CN112708601B - H1n1猪流感病毒ns1蛋白磷酸化位点丢失病毒的制备方法 - Google Patents

H1n1猪流感病毒ns1蛋白磷酸化位点丢失病毒的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了H1N1猪流感病毒NS1蛋白磷酸化位点丢失病毒的制备方法，利用Phos‑tag SDS电泳和点突变技术实现了H1N1猪流感病毒NS1蛋白磷酸化形式的分离并鉴定出NS1潜在磷酸化位点为第73位酪氨酸和第83位丝氨酸。将NS1基因73位密码子由TAC转变TTT，对应氨基酸由酪氨酸(Y)突变为苯丙氨酸(F)，83位密码子由TCT转变为GCT，对应氨基酸由丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)，通过反向遗传操作系统拯救出NS1蛋白的磷酸化位点突变的重组病毒。本发明具备的优点是：生物信息学方法结合Phos‑tag SDS电泳预测并验证了病毒蛋白的潜在磷酸化位点，此外NS1磷酸化位点丢失对于病毒的复制能力减弱，并且拮抗干扰素能力下降，可用作流感病毒候选疫苗株。

Description

H1N1猪流感病毒NS1蛋白磷酸化位点丢失病毒的制备方法
技术领域
本发明涉及兽用生物制品技术领域，特别涉及H1N1猪流感病毒NS1蛋白磷酸化位点丢失病毒的制备方法。
背景技术
猪流感(swine influenza，SI)是由猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)引起的人畜共患传染病，具有发病率高，传播速度快，死亡率低等特征，不仅严重危害我国养猪业的发展，还危害人类的健康，并由此引发全球公共卫生的关注。猪流感病毒全基因组长度约为13.6kb，由长短不等的8个独立片段组成。NS1(Nonstructural Protein)蛋白是猪SIV唯一的非结构蛋白，只出现在病毒感染早期的细胞核内，是与病毒复制、致病性和毒力相关的多功能蛋白和调控蛋白。研究已证实，NS1蛋白通过抑制干扰素及肿瘤坏死因子的产生和宿主蛋白的合成实现，干扰宿主细胞对病毒的免疫作用，进而逃避宿主细胞的抗病毒效应。
为了抑制病毒的复制，被病毒感染的细胞通常会激活多种抗病毒反应。因此，在进化的压力下，流感病毒进化出多种机制来应对这种宿主细胞的抗病毒。NS1作为一种多功能蛋白，表现出多种抑制活性，这对于病毒的复制和感染过程中毒力的提高起到了重要的促进作用。磷酸化修饰是功能性蛋白发挥作用的重要机制，最近几年的研究发现，许多的病毒非结构或者结构蛋白能够发生磷酸化修饰。根据目前的研究结果，流感病毒编码的蛋白中大多数都可以被磷酸化修饰，并且病毒的磷酸化修饰能通过很多途径影响病毒的复制。
发明内容
本发明的目的在于提供H1N1猪流感病毒NS1蛋白磷酸化位点丢失病毒的制备方法，生物信息学方法结合Phos-tag SDS电泳预测并验证了病毒蛋白的潜在磷酸化位点，此外NS1磷酸化位点丢失对于病毒的复制能力减弱，并且拮抗干扰素能力下降，可用作流感病毒候选疫苗株，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
H1N1猪流感病毒NS1蛋白磷酸化位点丢失病毒的制备方法，材料包括毒株、细胞、菌种及质粒，HINl亚型SIV A/Swine/Shanghai/3/2014(H1N1)(简称CM)的八质粒反向遗传系统由实验室构建并保存，大肠杆菌感受态细胞DH5a和质粒pCAGGS、pBD由本实验室保存，包括如下步骤：
S1：从Genbank下载30株包含不同亚型的流感病毒全基因组序列，选取其中的NS1序列进行分析；
S2：根据猪流感病毒A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)的NS1基因序列，设计重叠延伸PCR引物；
