CN104592367A - 流感病毒np蛋白突变体及其编码基因与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种流感病毒NP蛋白突变体及其编码基因与应用。本发明所提供的流感病毒NP蛋白突变体是将来自于野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的NP蛋白的第253位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸(I)后得到的，其氨基酸序列具体如序列表中序列1所示。实验证明，本发明所提供的流感病毒A/WSN/1933突变株，与野生型流感病毒A/WSN/1933毒株相比，具有流感病毒RNA聚合酶活性更强、流感病毒复制能力更强，且对哺乳动物的致病力相对降低的特性，可见该突变株为理想的针对H1N1亚型流感病毒的候选疫苗株。

Description

流感病毒NP蛋白突变体及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种流感病毒NP蛋白突变体及其编码基因与应用。
背景技术
流感病毒NP蛋白可以与多种宿主蛋白发生相互作用，在流感病毒复制周期的不同阶段起着十分重要的作用。如在流感病毒感染晚期，细胞质中的NP蛋白可以结合细胞骨架蛋白。纯化的NP蛋白在体外还能与F-actin相互作用，NP蛋白可以结合肌动蛋白亚基，并通过与F-actin的相互作用来调整NP蛋白在细胞核中的定位。
值得注意的是，宿主蛋白与NP蛋白的相互作用并不完全是有利于流感病毒复制的，有的宿主因子通过与NP蛋白的相互作用来抑制流感病毒的复制，这类宿主因子称为宿主限制性因子。例如，核蛋白90(NF90)属于RNA结合蛋白，它能够结合双链RNA或者单链RNA，以抵御外来RNA或病毒侵袭。NF90可以通过与NP蛋白的相互作用来抑制流感病毒的复制和转录。
NP蛋白在流感病毒感染的过程中并非固定于细胞中的某个位置，而是在细胞质和细胞核进行穿梭的过程中行使其功能。NP蛋白上已经报道过的核定位信号(NLS)有三个，其中最强的NLS1信号区是位于N端的非传统NLS(第3-13位氨基酸)。较弱的NLS2是一个双向NLS，位于第198-216位氨基酸。而NAS位于第327-345位氨基酸之间，又被成为核聚集信号区。
H1N1是一种RNA病毒，属于正黏液病毒科。它的宿主是犬科动物、鸟类和一些哺乳动物。有些H1N1病毒引起严重的疾病大多发生于家禽和家畜方面，同样人类也时常出现疫情。经过鸟类和猪为主的哺乳动物的传播和变异，可能导致疫情或人类流感大面积传播。因此，在筛选疫苗的时候既需要考虑疫苗候选毒株的繁殖能力、免疫原性等疫苗株所必需具有的特性，还需要考虑疫苗候选株对哺乳动物的致病力，避免使用对哺乳动物具有潜在强致病力的疫苗候选毒株，防止H1N1对哺乳动物及人类造成潜在威胁。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种NP蛋白突变体。
本发明所提供的NP蛋白突变体，是将来自于野生型流感病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株的NP蛋白(氨基酸序列如序列表中序列3所示，编码基因如序列表中序列4所示)的第253位的苯丙氨酸(F)突变为异亮氨酸(I)，其它氨基酸残基均不变后得到的。
具体而言，所述NP蛋白突变体的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
编码所述NP蛋白突变体的基因也属于本发明的保护范围。
具体而言，所述基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
其中，序列2由1497个核苷酸组成，整个序列2即为ORF，编码序列表中序列1所示的NP蛋白突变体。
含有所述基因的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
在本发明中，所述重组表达载体具体为在pCDNA3.0载体的酶切位点Kpn I和XhoI间正向插入序列表中序列2所示DNA片段后得到的重组质粒；或在pHH21载体的酶切位点BsmB I处正向插入序列表中序列2所示DNA片段后得到的重组质粒。
所述NP蛋白突变体，或所述基因，或所述重组载体或表达盒或重组菌，在制备具有如下至少一种功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围：
(a)增强流感病毒RNA聚合酶活性；
(b)增强流感病毒复制能力；
(c)降低对哺乳动物的致病力。
在(b)中，所述增强流感病毒复制能力具体体现在：使流感病毒的生长周期(或称为复制周期)提前。
其中，所述流感病毒为H1N1亚型流感病毒。在本发明中，所述具有如下至少一种功能的产品具体为流感病毒A/WSN/1933突变株。
所述流感病毒A/WSN/1933突变株也为本发明的保护范围。
所述流感病毒A/WSN/1933突变株，含有所述NP蛋白突变体。
所述流感病毒A/WSN/1933突变株表达的八个蛋白，除了NP蛋白与野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的NP蛋白不同外，其他蛋白均与野生型流感病毒A/WSN/1933毒株相同。
