CN1556216A - 蓝舌病毒的检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蓝舌病毒的检测方法及试剂盒，首先是细胞的培养及病毒的增殖；其次是通过在反应试管中加入样品处理液，制备待测样品和阴阳性对照物PCR模板；第三是通过在反应试管中分别加入待检病毒样品模板和逆转录反应溶液，以逆转录合成待检样品dsRNA的cDNA；第四是通过在反应试管中加入PCR反应体系，进行聚合酶链反应，扩增合成靶标序列。本发明检测准确、敏感、廉价、安全，操作方便，易于推广。

Description

蓝舌病毒的检测方法及试剂盒

                  技术领域

本发明涉及一种蓝舌病毒的检测方法，同时本发明还涉及蓝舌病毒的检测试剂盒。

                  背景技术

我国是养羊养牛大国，牛和羊是极其重要的经济动物，而且牛还是我国农业生产力。蓝舌病毒严重危害和制约我国养羊业的发展和农业生产耕牛的饲养。我国一直认为无此病毒流行，只是在1980年前后才发现有此病毒所致的蓝舌病。嗣后，该病迅速蔓延，形成全国范围的动物疫病，并造成了重大的经济损失。故，自二十世纪八十年代初，我国政府十分重视蓝舌病的防治。《中国进出口动物检疫规范》把蓝舌病作为我国第一类传染病，纳入检疫。

动物蓝舌病的病原体蓝舌病毒是一种含有10分子双链RNA(dsRNA)的病毒，每一分子dsRNA编排着一个基因，每一个基因编码一个蛋白多肽。10分子dsRNA根据分子大小划分为大(L)、中(M)、小(S)三个组，并依次命名为L1、L2、L3；M4、M5、M6；S7、S8、S9、S10。其中，L2和L5基因分别编码型特异性抗原VP2和VP5。蓝舌病毒有25个血清型，每一个血清型蓝舌病毒的VP2和VP5不同，也就是说其L2和L5不同。所以，用不同蓝舌病毒的VP2和VP5作免疫诊断，或用L2和L5作分子诊断不能含盖25个血清型的蓝舌病毒，只能检测本血清型的蓝舌病毒。所以，VP2和VP5、L2和L5只能用于蓝舌病毒的定型。S7基因是群特异性抗原VP7的编码基因，用VP7抗原作免疫学诊断和用S7作分子诊断则能检测所有25个血清型的蓝舌病毒。这就是说，蓝舌病毒的S7基因是保守的，也就是说，所有25个血清型的蓝舌病毒的S7基因是相同或基本相同的。所以，欲发展蓝舌病毒诊断技术则需针对VP7和S7开展研究。

蓝舌病毒的每一个dsRNA分子由编码区和编码区两侧的非编码区(NCR)所组成；dsRNA分子5′端的非编码区称之为5′非编码区(5′-NCR)；相对应的，dsRNA分子3′端的非编码区称之为3′非编码区(3′-NCR)。蓝舌病毒的每一个dsRNA分子的5′-NCR和3′-NCR不同；但是，所有血清型的蓝舌病毒S7基因的5′-NCR是相同的，并且非常稳定。所以，选择蓝舌病毒S75′-NCR作分子检测是非常可靠的。

至今，国内外BTV常用的方法仍然是血清学方法。由于尚无理想的BTV检测方法用于生产实践，所以，动物体内特异性血清抗体的检测则成为主要的BTV流行病学、海关检疫和畜牧业生产中的通用技术。由于抗体实验的敏感性较差，该方法只用于比较分析恢复期和急性期血清样本的抗体效价，当动物恢复期血清抗体有明显的增长幅度时才有诊断意义。动物体内BTV抗体的存在，只能表明该动物以前感染过BTV，并不能表明当前感染。而且，由于BTV抗体与BTV病毒符合物在特定条件下解开后，仍可释放出活性病毒粒子。尽管存在上述缺点，血清学试验仍在用于蓝舌病的诊断、流行病学研究和海关检疫，其中，琼脂糖凝胶免疫扩散试验(AGID)、微效价血清中和反应(MTSN)和酶联免疫吸附试验(ELISA)应用最为广泛。琼脂糖凝胶免疫扩散试验和微效价血清中和反应这些方法不仅操作烦琐、耗时、易受各种因素影响，而且不能检测低水平存在的BTV。另外，用ELISA方法时，如果在缺少高敏感性和强特异性的BTV抗原的情况下，这些血清学技术不能够直接地检测到血液中的病毒。竞争酶联免疫吸附试验(c-ELISA)是较为广泛采用，但是，这种方法不仅操作烦琐、不稳定、产量低、成本高，而且有一定的生物安全隐患。所以，采用琼脂糖凝胶免疫扩散试验和ELISA等基本的免疫学方法检测动物体内的蓝舌病毒血清抗体，通常难以把住国门和支持畜牧业生产。

