CN113355292B - 一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用 - Google Patents

一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113355292B
CN113355292B CN202110623057.7A CN202110623057A CN113355292B CN 113355292 B CN113355292 B CN 113355292B CN 202110623057 A CN202110623057 A CN 202110623057A CN 113355292 B CN113355292 B CN 113355292B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
virus
attenuated strain
porcine circovirus
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110623057.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113355292A (zh
Inventor
贺笋
张伟
潘毅平
李俊辉
程兰玲
候凤
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tiankang Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Tiankang Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tiankang Pharmaceutical Co ltd filed Critical Tiankang Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202110623057.7A priority Critical patent/CN113355292B/zh
Publication of CN113355292A publication Critical patent/CN113355292A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113355292B publication Critical patent/CN113355292B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

本发明提供了一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用，涉及生物基因工程技术领域。所述弱毒株的基因组经密码子突变或者密码子优化或者基因截短等途径使该基因最终不编码或者编码部分衣壳蛋白(Cap蛋白)，并且在基因截短缺失的核苷酸序列中插入荧光蛋白基因。在此基础上，将该基因改造型弱毒株基因组转染到能够表达衣壳蛋白的供体细胞中，通过利用细胞自身的复制系统和病毒自身的基因组，最终自我组装出完整的、可感染宿主细胞的病毒粒子。

