CN108130340B - 表达鸭源禽流感病毒ns1蛋白的方法以及该方法的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种表达鸭源禽流感病毒NS1蛋白的方法以及该方法的应用，该方法主要包括以下步骤：(1)四膜虫表达载体pD5H8‑NS1的构建；(2)四膜虫重组细胞株的构建及筛选；(3)NS1蛋白诱导表达及鉴定；所述的鸭源禽流感病毒NS1蛋白表达方法的应用，用于禽流感病毒鉴别诊断试剂盒的制备以及疫苗的制备中，本发明选用四膜虫表达系统作为鸭源禽流感病毒NS1蛋白的表达系统，能够高效、稳定的表达鸭源禽流感病毒NS1蛋白，本发明选用的四膜虫细胞表达系统所用的转基因表达载体pD5H8含高效金属硫蛋白基因MTT5启动子，为外源基因在四膜虫体内高效表达提供重要保证。

Description

表达鸭源禽流感病毒NS1蛋白的方法以及该方法的应用
技术领域
本发明涉及一种表达鸭源禽流感病毒NS1蛋白的方法以及该方法的应用。
背景技术
禽流感(Avian Influenza)是由A型流感病毒引起的一种禽类(家禽和野禽)的感染和/或疾病综合征，该病毒由8个基因片段构成，其中最短的一个基因为病毒非结构基因(non-structural gene，NS)。病毒复制过程中，NS基因表达两个重要的功能蛋白，分别是26kDa的NS1蛋白和14kDa的NEP(nuclear export protein，NEP)蛋白。其中NS1蛋白是种多功能蛋白，具有两大典型结构域，分别是RNA结合结构域(RNA-binding domain，RBD))和效应结合结构域(an effector domain,ED)，是决定AIV对被感染细胞破坏力的关键因素，影响AIV的复制、致病性、毒力和宿主范围。NS1蛋白的临床应用主要集中在禽流感的预防和诊断中，由于流感毒株容易变异，给禽流感预防和监控带来了很大的困难，因此，生产中迫切需要做好对禽流感疫情早发现、早诊断、早消灭，从而更好地控制禽流感的发生和流行。
目前表达系统主要包括动物细胞表达系统、酵母细胞表达系统和大肠杆菌等表达系统。动物细胞表达系统表达的蛋白具有天然的生物学活性和功能，但操作繁琐，且培养的成本高，不适合大规模培养。酵母细胞虽然操作简单、培养成本也较低，但破壁困难、分泌效率低，容易影响到下游蛋白的纯化。大肠杆菌表达的蛋白，缺乏转录和翻译后加工修饰，其表达的蛋白活性不高或没有活性，从而受到使用的限制。总之，表达系统的选择在目的产物的制备中占有举足轻重的地位。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、稳定表达鸭源禽流感病毒NS1蛋白的方法以及该方法的应用。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种鸭源禽流感病毒NS1蛋白表达的方法，它包括以下步骤：
(1)四膜虫表达载体pD5H8-NS1的构建：将H9N2亚型禽流感病毒NS1基因密码子优化后与四膜虫金属硫蛋白基因MTT5启动子序列以及终止子序列融合，构建到pD5H8穿梭载体，得阳性质粒pD5H8-NS1；
(2)四膜虫重组细胞株的构建及筛选：通过基因枪将步骤(1)所得的阳性质粒pD5H8-NS1转入饥饿处理的生殖期四膜虫株中进行基因重组，通过巴龙霉素梯度筛选获得稳定的重组四膜虫株；
(3)NS1蛋白诱导表达及鉴定：利用氯化镉培养步骤(2)所得的重组四膜虫株，诱导NS1蛋白基因表达；之后提取表达蛋白并鉴定分析表达蛋白的正确性。
所述的鸭源禽流感病毒NS1蛋白表达方法的应用，用于禽流感病毒鉴别诊断试剂盒的制备以及疫苗的制备。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：本发明选用四膜虫表达系统作为鸭源禽流感病毒NS1蛋白的表达系统，能够高效、稳定的表达鸭源禽流感病毒NS1蛋白。
本发明选用的四膜虫细胞表达系统所用的转基因表达载体pD5H8含高效金属硫蛋白基因MTT5启动子，为外源基因在四膜虫体内高效表达提供重要保证；
目前尚未见关于四膜虫表达系统表达禽源禽流感病毒NS1蛋白的报道。本发明首次将禽流感NS1基因构建到pD5H8穿梭载体，通过基因枪转化法将重组质粒转入四膜虫工程株，并实现与嗜热四膜虫同源重组，经巴龙霉素梯度筛选和单克隆后获得稳定的重组细胞株。最后在镉诱导下启动NS1基因大量稳定表达，为今后鉴别诊断试剂盒、疫苗研发奠定了良好的基础。
附图说明
图1是本发明pTIEV4盒式表达结构图。