所述流感病毒A/WSN/1933突变株的NP蛋白的编码RNA具体为将序列表中序列2中的T替换为U后所得的序列，其他蛋白的编码RNA序列同野生型流感病毒A/WSN/1933毒株。具体而言，所述流感病毒A/WSN/1933突变株的基因组RNA为八条独立的单链RNA，序列分别为将序列表中序列2、序列5-11共八条序列的反向互补链的中的T替换为U后得到的共八个序列。
所述流感病毒A/WSN/1933突变株在制备流感病毒疫苗(如针对H1N1亚型流感病毒的疫苗)中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种质粒套装。
本发明所提供的质粒套装，具体由如下12种质粒组成：所述质粒套装由如下12种质粒组成：pHH21-PB2、pHH21-PB1、pHH21-PA、pHH21-HA、pHH21-NP-mod、pHH21-NA、pHH21-M、pHH21-NS、pcDNA3.0-PB2、pcDNA3.0-PB1、pcDNA3.0-PA和pcDNA3.0-NP-mod；
所述pHH21-PB2为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列5所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-PB1为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列6所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-PA为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列7所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-HA为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列8所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-NP-mod为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列2所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-NA为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列9所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-M为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列10所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-NS为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列11所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pcDNA3.0-PB2为在载体pcDNA3.0的限制内内切酶KpnI和XhoI的识别位点之间正向插入序列表的序列5所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pcDNA3.0-PB1为在载体pcDNA3.0的限制内内切酶KpnI和XhoI的识别位点之间正向插入序列表的序列6所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pcDNA3.0-PA为在载体pcDNA3.0的限制内内切酶KpnI和XhoI的识别位点之间正向插入序列表的序列7所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pcDNA3.0-NP-mod为在载体pcDNA3.0的限制内内切酶KpnI和XhoI的识别位点之间正向插入序列表的序列2所示的双链DNA分子后得到的重组质粒。
另外，所述质粒套装在制备所述流感病毒A/WSN/1933突变株中的应用也属于本发明的保护范围。
实验证明，本发明所提供的流感病毒A/WSN/1933突变株，与野生型流感病毒A/WSN/1933毒株相比，具有流感病毒RNA聚合酶活性更强、流感病毒复制能力更强，且对哺乳动物的致病力相对降低的特性，可见该突变株为理想的针对H1N1亚型流感病毒的候选疫苗株。
附图说明
图1为WSN毒株NP蛋白突变前后的RNA聚合酶活性的测定结果。其中，WSN-WT为突变前(野生型)；F253I为突变后(突变型)。
图2为野生型流感病毒A/WSN/1933毒株和流感病毒A/WSN/1933突变株感染MDCK细胞的一步生长曲线。其中，WT表示野生型流感病毒A/WSN/1933毒株；F253I表示流感病毒A/WSN/1933突变株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
