CN1303212C - 一种禽流感病毒非结构蛋白基因ns1及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物病毒学技术领域。公开了一种禽流感病毒的非结构蛋白基因NS1的cDNA序列，用该基因构建原核表达载体；将表达载体转化至大肠杆菌中得到重组菌株(Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1)；利用该菌株表达禽流感病毒非结构蛋白NS1；利用所述的表达蛋白建立酶联免疫吸附试验鉴别诊断方法，用于区分禽流感灭活疫苗免疫鸡与野毒感染鸡。本发明还涉及制备方法、鉴别诊断试剂盒及其应用。

Description

一种禽流感病毒非结构蛋白基因NS1及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及动物病毒学技术领域。具体涉及一种新的含有禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的重组大肠杆菌菌株(Escherichia coli)BL21/pET-28a-NS1，利用该菌株表达禽流感病毒非结构蛋白NS1，并建立酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴别诊断方法，用于区分禽流感灭活疫苗免疫鸡与野毒感染鸡。本发明提供含有禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的表达质粒(pET-28a-NS1)、重组大肠杆菌菌株Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1，NS1蛋白的表达与纯化方法以及用该蛋白建立的可区分禽流感灭活疫苗免疫鸡与野毒感染鸡的鉴别诊断方法。

背景技术

禽流感(Avian influenza virus，AIV)又名真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种禽类的感染或/和疾病综合征。是国际兽疫局规定的A类烈性传染病，并被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。自1994年第一次报道H₉N₂亚型禽流感在中国的流行以来，我国对禽流感逐渐开始重视起来并开展了相应的研究。该亚型禽流感病毒不仅给养禽业造成巨大的经济损失，同时国内外学者的研究表明流感病毒也可能感染人，而且在中国大陆和香港地区一些流感毒株已经传给了猪和人，有可能给人类的健康构成新的威胁，从而引起了人们的高度重视。

A型流感病毒的基因组由8个不连续的病毒RNA节段组成，片段8在8个基因组片段中最短，仅有890个核苷酸，该片段的5’端有26个核苷酸为非编码区，它含有两个读码框(阅读框)，可编码两种蛋白质，即NS1和NS2，两者分子量分别为25000和12000。非结构蛋白NS1与AIV的复制密切相关，AIV新合成的基因组的5’端通过共价键与NS1联结，在随后的病毒包装过程中NS1被去掉并连在病毒粒子的外层，NS1具有抗原性，它虽然是微蛋白，但在病毒复制过程中能持续刺激机体产生抗体。非结构蛋白的出现仅仅只限于病毒的感染期，而在使用灭活苗免疫时不会产生，研究表明，非结构蛋白及其抗体可以作为病毒感染机体的一个重要标记，从而可以将其区分免疫群和感染群，进行鉴别诊断，但目前尚未有应用检测非结构蛋白抗体作鉴别禽流感的报道。基于此，利用大肠杆菌表达NS1蛋白，建立了区分AIV野毒感染鸡和灭活疫苗免疫鸡的ELISA鉴别诊断方法。

由于目前禽流感是世界各国密切关注的最重要的动物传染病。不同的国家或地区采取不同的控制政策，在采取捕杀政策的国家，重点是如何检测隐性感染动物；在采取注射疫苗预防禽流感的国家，如何区分野毒感染鸡和注苗动物则是控制和消灭该病的关键。因而建立有效的鉴别诊断方法以区别灭活疫苗免疫鸡和野毒感染鸡、检测隐性感染鸡就成为禽流感防制技术研究的重要课题。

目前用于禽流感检测的方法可以分为抗原检测和抗体检测方法两大类。前者主要包括病毒分离鉴定、RT-PCR、血凝试验(HA)、核酸探针技术等，该类方法检测周期长，技术、设备要求高，不适用于临床大规模检测；后者主要指血清学检测方法，主要包括血凝抑制试验(HI)、琼脂扩散试验(AGP)、神经氨酸酶抑制试验(NI)、病毒中和试验(Virus Neutralization Test；VNT)、全病毒酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay；ELISA)等，该类方法操作较前者简单易行，适合临床大规模的抗体监测，其不足是不能区分灭活疫苗免疫鸡和野毒感染鸡。因为常规的ELISA或血凝抑制试验是检测禽流感病毒的结构蛋白的抗体。结构蛋白的抗体既可以通过免疫获得，也可以由野毒感染而引起。因此这些方法只能用于动物禽流感病毒抗体水平的监测，在及时发现野毒感染，清除野毒感染鸡方面显得无能为力。

