CN1428438A - 转基因农产品检测试剂盒 - Google Patents

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CN1428438A CN 01139271 CN01139271A CN1428438A CN 1428438 A CN1428438 A CN 1428438A CN 01139271 CN01139271 CN 01139271 CN 01139271 A CN01139271 A CN 01139271A CN 1428438 A CN1428438 A CN 1428438A
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Abstract

本发明涉及转基因农产品的检测方法，该检测方法包括以下步骤：(a)抽提转基因产品的DNA；(b)用3－10对引物对抽提的DNA进行PCR扩增，所述的引物分别特异性扩增选自下组基因的扩增产物：P35S；TNOS；PNOS；NPTII；GUS；GFP；EPSPS野生型基因；EPSPS修饰基因CP4；豇豆胰蛋白酶CpTI；抗菌肽Shiva基因；(c)将步骤(b)中的扩增产物与标记有特异性探针的杂交膜杂交；(d)检测杂交结果。本发明还提供了相应的检测试剂盒以及有关的引物和探针序列。本发明可高效、准确、简便的检测转基因产品，用于海关、商检等领域。

Description

转基因农产品检测试剂盒
技术领域
本发明涉及产品检测技术，更具体地，本发明涉及转基因农产品的检测方法、检测试剂盒以及相应的探针序列，MPCR引物序列等。
背景技术
转基因作物能加快光合作用或提高作物抗病害、抗盐碱、抗干旱的能力，以增加作物产量。但不能不看到转基因作物可能给农村地区生物多样性带来的负面影响，转基因作物就象是一把双刃剑，在充分利用的同时，还得时刻对它保持警惕。特别是对国外进口的作物，更应该了解它们是否为转基因产物。
由于转基因作物在外表很难甚至不可能分辨，需要在基因水平上对它们进行检测，这给我国海关、出入境检验检疫局等单位的工作带来了一定的难度。为了能够对由转基因植物产生的转基因农产品作出综合评价，除了需要政府对此在政策上制定科学的评价体系，以及相应的严格的法律法规，还需要拥有一整套于此相配套的检测技术。
目前转基因植物及其产品的检测技术主要有基于外源基因表达产物的直接检测技术以及检测DNA背景的普通PCR技术等。对于前者在对待检样品的转基因背景一无所知的情况下很难有效应用，对于后者最常用的是对花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子以及胭脂碱合成酶(NOS)终止子进行分别检测，因为现在商业化的转基因农产品中绝大多数含有上述两者或其中之一。但是由于该方法仅仅是对其中之一进行检测，而CaMV35S启动子天然存在于花椰菜花叶病毒中，NOS终止子天然存在于植物病毒Ti质粒中。即使在待检样品中检测出上述基因，但无法排除是由于病毒感染引起的可能性。
因此，本领域迫切需要开发高效、准确、简便的检测转基因产品的技术，以便为海关、商检、技术监督、出入境检验检疫和食品生产加工等领域。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高效、准确、简便的检测转基因产品的方法。
本发明的另一目的是提供相应的检测试剂盒。
本发明的再一目的是提供有关的引物对和探针。
在本发明的第一方面，提供了一种转基因产品检测试剂盒，它含有3-10对引物，所述的引物分别特异性扩增选自下组基因的扩增产物：
花椰菜花叶病毒35S启动子P35S；
胭脂碱合成酶终止子TNOS；
胭脂碱合成酶启动子PNOS；
新霉素磷酸转移酶基因NPTII；
β-葡萄糖醛酸酶基因GUS；
绿色荧光蛋白基因GFP；
5-烯醇式丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶野生型基因EPSPS；
5-烯醇式丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶修饰基因CP4；
豇豆胰蛋白酶CpTI；
抗菌肽Shiva基因。
在本发明一实施例中，较佳地含有4-10对，更佳地含有6-10对，最佳地含有8-10对引物。
在一优选例中，所述的引物自身及引物间二聚体的ΔG≥-7Kcal/mol，3′端发夹结构ΔG≥-2Kcal/mol，3′内部稳定性-6.5Kcal/mol≥ΔG≥-8.5Kcal/mol，Tm值50℃-65℃，GC％40％-65％。
在另一优选例中，所述引物被分成二个引物组：
引物组(I)中的引物包括针对下组基因的引物：花椰菜花叶病毒35S启动子(P35S)、胭脂碱合成酶终止子(TNOS)、胭脂碱合成酶启动子(PNOS)、新霉素磷酸转移酶(NPTII)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)和绿色荧光蛋白(GFP)；
引物组(II)中的引物包括针对下组基因的引物：5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS，原始基因及修饰基因CP4)、豇豆胰蛋白酶CpTI、抗菌肽Shiva基因的；
且同一引物组的引物被合并在一起。
在另一优选例中，所述的引物选自下组：
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caggtcgctgtcaataattgcgggactctaatc     SEQ ID NO：2
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在本发明的第二方面，提供了一种检测转基因产品的检测方法，它包括以下步骤：