由于在缺少高敏感性和强特异性的BTV抗原的情况下，这些血清学技术方法用于血液中BTV抗体的检测的敏感性很低，所以，目前，有科学工作者希望应用基因重组技术为检测动物BTV血清抗体和制备抗BTV抗体而发展重组BTV VP7抗原。但是，利用基因工程在原核系统中表达的VP7蛋白抗原性很差；在真核系统中表达了VP7蛋白则提取抗原不仅工艺烦琐，而且成本很高。所以，重组基因工程蛋白多肽用于BTV诊断难以成型。

任何病毒的诊断莫过于直接病原学检测，其方法有病毒的分离，电镜下寻找病毒颗粒和病毒核酸的直接检测。病毒的分离，电镜下检测病毒颗粒这些方法耗时、工作烦琐而且耗费昂贵，并且需要一定的病毒浓度，难以达到病毒早期诊断，更无法推广应用。

所以检测病毒的特异性核酸序列已成为全世界共同追求的方法，一旦某种病毒的核酸技术成熟，就具有准确、早期和快速的特点。病毒核酸检测技术主要有两种，一为核酸分子杂交技术，另一为PCR技术。根据多年的应用情况看来，前者明显没有后者优越，诸如操作复杂，技术要求高，被检样品需要提纯，难以普及应用。所以已让位于PCR技术及其延伸的RT-PCR技术。

随着分子生物学的飞速发展，人们把发展早期、准确诊断和检测蓝舌病毒的技术聚焦到分子诊断技术和方法上。人们正在努力发展BTV分子诊断技术和方法，首推是逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术。但是，有两个矛盾一直没有解决，一是目标序列的选择和引物的设计，因为要求既要有特异性，又要有敏感性；二是双链RNA(dsRNA)分子的解链，因为dsRNA分子被解链成单链RNA(ssRNA)分子后容易降解，否则，便解链不全。所以，国外实验室常规采用羟甲基汞解链。但是，这种羟甲基汞需要现用现配制，以至该方法在国际上仅在实验室采用，无法作常规临床或现场使用。然而，在我国，即使在实验室里，用此方法解链都有很大困难。

通过蓝舌病毒核酸检测技术检测BTV病原，包括特异性核酸探针与待检样品的核酸分子杂交技术和PCR技术等。实验证明，在篮舌病毒标准核酸探针的敏感性值为0.1-10pg。在感染的发热期，病毒粒子和模板RNA的水平达不到这种标准。另外，用这种方法也无法检测到样品中低水平存在的BTV或是在组织培养、动物体内不能正常增殖的BTV。所以，核酸探针技术不适用于篮舌病的检疫，只能作为篮舌病毒的一种研究室鉴定方法。

很明显，人们把发展理想的蓝舌病毒诊断技术和方法已主要集中在逆转录PCR技术上，只要寻找到理想而能推广的dsRNA分子解链方法，优选到稳定而可靠的蓝舌病毒基因组靶标序列，设计出特异性的RT-PCR引物，解决好dsRNA模板制备系统、逆转录反应系统和PCR反应系统等，就有希望发展出全新的普遍实用的科技含量高的蓝舌病毒分子检测技术，并形成蓝舌病毒分子诊断试剂盒。