S3：NS1蛋白潜在磷酸化位点的筛选；
S4：NS1蛋白重组质粒的构建；
S5：phos-tagged SDS-PAGE进行验证；
S6：NS1磷酸化位点丢失的重组病毒的拯救与鉴定；
S7：RT-PCR检测；
S8：间接免疫荧光检测；
S9：重组病毒TCID50的检测与生长曲线的绘制；
S10：Real-time PCR检测。
优选的，S3中所使用的试剂包括高保真酶系统，Trizol RNA提取试剂，反转录酶系统，T4 DNA连接酶，DL2000 DNA Marker，质粒DNA小提试剂盒、蛋白预染MarKer、DNA胶回收试剂盒，EcoRⅠ、NheⅠ和BSPQⅠ限制性内切酶，Lipofectamine 2000、DMEM培养液、胎牛血清和Opti-MEM低血清培养基，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体、cell裂解液、FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、DH5α感受态细胞、blunt-zero连接载体，其它化学试剂均为分析纯。
优选的，S3还包括：
在gene bank中下载各亚型流感病毒全基因组序列并选取完整的NS1序列，用DNAstar7.0软件包中的Editseq将其翻译为蛋白序列，倒入Megalin里进行序列比对，筛选保守的氨基酸位点。
优选的，S4包括：
PCR扩增A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)分离株NS1全长，PCR产物经过1％的琼脂糖在90V电泳30min后，参照DNA marker切下与目的片段大小一致的693bp DNA条带，经胶回收试剂盒将目的产物回收并纯化克隆到T载体上获得阳性质粒，以其为模板，利用重叠延伸PCR方法扩增点突变NS1基因，获得NS1Y73F、NS1S76A、NS1S83A、NS1T151A突变基因，用EcoRⅠ和NheⅠ同时双酶切NS1突变基因PCR产物和pCAGGS质粒，用连接酶进行连接、转化DH5细胞，经提取质粒和双酶切鉴定，获得突变重组质粒pCAGGS-NS1Y73F、pCAGGS-NS1S76A、pCAGGS-NS1S83A、pCAGGS-NS1T151A。
优选的，S5还包括：
将NS1各重组质粒转染293T细胞，24h后收取蛋白样品，经上样缓冲液处理后进行Phos-tag SDS-PAGE凝胶电泳，随后将分离的蛋白转印至NC膜，用5％脱脂乳封闭1h；使用NS1蛋白单克隆抗体作为一抗(1∶1000倍稀释)室温孵育2h，随后室温孵育山羊抗鼠HRP-IgG(1∶8000倍稀释)1h，进行western blot检测，同时设置阴性对照。
优选的，S6还包括：
将病毒的八个基因片段与pBD载体进行酶切连接用于构建猪流感病毒反向遗传操作系统的表达质粒(PBD-NP、PBD-M、PBD-NS、PBD-NP、PBD-PB1、PBD-PB2，PBD-HA,PBD-NA)，转染前一天，取等量的293T加入6孔细胞培养板，细胞覆盖面积达70％时进行转染，转染步骤参照LipofectmintTM2000转染试剂说明进行，将在293T细胞上拯救的病毒上清液接种MDCK细胞，盲传三代。
优选的，S7还包括：
收集第3代细胞培养物，提取总RNA，利用相应引物进行RT-PCR检测，并测序验证。
优选的，S8还包括：
将第3代重组病毒接种于96孔细胞板，48h后进行间接免疫荧光检测。
优选的，S9还包括：
在细胞感染后的12h，24h，48h和72h分别收集细胞上清液，MDCK细胞在96孔细胞板中长成单层后，接种10倍系列稀释的病毒液，37℃，5％CO2条件下继续培养72h后，并按照Reed-Muench法测定TCID50并绘制病毒增殖曲线。