(a)抽提转基因产品的DNA；
(b)用3-10对引物对抽提的DNA进行MPCR扩增，所述的引物分别特异性扩增选自下组基因的扩增产物：
花椰菜花叶病毒35S启动子P35S；
胭脂碱合成酶终止子TNOS；
胭脂碱合成酶启动子PNOS；
新霉素磷酸转移酶基因NPTII；
β-葡萄糖醛酸酶基因GUS；
绿色荧光蛋白基因GFP；
野生型5-烯醇式丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶基因EPSPS；
修饰的5-烯醇式丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶基因CP4；
豇豆胰蛋白酶基因CpTI；
抗菌肽Shiva基因；
(c)将步骤(b)中的扩增产物与标记有特异性探针的杂交膜杂交；
(d)检测杂交结果。
在本发明方法的一个优选例中，所述引物被分成二个引物组：
引物组(I)中的引物包括针对下组基因的引物：花椰菜花叶病毒35S启动子P35S、胭脂碱合成酶终止子TNOS、胭脂碱合成酶启动子PNOS、新霉素磷酸转移酶基因NPTII、β-葡萄糖醛酸酶基因GUS和绿色荧光蛋白基因GFP；
引物组(II)中的引物包括针对下组基因的引物：5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶野生型基因EPSPS、5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶修饰基因CP4、豇豆胰蛋白酶基因CpTI、抗菌肽Shiva基因；
且同一引物组的引物被合并在一起。
在另一优选例中，所述的引物选自下组：
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并且所述的特异性探针选自下组：
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在另一优选例中，所述的引物带有选自下组的标记物：生物素、放射性同位素、荧光标记、地高辛。
在本发明第三方面，提供了一种寡核苷酸片段，它具有选自SEQ ID NO：1-30的核苷酸序列。
附图说明
图1显示了一对嵌合引物(Bio-XTPCM-S，XTPCM-A)在不同浓度，不同复性温度下的PCR结果。图中A，B，C，D的复性温度分别为56℃，60℃，65℃，68℃；1-5引物浓度为0.05uM，0.1uM，0.2uM，0.25uM，0.5uM；M-分子量标准物。
图2显示了在本发明一个实例中对大豆的转基因背景检测结果。图中，探针1-10排列顺序为XTPBNT，XTPBNP，XTPBCM，XTPBNPT，XTPBGUS，XTPBGFP，XTPBCP4，XTPBCpTI，XTPBEPSPS和XTPBShiva；杂交膜A-E为对照。杂交膜F为转基因大豆的检测结果，表明该转基因大豆含有TNOS，PNOS，P35S，NPT-II和EPSPS修饰基因CP4。
图3显示了在本发明一个实例中对大豆粉的转基因背景检测结果。图中，探针1-10排列顺序为XTPBNT，XTPBNP，XTPBCM，XTPBNPT，XTPBGUS，XTPBGFP，XTPBCP4，XTPBCpTI，XTPBEPSPS和XTPBShiva；杂交膜A-D为对照。杂交膜E为转基因大豆粉的检测结果，表明该转基因大豆粉含有TNOS，PNOS，P35S和EPSPS修饰基因CP4。
图4显示了在本发明的一个实例中对马铃薯的转基因背景检测结果。图中，探针1-10排列顺序为XTPBNT，XTPBNP，XTPBCM，XTPBNPT，XTPBGUS，XTPBGFP，XTPBCP4，XTPBCpTI，XTPBEPSPS和XTPBShiva；杂交膜A-D为对照；杂交膜E为转基因马铃薯的检测结果，表明该转基因马铃薯含有TNOS，PNOS，P35S，NPT-II和Shiva基因。
具体实施方式
本试剂盒的原理是根据转基因作物靶基因序列的保守区或特征基因片段设计引物，并通过实验确定最佳引物组合，从转基因植物及其产品的样本中制备核酸，用生物素标记的引物进行复合式PCR(Multiplex PCR-MPCR)反应。根据靶基因序列设计出十个特异性寡核苷酸靶基因的特征序列，作为靶DNA固定在杂交膜上。将带特有标记(如生物素标记)的MPCR产物与杂交膜进行杂交，通过杂交后的显色结果(阳性信号)的位置确定所检样本是否为转基因产品和样本中所含的外源基因的类型。
本发明的发明点之一是选定了用于转基因产品检测的靶目标基因。通常的检测方法只检测其中的一种或两种基因，容易导致假阳性。而本发明选定的靶目标基因包括了转基因植物常用的启动子、终止子、和标记基因。在检测时至少检测其中3种(3-10种)，因此可以有效地提高检测准确性。
本发明的发明点之二是对上述靶目标基因的特异性引物进行了优化，使得它们可以混在一起，在同-PCR体系中使用，从而简化了操作测序。
本发明人用PRIMER PREMIER 5.0进行了引物设计。考虑引物将用于MPCR系统，设计引物时应尽量使它们的动力学性质相近，这样可以较为容易地确定MPCR的实验条件。本发明采取的原则是尽可能降低引物自身以及引物之间二聚体，及其引物3′端发夹结构的稳定性，选择3′端内部稳定性较5′端低的引物。具体地说引物自身及引物间二聚体的ΔG≥-7Kcal/mol，3′端发夹结构ΔG≥-2Kcal/mol，3′内部稳定性-6.5Kcal/mo1≥ΔG≥-8.5Kcal/mol，Tm值50℃-65℃，GC％40％-65％。软件搜索后，从中选出符合要求的引物，必要时做一些简单的调整。为了使各引物的动力学性质进一步趋于一致，还在所设计的普通引物的5′端加上一段13bp的高GC含量的片段，成为嵌合引物。在各引物中该片段序列基本一致，但基于引物二级结构的考虑又有所不同。