现在发展中国家主要用禽流感灭活疫苗对本病进行防疫。由于禽流感灭活疫苗的成分主要是纯化的灭活病毒粒子，疫苗免疫鸡后，动物体内不会有病毒增殖，因而也就无病毒非结构蛋白的表达，动物体内也没有抗非结构蛋白抗体产生。而野毒感染鸡体内则有病毒的增殖，病毒在增殖过程中非结构蛋白也得到了表达，其中的一些非结构蛋白具有免疫原性，引起动物体产生抗非结构蛋白的抗体(Tesar等，Virus Genes.1989，3(1)：29-44)。动物体这种抗体差异，为建立检测隐性带毒鸡，区别灭活疫苗免疫鸡和野毒感染鸡的鉴别诊断方法提供了理论依据。

目前我国禽流感在禽流感的临床抗体检测中用的ELISA检测方法是用灭活的禽流感全病毒包被酶标板制备酶标抗原。该方法存在病毒灭活不彻底，从而造成活病毒逃逸、扩散的潜在危险。

鉴于禽流感病毒非结构蛋白NS1的特性，利用该蛋白研制出快速、准确、安全、廉价的鉴别禽流感免疫鸡与野毒感染鸡的诊断试剂盒，将为禽流感的防制和消灭提供有效工具。

发明内容

本发明目的之一是提供一种编码禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的cDNA序列。

本发明目的之二是提供一种可以特异性表达禽流感病毒非结构蛋白NS1的重组大肠杆菌，为ELISA鉴别诊断方法提供抗原。

本发明的目的之三是提供一种表达及纯化禽流感病毒非结构蛋白NS1的制备方法。

本发明的目的之四是提供一种快速、准确、安全、廉价的区分禽流感免疫鸡与野毒感染鸡的ELISA鉴别诊断方法及鉴别诊断试剂盒。

本发明通过以下技术方案实现：

一种禽流感病毒的非结构蛋白基因NS1的cDNA序列，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

表达禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的重组大肠杆菌(Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2004年5月10日，保藏编号：CCTCC NO：M204035，其中所说的非结构蛋白基因NS1含有如序列表SEQ ID NO：1所示的cDNA序列。

一种禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的重组大肠杆菌的制备方法，它包括下列步骤：

1)以分离的禽流感病毒基因组为模板，通过RT-PCR方法扩增得到禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的cDNA序列；

2)在原核表达载体pET-28a(Vet Q，1998，20：Suppl 2：24-26)的SalI和XhoI多克隆位点中定向插入禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的cDNA序列，构建得到原核表达载体pET-28a-NS1；

3)将步骤2)所说的原核表达载体pET-28a-NS1转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，用卡那霉素抗性筛选单个重组菌，诱导该菌株，得到特异表达禽流感病毒非结构蛋白基因NS1：

4)纯化步骤3)所表达的NS1蛋白，得到所需的禽流感鉴别诊断抗原；

5)将步骤4)得到的抗原组装成鉴别诊断禽流感的试剂盒。

以上所说的禽流感病毒非结构蛋白NS1纯化的具体步骤是：

挑取单个重组大肠杆菌BL21/pET-28a-NS1菌落至LB培养基加卡那霉素至终浓度50μg/mL，37℃摇床培养12小时后放4℃冰箱过夜；用含50μg/mL卡那霉素的LB培养基将该菌液按1∶100比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃摇床培养至 $\mathrm{OD}600\≅0.6,$ 用0.4mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷进行诱导，每小时取样100μl，诱导3-4小时后进行SDS-PAGE电泳分析，诱导的菌体经离心、超声波破碎后提取包涵体，经纯化、变性、复性等处理后分装于-20℃保存备用。在本步骤中申请人经过反复验证，证实本步骤中的一些重要技术参数如 $\mathrm{OD}600\≅0.6,$ 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷最佳诱导浓度为0.4mmol/L，最佳诱导时间为3-4小时。