A/WSN/1933(H1N1)毒株：记载于“S-S Wang,Zh-D Zhao,Y-H Bi,L Sun,X-L Liu*,W-J Liu*.2013.Tyrosine 132phosphorylation of influenza A virus M1protein is crucial forvirus replication by controlling its nuclear import.Journal of Virology,87(11):6182-91”一文中，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)毒株：记载于“Sh-Y Gao,Sh-Sh Wang,Sh Cao,L Sun,JLi,Y-H Bi,George F Gao,W-J Liu*.2014.The characteristics of nucleocytoplasmictransport of H1N1influenza A viruses nuclear export protein(NEP).Journal of Virology.88(13):7455-7463”一文中，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
A/Shandong/lx1023/2007(H9N2)毒株：记载于“Y-H Bi,Q Xie,S Zhang,Y Li,H-XXiao,T Jing,WN Zheng,J Li,X-J Jia,L Sun,J-H Liu,C Qin,George F Gao,W-J Liu.2014.Assessment of the internal genes of influenza A(H7N9)virus contributing to the highpathogenicity in mice.Journal of Virology.doi:10.1128/JVI.02390-14”一文中，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
A/Anhui/2013(H7N9)毒株：记载于“Y-H Bi,Q Xie,S Zhang,Y Li,H-X Xiao,T Jing,WN Zheng,J Li,X-J Jia,L Sun,J-H Liu,C Qin,George F Gao,W-J Liu.2014.Assessmentof the internal genes of influenza A(H7N9)virus contributing to the high pathogenicity inmice.Journal of Virology.doi:10.1128/JVI.02390-14”一文中，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
293T细胞：记载于“S-S Wang,Zh-D Zhao,Y-H Bi,L Sun,X-L Liu*,W-J Liu*.2013.Tyrosine 132phosphorylation of influenza A virus M1protein is crucial for virus replicationby controlling its nuclear import.Journal of Virology,87(11):6182-91”一文中，公众可从中国科学院微生物研究所获得。
MDCK细胞：中国兽医药品监察所。
载体pHH21：记载于“Neumann,G.et al.,Generation of influenza A viruses entirelyfrom cloned cDNAs.P Natl Acad Sci Usa 96(16),9345(1999)”一文中，公众可从中国科学院微生物研究所获得。。
载体pcDNA3.0：购自普如汀生物技术有限公司，货号：40544312200。
实施例1、流感病毒A/WSN/1933突变株的制备
一、流感病毒A/WSN/1933毒株NP蛋白突变位点的确定
本发明的发明人将流感病毒A/WSN/1933(H1N1)毒株(简称WSN)、A/PuertoRico/8/1934(H1N1)毒株(简称PR8)、A/Shandong/lx1023/2007(H9N2)毒株(简称SD)、和A/Anhui/2013(H7N9)毒株(简称AH)的NP蛋白氨基酸序列进行比对，发现位于NES3区的第253位氨基酸，除了人流感病毒WSN和PR8是苯丙氨酸(F)之外，禽源流感病毒SD和AH相应位点表现为异亮氨酸(I)。确定将流感病毒A/WSN/1933毒株NP蛋白的第253位氨基酸作为突变位点，将序列表中序列3所示的野生型流感病毒A/WSN/1933毒株NP蛋白的第253位氨基酸由苯丙氨酸(F)突变为异亮氨酸(I)，突变后的NP蛋白突变体的氨基酸序列具体如序列表中序列1所示。对应基因水平，野生型流感病毒A/WSN/1933毒株NP蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列4所示，而NP蛋白突变体的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
二、NP蛋白突变前后的RNA聚合酶活性的测定