可用于本发明的标记物没有特别限制，可以是核酸检测领域常用的各种标记物，其中包括(但并不限于)：生物素-亲和素、地高辛、放射性同位素、荧光标记等。
本发明的检测方法中，对MPCR反应条件没有特别限制，只要是特异性扩增即可。一种优选的反应条件如下：
            94℃  2分钟；
            94℃  30秒；55℃  45秒；72℃  1分钟；8个循环；
            94℃  30秒；60℃  45秒；72℃  1分钟；32个循环；
            72℃  5分钟。
本发明的优点在于，使用的将复合式PCR(Multiplex PCR-MPCR)和分子杂交技术联用的方法和建立转基因农产品检测技术，在灵敏度和特异型方面都能保证生物体中单拷贝基因型的检出。可以同时针对几个靶位点进行检测。不仅效率高，而且大大降低了产生假阳性的可能。该技术还吸取了基因芯片分析的特点，用杂交膜来替代基因芯片，因此可以用肉眼直接观测和拍照，用不着扫描仪。有利于技术的推广应用。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例
实施例1
寡聚核苷酸引物和杂交膜设计和合成
根据转基因产品所涉及的转入基因的启动子、终止子、标记基因，选定花椰菜花叶病毒35S启动子(P35S)、胭脂碱合成酶终止子(TNOS)、胭脂碱合成酶启动子(PNOS)、新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)、β-葡萄糖醛酸酶基因(GUS)、绿色荧光蛋白基因(GFP)、5-烯醇式丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS，野生型基因及修饰基因CP4)、豇豆胰蛋白酶CpTI、抗菌肽Shiva基因。根据这些基因启动子、终止子、标记基因的核苷酸序列，分别设计和合成了表1A-B和表2所示的特异性引物和特异性探针。
                表1A：用于MPCR的带生物素标记的引物序列
名称 序列(5′-3′)   SEQ ID NO：
XTPNT-SBio-XTPNT-A  caggtcgctgtcaTTGAATCCTGTTGCCGGTCTTXcaggtcgctgtcaATAATTGCGGGACTCTAATC     12
Bio-XTPCM-SXTPCM-A  XcaggtggcagtcaTCATTGCGATAAAGGAAAGGcaggtggctgtgaCGAAGGATAGTGGGATTGTG     34
XTPCP4-SBio-XTPCP4-A  caggctgctctgaCGAATATCCGATTCTCGCTGTCXgacgacgcactcaCGCCCTCATCGCAATCCAC     56
XTPGUS-SBio-XTPGUS-A  ccgtcactcgtcaCTGCTGTCGGCTTTAACCTCXcagcaccaggtcaGCGTCGCAGAACATTACATT     78
XTPNPT-SBio-XTPNPT-A  caggtcgctgtcaTTTCTCGGCAGGAGCAAGGXcaggtcgctgtcaACTGGGCACAACAGACAATC     910
Bio-XTPNP-SXTPNP-A  XcaggtcgctgtcaCAAAAGTCGCCTAAGGTCACcaggtcgctgtcaTACCGAGGGGAATTTATGGA     1112
XTPEPSPS-SBio-XTPEPSPS-A  cagcctgctctgtCGTCTTGAAGGTCGTGGTAXcaggacggactcaGCAACAGCGAGAATTGGATA     1314
Bio-XTPCPTI-SXTPCPTI-A  XcaggacgcacagaACCACCTCGGAAGTAATCATcagcacgcagtcaGGTTTGTAACAGAAATCAGCAA     1516
Bio-XTPGFP-SXTPGFP-A  XctggtgcctgcgaGCCAACACTTGTCACTACTTTCcaggtggtcacgaACAGGTAATGGTTGTCTGGTAA     1718
XTPShiva-SBio-XTPShiva-A  caggtggcagtcaGGTGGAGGTTGTTCAGAAGGXcaggtcgcactgaTTAACCCACAGCCCTAGCAT     1920
                        表1B：用于MPCR的特异性引物的特性
 名称 SEQ ID NO：     Tm℃     AT/TA％     GC％     靶目标     长度bp
 XTPNT-SBio-XTPNT-A     12     81.475.6     5.9％15.2％     52.948.5 TNOS 159
 Bio-XTPCM-SXTPCM-A     34     77.678.5     12.1％9.1％     48.554.5 P35S 210
 XTPCP4-SBio-XTPCP4-A     56     80.684.4     11.4％6.3％     54.362.5     WtEPSPS 175
 XTPGUS-SBio-XTPGUS-A     78     79.578.9     3.0％6.1％     57.651.5 GUS 318
 XTPNPT-SBio-XTPNPT-A     910     81.779.5     3.1％3.1％     59.454.5     NPT-II 295