一种禽流感病毒的非结构蛋白基因NS1在制备禽流感鉴别诊断试剂盒中的应用。

一种禽流感病毒的鉴别诊断试剂盒，它包含以上所述的禽流感鉴别诊断抗原。

以下对本发明做进一步描述：

1)作为本发明的原始禽流感病毒是由本申请人从湖北省感染了禽流感病毒的鸡场中分离得到的，经鉴定该毒株血清型为H₉N₂，该毒株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2004年5月20日，保藏编号：CCTCC-C200410。对该毒株的非结构蛋白基因NS1进行克隆：以提取的禽流感病毒RNA为模板，通过RT-PCR扩增得到NS1基因的cDNA，经测序分析确定该NS1基因的cDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2)原核表达载体pET-28a-NS1的构建：将禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的cDNA序列定向插入到原核表达载体pET-28a的SalI和XhoI多克隆位点。

3)重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1的构建：将2)所述的原核表达载体转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，经卡那霉素抗性筛选得到阳性重组菌株。该菌株保藏在保藏在CCTCC，保藏日期：2004年5月10日，保藏编号：M204035。

4)禽流感病毒非结构蛋白基因在大肠杆菌BL21中的表达及表达蛋白的纯化方法：将3)所述的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1在LB液体培养基中培养，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，斑点杂交分析，证实该重组大肠杆菌可以特异性地表达禽流感病毒非结构蛋白NS1，表达的蛋白以包涵体的形式存在大肠杆菌BL21中，且具有免疫学活性。

5)区分禽流感野毒感染鸡与灭活疫苗免疫鸡的NS1-ELISA鉴别诊断方法的建立与鉴别诊断试剂盒的制备：经离心破碎BL21细胞，从4)中所述的包涵体中纯化NS1表达蛋白。用该蛋白包被ELISA酶标板制备ELISA抗原酶标板。用空白对照菌(Escherichia coli BL21/pET-28a)诱导产物制备血清稀释液，按照普通ELISA方法检测待检血清。根据反应后的吸光值确定阴性、可疑、阳性的判断临界值。按照如下的配方制备包被液、洗涤液、封闭液、底物液A、B、终止液：

包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，ddH₂O加至1000mL(pH9.6)。

10倍洗涤液：NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KH₂PO₄2g，Tween-20 5mL，双蒸水水加至1000mL(pH7.4)。

封闭液：0.5g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗涤液。

底物液：底物液A：0.006％H₂O₂缓冲液；底物液B：取Na₂HPO₄·12H₂O14.2g，柠檬酸10.5g，用双蒸水定容至500mL配成0.1磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5.0)，然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用

终止液(0.025％HF)：HF(40％)625μL，双蒸水100mL。

将NS1抗原酶标板、禽流感野毒感染标准阳性血清、灭活疫苗免疫标准阴性血清、包被液、洗涤液、封闭液底物缓冲液A、B、终止液组装成NS1-ELISA鉴别诊断试剂盒。

本发明的有益效果是：

1、本发明的有益效果之一是生物安全性高。本发明所涉及到的原核表达载体pET-28a是分子生物学中常用的原核表达载体，没有生物危险性，在此基础上构建的原核表达载体pET-28a-NS1也没有任何生物危险性。重组大肠杆菌BL21/pET-28a-NS1是将原核表达载体pET-28a-NS1转化至分子生物学中常用的大肠杆菌BL21感受态细胞后经卡那霉素抗性筛选获得，也不具生物危险性。本发明所用的抗原酶标板是用禽流感病毒的非结构蛋白制备的，制备过程中不涉及禽流感活病毒，因此没有禽流感活病毒逃逸、扩散的潜在危险。

2、本发明的有益效果之二是生产成本低。本发明所提供的禽流感鉴别诊断方法和诊断试剂盒所需抗原是禽流感病毒的非结构蛋白。该蛋白可以通过重组大肠杆菌BL21/pET-28a-NS1在体外得到大量的表达，适合大规模的生产。而目前常用的禽流感全病毒ELISA诊断方法和诊断试剂盒的抗原是用禽流感全病毒制备的，需要大量的增殖活病毒，所需生产设备、生产工艺和生产成本较高。