按照如下步骤进行荧光素酶(Luciferase)实验，从而测定突变前后NP蛋白的RNA聚合酶活性：
1、转染293T细胞(12孔板)
(1)待转染质粒：PB1、PB2、PA和NP(或NP突变后质粒)表达载体各100ng，luciferase和β-gal质粒各50ng。
其中，PB1、PB2、PA和NP表达载体，luciferase和β-gal质粒均记载于“Yu M,etal.Identification and characterization of three novel nuclear export signals inthe influenza A virus nucleoprotein.Journal of virology,2012May；86(9):4970-80”一文中。NP突变后质粒，为将“NP表达载体”中序列4所示的NP野生型基因替换为序列2所示的NP突变基因后得到的重组质粒。
(2)转染试剂：lipofectamine 2000。转染4-6h换液。
转染的具体操作步骤参见lipofectamine 2000说明书。
2、收细胞
(1)细胞裂解液(sigma)：将5×细胞裂解液用水稀释为1×。
(2)吸弃培养液，用PBS洗一遍(培养基的颜色会对测β-gal活性读数会产生影响)。
(3)每孔加入160μL 1×细胞裂解液，用200μL的枪头刮下细胞。
(4)将裂解混合物转移到EP管中，-80℃冻存1h，4℃解冻。
(5)4℃12000×g离心10min。
3、测β-半乳糖苷酶的活性
(1)显色底物：900μL Z buffer+200μL ONPG，混匀。
其中，Z buffer的溶剂为水，溶质及浓度如下：Na2HPO4.12H2O 21.5g；NaH2PO4.2H2O 6.2g；KCl 0.75g；MgSO4.7H2O 0.246g；调pH值至7.0。
ONPG(4mg/mL)：用Z buffer配制(0.2g ONPG加到50μL Z buffer)，37℃溶解，分装避光保存。
(2)取20μL裂解上清加入到显色底物中，混匀，37℃静置，至变为淡黄色
(3)终止显色：加入500μL 1M Na2CO3终止反应。
(4)各取100μL加入96孔板中(4个重复)，测OD450。
4、测luciferase活性
(1)在EP管中加入50μL luciferase底物。
(2)每管中加入10μL裂解上清测荧光值，即混即测。
(3)将所有得到的数值分别除以野生型1组所得的数值，并乘以100。将得到的数值再求组间平均和误差值。
结果显示，与NP蛋白突变前相比，突变组vRNP活性有0.8倍的升高。具体参见图1。
另外，本发明的发明人还对WT与突变组NP蛋白表达量进行了Western-blotting检测，一抗为抗M1的单抗，抗A型流感病毒M1蛋白的鼠源单克隆抗体，二抗为羊抗兔HRP抗体，两种抗体均购自百汇中源公司。Western-blotting结果显示，WT与突变组NP蛋白表达量基本一致。
三、流感病毒A/WSN/1933突变株的拯救及鉴定
1、重组质粒的构建
A型流感病毒反向遗传操作系统是基于12种质粒的病毒拯救系统，12种质粒包括分别携带病毒的8个基因组片段的8个质粒(pHH21-PB2、pHH21-PB1、pHH21-PA、pHH21-HA、pHH21-NP或pHH21-NP-mod、pHH21-NA、pHH21-M和pHH21-NS)，和4个分别编码PA、PB1、PB2和NP的质粒(pcDNA3.0-PB2、pcDNA3.0-PB1、pcDNA3.0-PA和pcDNA3.0-NP或pcDNA3.0-NP-mod)。
(1)重组质粒pHH21-PB2
在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列5所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-PB2。
(2)重组质粒pHH21-PB1
在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列6所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-PB1。
(3)重组质粒pHH21-PA
在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列7所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-PA。
(4)重组质粒pHH21-HA
在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列8所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-HA。
(5)重组质粒pHH21-NP或pHH21-NP-mod
在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列4所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-NP。
在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列2所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-NP-mod。