 Bio-XTPNP-SXTPNP-A     1112     78.078.4     3.0％15.2％     48.551.5 PNOS 110
 XTPEPSPS-SBio-XTPEPSPS-A     1314     78.078.3     3.1％9.0％     56.351.5     MfEPSPS(CP4) 349
 Bio-XTPCPTI-SXTPCPTI-A     1516     77.578.1     9.0％6.0％     51.545.7 CpTI 249
 Bio-XTPGFP-SXTPGFP-A     1718     79.977.1     3.0％8.6％     54.348.6 GFP 460
 XTPShiva-SBio-XTPShiva-A     1920     79.678.7     0.0％12.1％     57.654.5 Shiva 136
注：表1中X表示带有生物素标记物。
表1中列出了嵌合引物序列及其相关参数，序列中小写字母是人工加入部分，大写字母是经软件设计后所得的结果。为了评价嵌合引物的有效性，对所有引物做了不同引物浓度，不同复性温度条件下的PCR效果鉴定。引物浓度取0.05mM，0.1mM，0.2mM，0.25mM，0.5mM五个浓度梯度，复性温度取56℃，60℃，65℃，68℃四个梯度。实验中以质粒pBI121(Clontech Laboratories，Inc.)DNA 10pg为模板，结果表明嵌合引物在较为广泛的浓度及温度范围内都可以取得较好的效果(图1)。
在引入嵌合序列后，提高了系统对模板DNA浓度的宽容度，即使在较低浓度的模板条件下也可获得满意的结果。
表2：制备杂交膜的靶基因的探针特征序列
 名称                       序列(5′-3)   Tm  GC％ SEQ ID N0：
 XTPBNT  NH4-TTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCA  74.6  26.7     21
 XTPBNP  NH4-GAGGGGAATTTATGGAACGTCAGTGGAGCA  75.3  50.0     22
 XTPBCM  NH4-AATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGG  72.1  46.4     23
 XTPBNPT  NH4-ACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTC  75.0  57.1     24
 XTPBGUS  NH4-GAGGCAGTCAACGGGGAAACTCAGCAA  74.8  55.6     25
 XTPBGFP  NH4-GTACATAACCTTCGGGCATGGCACTCTTGA  73.8  50.0     26
 XTPBCP4  NH4-GTCTGGAAGAACTCCGCGTCAAGGAAAGC  75.5  55.2     27
 XTPBCpTI  NH4-GCATGAATCGCAGCATGGTTCTGAAGACTC  74.6  50.0     28
 XTPBEPSPS  NH4-TGGCTGACTTGCGTGTTCGTTCTTCTACTTTG  74.9  46.9     29
 XTPBShiva  NH4-GTTGTTCAGAAGGATTGACAGGGTTGGTAAGCA  74.6  45.5     30
注：探针的5′端带有-NH4基团。
实施例2
转基因产品检测试剂盒的制备
A.检测试剂盒组成及保存
MPCR部分
引物组(I) 250mL -20℃
引物组(II) 250mL -20℃
MPCR混合液 20mL×200支 -20℃
Taq酶 150mL -20℃
对照DNA 100mL -20℃
矿物油 5mL 室温
其中，引物组(I)中的引物是针对花椰菜花叶病毒35S启动子(P35S)、胭脂碱合成酶终止子(TNOS)、胭脂碱合成酶启动子(PNOS)、新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)、β-葡萄糖醛酸酶基因(GUS)和绿色荧光蛋白基因(GFP)的；引物组(II)中的引物是针对5-烯醇式丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶基因(EPSPS野生型基因及修饰基因CP4)、豇豆胰蛋白酶基因CpTI、抗菌肽Shiva基因的。杂交及显色部分
杂交膜(杂交袋中) 100条 室温
杂交液 100mL -20℃
杂交袋(空) 100个 室温
生物素-碱性磷酸酶 55mL -20℃
洗涤试剂A NaCl(32.9克) 室温
柠檬酸三钠. 2H2O(16.5克)
洗涤试剂B SDS(5克) 室温
显色试剂A Tris(2.4克)；NaCl(1.2克) 室温
显色试剂B MgCl2.6H2O(20毫克) 室温
显色底物 氮蓝四唑(NBT) -20℃
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP) -20℃
B.检测试剂的配制
[1]将洗涤试剂A袋中的试剂倒入1000mL带刻度的干净烧杯中，用双蒸水将残留在袋中的试剂彻底洗入烧杯，加双蒸水至750mL，此液为10×膜洗涤液A。室温保存；
[2]将洗涤试剂B袋中的试剂倒入500mL带刻度的干净烧杯中，用双蒸水将残留在袋中的试剂彻底洗入烧杯，加双蒸水至500mL，此液为10×膜洗涤液B。室温保存；
[3]配制1000mL膜洗涤液，各取100mL洗涤液A、B，补加800mL双蒸水。室温保存；
[4]配制生物素交联缓冲液(100mM Tris PH7.5，0.15M NaCL)。