                  发明内容

本发明的目的在于提供一种蓝舌病毒的检测方法，该方法检测蓝舌病毒具有准确、敏感、廉价、安全，并且设备简短、操作方便、易于推广等特征。

本发明的另一个目的在于提供一种检测蓝舌病毒的试剂盒，使用该试剂盒，可对蓝舌病毒进行定性或定量检测。本发明的关键点

A.一对特异性引物

根据已报道的BTV-10的S7片段序列，采用美国PREMIER Biosoft Interna-tional公司的引物设计软件Primer Premier 5设计了一对特异性引物，覆盖了BTV S7片段5’非编码区290bp的片段。由上海生物工程公司合成。各引物干粉用双蒸水配置成25μmol/L的溶液，备用。引物序列如下：

正义引物P1：5′-AGC CAT ATG TTG AGT ATT-3′

反义引物P2：5′-TAG AGA TGG ACA CTA TGG C-3′

上述BTV-10是自美国分离的BTV标准株(美国国家兽医服务实验室NVSL；Maclachlan NJ and Fuller FJ，Genetic Stability in Calves of a Single Strainof Bluetongue Virus[J]，Am J Vet Res，1986，47(4)：762-4)。BTV-10株的S7片段序列见论文：Timothy FK and Li J KK，Bluetongue Virus Evolution，Sequence Analysis of the Genomic S7 Segment and Major Core Protein VP7[J]Virology，1991，181：749-755。

B.dsRNA的解链方法

为了达到上述目的，本发明经过反复实验研究，选择S7基因5′非编码区(5′-NCR)的一段序列作为靶标序列，凝练了一对特异性引物，大幅度地将dsRNA解链温度提高到94℃-96℃7-9分钟(一般是3-5分钟)，形成了操作简单的dsRNART-PCR技术和蓝舌病毒分子诊断试剂盒，可用于蓝舌病毒感染的早期诊断和环境中蓝舌病毒的检测。

C.阳性对照重组pUCm-T-BTV-S7质粒构建了本检测技术的阳性对照物重组pUCm-T-BTV-S7质粒及其大肠杆菌TGl菌株转化子，以空载pUCm-T质粒为阴性对照物。阳性对照重组pUCm-T-BTV-S7质粒构建见后。所用pUCm-T载体购自Promega公司。

本发明的检测方法和操作程序

步骤如下：

(1)细胞的培养及病毒的增殖

采用含有10％的小牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素、10μl/ml谷氨酰胺MEM培养基培养Vero细胞。待细胞单层覆盖达80％培养瓶底时，弃去培养液，用pH7.2的PBS洗涤。接种病毒悬液。28-37℃吸附1h，弃去病毒悬液。加入6-8ml含有0-2％小牛血清的MEM维持培养基，其他成分与培养基相同。28-37℃培养，出现90％以上细胞病变(CPE)时，收获病毒，用于BTV dsRNA基因扩增模板的制备。

(2)待测样品PCR模板的制备

采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取病毒基因组dsRNA。

让待测样品通过7种样品处理液处理，成为待检模板。

(A)来自动物待检样品BTV dsRNA模板的制备

a.取待检肝素抗凝全血3ml加入样品处理溶液I，轻柔悬浮血细胞。1200-1600r/min离心10分钟，沉淀用样品处理溶液I再洗涤一次。

b.收集沉淀，于沉淀中分别加入400μl样品处理溶液II，混匀至液体清亮。

c.加入等体积的样品处理溶液III，荡8-12秒，冰浴15分钟。

d.4℃，11000-13000r/min离心20分钟，取上清至另一管中。

e.于上清液加入等体积样品处理溶液IV和1/10体积样品处理液V，-20℃放置30分钟。

f.4℃，12000-15000r/min离心10分钟。沉淀用样品处理溶液VI洗涤一次，4℃，12000-15000r/min离心10分钟，弃上清，沉淀溶解于10μl的样品处理溶液VII，即为待检模板，用于RT-PCR扩增。

(B)来自细胞培养BTV dsRNA模板的制备

a.培养20-36hr的带毒单层细胞加入裂解液，及样品处理溶液II1ml，待溶液清亮后，吸取并移至Ep管中。

b.等体积的样品处理溶液III，充分混匀，冰浴15分钟。

c.4℃，11000-13000r/min离心20分钟，取上层水相，移入一新的Ep管中。

d.加入等体积的样品处理溶液IV和1/10体积的样品处理溶液V，-20℃沉淀30分钟，4℃，12000-15000r/min离心10分钟，弃上清。

e.用预冷的样品处理溶液VI洗涤沉淀一次，4℃，12000-15000r/min离心10分钟，弃上清，沉淀自然干燥。沉淀用样品处理溶液VII10μl溶解，-20℃保存，备着RT-PCR用模板。