优选的，S10还包括：
各重组病毒及野生毒株感染293T细胞，24h后收集细胞提取RNA反转录得到的cDNA为模板进行Real-time PCR，检测各重组病毒感染后干扰素IFN-β的表达水平。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供一种降低病毒蛋白NS1拮抗干扰素功能为基础的重组感染性克隆，为后续外源基因的插入、重组病毒的制备，以及对宿主的免疫应答等研究提供一个有效的技术平台。
2、本发明还公开了利用生物信息学方法和Phos-tag SDS电泳技术预测并鉴定H1N1猪流感病毒NS1蛋白的关键磷酸化位点的方法，利用点突变技术构建NS1蛋白磷酸化位点丢失的重组质粒。
3、本发明所述的表达NS1蛋白磷酸化位点缺失的重组感染性克隆，包含了猪流感病毒全长、NS1关键磷酸化位点缺失基因的插入。
4、本发明公开了NS1蛋白73位和83位磷酸化位点的丢失对病毒复制和宿主产生干扰素的影响。
附图说明
图1为本发明猪流感病毒NS1蛋白的磷酸化位点的预测图；
图2为本发明NS1蛋白的关键磷酸化位点的鉴定示意图：
图3为本发明NS1重组质粒的构建与鉴定示意图；
图4为本发明重组病毒的RT-PCR检测示意图；
图5为本发明重组病毒的间接免疫荧光检测示意图；
图6为本发明重组病毒生长曲线的绘制示意图；
图7为本发明重组病毒诱导干扰素的表达水平示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
H1N1猪流感病毒NS1蛋白磷酸化位点丢失病毒的制备方法，材料包括毒株、细胞、菌种及质粒，HINl亚型SIV A/Swine/Shanghai/3/2014(H1N1)(简称CM)的八质粒反向遗传系统由实验室构建并保存，大肠杆菌感受态细胞DH5a和质粒pCAGGS、pBD由本实验室保存，生物信息学软件有：DNAstar7.0软件包(DNASTARInc.Madison，WI153751，USA)；Netphos3.1server磷酸化位点在线分析软件。试剂包括高保真酶系统，Trizol RNA提取试剂，反转录酶系统，T4 DNA连接酶，DL2000 DNAMarker，质粒DNA小提试剂盒、蛋白预染MarKer、DNA胶回收试剂盒，EcoRⅠ、NheⅠ和BSPQⅠ限制性内切酶，Lipofectamine 2000、DMEM培养液、胎牛血清和Opti-MEM低血清培养基，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体、cell裂解液、FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、DH5α感受态细胞、blunt-zero连接载体，其余化学试剂均为分析纯。
H1N1猪流感病毒NS1蛋白磷酸化位点丢失病毒的制备方法包括如下步骤：
S1：从Genbank下载包含不同亚型的流感病毒全基因组序列，选取其中的NS1序列进行分析；
S2：根据猪流感病毒A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)的NS1基因序列，设计重叠延伸PCR引物；具体引物序列见下表：
S3：NS1蛋白潜在磷酸化位点的筛选
在gene bank中下载各亚型流感病毒全基因组序列并选取完整的NS1序列，用DNAstar7.0软件包中的Editseq将其翻译为蛋白序列，倒入Megalin里进行序列比对，筛选保守的氨基酸位点。将猪流感病毒A/Swine/Shanghai/3/2014(H1N1)的NS1蛋白氨基酸序列导入Netphos3.1 server在线软件，预测其中的可能被磷酸化的氨基酸位点，并结合保守性氨基酸位点，筛选出NS1可能的磷酸化位点73、76、83和151位氨基酸分别进行研究。