按以下方法先配制10×生物素交联缓冲液贮液，
60.5g Tris+300mL H2O+33mL HCL，彻底溶解后加双蒸水至500mL，得1M Tris贮液；
65.7g NaCL+750mL H2O彻底溶解，得1.5M NaCL贮液；
各取100mL 1M Tris贮液和1.5M NaCL贮液，加800mL双蒸水，配制成1000mL生物素交联缓冲液，
[5]将显色试剂A袋中的试剂倒入50mL带刻度的干净烧杯中，用双蒸水将残留在袋中的试剂彻底洗入烧杯，加双蒸水至20mL，此液为10×显色液A。室温保存；
[6]将显色试剂B袋中的试剂倒入50mL带刻度的干净烧杯中，用双蒸水将残留在袋中的试剂彻底洗入烧杯，加双蒸水至20mL，此液为10×显色液B。室温保存；
[7]配制100mL显色缓冲液，各取10mL显色液A、B，补加80mL双蒸水。室温保存。
实施例3
转基因产品的检测
1.转基因农产品DNA抽提：
将大豆浸于水中4-8小时，使之变软；70％乙醇浸1分钟；无菌蒸馏水充分浸两次，每次5min；取一粒大豆放入1.5ml无菌离心管，加入400mL 2×CTAB抽提液[CTAB(W/V)2％；Tris-HCL(pH8.0)100mmol/l；EDTA 20mmol/l；NaCL1.4mol/l；巯基乙醇2％]，用特制玻璃研磨器或普通玻璃棒将大豆尽可能磨碎；65℃水浴保温30分钟；加400mL氯仿，充分混合，14,000rpm，10min；将上清取入另一1.5ml离心管；加入1.5倍，即600uL CTAB沉淀缓冲液[CTAB 1％，Tris-HCl(pH8.0)50mmol/l，EDTA 10mmol/l，巯基乙醇1％]；室温放置一小时；12,000rpm，5min，弃上清；加400mL 1.25M NaCL溶解沉淀；等体积氯仿反复抽提2-3次；将上清转人另-1.5ml离心管，加250uL异丙醇，室温放10分钟后12,000rpm，10min离心，弃上清；沉淀DNA用70％及无水乙醇洗后晾干，溶于50mL H2O。
3.MPCR反应
取4支MPCR混合液管，编号1、2、3、4，同时取出引物组(I)和(II)，室温彻底融化后按下表将各相应试剂加入混合中，其中1、3管加引物组(I)，2、4管加引物组(II)，1、3管加待测DNA，2、4管加对照DNA
MPCR混合液            20mL
引物组(I/II)          2mL
DNA                   约50ng
Taq酶                 1mL
H2O                   1-7mL
总计                  30mL
每管中加1滴矿物油，用以下程序做MPCR反应：
        94℃ 2分钟；
        94℃ 30秒；55℃ 45秒；72℃ 1分钟；8个循环；
        94℃ 30秒；60℃ 45秒；72℃ 1分钟；32个循环；
        72℃ 5分钟。
[2]从1、3管中各取15uL同55℃杂交液(700mL)混合，将混合液加入装有杂交膜的杂交袋中，用封口机封口，同时从2、4管中各取15mL同55℃杂交液(700mL)混合，将混合液加入装有杂交膜的杂交袋中，用封口机封口，记住杂交膜的编号；55℃水浴杂交30分钟；杂交过程中取100-150mL洗涤液于一大小合适的烧杯中，放于55℃水浴中加热；
[3]取出膜，放入已预热至55℃的洗涤液中，不要将烧杯从水浴中取出，洗涤10分钟，其间不断摇动；
[4]倒掉洗涤液，换100-150mL洗涤液，在室温下洗涤10分钟，其间不断摇动
[5]取出膜，在盛有生物素交联缓冲液的平皿中浸片刻；同时取5mL生物素交联缓冲液于另一干净平皿，并加1mL生物素-碱性磷酸酶，充分混匀；
[6]将膜转入含生物素-碱性磷酸酶的平皿中，并将膜没入溶液中，室温静置10分钟；
[7]取出膜，放入一干净烧杯，并加入100-150mL生物素交联缓冲液，室温洗10分钟，其间换缓冲液2-3次；
[8]将膜转入盛有适量显色缓冲液的平皿中浸片刻；
[9]将膜转入杂交袋中，按每10ml显色缓冲液加66ul氮蓝四唑(NBT)和33ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)的比例配制显色液，封口，室温显色10-30分钟。用10mM EDTA(pH8.0)终止显色。
3.杂交膜制备，杂交条件和检测：
用0.1N HCl浸泡Biodyne C膜(Pall Gelman Sciences)，再用现配制的20％EDC(w/v)溶液处理15分钟。将含靶基因的特征序列的探针溶液各用1ml按顺序点样，制备成杂交膜。
用带生物素标记的引物对检测样本DNA进行MPCR反应，反应产物加入杂交液(0.1％SDS，0.75M NaCl，75mM柠檬酸钠，pH7.0)中，把杂交膜放入杂交液，55℃保温30分钟。然后用0.5×SSC，0.1％SDS溶液55℃洗涤10分钟，再于室温洗涤10分钟。
经上述处理的杂交膜放入含抗生物素蛋白链菌素的缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl，pH7.5)中，室温放置10分钟，用显色缓冲液(0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，50mM MgCl2，pH9.5)洗涤一次，按每10ml显色缓冲液加66ul氮蓝四唑(NBT)and 33ml 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)的比例配制显色液，将杂交膜放入显色液中显色10-30分钟，用10mM EDTA(pH8.0)终止显色。