(6)重组质粒pHH21-NA
在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列9所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-NA。
(7)重组质粒pHH21-M
在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列10所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-M。
(8)重组质粒pHH21-NS
在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列11所示的双链DNA分子，得到质粒pHH21-NS。
(9)重组质粒pcDNA3.0-PB2
在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间正向插入序列表的序列5所示的双链DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-PB2。
(10)重组质粒pcDNA3.0-PB1
在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间正向插入序列表的序列6所示的双链DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-PB1。
(11)重组质粒pcDNA3.0-PA
在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间正向插入序列表的序列7所示的双链DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-PA。
(12)重组质粒pcDNA3.0-NP或pcDNA3.0-NP-mod
在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间正向插入序列表的序列4所示的双链DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-NP。
在载体pcDNA3.0的KpnI和XhoI酶切位点之间正向插入序列表的序列2所示的双链DNA分子，得到质粒pcDNA3.0-NP。
2、流感病毒A/WSN/1933突变株的拯救
(1)在转染前一天对293T细胞进行传代。
(2)转染前换无抗生素培养基，混匀步骤1构建的12种质粒(pHH21-PB2、pHH21-PB1、pHH21-PA、pHH21-HA、pHH21-NP-mod、pHH21-NA、pHH21-M、pHH21-NS、pcDNA3.0-PB2、pcDNA3.0-PB1、pcDNA3.0-PA和pcDNA3.0-NP-mod)。其中pcDNA3.0-PA 0.1μg，其余质粒各1μg。按照lipofectamine2000说明书操作，转染步骤(1)准备好的293T细胞。
(3)转染4-6h后换液，换为含TPCK处理的胰酶2μg/mL、0.01％-0.1％FBS的DMEM。48小时后，取细胞上清，3000g离心5min，弃沉淀，将上清(流感病毒A/WSN/1933突变株的病毒原液)分装后冻存于-70℃，备用。
采用相同的方法，采用重组质粒pHH21-NP替代pHH21-NP-mod，采用重组质粒pcDNA3.0-NP替代pcDNA3.0-NP-mod，拯救获得野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的病毒原液。
3、流感病毒A/WSN/1933突变株的鉴定
(1)噬斑鉴定
将MDCK细胞接种于12孔板中，每孔约1×105细胞，37℃、5％CO2培养箱中培养过夜；用PBS缓冲液洗去细胞表面的培养基，将待测的培养上清(步骤2获得的流感病毒A/WSN/1933突变株的病毒原液或野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的病毒原液)用病毒感染液梯度稀释后分别加入各孔中，每个稀释度设置三个重复孔，37℃孵育1小时；吸弃上清并用PBS缓冲液清洗细胞，每孔加入1毫升混合溶液(混合溶液的制备方法：将1体积份融化后降温至37℃左右的3％低熔点琼脂糖与1体积份预热到37℃的无酚红DMEM培养基等体积混合，且混合物中加入TPCK处理的胰酶、青霉素和链霉素，使得胰酶浓度为2μg/ml，青霉素和链霉素的浓度均为100U/ml)；将12孔板4℃放置15分钟以上，待琼脂凝固后，将孔板翻转过来倒置在37℃培养箱中培养，在显微镜下观察细胞病变情况。
结果显示，培养3天后，将12孔板从培养箱中取出，可见流感病毒A/WSN/1933突变株的病毒原液组合野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的病毒原液租均产生明显的噬斑。
(2)基因组测序鉴定
取步骤2拯救所得流感病毒A/WSN/1933突变株和野生型流感病毒A/WSN/1933毒株，分别提取总RNA，反转录获得cDNA，并进行序列测定。