3、本发明的有益效果之三是可以提供区分禽流感野毒感染鸡和灭活疫苗免疫鸡鉴别诊断方法和鉴别诊断试剂盒。本发明ELISA鉴别诊断方法和试剂盒所用抗原以禽流感病毒非结构蛋白。由于禽流感灭活疫苗免疫未感染禽流感病毒的鸡群后，被免疫鸡体内无活病毒的增殖，故无禽流感病毒非结构蛋白NS1的产生，也就无抗非结构蛋白NS1抗体的产生，而禽流感野毒感染鸡体内有禽流感活病毒的增殖，病毒在增殖的过程中会转录翻译出非结构蛋白NS1，动物机体就会产生抗非结构蛋白NS1的抗体。因此用禽流感病毒非结构蛋白NS1，作为EL1SA酶标抗原可以与抗非结构蛋白NS1抗体发生特异性结合，从而达到鉴别禽流感诊断灭活疫苗免疫鸡和野毒感染鸡的效果。目前我国临床上使用的常规ELISA诊断方法和试剂盒其ELISA抗原是用灭活的禽流感全病毒制备的。该方法检测的是禽流感病毒的抗体。由于无论是灭活疫苗免疫鸡还是野毒感染鸡，都会产生抗禽流感病毒的抗体。因此常规的ELISA诊断方法和试剂盒不能达到本发明鉴别诊断的目的。

4、本发明的有益效果之四是提供的鉴别诊断试剂盒使用方便。本发明在提供了鉴别诊断方法的基础上，还将该方法所需的各种试剂组装成试剂盒，操作简单易行，非常适合禽流感的临床大规模检测。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明的禽流感病毒非结构蛋白NS1的cDNA序列。

序列表SEQ ID NO：3是本发明的禽流感病毒非结构蛋白NS1的cDNA序列上游引物。

序列表SEQ ID NO：4是本发明的禽流感病毒非结构蛋白NS1的cDNA序列下游引物。

图1显示本发明的主要技术路线。

图2显示了表达病毒禽流感非结构蛋白NS1基因表达载体pET-28a-NS1物理图谱及构建流程图。

图3显示了AIV H₉N₂株RT-PCR扩增NS1结果。1.阴性对照，2.RT-PCR产物，3.DL2000marker。

图4显示了重组表达质粒的酶切鉴定图。1.DL 2000marker 2.pET-28a-NS1/Sall+Xhol 3.pET-28a/Sall+Xhol 4.DL 15000marker

图5显示的是诱导表达的禽流感病毒非结构蛋白NS1的SDS-PAGE电泳图。图5(A)中：1.蛋白marker 2.pET-28a-NS1 in BL21(DE3)3.pET-28a in BL21(DE3)

图5(B)中：1.蛋白marker 2.纯化的NS1蛋白

图6显示的是诱导表达的禽流感病毒非结构蛋白NS1的斑点杂交检测结果。1.pET-28a-NS12.pET-28a

具体实施方式

实施例1

禽流感病毒非结构蛋白基因NS1cDNA序列的克隆

在9-11日龄鸡胚上接种禽流感病毒(Avian influenza vir，作为本发明的原始禽流感病毒株，是由申请人从湖北省感染了禽流感病毒的某鸡场中分离得到的，经鉴定该毒株血清型为H₉N₂，该毒株保减在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2004年5月20日，保藏编号：CCTCC-C200410。收集病毒。以禽流感病毒提取的病毒RNA为模板，通过RT-PCR扩增禽流感病毒非结构蛋白基因cDNA。RT-PCR所用引物根据NCBI报道的NSl基因组序列设计，其序列如下：

P1：5’-GCGTCGACATAATGGATTCCAAC-3’(上游引物)

P2：5’-CCACTCGAGCTATTTTGGAGAGAG-3’(下游引物)