4.转基因大豆的检测结果
对转基因大豆的检测结果表明，大豆样品含TNOS，PNOS，P35S，NPT-II和CP4基因。转基因大豆样品的杂交结果见图2。
实施例4
转基因大豆粉的检测
如实施例3那样检测转基因大豆粉样品，不同点仅在于用大豆粉样品替换了转基因大豆样品。
对转基因大豆粉的检测结果表明，大豆粉样品含TNOS，PNOS，P35S和CP4基因。转基因大豆粉样品的杂交结果见图3。
实施例5
转基因土豆的检测
如实施例3那样检测转基因土豆(马铃薯)样品，不同点仅在于用土豆样品替换了转基因大豆样品。
对转基因土豆的检测结果表明，马铃薯样品含TNOS，PNOS，P35S，NPT-II和Shiva基因。转基因马铃薯样品的杂交结果见图4。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
                        序列表<110>中国科学院上海生物工程研究中心<120>转基因农产品检测试剂盒<130>016959<160>30<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>34<212>DNA<213>引物<400>1caggtcgctg tcattgaatc ctgttgccgg tctt                              34<210>2<211>33<212>DNA<213>引物<400>2caggtcgctg tcaataattg cgggactcta atc                               33<210>3<211>33<212>DNA<213>引物<400>3caggtggcag tcatcattgc gataaaggaa agg                               33<210>4<211>33<212>DNA<213>引物<400>4caggtggctg tgacgaagga tagtgggatt gtg                               33<210>5<211>35<212>DNA<213>引物<400>5caggctgctc tgacgaatat ccgattctcg ctgtc                             35<210>6<211>32<212>DNA<213>引物<400>6gacgacgcac tcacgccctc atcgcaatcc ac                               32<210>7<211>33<212>DNA<213>引物<400>7ccgtcactcg tcactgctgt cggctttaac ctc                              33<210>8<211>33<212>DNA<213>引物<400>8cagcaccagg tcagcgtcgc agaacattac att                              33<210>9<211>32<212>DNA<213>引物<400>9caggtcgctg tcatttctcg gcaggagcaa gg                               32<210>10<211>33<212>DNA<213>引物<400>10caggtcgctg tcaactgggc acaacagaca atc                              33<210>11<211>33<212>DNA<213>引物<400>11caggtcgctg tcacaaaagt cgcctaaggt cac                              33<210>12<211>33<212>DNA<213>引物<400>12caggtcgctg tcataccgag gggaatttat gga                            33<210>13<211>32<212>DNA<213>引物<400>13cagcctgctc tgtcgtcttg aaggtcgtgg ta                             32<210>14<211>33<212>DNA<213>引物<400>14caggacggac tcagcaacag cgagaattgg ata                            33<210>15<211>33<212>DNA<213>引物<400>15caggacgcac agaaccacct cggaagtaat cat                            33<210>16<211>35<212>DNA<213>引物<400>16cagcacgcag tcaggtttgt aacagaaatc agcaa                          35<210>17<211>35<212>DNA<213>引物<400>17ctggtgcctg cgagccaaca cttgtcacta ctttc                          35<210>18<211>35<212>DNA<213>引物<400>18caggtggtca cgaacaggta atggttgtct ggtaa                              35<210>19<211>33<212>DNA<213>引物<400>19caggtggcag tcaggtggag gttgttcaga agg                                