结果显示，野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的NP基因(野生型)如序列表中序列4所示；PB2基因如序列表中序列5所示；PB1基因如序列表中序列6所示；PA基因如序列表中序列7所示；HA基因如序列表中序列8所示；NA基因如序列表中序列9所示；M基因如序列表中序列10所示；NS基因如序列表中序列11所示。流感病毒A/WSN/1933突变株的NP基因(突变型)如序列表中序列2所示；PB2基因如序列表中序列5所示；PB1基因如序列表中序列6所示；PA基因如序列表中序列7所示；HA基因如序列表中序列8所示；NA基因如序列表中序列9所示；M基因如序列表中序列10所示；NS基因如序列表中序列11所示。
实施例2、流感病毒A/WSN/1933突变株的性能测定
一、流感病毒A/WSN/1933突变株的复制能力的测定
1、噬斑检测病毒的复制能力
将实施例1拯救获得的野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的病毒原液和流感病毒A/WSN/1933突变株的病毒原液分别接种MDCK细胞，接种后培养96小时，分别获得了野生型的和突变的WSN流感病毒。对拯救获得的病毒的滴度在MDCK细胞上进行噬斑检测，具体如下：
(1)以1×105MDCK细胞接种12孔板，置于CO2培养箱培养过夜，使细胞长成单层(铺满80％以上)。
(2)用PBS洗涤细胞3次，吸净孔内的液体。
(3)取出-80℃冻存的病毒液，融化后于4℃5000rmp离心5min。
(4)在1.5mL离心管中加入适量无血清无抗生素DMEM培养基。按照10倍梯度逐级稀释病毒液(10-1-10-8)。
(5)将不同稀释度的病毒液加入12孔板，每个稀释度3个平行孔，每孔1mL；留一个孔做正常细胞对照。置于37℃培养箱孵育1h。
(6)吸弃病毒液，用PBS清洗3次。尽量去除残余的液体。
(7)在水浴锅中加热融化3％低熔点琼脂糖。待其冷却到50℃左右时，与37℃预热的无酚红DMEM培养液以1:1的体积比混合(DMEM中含有4μg/mL TPCK处理过的胰酶，即终浓度为2μg/mL)，混匀后迅速加到12孔板中，每孔1mL。
(8)将12孔板在4℃放置10-15min，待琼脂糖凝固后再将12孔板倒置，于37℃培养。在显微镜下观察细胞病变情况。培养2-4d后，将12孔板从培养箱中取出，对着光线计数空斑数。实验重复三次，结果取平均值。
结果显示：野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的log10PFU/ml为5.08±0.13，而流感病毒A/WSN/1933突变株的log10PFU/ml为5.70±0.09，比野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的滴度有所上升。三次重复实验的测定结果具体如表1所示。该结果表明F253I突变的NP蛋白影响了病毒拯救的过程，增加了细胞上清中病毒粒子的含量。
表1野生型的和突变的WSN流感病毒的滴度测定结果(单位：log10PFU/ml)
重复1 重复2 重复3 平均值±标准差
野生型 5.00 5.01 5.23 5.08±0.13
突变型 5.80 5.61 5.70 5.70±0.09
2、生长曲线检测病毒的复制能力
按照如下步骤测定野生型的和突变的WSN流感病毒的一步生长曲线：
(1)MDCK细胞铺于6cm培养皿中，37℃细胞培养箱中培养过夜。
(2)将细胞培养液吸掉，用PBS洗涤3次。
(3)按照感染复数MOI＝0.1，分别使用野生型流感病毒A/WSN/1933毒株和流感病毒A/WSN/1933突变株感染MDCK细胞，37℃吸附1小时。
(4)将病毒感染后的上清液吸掉，用PBS洗涤3次。
(5)加入含TPCK胰酶的DMEM细胞培养液继续培养，分别在感染后4、6、8、10、12小时取出500μl培养上清，-80℃保存。
(6)用噬斑方法检测不同病毒不同感染时间的培养上清中的病毒滴度。其中，噬斑方法参见步骤1进行。实验重复三次，结果取平均值。
结果显示：野生型流感病毒A/WSN/1933毒株感染8小时开始检测到病毒粒子存在，而流感病毒A/WSN/1933突变株感染4小时便可以检测到病毒粒子。在整个检测过程中，在对应的取样时间点，流感病毒A/WSN/1933突变株的滴度始终高于野生型病毒的滴度。病毒一步生长曲线的测定结果表明流感病毒A/WSN/1933突变株的生长周期比野生型病毒提前了4个小时左右。野生型的和突变的WSN流感病毒的一步生长曲线具体如图2所示。
二、流感病毒A/WSN/1933突变株对小鼠致病力的测定
所用小鼠品种为BALB/c：购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
1、有限稀释法繁殖病毒
(1)取100μL野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的病毒液，用无血清DMEM培养液进行10倍倍比稀释，稀释倍数为：原液、101、102、103、104(此步骤在冰上进行)。每个稀释度取100μL病毒液，接种9日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种3枚鸡胚，蜡封后37℃温箱孵育，弃去24h内死亡鸡胚，72h后将鸡胚放置在4℃冰箱中放置6h。无菌收集尿囊液，每枚鸡胚收集的尿囊液均独立置于15ml离心管中。每管中取50μL尿囊液，用1％SPF鸡红细胞悬液做血凝试验，选取血凝效价最高的尿囊液离心(3000rpm 10min)，取上清(即为病毒液)。