图2是构建的NS1基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图3是PCR鉴定重组质粒pD5H8-NS1扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图4是NotⅠ酶切鉴定重组质粒pD5H8-NS1的琼脂糖凝胶电泳图。
图5是接合生殖期四膜虫核的发育结果示意图。
图6是目标蛋白胶体层生成状态示意图。
图7是SDS-PAGE和Western-blot鉴定NS1蛋白的鉴定结果示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
一种鸭源禽流感病毒NS1蛋白表达的方法，它包括以下步骤：
(1)四膜虫表达载体pD5H8-NS1的构建：将H9N2亚型禽流感病毒NS1基因密码子优化后与四膜虫金属硫蛋白基因MTT5启动子序列以及终止子序列融合，构建到pD5H8穿梭载体，得阳性质粒pD5H8-NS1；
(2)四膜虫重组细胞株的构建及筛选：通过基因枪将步骤(1)所得的阳性质粒pD5H8-NS1转入饥饿处理的生殖期四膜虫株中进行基因重组，通过巴龙霉素梯度筛选获得稳定的重组四膜虫株；
(3)NS1蛋白诱导表达及鉴定：利用氯化镉培养步骤(2)所得的重组四膜虫株，诱导NS1蛋白基因表达；之后提取表达蛋白并鉴定分析表达蛋白的正确性。其中，鉴定表达蛋白的方法为SDS-PAGE、Western blot以及LC-MS/MS中的一种或几种的结合。
本发明选用的四膜虫表达系统表达的蛋白像哺乳动物表达系统一样具有天然的生物学活性和功能且可获得大量抗原性、免疫原性较好的，与天然蛋白功能相似的可溶性重组蛋白，对外源蛋白进行转录后加工包括糖基化、酰基化、正确的信号肽切割以及正确折叠的作用，因此，该表达系统是表达有生物活性蛋白的理想载体，另外，嗜热四膜虫同时具有易于生长(2-2.5h可繁殖一代)、成本低(有限化学培养基便可培养，无需肽和血清组分)、操作简便等诸多优点。
本发明鸭源禽流感病毒NS1蛋白表达的方法中，步骤(1)的具体操作方法为：
1)提取病毒RNA；
2)NS1基因cDNA的制备：将步骤1)提取的病毒RNA通过反转录引物序列5’-AGCAAAAGCAGG-3’反转录为cDNA；
3)NS1基因的PCR扩增：
以FQNS1F-BamHI和FQNS1R-XhoI作为引物，以步骤2)所得的cDNA为模板，PCR扩增NS1基因；其中，所述FQNS1F-BamHI以及FQNS1R-XhoI的序列如下：
FQNS1F-BamHI：GGATCCATGGACTCCAACACTGTGTCAAG，其中，下划线部分为BamHI限制性酶切位点；
FQNS1R-XhoI：CTCGAGTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTATCGTCGT CGTCTTTATAATCCTTTGGAGAGAGTGGAGGTC，其中，下划线部分为XhoI限制性酶切位点；
4)TOPO克隆阳性质粒的构建及密码子优化：将步骤3)所得的PCR扩增产物经纯化回收后，利用在线软件分析NS1基因与四膜虫密码子使用偏好性，再对NS1基因进行密码子优化，优化后NS1基因5’端加上BamHI酶切位点和信号肽、3’端加上组氨酸标签和XhoI酶切位点，总长为735bp，将优化后的合成序列构建到TOPO克隆载体，形成TOPO克隆阳性质粒；
5)构建PTIEV4-NS1阳性质粒：步骤4)所得的TOPO克隆阳性质粒通过双酶切、连接、转化，构建到PTIEV4载体上，得PTIEV4-NS1阳性质粒；
6)构建四膜虫表达载体pD5H8-NS1：将PTIEV4-NS1阳性质粒和穿梭载体pD5H8分别通过NotI酶切，然后连接、转化，得阳性质粒pD5H8-NS1；
步骤3)所述的PCR扩增的反应体系为：在50μL体系中含有以下成分：
Figure BDA0001571485540000041
步骤3)所述的PCR扩增的反应条件为：98℃预变性30s，按98℃12s，55℃25s，72℃60s，进行35个循环，最后72℃延伸10min；
步骤5)的具体操作方法为：
将步骤4)所得的TOPO克隆阳性质粒与PTEIV4载体通过BamHI和XhoI双酶切，酶切产物经回收后，目的基因和载体按摩尔比6:1混合，16℃连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，在带氨苄的LB固体培基上培养16h，挑选单菌落扩大培养，用载体上设计的引物PTIEV4-1206F和引物PTIEV4-1496R进行PCR鉴定单菌落，提取重组质粒即PTIEV4-NS1阳性质粒，对PTIEV4-NS1阳性质粒进行测序验证；