S4：NS1蛋白重组质粒的构建
PCR扩增A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1)分离株NS1全长，实验采用体系:10xbuffer 5ul,dNTP 2ul,上下游引物各2ul,cDNA 2ul,pfu酶1ul,ddH2O 36ul。PCR反应条件为：94℃预变3min，94℃30s，57℃30s，72℃50s(30cycles)，72℃10min，PCR产物经过1％的琼脂糖在90V电泳30min后，参照DNA marker切下与目的片段大小一致的693bp DNA条带，经胶回收试剂盒将目的产物回收并纯化克隆到T载体上获得阳性质粒，以其为模板，利用重叠延伸PCR方法扩增点突变NS1基因，获得NS1Y73F、NS1S76A、NS1S83A、NS1T151A突变基因，用EcoRⅠ和NheⅠ同时双酶切NS1突变基因PCR产物和pCAGGS质粒，用连接酶进行连接、转化DH5细胞。经提取质粒和双酶切鉴定，获得突变重组质粒pCAGGS-NS1Y73F、pCAGGS-NS1S76A、pCAGGS-NS1S83A、pCAGGS-NS1T151A。
S5：phos-tagged SDS-PAGE进行验证
按照说明书配制含有Phos-tag Acrylamide的12％SDS-PAGE凝胶；将NS1各重组质粒转染293T细胞，24h后收取蛋白样品，经上样缓冲液处理后进行Phos-tag SDS-PAGE凝胶电泳。随后将分离的蛋白转印至NC膜，用5％脱脂乳封闭1h；使用NS1蛋白单克隆抗体作为一抗(1∶1000倍稀释)室温孵育2h，随后室温孵育山羊抗鼠HRP-IgG(1∶8000倍稀释)1h，进行western blot检测。同时设置阴性对照。
S6：NS1磷酸化位点丢失的重组病毒的拯救与鉴定
将病毒的八个基因片段与pBD载体进行酶切连接用于构建猪流感病毒反向遗传操作系统的表达质粒(PBD-NP、PBD-M、PBD-NS、PBD-NP、PBD-PB1、PBD-PB2，PBD-HA，PBD-NA)。病毒拯救参照Hoffmann等方法进行。转染前一天，取等量的293T加入6孔细胞培养板，细胞覆盖面积达70％时进行转染，转染步骤参照LipofectmintTM2000转染试剂说明进行。将在293T细胞上拯救的病毒上清液接种MDCK细胞，盲传三代。
S7：RT-PCR检测
收集第3代细胞培养物，提取总RNA，利用相应引物进行RT-PCR检测，并测序验证。
S8：间接免疫荧光检测
将第3代重组病毒接种于96孔细胞板，48h后进行间接免疫荧光检测。具体操作步骤为：弃去细胞上清，预冷的PBST洗涤3遍，拍干；加入70％乙醇，100μL/孔，37℃孵育1h；弃去上清，PBST洗涤3遍，拍干；加入NS1单克隆抗体(1:1000倍稀释)，100μL/孔，37℃孵育1h；弃去上清，PBST洗涤3遍，拍干；加入FITC标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1h；弃去上清，PBST洗涤3遍，拍干；加入适量PBST液体，在荧光显微镜下观察。
S9：重组病毒TCID50的检测与生长曲线的绘制
在细胞感染后的12h，24h，48h和72h分别收集细胞上清液，MDCK细胞在96孔细胞板中长成单层后，接种10倍系列稀释的病毒液，37℃，5％CO2条件下继续培养72h后，并按照Reed-Muench法测定TCID50并绘制病毒增殖曲线。
S10：Real-time PCR检测
各重组病毒及野生毒株感染293T细胞，24h后收集细胞提取RNA反转录得到的cDNA为模板进行Real-time PCR，检测各重组病毒感染后干扰素IFN-β的表达水平。采用SYBRGreen I法进行实时荧光定量PCR扩增，以β-Actin基因为内参，检测IFN-β转录水平的变化。荧光定量PCR引物为，每次反应均设阴性对照，每个样品每个基因均重复3次，取Ct平均值，所得的数据用2-△△CT方法进行处理。