经测定，每0.1mL野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的病毒液中病毒含量为10-5.8TCID50(细胞半数致死量)。
(2)取100μL流感病毒A/WSN/1933突变株的病毒液，用无血清DMEM培养液进行10倍倍比稀释，稀释倍数为：原液、101、102、103、104(此步骤在冰上进行)。每个稀释度取100μL病毒液，接种9日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种3枚鸡胚，蜡封后37℃温箱孵育，弃去24h内死亡鸡胚，72h后将鸡胚置于在4℃冰箱6h。无菌收集尿囊液，每枚鸡胚收集的尿囊液均独立置于15ml离心管中。每管中取50μL尿囊液，用1％SPF鸡红细胞悬液做血凝试验，选取血凝效价最高的尿囊液离(3000rpm 10min)，取上清(即为病毒液)。
经测定，每0.1mL流感病毒A/WSN/1933突变株的病毒含量＝10-5.57TCID50(细胞半数致死量)。
其中，血凝实验的具体实验步骤如下：
在96孔微量血凝板的各孔内分别加入25μl 0.9％生理盐水。在第一列孔内分别加入25μl待测的尿囊液，混匀后，从第一列孔吸出25μl加入到第二列孔内，依次倍比稀释直至第十一列孔，从第十一列孔吸出25μl液体弃除。第十二列孔为阴性对照(25μl0.9％生理盐水)。在各孔内分别加入25μl的1％SPF鸡红细胞悬液，振荡均匀。室温(25℃)静置30min后观察结果。阴性对照孔正常的情况下，能使鸡红细胞完全凝集的最高稀释倍数为尿囊液的血凝效价。
TCID50实验的具体实验步骤如下：
①准备细胞：取生长良好的MDCK细胞，按常规方法消化，运用2％(体积分数)FBS，1‰(1g/L)双抗DMEM制备细胞悬液，对细胞进行计数，调整细胞浓度为1×105个/ml的悬液，然后加入到96孔细胞培养板中，100μl/孔。37℃，5％CO2培养过夜或8～12小时，使其铺满单层。
②稀释病毒：将待测定病毒进行10倍梯度稀释，选取6-8个梯度进行试验。
先分装2％(体积分数)FBS，1‰(1g/L)双抗DMEM，每管900μl，用记号笔标号，用100μl移液器从待检病毒原液中取100μl加入1号管，在振荡器上振荡混匀，然后取100μl加入2号管，振荡混匀，从第2管吸取100μl混合液到第3管，混匀，依此类推逐一稀释，从而获得待检病毒原液的10-5-10-12倍稀释液(请核实)。
③感染病毒：96孔板中细胞长满单层后，将原培养液弃掉；在96孔板的第11、12两列各加100μl 2％(体积分数)FBS，1‰(1g/L)双抗DMEM作为细胞对照。病毒稀释液从低浓度开始每个稀释度加10个复孔，每孔100μl，用10-5～10-12连续梯度稀释的病毒稀释液依次感染96孔板中的细胞(注意加样的时候，要贴壁加入，避免将细胞冲起)。置于37℃5％CO2条件下培养72h，主要观察细胞病变孔数并记录。
④观察并记录现象：以72h为结果判断终点，观察并记录。
采用Reed-Muench两氏法计算待测病毒液的TCID50。
距离比例＝(高于且最接近50％病变率的百分数-50％)/(高于且最接近50％病变率的百分数-低于且最接近50％病变率的百分数)
LogTCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于且最接近50％病变率的稀释度的对数
2、病毒液的制备
(1)将步骤1得到的野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的病毒液用无血清DMEM培养液稀释到101TCID50/50μL、102TCID50/50μL、103TCID50/50μL、104TCID50/50μL、105TCID50/50μL(此步骤在冰上进行)。
(2)将步骤2得到的流感病毒A/WSN/1933突变株的病毒液用无血清DMEM培养液稀释到101TCID50/50μL(此步骤在冰上进行)。
3、小鼠攻毒试验
将4-6周龄(16-18g)雌性BALB/c小鼠分为3组，每组40只，分别进行如下处理：
第一组：将小鼠用乙醚轻度麻醉，以不随意挣扎为标准，将101TCID50/50μL野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的病毒液以人工滴鼻方法感染小鼠，每只接种50μL病毒液。连续观察14天，记录小鼠存活情况。
第二组：将小鼠用乙醚轻度麻醉，以不随意挣扎为标准，将101TCID50/50μL流感病毒A/WSN/1933突变株的病毒液以人工滴鼻方法感染小鼠，每只接种50μL病毒液。连续观察14天，记录小鼠存活情况。
第三组：将小鼠用乙醚轻度麻醉，以不随意挣扎为标准，将PBS以人工滴鼻方法感染小鼠，每只接种50μL PBS。连续观察14天，记录小鼠存活情况。