其中，所述引物PTIEV4-1206F以及引物PTIEV4-1496R的序列如下：
PTIEV4-1206F：AATCATGAGTTCACCATTTAAAC，
PTIEV4-1496R：AGCAATAACACCTTGAAGCAAAG。
步骤6)的具体操作方法为：
将PTIEV4-NS1阳性质粒与穿梭载体pD5H8分别通过NotI酶切；将酶切后的穿梭载体pD5H8去磷酸化；
接着，将酶切后的PTIEV4-NS1阳性质粒与去磷酸化后的穿梭载体pD5H8在16℃连接过夜，连接产物电转化至大肠杆菌DH5α电转化感受态细胞，2mm电击杯电击参数为：300V，25μF，50Ω；电转后取50μL加入到含100μg/ml氨苄的LB固体培养基上培养16h；挑选单菌落、用穿梭载体pD5H8上的引物pD5H8-12476F以及引物pD5H8-13086R进行PCR验证，同时NotⅠ酶切鉴定重组子，最后测序验证NS1基因插入方向是否正确，并制备阳性质粒pD5H8-NS1；
其中，所述引物pD5H8-12476F以及引物pD5H8-13086R的序列如下：
pD5H8-12476F：AACATGGAACGGGTATT，
pD5H8-13086R：CTAAGCTCATTCTGCGTAAA。
步骤6)中，酶切后的穿梭载体pD5H8的去磷酸化反应体系为：在50μL体系中含有以下成分：
Figure BDA0001571485540000051
步骤6)中，酶切后的穿梭载体pD5H8的去磷酸化反应条件为：在37℃下反应1h。
步骤(2)的具体操作步骤为：
在100mL NEFF培养基(0.25％蛋白胨+0.25％酵母提取液+0.55％葡萄糖+33μMFeCl3)中，分别接种200μL CU427和CU428四膜虫株，30℃、80rpm培养浓度到对数生长期5×105个/mL；分别将两种四膜虫株饥饿培养24h后轻柔混合均匀，静置培养10-11h，观察虫株配对率及核的发育，在显微镜下计算虫子的配对率，达到80％以上可用于基因枪转化；取阳性质粒pD5H8-NS1 4.5μg加入到30μL浓度为50mg/mL金颗粒中，轻涡旋；同时将虫液800×g离心2min后重悬均匀、涂布在湿润的滤纸中央，待真空度稳定后轰击，迅速将转化后四膜虫转入NEFF培液，置30℃避光静置培养，24h后加入巴龙霉素100μg/mL选择培养，并每隔48h把巴龙霉素浓度提高到200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL，梯度筛选活力好的阳性虫株单克隆培养至对数生长期约5×105个/mL，提取全细胞基因组DNA进行PCR鉴定，最后在无菌环境下，将四膜虫移至50mL灭菌过的离心管中。1000×g离心10min，弃上清，用50mL灭菌的10mM Tris-HCl pH7.4重悬，移至250mL三角瓶中，30℃静置饥饿2-3天；将四膜虫1000×g离心10min，去上清，浓缩至1-2mL，用4倍体积的含10％DMSO的10mM Tris-HCl(pH 7.4)重悬，吸至冻存管中，每管300μL；室温静置30min，转到程序速冻降温盒中，-80℃冰箱过夜；并移至液氮中，冻存阳性虫株即重组四膜虫株。
步骤(3)的具体操作方法为：
加入终浓度15μg/mL的氯化镉培养步骤(2)所得的重组四膜虫株16h，诱导外源基因表达；之后提取表达蛋白，其中，表达蛋白的提取方法为：10000×g离心5min收集虫体，用预冷的Buffer A(40mM Hepes；1mM CaCl2pH7.4)重悬虫体，其中，每50ml的虫液用1ml的bufferA重悬；之后加入终浓度为20μg/mL PMSF及等体积600mM NaCl，5000×g离心3min，吸出中间乳白色胶体层，重悬于10倍体积的含PMSF的Buffer A中，5000×g离心3min；接着将离心所得的沉淀胶体用于SDS-PAGE和Western blot分析鉴定分析表达蛋白的正确性；
采用Mini-Protein cell系统进行变性还原条件下的凝胶电泳SDS-PAGE；45mA转印2h，3％BSA的TBS封闭过夜，次日加入兔抗阳性血清，室温孵育3h，羊抗兔AP酶标抗体，室温孵育1h，BCIP/NBT显色；对表达的蛋白进行LC-MS/MS质谱鉴定，将SDS-PAGE电泳后的蛋白切胶回收，胰蛋白酶酶解成肽段上机检测，同时对结果进行数据库检索；