本发明经过以上的试验，结果显示：
(1)NS1蛋白磷酸化位点的预测
如图1，用Netphos 3.0 server在线软件分析猪流感病毒的NS1蛋白氨基酸序列，一共有10个丝氨酸位点，8个苏氨酸位点和1个酪氨酸位点可能被磷酸化。结合NS1蛋白的保守性分析本研究中，选取73、76、83、151位分别进行研究。
(2)NS1蛋白磷酸化位点的验证
采用Phostag SDS-PAGE技术对真核表达的NS1蛋白进行磷酸化和非磷酸化形式的分离。结果显示，使用Phos-tag SDS-PAGE电泳时，磷酸化的NS1蛋白由于结合了大分子量的Phos-tag而造成迁移速率减慢，与非磷酸化的蛋白分开，而73位和83位突变后非磷酸化条带增强，表明了73位和83位可能是NS1磷酸化的关键位点，如图2。
(3)NS1重组质粒的构建与鉴定
重叠延伸PCR扩增结果为690bp，如图3(a)。重组pCAGGS载体质粒pCAGGS-NS1Y73F、pCAGGS-NS1S76A、pCAGGS-NS1S83A、pCAGGS-NS1S151A、利用EcoRⅠ、NheⅠ双酶切和菌液鉴定，大小正确，如图3(b)、(c)。
(4)RT-PCR检测
收集第3代细胞培养物，提取总RNA，扩增病毒的8个基因。如图4，重组病毒都能扩增出条带，大小分别为：PA：2233bp；PB1：2341bp；PB2：2341bp；HA：1776bp，NA：1462bp；NP：1565bp；M：1027bp；NS：890bp。测序结果正确。
(5)间接免疫荧光检测
利用NS1蛋白单克隆抗体进行间接免疫荧光检测，结果如图5，感染重组病毒的MDCK细胞内发出特异性绿色荧光，说明重组病毒拯救成功。
(6)NS1磷酸化位点丢失的病毒生长曲线的绘制
结果如图6，病毒在MDCK细胞上均能较好的复制，在病毒感染初期，突变株rSIVNS1 73F,rSIV NS183A与野生毒株WT繁殖滴度不存在显著差异，而在感染48h后，突变株rSIV NS1 73F,rSIV NS183A的滴度分别为5.87和5.47TICD50/ml，显著低于野生毒株rSIV的滴度7.5TICD50/ml。
(7)NS1磷酸化位点的缺失对干扰素产生的影响
在NS1的73位，83位突变成不能磷酸化的苯丙氨酸和丙氨酸后，病毒感染24h IFN-β表达水平与对照组相比升高了4倍，而野生毒株感染后IFN-β表达水平处于抑制状态，如图7。
本发明通过对猪流感病毒的NS1蛋白氨基酸序列进行分析，寻找H1N1猪流感病毒NS1蛋白的关键磷酸化位点，确定NS1蛋白磷酸化修饰对病毒复制和拮抗宿干扰素能力的影响，构建并拯救了表达H1N1猪流感病毒NS1蛋白磷酸化位点缺失病毒，为后续重组病毒疫苗研制提供个契机和平台。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.H1N1猪流感病毒NS1蛋白磷酸化位点丢失病毒的制备方法，材料包括毒株、细胞、菌种及质粒，HINl亚型SIVA/Swine/Shanghai/3/2014H1N1的八质粒反向遗传系统由实验室构建并保存，大肠杆菌感受态细胞DH5a和质粒pCAGGS、pBD由本实验室保存，其特征在于，包括如下步骤：
S1：从Genbank下载包含不同亚型的流感病毒全基因组序列，选取其中的NS1序列进行分析；
S2：根据猪流感病毒A/swine/Shanghai/3/2014H1N1的NS1基因序列，设计重叠延伸PCR引物；具体引物序列见下表：