结果显示，第一组小鼠在14天内全部死亡，死亡率为100％；相比之下。第二组小鼠在14天内死亡率显著降低(具体结果如表2所示)。可见，相比野生型流感病毒A/WSN/1933毒株而言，流感病毒A/WSN/1933突变株对小鼠致病力降低。这表明流感病毒A/WSN/1933突变株可作为流感病毒疫苗的候选毒株。
表2不同毒株对小鼠致病力的测定
组别 第一组 第二组 第三组
小鼠死亡率(％) 100％ 25％ 0

Claims (10)

1.NP蛋白突变体，是将来自于野生型流感病毒A/WSN/1933毒株的NP蛋白的第253位的苯丙氨酸突变为异亮氨酸(I)后得到的。
2.根据权利要求1所述的NP蛋白突变体，其特征在于：所述NP蛋白突变体的氨基酸序列如序列表中序列1所示。
3.编码权利要求1或2所述NP蛋白突变体的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。
5.含有权利要求3或4所述基因的重组载体、表达盒或重组菌。
6.权利要求1或2所述NP蛋白突变体，或权利要求3或4所述的基因，或权利要求5所述的重组载体或表达盒或重组菌，在制备具有如下至少一种功能的产品中的应用：
(a)增强流感病毒RNA聚合酶活性；
(b)增强流感病毒复制能力；
(c)降低对哺乳动物的致病力。
7.流感病毒A/WSN/1933突变株，含有权利要求1所述的NP蛋白突变体。
8.根据权利要求7所述的流感病毒A/WSN/1933突变株，其特征在于：所述流感病毒A/WSN/1933突变株的NP蛋白的编码RNA为将序列表中序列2中的T替换为U后所得的序列。
9.权利要求7或8所述的流感病毒A/WSN/1933突变株在制备流感病毒疫苗中的应用。
10.质粒套装，其特征在于：所述质粒套装由如下12种质粒组成：pHH21-PB2、pHH21-PB1、pHH21-PA、pHH21-HA、pHH21-NP-mod、pHH21-NA、pHH21-M、pHH21-NS、pcDNA3.0-PB2、pcDNA3.0-PB1、pcDNA3.0-PA和pcDNA3.0-NP-mod；
所述pHH21-PB2为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列5所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-PB1为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列6所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-PA为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列7所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-HA为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列8所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-NP-mod为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列2所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-NA为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列9所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-M为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列10所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pHH21-NS为在载体pHH21的限制内内切酶BsmBI的切割位点处正向插入序列表的序列11所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pcDNA3.0-PB2为在载体pcDNA3.0的限制内内切酶KpnI和XhoI的识别位点之间正向插入序列表的序列5所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pcDNA3.0-PB1为在载体pcDNA3.0的限制内内切酶KpnI和XhoI的识别位点之间正向插入序列表的序列6所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pcDNA3.0-PA为在载体pcDNA3.0的限制内内切酶KpnI和XhoI的识别位点之间正向插入序列表的序列7所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
所述pcDNA3.0-NP-mod为在载体pcDNA3.0的限制内内切酶KpnI和XhoI的识别位点之间正向插入序列表的序列2所示的双链DNA分子后得到的重组质粒；
或
所述质粒套装在制备权利要求7或8所述流感病毒A/WSN/1933突变株中的应用。
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