步骤(3)中，表达蛋白的提取方法相比传统的提取方法具有操作简单、提取效率高且节约试验成本的优点。
具体实施例如下：
1.1材料
鸭源禽流感病毒A/duck/Fujian/FQ2/2007(H9N2)毒株由本实验室于2007年从福建分离保存(GenBank登录号JF916709)。病毒分离的方法具体如下：采集病鸡的气管、肺、肾组织于灭菌的玻璃研磨器匀浆，用PBS配成100g/L的悬液，冻融两次，2500×g离心10min，取上清液经0.22μm滤器过滤除菌备用。将处理好的病料组织悬液经尿囊腔接种l0日龄SPF鸡胚，每枚0.2ml，37℃孵育，剔除24h内死亡的鸡胚，每日观察2次，无菌收集48～96h的尿囊液，连传3代，无菌回收胚液，-30℃保存备用。兔抗A/duck/Fujian/FQ2/2007(H9N2)血清、大肠杆菌DH5α感受态细胞由本实验室保存。嗜热四膜虫CU427株与CU428株系、穿梭载体pD5H8均由康奈尔大学Theodore G.Clark教授馈赠。
1.2仪器和试剂
凝胶成像分析系统(BIO-RAD)、PCR仪(Eppendorf)，PDS-1000/He台式基因枪(Bio-Rad)。Trizol购自Invitrogen公司，TOPO克隆试剂盒购自Transgene公司，质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒和去内毒素质粒提取试剂盒均购自美国Omega公司。子弹金颗粒(Bio-RadS550d)。限制性内切酶购自NEB公司。AMV反转录酶和Ex Taq DNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。DAPI购自碧云天公司。
1.3引物设计
A/duck/Fujian/FQ2/2007(H9N2)株禽流感病毒NS基因特异引物具体见表1。反转录引物序列为5’-AGCAAAAGCAGG-3’。反向引物中加入四膜虫偏好的终止密码子TGA。NS基因、中间载体PTIEV4和表达载体pD5H8特异性验证引物具体如下：
表1本发明所涉及的引物序列
Figure BDA0001571485540000081
其中，引物FQNS1F-BamHI含有BamH I酶切位点，引物FQNS1R-XhoI含有Xho I酶切位点。上述引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。
1.4毒株NS基因扩增及密码子优化
病毒RNA提取和cDNA制备：
取250μL的尿囊液毒加入Trizol 1mL，混匀后室温静置5min，加入200μL氯仿，振荡混匀，12500×g离心15min，取上清加入500μL异丙醇，室温放置10min后12500×g离心10min，弃上清；加入75％乙醇除盐，12500×g离心5分钟，导致滤纸上吸掉多余液体，干燥后加入20μL DEPC水，备用。以提取的RNA为模板，按TaKaRaAMV反转录试剂盒说明书合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应。PCR扩增以cDNA为模板，反应体系为50μL，反应体系为：10×Phusion HF Buffer10μL，dNTP mixture(2.5nmol/L)1μL，Phusion DNA Polymerase 0.5μL，引物FQNS1F-BamHI(20μM)以及引物FQNS1R-XhoI(20μM)各1μL，模板cDNA1.5μL，ddH2O 35μL。反应条件如下：98℃预变性30s，按98℃12s，55℃25s，72℃60s，进行35个循环，最后72℃延伸10min。取5μL产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
NS基因构建到Topo克隆载体及密码子优化：