RT-PCR反应体系为：模板RNA 8μL，2×Reaction buffer 25μL，P1、P2引物各1.0(终浓度为10pmol/L)，Taq/mix 1.0μL，加DEPC处理水至50μL。RT反应条件为45℃40分钟，99℃5分钟，5℃5分钟；然后PCR反应条件为，95℃预变性5分钟94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸1分30秒，共35个循环，最后72℃延伸10分钟。将RT-PCR产物同收、纯化，与克隆载体pMD18-T连接后，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆子(命名为pT-NS1)，小量提取质粒，经酶切鉴定后测序得到NS1的cDNA全序列(如序列表SEQ ID NO：1所示)。

实施例2

禽流感病毒非结构蛋白NS1基因原核表达载体的构建

用Sall和Xhol分别酶切pT-NS1和载体pET-28a，回收NS1基因和载体pET-28a；然后用T4 DNAligase连接，16℃水浴过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养，从中随机挑选多个单菌落，分别放入LB液体培养基中37℃培养12小时后从中提取质粒，经酶切鉴定后筛选得到阳性重组质粒，并命名为pET-28a-NS1。

实施例3

重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1和Escherichia coli BL21/pET-28a的构建

将重组表达载体pET-28a-NB1转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，涂布LB卡那霉素(Kana)平皿，挑选多个单菌落放入LB液体培养基中37℃培养8小时后分别用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达，然后进行SDS-PAGE和斑点杂交分析，从中筛选出能够在大肠杆菌BL21中诱导表达禽流感病毒非结构蛋白NS1的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1。

同时，将载体pET-28a同步转化至大肠杆菌BL21细胞，按以上方法在大肠杆菌BL21中诱导表达，筛选出无禽流感病毒非结构蛋白表达的空白对照重组大肠杆菌菌Escherichia coli BL21/pET-28a。

实施例4

最佳诱导物浓度及最佳诱导时间的确定

挑取单个重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1菌落至5mL LB培养基，加卡那霉素(Kana)至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养8小时后放4℃冰箱过夜。用含50μg/mL卡那霉素(Kana)的LB培养基将该菌液按1∶100比例稀释后，分装至5支细菌培养瓶中(5mL/瓶)，置37℃摇床培养至 $\mathrm{OD}600\≅0.6,$ 加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L，继续培养3h后，等量取样进行SDS-PAGE。根据NS1蛋白表达情况确定IPTG最佳诱导浓度为0.4mmol/L。

挑取单个重组大肠杆菌BL21/pET-28a-NS1菌落至5mL LB培养基，加至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养8小时后放4℃冰箱过夜。用含50μg/mL卡那霉素(Kana)的LB培养基将该菌液按1∶100比例稀释后，分装至5支细菌培养瓶中(5mL/瓶)，置37℃摇床培养至 $\mathrm{OD}600\≅0.6,$ 以最佳诱导物浓度(IPTG浓度为0.4mmol/L)进行诱导，每小时取样1mL，共诱导5小时后进行SDS-PAGE电泳分析，根据NS1表达情况确定最佳诱导时间为3-4小时。

实施例5

禽流感病毒非结构蛋白NS1的大量诱导表达和蛋白纯化

挑取单个重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1菌落至5mL LB培养基，加卡那霉素至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养至混浊，放4℃冰箱过夜。取该菌液2mL加入200mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，置37℃摇床培养至 ${\mathrm{OD}}_{600}\≅0.6,$ 加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓厦为0.4mmol/L，继续诱导培养3-4小时。

离心收集诱导后的菌体，用细菌裂解液重悬，-40℃速冻1小时，超声波破碎2-3分钟，至溶液为清亮透明。4℃离心后弃上清，用少许TE溶液(pH7.4)轻轻洗涤沉淀。加入原细菌培养液体积1/10的包涵体变性溶液，用吸管吹打沉淀或搅拌，静置1-2h，使其沉淀缓慢溶解。4℃12000转离心10min，弃沉淀，取上清，加入PEG4000至0.2％(W/V)、氧化型谷光苷肽至1mM、还原性谷光苷肽2mM，静置至少30min后，转至处理好的透析袋中，于TE溶液(pH7.4)或PBS溶液(pH7.4)中透析2-3d，取出立即使用或分装至1.5mL管，-20℃或-40℃保存备用

细菌裂解液配方：Tris-Cl 50mM/L、EDTA 0.5mM/L、NaCl 50mM/L、Glycerol 5％(W/V)、DTT 0.5mM/L(使用前加入)。