(3)待检样品dsRNA逆转录合成cDNA

1.5ml反应试管分别加入待检病毒样品模板dsRNA提取液3μl，逆转录反应溶液I8.5μl，94-96℃变性7-9分钟，冰浴5分钟；向混合物中管内加入逆转录反应液II8.5μl，混匀，37℃孵育60-80分钟，72℃2-4分钟灭活逆转录酶；-20℃保存。

逆转录反应溶液I：含有正义引物P1和反义引物P2，

逆转录反应溶液II：含有10×逆转录缓冲液，dNTP，M-MLV逆转录酶

(4)聚合酶链式反应

反应试管中依次加入：

10×PCR缓冲液             2.5μl

25mmol/LMgCl₂            1.5μl

25μmol/LP1               1.0μl

25μmol/LP2               1.0μl

10mmol/LdNTPs             0.5μl

cDNA                      1.0μl

无菌水                    17.0μl

Taq DNA聚合酶             0.5μl(5u/μl)

               总体积为：25.0μl

混匀反应体系，瞬时离心后，覆盖灭菌液体石蜡20μl；反应管放入DNA扩增仪中，预变性94-96℃2-4分钟，变性94-96℃28-32秒，退火50℃28-32秒，延伸72℃42-46秒，共30-36个循环。最后，产物DNA延伸补齐72℃7-9分钟。

阳性对照试管和阴性对照试管处理同上。

阳性对照物：含有BTV-10S75′-NCR片段的pUCm-T-BTV-S7重组质粒；

阴性对照物：pUCm-T质粒空载。

pUCm-T载体购自Promega公司。

(5)检测结果的判定

(A)TAE用少量双蒸水溶解后定溶至500ml，取40ml于一烧杯，加入琼脂糖，加热使之溶解并浇制电泳平板，剩余液体用作电泳缓冲液。

(B)吸取反应管中的下层液体10μl，点样；按5V/cm电压降电泳15-30分钟，在紫外灯下观察分析结果，出现与阳性对照平齐的DNA带即为阳性，否则为阴性。

本发明蓝舌病毒分子检测试剂盒之组成

该试剂盒由样品处理液、逆转录反应液、PCR反应体系、阴性与阳性对照物、液体石蜡、电泳缓冲液、含EB琼脂糖组成。

(1)7种样品处理液：

样品处理液I：PBS溶液；

样品处理液II：6mol/L异硫氰酸胍，pH7.0的7.5mol/L柠檬酸钠，0.75％十二烷基磺酸钠，0.15mol/Lβ-巯基乙醇；

样品处理液III：苯酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1；

样品处理液IV：异丙醇；

样品处理液V：3mol/L NaAc

样品处理液VI：75％乙醇；

样品处理液VII：DEPC处理的双蒸水；

(2)2种逆转录反应溶液：

逆转录反应溶液I：含有：

25μmol/L的正义引物P1，

25μmol/L的反义引物P2，

焦碳酸二乙酯处理双蒸水，

正义引物P1：5′-AGC   CAT  ATG   TTG   AGT  ATT-3′

反义引物P2：5′-TAG   AGA  TGG   ACA   CTA  TGG C-3′

逆转录反应溶液II：含有10×RT缓冲液，10mmol/LdNTP，200u/μlM-MLV逆转录酶；

(3)PCR反应体系：

10×PCR缓冲液     25mmol/L MgCl₂ 25μmol/L P1

25μmol/LP2       10mmol/L dNTPs    cDNA

无菌水            Taq DNA聚合酶

(4)阳性与阴性对照物为：

阳性对照物：含有BTV-10S75′-NCR片段的pUCm-T-BTV-S7重组质粒；

阴性对照物：pUCm-T质粒空载，pUCm-T载体购自Promega公司。

(5)液体石蜡：商业化的实验用液体石蜡

(6)电泳缓冲液：50倍的TAE电泳缓冲液含有Tris碱242g，冰醋酸57.1ml，0.5mol/L EDTA，pH8.0

(7)含EB琼脂糖：含EB染料的商业化实验用琼脂糖。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果

至今，国内外BTV诊断常用的方法仍然是血清学方法。由于尚无成熟的BTV检测方法用于生产实践，动物体内特异性血清抗体的检测则成为主要的BTV流行病学、海关检疫和畜牧业生产中的通用技术。