33<210>20<211>33<212>DNA<213>引物<400>20caggtcgcac tgattaaccc acagccctag cat                                33<210>21<211>45<212>DNA<213>探针<400>21ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgca                   45<210>22<211>30<212>DNA<213>探针<400>22gaggggaatt tatggaacgt cagtggagca                                    30<210>23<211>28<212>DNA<213>探针<400>23aatccacttg ctttgaagac gtggttgg                                      28<210>24<211>28<212>DNA<213>探针<400>24acttcgccca atagcagcca gtcccttc                                      28<210>25<211>27<212>DNA<213>探针<400>25gaggcagtca acggggaaac tcagcaa                               27<210>26<211>30<212>DNA<213>探针<400>26gtacataacc ttcgggcatg gcactcttga                            30<210>27<211>29<212>DNA<213>探针<400>27gtctggaaga actccgcgtc aaggaaagc                             29<210>28<211>30<212>DNA<213>探针<400>28gcatgaatcg cagcatggtt ctgaagactc                            30<210>29<211>32<212>DNA<213>探针<400>29tggctgactt gcgtgttcgt tcttctactt tg                         32<210>30<211>33<212>DNA<213>探针<400>30gttgttcaga aggattgaca gggttggtaa gca                        33

Claims (9)

1.一种转基因产品检测试剂盒，其特征在于，它含有3-10对引物，所述的引物分别特异性扩增选自下组基因的扩增产物：
花椰菜花叶病毒35S启动子P35S；
胭脂碱合成酶终止子TNOS；
胭脂碱合成酶启动子PNOS；
新霉素磷酸转移酶基因NPTII；
β-葡萄糖醛酸酶基因GUS；
绿色荧光蛋白基因GFP；
5-烯醇式丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶野生型基因EPSPS；
5-烯醇式丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶修饰基因CP4；
豇豆胰蛋白酶CpTI；
抗菌肽Shiva基因。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物自身及引物间二聚体的ΔG≥-7Kcal/mol，3′端发夹结构ΔG≥-2Kcal/mol，3′内部稳定性-6.5Kcal/mol≥ΔG≥-8.5Kcal/mol，Tm值50℃-65℃，GC％ 40％-65％。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物被分成二个引物组：
引物组(I)中的引物包括针对下组基因的引物：花椰菜花叶病毒35S启动子(P35S)、胭脂碱合成酶终止子(TNOS)、胭脂碱合成酶启动子(PNOS)、新霉素磷酸转移酶(NPTII)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)和绿色荧光蛋白(GFP)；
引物组(II)中的引物包括针对下组基因的引物：5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS，原始基因及修饰基因CP4)、豇豆胰蛋白酶CpTI、抗菌肽Shiva基因的；
且同一引物组的引物被合并在一起。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物选自下组：
caggtcgctgtcattgaatcctgttgccggtctt    SEQ ID NO：1
caggtcgctgtcaataattgcgggactctaatc     SEQ ID NO：2
caggtggcagtcatcattgcgataaaggaaagg     SEQ ID NO：3
caggtggctgtgacgaaggatagtgggattgtg     SEQ ID NO：4
caggctgctctgacgaatatccgattctcgctgtc    SEQ ID NO：5
gacgacgcactcacgccctcatcgcaatccac       SEQ ID NO：6
ccgtcactcgtcactgctgtcggctttaacctc      SEQ ID NO：7
cagcaccaggtcagcgtcgcagaacattacatt      SEQ ID NO：8
caggtcgctgtcatttctcggcaggagcaagg       SEQ ID NO：9