包涵体变性溶液：细菌裂解液+SKL(十二脘基肌胺酸钠，购自武汉凌飞科技公司)0.3％(W/V)。

实施例6

禽流感病毒NS1-ELISA鉴别诊断试剂盒构成及制备方法

1、NS1-ELISA试剂盒包括：

1.1包被抗原的微孔板                 (8孔×12条×2块)

1.2阴、阳性对照血清各1管            (0.5ml/管)

1.3抗鸡IgG-HRP结合物    1瓶         (25ml/瓶)

1.4 10倍洗涤液浓缩液    1瓶         (50ml/瓶)

1.5底物A液、B液         各1瓶       (12ml/瓶)

1.6终止液               1瓶         (12ml/瓶)

1.7血清稀释液           1瓶         (50ml/瓶)

2、NS1-ELISA相关溶液配方

包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，ddH₂O加至1000mL(pH9.6)。10倍洗涤液：NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄·12H₂O 29g，KH₂PO₄2g，Tween-205mL，双蒸水加至1000mL(pH7.4)。

封闭液：0.5g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗涤液。

底物液：底物液A：0.006％H₂O₂缓冲液；底物液B：取Na₂HPO₄·12H₂O14.2g，柠檬酸10.5g，用双蒸水定容至500mL配成0.1mL磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5.0)，然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用

终止液(0.025％HF)：HF(40％)625μL，双蒸水100mL。

3、NS1-ELISA抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度采取方阵滴定的方法来确定。试验结果表明抗原最佳包被浓度为1∶80，即0.175μg/mL，血清最佳稀释度为1∶40，即0.25μL/孔。(见表1、2所示)。

表1用本发明的试剂盒检测禽流感阳性血清结果

	血清稀释度	抗原
										1∶10	1∶20	1∶40	1∶80	1∶160	1∶320	1∶640	1∶1280
		阳性血清结果	1∶201∶401∶801∶1601∶3201∶640	1.8001.6601.2480.8750.7620.560	1.6851.3281.0650.8060.5460.412	1.6421.3491.0040.6770.4310.330	1.1591.0360.6930.4560.3320.205	0.8640.6340.5120.3240.2130.152	0.8600.5520.3480.1830.1380.117									0.5770.4340.2770.1230.1190.090	0.6530.3420.1990.1120.0860.076

表2用本发明的试剂盒检测禽流感阴性血清结果

		抗原
										1∶10	1∶20	1∶40	1∶80	1∶160	1∶320	1∶640	1∶1280
			1∶201∶401∶80	0.5100.3630.322	0.4480.3020.234	0.3570.2550.186	0.2790.2010.148	0.1830.1180.111	0.1450.0960.075									0.1090.0840.077	0.1090.0850.086

阴性血清结果

1∶1601∶3201∶640

0.2380.2370.208

0.2170.1650.173

0.1570.1620.122

0.1400.1190.111

0.1060.1000.094

0.0770.0750.060

0.0740.0680.062

0.0950.0830.065

抗原酶标板的制备：将上述实施例5制备的NS1蛋白用所说的包被液按1∶80稀释，按100μL/孔加入到酶标板中，置37℃1小时后放入4℃冰箱过夜；弃包被液，加入所说的封闭液(150μL/孔)于37℃封闭1小时；弃封闭液，加保护剂(150μL/孔)，37℃1小时，4℃8小时，弃保护剂，自然风干；将酶标板放入专用锡泊袋，加一小袋干燥剂，抽真空，热压封口。

4、血清稀释液的制备：将空白对照菌(BL21/pET-28a)作同步诱导，离心收集菌体，TEN溶液(pH7.4)洗涤1次，加入原培养物体积1/10的PBS溶液(pH7.4)重悬，-40℃速冻1h，超声波破碎至透明(2-3min)；取该溶液20mL，加入封闭液80mL，即为血清稀释液。