切胶回收目的基因片段，连接Topo载体，反应体系为5μL，PCR胶回收产物100ng、pEASY Blunt Zero Vector 1μL，加ddH2O到5μL。室温作用15min，然后添加2.5μL到感受态DH5α细胞，轻柔混匀。冰浴40s，42℃热激45s，快速冰浴5min。最后取50μL加入到含100μg/mL氨苄的LB固体培养基上培养16h。挑选阳性菌落，进行菌液PCR鉴定后，提取阳性质粒DNA，送大连宝生物有限公司测序验证。在线软件http://gcua.schoedl.de/和http:// www.kazusa.or.jp/codon/分析NS1基因与四膜虫密码子使用偏好性，再对NS1基因进行密码子优化，优化后NS1基因5’端加上BamHI酶切位点和信号肽、3’端加上组氨酸标签和XhoI酶切位点，总长为735bp，由宝生物工程(大连)有限公司合成，将合成序列构建到TOPO克隆载体，反应体系为5μL，PCR胶回收产物100ng、pEASY Blunt Zero Vector 1μL，加ddH2O到5μL。室温作用15min，然后取2.5μL加入到感受态DH5α细胞，轻柔混匀。冰浴40s，42℃热激45s，快速冰浴5min。最后取50μL加入到含100μg/ml氨苄的LB固体培养基上培养16h。挑选单菌落，进行菌液PCR鉴定后，提取阳性质粒DNA，送大连宝生物有限公司测序进一步验证。
结果与分析：
A/duck/Fujian/FQ2/2007(H9N2)毒株NS1基因总长度为654bp，编码217个氨基酸。本研究仅选用UGA作为终止密码子，已有研究证实携带UAA和UAG三联体作为终止密码子的外源基因不被正确地表达。密码子优化前后序列对比如表2。
表2NS1基因序列密码子优化
Figure BDA0001571485540000091
Figure BDA0001571485540000101
其中：基因序列不含起始密码子ATG和终止密码子TGA；下划线部分为优化后的密码子。
1.5四膜虫表达载体pD5H8-NS1构建
将TOPO克隆的阳性质粒和PTEIV4载体通过BamHI和XhoI双酶切、酶切产物回收后，目的基因和载体按摩尔比6:1混合，16℃连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。在带氨苄的LB固体培基上培养16h，挑选单菌落扩大培养，用载体上带的通用引物PTIEV4-1206F和PTIEV4-1496R进行PCR鉴定单菌落，阳性克隆送测序验证。PTIEV4载体盒式表达结构见图1。
首先，将PTIEV4-NS1阳性质粒和穿梭载体pD5H8分别通过NotI酶切，同时为了避免载体自连，将酶切后穿梭载体pD5H8去磷酸化，反应体系如下：10×CIAP Buffer 5μL，pD5H8载体片段20μL，CIAP 1μL，补ddH2O到50μL，37℃反应1h。16℃连接过夜，连接产物电转化至大肠杆菌DH5α电转化感受态细胞，2mm电击杯电击参数为：300V，25μF，50Ω。电转后取50μL加入到含100μg/ml氨苄的LB固体培养基上培养16h。挑选单菌落、选用穿梭载体pD5H8上设计的引物pD5H8-12476F和pD5H8-13086R进行PCR验证(见图3)、同时NotⅠ酶切(见图4)鉴定重组子，最后测序验证NS1基因插入方向是否正确，并制备阳性质粒pD5H8-NS1。
结果与分析：
从图2、图3、图4可知：构建的NS1基因5’端加上信号肽和3’端加上组氨酸标签，总长为735bp；PCR鉴定重组质粒pD5H8-NS1克隆为阳性克隆，扩增片段大小为5577bp；NotⅠ酶切为双条带，其中，一条为pD5H8载体骨架片段(12899bp)，另一条为插入的盒式表达框片段大小为4966bp，表明构建的载体正确。其中，在图2中，M为DL10000，1为NS1基因；在图3中，M为DL10000，1为空白对照，2为pD5H8空载质粒(611bp)，3为pD5H8-NS1阳性质粒；在图4中，M为DL10000，1为NotⅠ酶切鉴定重组质粒。
1.6四膜虫重组细胞株的构建及筛选
在100mL NEFF培养基(0.25％蛋白胨+0.25％酵母提取液+0.55％葡萄糖+33μMFeCl3)中，分别接种200μL CU427和CU428四膜虫株，30℃、80rpm培养浓度到对数生长期5×105个/mL；分别将两种四膜虫株饥饿培养24h后轻柔混合均匀，静置培养10-11h，观察虫株配对率及核的发育，在显微镜下计算虫子的配对率，达到80％以上可用于基因枪转化；取阳性质粒pD5H8-NS1 4.5μg加入到30μL浓度为50mg/mL金颗粒中，轻涡旋；同时将虫液800×g离心2min后重悬均匀、涂布在湿润的滤纸中央，待真空度稳定后轰击，迅速将转化后四膜虫转入NEFF培液，置30℃避光静置培养，24h后加入巴龙霉素100μg/mL选择培养，并每隔48h把巴龙霉素浓度提高到200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1000μg/mL，梯度筛选活力好的阳性虫株单克隆培养至对数生长期约5×105个/mL，提取全细胞基因组DNA进行PCR鉴定，最后在无菌环境下，将四膜虫移至50mL灭菌过的离心管中。1000×g离心10min，弃上清，用50mL灭菌的10mM Tris-HCl pH7.4重悬，移至250mL三角瓶中，30℃静置饥饿2-3天；将四膜虫1000×g离心10min，去上清，浓缩至1-2mL，用4倍体积的含10％DMSO的10mM Tris-HCl(pH 7.4)重悬，吸至冻存管中，每管300μL；室温静置30min，转到程序速冻降温盒中，-80℃冰箱过夜；并移至液氮中，冻存阳性虫株即重组四膜虫株。
