、枯草芽孢杆菌和红螺菌发酵用种子罐培养基的配方g/L为：豆饼粉12，红糖8，可溶性淀粉2，酵母膏0.5，K₂HPO₄1，KH₂PO₄2，MgSO₄0.5，MnSO₄0.01，CaCO₃0.03，NaCl0.5，并调节pH为7.0；接种后在温度为37℃，压力0.05Mpa，通气量体积比1∶1和200-300r/min搅拌条件下，培养8-10h；达到如下指标：菌体生长整齐；处于对数生长期；含菌量2亿个/mL；无杂菌污染，OD₅₆₂值0.4，即可移种至发酵罐内发酵培养；

3)菌液发酵工艺

发酵罐培养基g/L：豆饼粉10，糖蜜12，可溶性淀粉2，酵母膏0.5，K₂HPO₄1，KH₂PO₄2，MgSO₄0.5，MnSO₄0.01，CaCO₃0.03，NaCl0.5，pH7.0-7.5，灭菌后总体积不得超过罐容积的70％，在0.11Mpa压力下灭菌30min；

采用体积比5-10％接种量接入种子液，发酵培养条件：温度37℃，搅拌速度180-200r/min，罐压0.05Mpa，移种后4h内通气量为1∶0.7-0.8，以后逐渐增大至1∶1，一般发酵培养周期为18-24h，即可放罐，获得的发酵菌液杂菌污染≤0.3％；含菌量≥30亿个/ml；OD₅₆₂≥0.8；

4)微生物水质净化剂复合

植物乳杆菌发酵用培养基g/L：麦根4，磷酸氢二钾0.5，硫酸铵0.5，豆饼粉0.5，玉米淀粉水解糖5，碳酸钙5，pH 6.5，31℃厌氧发酵72h，含菌量≥20亿个/ml。

将步骤(3)中制备出来的复合微生物与植物乳杆菌发酵液按体积比17∶3混合均匀，加入体积比0.1％的保护剂，包装即可。

3、权利要求1或2所述养殖水体用微生物水质净化剂的应用。

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