实施例7

禽流感病毒NS1-ELISA检测步骤及判断标准

操作步骤

1)从4℃冰箱中取出试剂盒，平衡各组分至室温。

2)取预包被的微孔条板(根据标本多少，可拆开分次使用)，用洗涤液洗板3次，200μl/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次拍干。除空白对照孔外，每孔加入以样品稀释液1∶40稀释的待检样品，每孔加100μl，同样1∶40稀释对照血清，设阳性对照2孔，阴性对照3孔，空白孔不加，轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37℃温育30分钟。

3)甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，200μl/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次拍干。

4)每孔加酶标二抗100μl，置37℃温育30分钟。

5)洗涤4次，200μl/孔，每次静置3分钟倒掉，最后一次拍干。

6)每孔加底物A液、B液各1滴(50μl)，室温避光显色15分钟。

7)每孔加终止液1滴(50μl)，15分钟内测定结果。

NS1-ELISA结果判定标准的确定：采集经禽流感(H₉N₂)亚型灭活苗免疫，经HI检测为阳性的94份鸡血清，进行NS1-ELISA检测全为阴性，计算该94份血清的平均值x，标准偏差SD，阴阳界限计算公式x+2SD。计算得平均值x等于0.192，SD等于0.088，求得阴阳界限为0.369。

结果判定：以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD₆₃₀值，OD₆₃₀≥0.369判为阳性，疑为禽流感病毒感染；OD₆₃₀＜0.369判为阴性。

实施例8

本发明的应用效果举例

本例中所指的NS1-ELISA检测方法参照实施例7所述的操作步骤，其检测结果如表3，表4和表5所示。

1.分别将鸡新城疫阳性血清、鸡马立克氏病阳性血清、鸡传染性支气管炎阳性血清、鸡传染性喉气管炎阳性血清、鸡传染性法氏囊阳性血清、鸡腺病毒I型阳性血清、鸡腺病毒III型阳性血清、鸡副流感阳性血清作1∶40稀释，用NS1-ELISA检测，同时设阳性、阴性对照，结果(表3)表明与上述阳性血清无交叉反应。

表3禽流感NS1-ELISA交叉反应的检测

	血清编号								阳性对照	阴性对照
											1	2	3	4	5	6	7	8
	OD值	0.217	0.206	0.097	0.179	0.134	0.137	0.114											0.112	1.104	0.196

注：1鸡马立克氏病阳性血清，2鸡腺病毒I型阳性血清，3鸡腺病毒III型阳性血清，4鸡副流感阳性血清，5鸡传染性支气管炎阳性血清，6鸡传染性喉气管炎阳性血清，7鸡新城疫阳性血清，8鸡传染性法氏囊阳性血清

2.为验证试剂盒的敏感性和特异性，选择用国内常用的检测方法血凝抑制试验(HI)检测为阴性的健康鸡群进行免疫试验和攻毒试验，抗体效价在第5周达峰值，检测结果如下表4所述。

表4禽流感NS1-ELISA的诊断特异性与敏感性试验

血清类型	血清数量(份)	NS1-ELISA结果阳性(阳性率％)	血凝抑制试验(HI)结果阳性(阳性率％)
				AIV灭活苗免疫鸡血清AIV攻毒鸡血清	7227	4(5.6)26(96.3)	69(95.8)26(96.3)

3.NS1-ELISA临床检测结果。

表5禽流感NS1-ELlSA临床检测结果

检测鸡来源地	血清份数	阳性血清份数	阳性率(％)
				广东深圳湖北安陆湖北新洲合计	40317456633	2259034348	55.851.760.755.0

试验结果显示，利用禽流感病毒非结构蛋白NS1基因表达抗原，建立的ELISA检测方法可以快速、准确地区分禽流感免疫鸡与野毒感染鸡。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。

禽流感病毒非结构蛋白基因NS1序列1-3(SEQUENCE LISTING)

<110>华中农业大学

<120>一种禽流感病毒非结构蛋白基因NS1及其制备方法与应用

<130>

<141>2004-05-18

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>627

<212>DNA

<213>鸡(Gallus gallus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(627)