结果与分析：
配对约4h后取100μL虫液，加50μL DAPI和多聚甲醛混合液，在显微镜下观察虫子活力并计算虫子的配对率，当虫株配对率达到80％以上且大核原基形成后可用于后续实验。配对11h后在激光共聚焦荧光显微镜下观察核的发育(见图5)，配对四膜虫株体内小核数量增多(2-4个/单体)、大核原基形成，说明供体株系(rDNA复制能力强)和宿主株系已发生同源重组，可用于基因枪转化实验。其中在图5中，左列为明场，中列为DAPI染色，右列为明场与DAPI染色合并图。上方三幅图为接合生殖4h四膜虫株，下方三幅图为接合生殖11h四膜虫株。其中白色空心箭头标注的是小核，标尺为10μm。
1.7NS1蛋白诱导表达及鉴定
加入终浓度15μg/mL的氯化镉培养重组四膜虫株16h，诱导外源基因表达。10000×g离心5min收集虫体，用预冷的Buffer A(40mM Hepes，1mM CaCl2pH7.4)重悬虫体，其中，每50ml的虫液用1ml的bufferA重悬；之后加入终浓度为20μg/mL PMSF及等体积600mM NaCl，5000×g离心3min，小心吸出中间乳白色胶体层，重悬于10倍体积的含PMSF的Buffer A中，5000×g离心3min沉淀胶体用于SDS-PAGE和Western blot分析。
采用Mini-Protein cell系统(Bio-Rad)进行变性还原条件下的凝胶电泳SDS-PAGE。45mA转印2h，3％BSA的TBS封闭过夜，次日加入兔抗阳性血清(1:100)，室温孵育3h，羊抗兔AP酶标抗体(1:20000)，室温孵育1h，BCIP/NBT显色。对表达的蛋白进行LC-MS/MS质谱鉴定，将SDS-PAGE电泳后的蛋白切胶回收，胰蛋白酶酶解成肽段上机检测，同时对结果进行数据库检索。
结果与分析：
SDS-PAGE分析，诱导后的阳性重组子虫株在30kDa的位置有一条丰度很高的条带(如图7)；目的蛋白主要集中在中间的胶体层中，上清没有目的蛋白，沉淀中有些微量目的蛋白(如图6、7所示)。Western-blot也进一步证实在30kDa左右有一条与兔抗特异反应的条带(如图7所示)。为保证结果可靠性，SDS-PAGE后将目标蛋白切胶回收，进行LC-MS/MS质谱鉴定，确定表达的蛋白为禽流感A/duck/Fujian/FQ2/2007(H9N2)毒株NS1蛋白。
其中，在图6中最上层为上清、中间层为蛋白胶体层、最下层为沉淀；在图7中，1为蛋白胶体层，2为上清，3为沉淀，4为Western blot验证表达产物。
1.8间接ELISA检测方法的建立
将表达的蛋白用PBS稀释至5μg/mL，包被酶标板，每孔50μL，一抗为阳性兔抗血清(1:100稀释)，二抗为羊抗鼠HRP酶标抗体(1:5000稀释)，每孔50μL，室温反应60min，同上洗涤后加底物OPD，37℃显色15～30min后判定结果，以P:N≥2.1且OD>0.2时，判为阳性。一抗NDV、IBDV、DTMV血清以及免疫前兔抗血清作为阴性对照。
结果与分析：
ELISA结果证实表达的蛋白与阳性兔抗血清产生特异性反应，与NDV、IBDV、DTMV及免疫前兔抗血清等不产生交叉反应，表明制备的蛋白特异性好，可用于后续研究。
序列表
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 表达鸭源禽流感病毒NS1蛋白的方法以及该方法的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
ggatccatgg actccaacac tgtgtcaag 29
<210> 2
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
ctcgagtcag tgatggtgat ggtgatgttt atcgtcgtcg tctttataat cctttggaga 60