caggtcgctgtcaactgggcacaacagacaatc      SEQ ID NO：10
caggtcgctgtcacaaaagtcgcctaaggtcac      SEQ ID NO：11
caggtcgctgtcataccgaggggaatttatgga      SEQ ID NO：12
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caggacgcacagaaccacctcggaagtaatcat      SEQ ID NO：15
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ctggtgcctgcgagccaacacttgtcactactttc    SEQ ID NO：17
caggtggtcacgaacaggtaatggttgtctggtaa    SEQ ID NO：18
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caggtcgcactgattaacccacagccctagcat      SEQ ID NO：20。
5.一种检测转基因产品的检测方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(a)抽提转基因产品的DNA；
(b)用3-10对引物对抽提的DNA进行MPCR扩增，所述的引物分别特异性扩增选自下组基因的扩增产物；
花椰菜花叶病毒35S启动子P35S；
胭脂碱合成酶终止子TNOS；
胭脂碱合成酶启动子PNOS；
新霉素磷酸转移酶基因NPTII；
β-葡萄糖醛酸酶基因GUS；
绿色荧光蛋白基因GFP；
野生型5-烯醇式丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶基因EPSPS；
修饰的5-烯醇式丙酮酰草酸-3-磷酸合成酶基因CP4；
豇豆胰蛋白酶基因CpTI；
抗菌肽Shiva基因；
(c)将步骤(b)中的扩增产物与标记有特异性探针的杂交膜杂交；
(d)检测杂交结果。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物被分成二个引物组：
引物组(I)中的引物包括针对下组基因的引物：花椰菜花叶病毒35S启动子P35S、胭脂碱合成酶终止子TNOS、胭脂碱合成酶启动子PNOS、新霉素磷酸转移酶基因NPTII、β-葡萄糖醛酸酶基因GUS和绿色荧光蛋白基因GFP；
引物组(II)中的引物包括针对下组基因的引物：5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶野生型基因EPSPS、5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶修饰基因CP4、豇豆胰蛋白酶基因CpTI、抗菌肽Shiva基因；
且同一引物组的引物被合并在一起。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的引物选自下组：
caggtcgctgtcattgaatcctgttgccggtctt     SEQ ID NO：1
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ctggtgcctgcgagccaacacttgtcactactttc    SEQ ID NO：17
caggtggtcacgaacaggtaatggttgtctggtaa    SEQ ID NO：18
caggtggcagtcaggtggaggttgttcagaagg      SEQ ID NO：19
caggtcgcactgattaacccacagccctagcat      SEQ ID NO：20
并且所述的特异性探针选自下组：
ttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgca  SEQ ID NO：21
gaggggaatttatggaacgtcagtggagca                 SEQ ID NO：22
aatccacttgctttgaagacgtggttgg                   SEQ ID NO：23
acttcgcccaatagcagccagtcccttc                   SEQ ID NO：24
gaggcagtcaacggggaaactcagcaa                    SEQ ID NO：25
gtacataaccttcgggcatggcactcttga                 SEQ ID NO：26
gtctggaagaactccgcgtcaaggaaagc                  SEQ ID NO：27
gcatgaatcgcagcatggttctgaagactc                 SEQ ID NO：28
tggctgacttgcgtgttcgttcttctactttg               SEQ ID NO：29
gttgttcagaaggattgacagggttggtaagca              SEQ ID NO：30。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的引物带有选自下组的标记物：生物素、放射性同位素、荧光标记、地高辛。
9.一种寡核苷酸片段，其特征在于，它具有选自SEQ ID NO：1-30的核苷酸序列。
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