为此，本发明经过反复实验研究，实现了靶标序列的选择，一对特异性引物的凝练，找到了简单的dsRNA分子的解链技术，从而形成了操作简单的dsRNART-PCR技术和蓝舌病毒分子诊断试剂盒。

很明显，本发明克服了现有蓝舌病毒检测和诊断技术和方法的缺点，具有以下优点和效果：

(1)RT-PCR技术直接检测BTV病原体，所以结果特异、准确；

(2)RT-PCR技术检测病毒核酸，所以可进行蓝舌病早期诊断；

(3)检测的把物质是病毒的dsRNA核酸，所以安全；

(4)由于本发明的技术形成了检测药盒，所以使用方便；

(5)由于找到了dsRNA分子解链的简单技术，以及阳性对照物已通过基因重组技术克隆到质粒载体中，所以检测药盒价格低廉；

(6)易于推广，用作常规现场和临床使用，亦可用于实验室研究工作。

                  附图说明

图1.BTV-10型S75′-NCR序列重组质粒pUCm-T-BTV-10-S7 PCR及酶切鉴定A.PCR Marker，B.BTV-10 S75′-NCR 序列 RT-PCR 产物，C.pUCm-T-BTV-10-S7酶切产物(BamHI/HindIII)，Marker：1000bp，900bp，

800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp

图2.本发明技术和检测药盒应用于生产实践的效果

M：Marker，P：阳性对照，1-12：可疑蓝舌病绵羊血液样品

图3.蓝舌病毒HbC3和10型标准株S75′NCR序列RT-PCR产物

A.BTV-HbC3，B.BTV-10，C.PCR Marker

Marker：1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp

                  具体实施方式

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明

实施例1阳性对照物的制备

A.连接反应

将BTV-10S75′-NCR片段的RT-PCR dsDNA产物低熔点琼脂糖回收，

与pUCm-T载体做连接反应，总体积为10μl的反应体系中分别加入

T4DNA连接酶             1.0μl

S7PCR回收产物           1.0μl

PEG4000                 1.0μl

pUCm-T载体              1.0μl

无菌水                  6.0μl

       混匀，于16℃水浴2hr

B.重组pUCm-T-BTV-S7质粒转化大肠杆菌TG1菌株，并在其中扩增

(A)感受态细胞的制备：

(1)将20μl、25％甘油保存的大肠杆菌TG1菌株接种到20ml(1∶1000)含Amp(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃摇床、200rpm振荡培养过夜。

(2)第二天从培养的菌液中吸取1ml的菌体培养物到20mlLB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养2hr，至菌体浓度A＝0.4-0.6。

(3)将菌体培养物转移到1.5ml的离心管中，冰浴10min，使之冷却到0℃。

(4)3000rpm离心10分钟，回收菌体，将离心管倒置以去净培养液。

(5)每管加入2.5ml冰预冷的50mmol/L CaCl₂重悬后，冰浴30min。

(6)3000rpm离心10min回收菌体，将离心管倒置以去净液体部分。

(7)用总共1ml的冰预冷的50mmol/LCaCl₂重悬菌体，置4℃冰浴1hr，保持2-4hr或过夜再用。

(B)转化：

(1)新鲜制备或-70℃下保存的100μl感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻地将细胞均匀悬浮。

(2)加入10μl pUCm-T-S7连接液，轻轻混匀。

(3)冰上放置30min。

(4)42℃水浴90sec(热休克)。

(5)冰上放置2分钟。

(6)加入400mlLB液体培养基，37℃，250rpm荡培养1hr，复苏细菌。

(7)室温4000rpm离心5min，吸掉400μl上清液，用剩余的培养基将细胞均匀悬浮。

(8)将细菌涂布于含Amp(50μg/ml)的90mmLB平板上。平板在37℃正向放置1hr以吸收过多的液体，然后倒置培养板过夜。

(C)筛选：

从LB平板上挑选可疑的单个菌落，接种到5ml含Amp(50μg/ml)的LB液体培养基中，置37℃摇床、200rpm下震荡培养过夜。

(D)碱裂解法提抽质粒DNA：

(1)将LB液体培养基中生长的菌体各吸取0.5ml，加入等体积的50％甘油，混匀后置于-20℃保存；将剩余的菌体倒入1.5mlEp管中，12000rpm离心5min沉淀菌体。去上清，凉干沉淀。