gagtggaggt c 71
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
aatcatgagt tcaccattta aac 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
agcaataaca ccttgaagca aag 23
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
aacatggaac gggtatt 17
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
ctaagctcat tctgcgtaaa 20
<210> 7
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
agcaaaagca gg 12

Claims (4)

1.一种鸭源禽流感病毒NS1蛋白表达的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
（1）四膜虫表达载体pD5H8-NS1的构建：将H9N2亚型禽流感病毒NS1基因密码子优化后与四膜虫金属硫蛋白基因MTT5启动子序列以及终止子序列融合，构建到pD5H8穿梭载体，得阳性质粒pD5H8-NS1；
（2）四膜虫重组细胞株的构建及筛选：通过基因枪将步骤（1）所得的阳性质粒pD5H8-NS1转入饥饿处理的生殖期四膜虫株中进行基因重组，通过巴龙霉素梯度筛选获得稳定的重组四膜虫株；
（3）NS1蛋白诱导表达及鉴定：利用氯化镉培养步骤（2）所得的重组四膜虫株，诱导NS1蛋白基因表达；之后提取表达蛋白并鉴定分析表达蛋白的正确性；
其中，步骤（1）的具体操作方法为：
1）提取病毒RNA；
2）NS1基因cDNA的制备：将步骤1）提取的病毒RNA通过反转录引物序列5’-AGCAAAAGCAGG-3’反转录为cDNA；
3）NS1基因的PCR扩增：
以FQNS1F- BamHI和FQNS1R-XhoI作为引物，以步骤2）所得的 cDNA为模板，PCR扩增NS1基因；其中，所述FQNS1F- BamHI以及FQNS1R-XhoI的序列如下：
FQNS1F- BamHI：GGATCCATGGACTCCAACACTGTGTCAAG；
FQNS1R-XhoI：CTCGAGTCAGTGATGGTGATGGTGATGTTTATCGTCGT
CGTCTTTATAATCCTTTGGAGAGAGTGGAGGTC；
步骤3）所述的PCR扩增的反应体系为：在50μL体系中含有以下成分：
Figure 848278DEST_PATH_IMAGE002
；
步骤3）所述的PCR扩增的反应条件为：98℃预变性30 s，按98℃ 12 s，53℃ 25 s，72℃60 s，进行35个循环，最后72℃延伸10 min；
4）TOPO克隆阳性质粒的构建及密码子优化：将步骤3)所得的 PCR扩增产物经纯化回收后，利用在线软件分析NS1基因与四膜虫密码子使用偏好性，再对NS1基因进行密码子优化，优化后NS1基因5’端加上BamHI酶切位点和信号肽、3’端加上组氨酸标签和XhoI酶切位点，总长为735 bp，将优化后的合成序列构建到TOPO克隆载体，形成TOPO克隆阳性质粒；
5）构建pTIEV4-NS1阳性质粒：步骤4）所得的TOPO克隆阳性质粒通过双酶切、连接、转化，构建到pTIEV4载体上，得pTIEV4-NS1阳性质粒；
其中，步骤5）的具体操作方法为：
将步骤4）所得的TOPO克隆阳性质粒与pTEIV4载体通过BamHI和XhoI双酶切，酶切产物经回收后，目的基因和载体按摩尔比6:1混合，16℃连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，在带氨苄的LB固体培基上培养16 h，挑选单菌落扩大培养，用载体上设计的引物pTIEV4-1206F和引物pTIEV4-1496R进行PCR鉴定单菌落，提取重组质粒即pTIEV4-NS1阳性质粒，对PTIEV4-NS1阳性质粒进行测序验证；
其中，所述引物pTIEV4-1206F以及引物PTIEV4-1496R的序列如下：
pTIEV4-1206F：AATCATGAGTTCACCATTTAAAC，
pTIEV4-1496R：AGCAATAACACCTTGAAGCAAAG；
6）构建四膜虫表达载体pD5H8-NS1：将pTIEV4-NS1阳性质粒和穿梭载体pD5H8分别通过NotI酶切，然后连接、转化，得阳性质粒pD5H8-NS1；