S3：NS1蛋白潜在磷酸化位点的筛选；在gene bank中下载各亚型流感病毒全基因组序列并选取完整的NS1序列，用DNAstar7.0软件包中的Editseq将其翻译为蛋白序列，倒入Megalin里进行序列比对，筛选保守的氨基酸位点；
S4：NS1蛋白重组质粒的构建；PCR扩增A/swine/Shanghai/3/2014H1N1分离株NS1全长，PCR产物经过1％的琼脂糖在90V电泳30min后，参照DNAmarker切下与目的片段大小一致的693bp DNA条带，经胶回收试剂盒将目的产物回收并纯化克隆到T载体上获得阳性质粒，以其为模板，利用重叠延伸PCR方法扩增点突变NS1基因，获得NS1Y73F、NS1S76A、NS1S83A、NS1T151A突变基因，用EcoRⅠ和NheⅠ同时双酶切NS1突变基因PCR产物和pCAGGS质粒，用连接酶进行连接、转化DH5细胞，经提取质粒和双酶切鉴定，获得突变重组质粒pCAGGS-NS1Y73F、pCAGGS-NS1S76A、pCAGGS-NS1S83A、pCAGGS-NS1T151A；
S5：phos-tagged SDS-PAGE进行验证；将NS1各重组质粒转染293T细胞，24h后收取蛋白样品，经上样缓冲液处理后进行Phos-tag SDS-PAGE凝胶电泳，随后将分离的蛋白转印至NC膜，用5％脱脂乳封闭1h；使用NS1蛋白单克隆抗体作为一抗1:1000倍稀释室温孵育2h，随后室温孵育山羊抗鼠HRP-IgG 1:8000倍稀释1h，进行westernblot检测，同时设置阴性对照；
S6：NS1磷酸化位点丢失的重组病毒的拯救与鉴定；将病毒的八个基因片段与pBD载体进行酶切连接用于构建猪流感病毒反向遗传操作系统的表达质粒PBD-NP、PBD-M、PBD-NS、PBD-NP、PBD-PB1、PBD-PB2，PBD-HA,PBD-NA，转染前一天，取等量的293T加入6孔细胞培养板，细胞覆盖面积达70％时进行转染，转染步骤参照LipofectmintTM2000转染试剂说明进行，将在293T细胞上拯救的病毒上清液接种MDCK细胞，盲传三代；
S7：RT-PCR检测；收集第3代细胞培养物，提取总RNA，利用相应引物进行RT-PCR检测，并测序验证；
S8：间接免疫荧光检测；将第3代重组病毒接种于96孔细胞板，48h后进行间接免疫荧光检测；
S9：重组病毒TCID50的检测与生长曲线的绘制；在细胞感染后的12h，24h，48h和72h分别收集细胞上清液，MDCK细胞在96孔细胞板中长成单层后，接种10倍系列稀释的病毒液，37℃，5％CO2条件下继续培养72h后，并按照Reed-Muench法测定TCID50并绘制病毒增殖曲线；
S10：Real-time PCR检测；各重组病毒及野生毒株感染293T细胞，24h后收集细胞提取RNA反转录得到的cDNA为模板进行Real-time PCR，检测各重组病毒感染后干扰素IFN-β的表达水平。
2.根据权利要求1所述的H1N1猪流感病毒NS1蛋白磷酸化位点丢失病毒的制备方法，其特征在于，S3中所使用的试剂包括高保真酶系统，Trizol RNA提取试剂，反转录酶系统，T4DNA连接酶，DL2000 DNAMarker，质粒DNA小提试剂盒、蛋白预染MarKer、DNA胶回收试剂盒，EcoRⅠ、NheⅠ和BSPQⅠ限制性内切酶，Lipofectamine 2000、DMEM培养液、胎牛血清和Opti-MEM低血清培养基，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体、cell裂解液、FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)、DH5α感受态细胞、blunt-zero连接载体，其它化学试剂均为分析纯。
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