(2)加入BufferI100μl，悬浮菌体，震荡器充分震荡，使之均匀分散。

(3)加入临时配制的BufferII200μl，上下颠倒混匀，直至透明。

(4)加入BufferIII150μl，上下颠倒混匀，冰浴10min。

(5)12000rpm离心15min，吸取上清。

(6)加入等体积的苯酚，混匀提抽DNA，12000rpm离心15min，吸取上清。

(7)上清用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提抽一次，12000rpm离心15min，吸取上清。

(8)上清再用等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)提抽一次，12000rpm离心15min，吸取上清。

(9)加入1/10体积的3mol/l冰醋酸和2倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20℃沉淀过夜。

(11)次日取出，12000rpm离心15min，去除上清。

(12)DNA沉淀用75％乙醇漂洗一次，12000rpm离心5min，去除上清。

(13)DNA沉淀于37℃稍干燥，保存于-20℃。

C.蓝舌病毒S7片段的重组pUCm-T-BTV-S7质粒的鉴定

(1)取BTV-10标准株的RT-PCR产物10μl于1％琼脂糖凝胶上电泳，结果扩增产物为290bp的BTVS7 cDNA片断，与预先设计的大小相符。

BTV-10标准株是自美国分离的BTV标准株(美国国家兽医服务实验室NVSL；Maclachlan NJ and Fuller FJ，Genetic Stability in Calves of a Single Strainof Bluetongue Virus[J]，Am J Vet Res，1986，47〔4〕：762-4)。

(2)对提抽的菌落质粒DNA进行PCR扩增，结果在样品BTV-10的11个菌落中有9个也扩增出290bp特异性带。对PCR阳性的重组质粒DNA用BamHI和HindIII双酶切，结果皆切出了1条与RT-PCR产物大小一致的小片段。PCR鉴定与酶切分析结果相一致，表明BTV-10毒株S1基因片段均已克隆到载体质粒中。(见图1)

(3)经限制性内切酶分析，PCR检测确认有蓝舌病毒VP7基因插入的纯化质粒pUCm-T-BTV-10-S7，以通用测序引物在ABI PRISM370型自动分析仪上双向测序，得到290bp的BTVS7基因5′-NCR的序列片段(见PCR扩增靶序列表)。

实施例2各种溶液的配制

工具酶

M-MLV逆转录酶，BamHI和HindIII为Promega公司产品。

Taq DNA聚合酶为生工生物工程公司产品。

RNAsin为华美生物工程公司产品。

主要化学药品

DEPC为GIBCO公司产品。

琼脂糖为华美生物工程公司产品。

低熔点琼脂糖为Promega公司产品。

pUCm-T载体为Promega公司产品。

TG1工程大肠杆菌为Sigma公司产品。

RNA提取所用试剂及溶液

裂解液配方：6mol/L异硫氰酸胍，7.5mol/L柠檬酸钠(pH7.0)，0.75％(W/V)十二烷基磺酸钠，0.15mol/Lβ-巯基乙醇(2-ME)

水饱和酚：用DEPC处理过的双蒸水饱和(pH4.0)

3mol/LNaAc(pH4.0)

氯仿∶异戊醇(24∶1)

100％异丙醇

75％乙醇(用DEPC处理过的双蒸水配置)

常用缓冲液

(1)TAE电泳缓冲液(50×)：Tris碱242g，冰醋酸57.1ml，0.5mol/LEDTA(pH8.0)。

(2)凝胶加样缓冲液(6×)：0.25％溴酚兰，40％蔗糖水溶液。

实施例3检测试剂的组成物

样品处理液I：PBS溶液

样品处理液II：6mol/l异硫氰酸胍，7.5mol/l柠檬酸钠(pH7.0)，0.75％(W/V)十二烷基磺酸钠，0.15mol/Lβ-巯基乙醇(2-ME)

样品处理液III：苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)