其中，步骤6）的具体操作方法为：
将pTIEV4-NS1阳性质粒与穿梭载体pD5H8分别通过NotI酶切；将酶切后的穿梭载体pD5H8去磷酸化；
接着，将酶切后的pTIEV4-NS1阳性质粒与去磷酸化后的穿梭载体pD5H8在16℃连接过夜，连接产物电转化至大肠杆菌DH5α电转化感受态细胞，2 mm电击杯电击参数为：300 V，25μF，50 Ω；电转后取50 μL加入到含100 μg/mL 氨苄的LB固体培养基上培养16 h；挑选单菌落、用穿梭载体pD5H8上的引物pD5H8-12476F以及引物pD5H8-13086R进行PCR验证，同时NotⅠ酶切鉴定重组子，最后测序验证NS1基因插入方向是否正确，并制备阳性质粒pD5H8-NS1；
其中，所述引物pD5H8-12476F以及引物pD5H8-13086R的序列如下：
pD5H8-12476F：AACATGGAACGGGTATT，
pD5H8-13086R：CTAAGCTCATTCTGCGTAAA；
步骤6）中，酶切后的穿梭载体pD5H8的去磷酸化反应体系为：在50 μL体系中含有以下成分：
Figure 93315DEST_PATH_IMAGE004
；
步骤6）中，酶切后的穿梭载体pD5H8的去磷酸化反应条件为：在37℃下反应1h。
2.根据权利要求1所述的鸭源禽流感病毒NS1蛋白表达的方法，其特征在于：步骤（2）的具体操作方法为：
在100 mL NEFF培养基中，分别接种200 μL CU427和CU428四膜虫株，30℃、80 rpm培养浓度到对数生长期5×105个/mL；分别将两种四膜虫株饥饿培养24 h后轻柔混合均匀，静置培养10-11 h，观察虫株配对率及核的发育，在显微镜下计算虫子的配对率，达到80%以上可用于基因枪转化；取阳性质粒pD5H8-NS1 4.5 µg加入到30 μL浓度为50 mg/mL金颗粒中，轻涡旋；同时将虫液800×g离心2 min后重悬均匀、涂布在湿润的滤纸中央，待真空度稳定后轰击，迅速将转化后四膜虫转入NEFF培液，置30℃避光静置培养，24 h后加入巴龙霉素100μg/mL选择培养，并每隔48 h把巴龙霉素浓度提高到200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL、800μg/mL 、1000 μg/mL，梯度筛选活力好的阳性虫株单克隆培养至对数生长期约5×105个/mL，提取全细胞基因组DNA进行PCR鉴定，最后在无菌环境下，将四膜虫移至50 mL 灭菌过的离心管中；1000× g 离心10 min，弃上清，用50mL灭菌的10 mM Tris-HCl pH7.4重悬，移至250 mL 三角瓶中，30℃静置饥饿2-3天；将四膜虫1000×g离心10 min，去上清，浓缩至1-2mL，用4倍体积的含10%DMSO的10 mM Tris-HCl pH 7.4重悬，吸至冻存管中，每管300 μL；室温静置30 min，转到程序速冻降温盒中，-80℃冰箱过夜；并移至液氮中，冻存阳性虫株即重组四膜虫株。
3.根据权利要求1所述的鸭源禽流感病毒NS1蛋白表达的方法，其特征在于：步骤（3）的具体操作方法为：
加入终浓度1.5 μg/mL的氯化镉培养步骤（2）所得的重组四膜虫株16 h，诱导外源基因表达； 10000× g离心5 min收集虫体，用预冷的Buffer A重悬虫体，其中，每50 ml的虫液用1ml的bufferA重悬；之后加入终浓度为20 μg/mL PMSF及等体积600 mM NaCl，5000×g离心3 min，吸出中间乳白色胶体层，重悬于10倍体积的含PMSF的Buffer A中，5000×g 离心3min沉淀胶体用于SDS-PAGE和Western blot分析；
采用Mini-Protein cell系统进行变性还原条件下的凝胶电泳SDS-PAGE；45 mA转印2h，3%BSA的TBS封闭过夜，次日加入兔抗阳性血清，室温孵育3 h，羊抗兔AP酶标抗体，室温孵育1 h，BCIP/NBT显色；对表达的蛋白进行LC-MS/MS质谱鉴定，将SDS-PAGE电泳后的蛋白切胶回收，胰蛋白酶酶解成肽段上机检测，同时对结果进行数据库检索。
4.根据权利要求1所述的鸭源禽流感病毒NS1蛋白表达方法的应用，其特征在于：用于禽流感病毒鉴别诊断试剂盒的制备以及疫苗的制备。
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