<223>

<400>1

act gtg tca agc ttc cag gta gac tgc ttt ctt tgg cat gtc cgc aaa    48

Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp His Val Arg Lys

1               5                   10                  15

cga ttt gca gac caa gaa ctg ggt gat gcc cca ttt ctg gac cgg ctt    96

Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe Leu Asp Arg Leu

            20                  25                  30

cgc cga gat cag aag tcc ctg aga gga aga ggc agc act ctt ggt ctg    144

Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu

        35                  40                  45

gac atc aga acc gcc act cat gaa gga aag cat ata gtg gag cgg atc    192

Asp Ile Arg Thr Ala Thr His Glu Gly Lys His Ile Val Glu Arg Ile

    50                  55                  60

ctg gag gaa gag tca gat gag gca ctt aaa atg acc att gct tca gtg    240

Leu Glu Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr Ile Ala Ser Va1

65                  70                  75                  80

cca gct cca cgc tac cta act gac atg act ctt gaa gaa atg tca agg    288

Pro Ala Pro Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg

                85                  90                  95

gat tgg tta atg ctc att ccc aaa cag aaa gtg aca ggg tcc ctt tgc    336

Asp Trp Leu Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Thr Gly Ser Leu Cys

            100                 105                 110

att aga atg gac caa gca ata gtg gat aaa acc atc aca ctg aaa gca    384

Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Val Asp Lys Thr Ile Thr Leu Lys Ala

        115                 120                 125

aac ttc agt gtg att ttc aat cga ctg gaa gct cta ata tta ctt aga    432

Asn Phe Ser Val Ile Phe Asn Arg Leu Glu Ala Leu Ile Leu Leu Arg

    130                 135                 140

gct ttt aca gac gaa gga gca ata gtg ggc gaa atc tca cca tta cct    480

Ala Phe Thr Asp Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile Ser Pro Leu Pro

145                 150                 155                 160

tct ctt cca gga cat act gat gag gat gtc aaa aat gca att ggg atc    528

Ser Leu Pro Gly His Thr Asp Glu Asp Val Lys Asn Ala Ile Gly Ile

                165                 170                 175

ctc atc gga gga ttt gaa tgg aat gat aac aca gtt cga gtc tct gaa    576

Leu Ile Gly Gly Phe Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val Arg Val Ser Glu

        180                 185                 190

act cta cag aga ttc gct tgg aga agc agc gat gag gat ggg aga cct    624

Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asp Glu Asp Gly Arg Pro

    195                 200                 205

cca                                                                627

Pro

<210>2

<211>209

<212>PRT

<213>鸡(Gallus gallus)

<400>2

Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp His Val Arg Lys

1               5                   10                  15

Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe Leu Asp Arg Leu

            20                  25                  30

Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser Thr Leu Gly Leu

        35                  40                  45

Asp Ile Arg Thr Ala Thr His Glu Gly Lys His Ile Val Glu Arg Ile

    50                  55                  60

Leu Glu Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr Ile Ala Ser Val

65                  70                  75                  80

Pro Ala Pro Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Glu Glu Met Ser Arg

                85                  90                  95

Asp Trp Leu Met Leu Ile Pro Lys Gln Lys Val Thr Gly Ser Leu Cys

            100                 105                 110

Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Val Asp Lys Thr Ile Thr Leu Lys Ala

        115                 120                 125

Asn Phe Ser Val Ile Phe Asn Arg Leu Glu Ala Leu Ile Leu Leu Arg

    130                 135                 140

Ala Phe Thr Asp Glu Gly Ala Ile Val Gly Glu Ile Ser Pro Leu Pro

145                 150                 155                 160

Ser Leu Pro Gly His Thr Asp Glu Asp Val Lys Asn Ala Ile Gly Ile

                165                 170                 175

Leu lie Gly Gly Phe Glu Trp Asn Asp Asn Thr Val Arg Val Ser Glu

            180                 185                 190

Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Asp Glu Asp Gly Arg Pro

        195                 200                 205

Pro

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>鸡(Gallus gallus)

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(23)

<223>

<400>3

gcgtcgacat aatggattcc aac                                        23

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>鸡(Gallus gallus)

<220>

<221>5’UTR

<222>(1)..(24)

<223>

<400>4

ccactcgagc tattttggag agag                                       24

Claims (2)

1、一种能够特异性表达禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET-28a-NS1，其保藏号为CCTCC NO：M204035。

2、权利要求1所述的重组大肠杆菌在制备禽流感鉴别诊断试剂盒中的应用

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