样品处理液IV：异丙醇

样品处理液V：3mol/L NaAc

样品处理液VI：75％乙醇

样品处理液VII：DEPC处理的双蒸水

逆转录反应液I：25μmol/L正义引物P1(5′-AGC CAT ATG TTG AGT ATT-3′)和25μmol/L反义引物P2(5′-TAG AGA TGG ACA CTATGG C-3′)，焦碳酸二乙酯处理的双蒸水。

逆转录反应液II：10×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，200u/μlM-MLV逆转录酶。

PCR反应体系：10×PCR缓冲液，25mmol/LMgCl₂，25μmol/LP1，25μmol/LP2，10mmol/LdNTPs，逆转录合成的BTVS75′-NCRcDNA，无菌水，Taq DNA聚合酶。

阳性对照物：含有BTV-10S75′-NCR片段的pUCm-T-BTV-S7重组质粒。

阴性对照物：pUCm-T质粒空载，pUCm-T载体购自Promega公司。

液体石蜡：商业化的实验用液体石蜡

电泳缓冲液：50倍的TAE电泳缓冲液含有Tris碱242g，冰醋酸57.1ml，0.5mol/L EDTA，pH8.0

含EB琼脂糖：含EB染料的商业化实验用琼脂糖。

实施例4利用试剂盒检测蓝舌病毒例

取湖北省某畜牧场可疑病羊的肝素抗凝全血12份，健康绵羊肝素抗凝全血1份。提取全血BTV核酸进行RT-PCR检测方式同前。应用此RT-PCR系统，我们共检测了12例待测血液样品。其中11例各扩增出一条与标准株BTV-10结果相同大小的核酸序列，而第7例标本血和健康绵羊血未见扩增出相应的核酸序列。进一步用免疫学方法、透射电子显微镜技术、敏感细胞培养技术分离BTV诊断方法和临床观察等联合验证该检测技术和方法，结果证明了本发明的技术和分子诊断药盒的检测符合率。(见图2)

实施例5利用试剂盒检测蓝舌病毒例

将人肝癌Hep-3B细胞体外培养以1×10⁸/ml剂量接种于裸鼠的颈背部皮下，以BTV-HbC₃(1×10⁴PFU浓度)行瘤内注射处理。三周后同时提取肿瘤组织和各器官组织材料的总RNA，10％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)电泳作dsRNA基因组图谱分析和用此分子诊断药盒RT-PCR产物分析，以及群特异性抗体查BTV特异性抗原免疫学检测。比较研究结果显示，该诊断药盒的检测效率优于免疫学方法，敏感度高于PAGE BTV基因组图谱分析。(见图3)

本发明已成为研究室用于BTV分子生物学、细胞生物学和实验动物学检测BTV分子和BTV的常规技术和方法，现贡献给社会。

                SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>蓝舌病毒的检测方法及试剂盒

<130>蓝舌病毒的检测方法及试剂盒

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>290

<212>DNA

<213>蓝舌病毒10型

<400>1

taccgtctga tgacctttgt accgtccatt gtagcacgtg tgtagcccca ctcgtaagag    60

gcatgatgat ttgacgtcgt ccccaccttc ctcccgatta ctcgggcagt ctccttagag    120

tgctcaacta aatggtagta actaaggata agggttgcgc tcgttgcagg acttaaccga    180

acatctcacg acacgagctg acgacaacca tgcaccatct gtcattctgt taacctccac    240

tatgtctcta tagctttgca gaagatgtca agagtgggca gttaaggaat               290

Claims (6)

1.一种蓝舌病毒的检测方法，其步骤是：

A、细胞的培养及病毒的增殖，采用含有10％的小牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素、10μl/ml谷氨酰胺、MEM培养基培养Vero细胞，待细胞单层覆盖达80％培养瓶底时，弃去培养液，用pH7.2的PBS洗涤，接种病毒悬液，28-37℃吸附，弃去病毒悬液，加入含有0-2％小牛血清的MEM维持培养基，37℃培养，出现细胞病变时，收获病毒；

B、待测样品PCR模板的制备，采用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取病毒基因组dsRNA，让待测样品通过样品处理溶液处理，成为待检模板：一种是来自动物待检样品BTV dsRNA模板的制备：首先是取待检肝素抗凝全血加入PBS缓冲液，轻柔悬浮血细胞，离心，沉淀用PBS缓冲液洗涤；其次是收集沉淀，于沉淀中加入由异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基磺酸钠、β-巯基乙醇组成的裂解液，混匀至液体清亮；第三是加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，静置；第四是离心，取上清至管中；第五是于上清液加入等体积异丙醇和1/10体积的3mol/L NaAc溶液，放置；第六是离心，沉淀用75％乙醇洗涤，溶解于焦碳酸二乙酯DEPC处理的水，即为待检模板，用于RT-PCR扩增；另一种是来自细胞培养BTV dsRNA模板的制备：首先是培养20-36hr的带毒单层细胞加入上述相同的裂解液，待溶液清亮后，吸取并移至Ep管中；其次是加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇，混匀，冰浴；第三是离心，取上层水相，移入Ep管中；第四是加入等体积的异丙醇和1/10体积的3mol/L NaAc溶液，沉淀，离心，弃上清；第五是用预冷的75％乙醇洗涤沉淀，离心，弃上清，沉淀干燥，沉淀用DEPC处理的水溶解，保存；

C、待检样品dsRNA逆转录合成cDNA：在反应试管分别加入待检病毒样品模板dsRNA提取液，正义引物P1和反义引物P2，94-96℃变性7-9分钟，冰浴5分钟，向混合物中加入10×逆转录缓冲液、dNTP和M-MLV逆转录酶，混匀，37℃孵育60-80分钟，72℃ 2-4分钟灭活逆转录酶，保存；

D、聚合酶链式反应，在反应试管中依次加入：10×PCR缓冲液、MgCl₂、正义引物P1、反义引物P2、dNTPs、cDNA、无菌水、Taq DNA聚合酶，混匀反应体系，离心后，覆盖灭菌液体石蜡，反应管放入DNA扩增仪中，预变性94-96℃2-4分钟，变性94-96℃ 28-32秒，退火50℃ 28-30秒，延伸72℃ 42-46秒，共30-36个循环，产物DNA延伸补齐72℃ 7-9分钟；阳性对照试管和阴性对照试管处理同上；

E、检测结果：a.用双蒸水配制TAE缓冲液，取一定量于一烧杯，加入琼脂糖，加热使之溶解，浇制电泳平板，亦用TAE缓冲液作电泳缓冲液；b.吸取反应管中的下层液体，点样，按电压降5V/cm电泳15-30分钟，在紫外灯下观察分析结果，出现与阳性对照平齐的DNA带即判读为阳性。

2.根据权利要求1所述的一种蓝舌病毒的检测方法，其特征在于阳性对照物含BTV-10的S7 5′-NCR片段的pUCM-T-BTV-S7重组质粒。

3.实现权利要求1所述的蓝舌病毒检测方法的一种试剂盒，其特征在于：该试剂盒由样品处理液、逆转录反应溶液、PCR反应体系、阴性与阳性对照物、液体石蜡、电泳缓冲液、含EB的琼脂糖。

4.根据权利要求3所述的一种蓝舌病毒检测方法的试剂盒，其特征在于：样品处理液I：PBS溶液；样品处理液II：6mol/l异硫氰酸胍，pH7.0的7.5mol/l柠檬酸钠，0.75％十二烷基磺酸钠，0.15mol/L β-巯基乙醇；样品处理液III：苯酚/氯仿/异戊醇为25/24/1；样品处理液IV：异丙醇；样品处理液V：3mol/LNaAc；样品处理液VI：75％乙醇；样品处理液VII：DEPC处理的双蒸水。

5.根据权利要求3所述的一种蓝舌病毒检测方法的试剂盒，其特征在于：逆转录反应溶液为：逆转录反应溶液I：含有25μmol/L的正义引物P1，25μmol/L的反义引物P2和DEPC处理双蒸水；逆转录反应溶液II：含有10×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，200u/μl M-MLV逆转录酶。

6.根据权利要求5所述的一种蓝舌病毒检测方法的试剂盒，其特征在于：

    正义引物P1：5′-AGC CAT ATG TTG AGT ATT-3′

    反义引物P2：5′-TAG AGA TGG ACA CTA TGG C-3′。

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