Description

一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物基因工程技术领域，尤其是涉及一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用。
背景技术
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)属于圆环病毒科，无囊膜，直径约12-23nm，具有大约1.7kb的单链环状DNA基因组，是猪圆环病毒相关疾病(PCV2-associated disease,PCVAD)的主要病原体，给养猪业造成了巨大的经济损失。
PCV2基因组中有两个主要的开发阅读框(ORF)。最大的为ORF1，是Rep蛋白编码基因，Rep基因编码两个病毒复制相关蛋白Rep和Rep′，Rep和Rep′能够与位于基因间区复制起点(ori)内的特定序列结合，启动PCV2进行滚环复制。Rep蛋白不能单独启动猪圆环病毒的复制，而是由Rep蛋白与Rep’的共同参与。但通过将包含PCV基因组的质粒转化至大肠杆菌进行分析时，发现只需要Rep蛋白就可以启动PCV的复制。PCV2 ORF2基因编码衣壳蛋白(Cap蛋白)，作为PCV2唯一的结构蛋白及主要的免疫原性蛋白。研究学者用PCV2 ORF2取代PCV1ORF2构建嵌合型PCV1-2，制备的疫苗免疫商品猪后能产生高水平的PCV2抗体。Shang等证实PCV有4个与抗体识别的区域，分别位于Cap蛋白第156～162，175～192，195～200和228～233氨基酸之间，PCV2抗体只能识别PCV2 Cap蛋白，该蛋白具有良好的特异性。因此，Cap蛋白可作为血清学诊断和疫苗研发的首要选择。
研究表明，Rep和Rep’都定位于感染细胞的胞浆内，而在核仁中并不存在，这种定位在病毒感染周期过程中并不会改变。Cap蛋白的定位相对来说是不断变化的，在质粒转化细胞中，Cap蛋白在整个细胞周期中都定位于核仁，而在感染的早期，Cap蛋白起始定位于核仁，随后迁移至核质然后再运输至细胞质中，表明Cap蛋白在感染周期的整个过程中穿梭定位于细胞的不同区域。
另外，猪圆环病毒无囊膜，由Cap蛋白组合的二十面体包裹核酸构成完整的病毒粒子，因此，Cap蛋白在病毒入侵及致病性方面发挥重要作用。Misinzo等分析称，PCV2主要通过Cap蛋白吸附硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)或硫酸软骨素B(chondroitinsulfate B，CS-B)受体感染病毒宿主细胞。
PCV2作为最小的动物病毒之一，基因组仅为1.7kb，表达的蛋白非常有限。前期研究发现，病毒为了更好地生存，它必须利用宿主蛋白调控完成自身复制。由于病毒自身的基因组结构，PCV2自身不编码复制酶，主要依靠细胞有丝分裂S期表达的酶及蛋白进行滚环复制，从而导致病毒的相关蛋白的转录或者翻译受限，影响病毒粒子组装的效率；这也是病毒滴度较低的原因。另外研表明，病毒的易感性不强，病毒感染细胞不产生细胞病变效应(CPE)，且仅有30％细胞能够感染，从而对病毒的病原学研究和疫苗研制带来不便。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用。本发明所提供的基因改造型弱毒株仅能够复制基因组，不能够表达完整的Cap蛋白，病毒不能组装完整的病毒，不但确保了病毒的安全性，还能够与野毒株在病原学上进行鉴别检测。
本发明提供的技术方案如下：
在一个方面，本发明提供了一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株，所述弱毒株的基因中，部分或全部编码衣壳蛋白Cap的核苷酸序列缺失，且缺失的核苷酸序列被荧光蛋白编码基因的核苷酸序列替换。
在一个实施方案中，所述弱毒株的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2所示；所述荧光蛋白编码基因为GFP基因。
在一个实施方案中，本发明提供的弱毒株包含PCV2大部分基因序列，缺失部分ORF2基因(也即编码Cap蛋白的基因)，缺失位置插入GFP基因。
(1)截短插入GFP后PCV2基因组序列(SEQ ID No.1)：
注：未加粗部分为ORF1基因，加粗为部分ORF2基因，下划线部分为GFP基因；序列两端含有基因组自身带有SacII限制性酶切位点。
(2)基因突变后PCV2基因组序列(SEQ ID No.2):
注：下划线部分为ORF1基因，加粗部分为ORF2基因，将ORF2基因起始密码子由ATG(CAT)替换成TAA(TTA)；序列两端含有基因组自身带有SacII限制性酶切位点(下划线+加粗+斜体)。
在一个可选的实施方案中，所述荧光蛋白编码基因也可选自其他基因，例如YFP、mCHERRY以及EGFP等。
本发明还提供了含有前述的核苷酸序列的载体；优选地，所述载体为重组表达载体或重组克隆载体。
在另一个方面，本发明还提供了猪圆环病毒基因改造型弱毒株的构建方法，包括以下步骤：
(a)根据PCV2全基因组，设计并合成部分或全部编码衣壳蛋白Cap的核苷酸序列缺失，且缺失位置插入荧光蛋白编码基因的核苷酸序列的全长基因序列；
(b)步骤(a)合成的序列并将其插入到克隆载体中；
(c)构建Cap基因改造型重组表达质粒并转化感受态细胞，提取所述重组表达质粒并转染细胞；
(d)筛选出阳性细胞，进行病毒的检测和鉴定。
在一个实施方案中，在构建Cap基因改造型重组质粒并转化感受态细胞后，提取所述重组质粒并转染细胞，然后进行传代培养。
在一个具体的实施方案中，所述设计的部分或全部编码衣壳蛋白Cap的核苷酸序列缺失且缺失位置插入荧光蛋白编码基因，所设计的PCV2的全长核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。
在一个具体的实施方案中，将设计出的PCV2全长基因序列插入到克隆载体pMD18T中；并设计引物进行鉴定。
在一个具体的实施方案中，利用质粒载体pBluescript SKⅡ(+)进行Cap基因改造型重组质粒的构建。具体地，利用限制性内切酶双酶切含PCV2 ORF2和GFP部分基因的pMD阳性质粒和质粒载体pBluescript SKⅡ(+)，对酶切片段进行纯化和连接。
进一步地，将构建好的Cap基因改造型重组质粒(pBluescript SK-PCV2-△Cap-GFP)转化感受态细胞(例如DH5α感受态细胞)，提取阳性重组质粒并转染细胞(例如PK-15细胞)。可以采用Invitrogen公司脂质体LipofectamineTM2000进行转染。
进一步地，传代培养后，在倒置显微镜下观察荧光信号，评价转染效果和基因复制效果。应用单细胞克隆技术，筛选出阳性细胞，进行放大培养，并保存细胞。对获得的阳性细胞进行分子生物学检测，提取病毒基因组进行基因测序、酶切分析及基因拷贝数分析。
在另一个方面，本发明提供了所述猪圆环病毒基因改造型弱毒株在制备预防猪圆环病毒病的药物或疫苗中的应用；优选地，所述应用包括将所述猪圆环病毒基因改造型弱毒株与含PCV2 Cap蛋白基因的重组表达质粒联合使用。例如，针对PCV2阳性猪场，免疫具有基因改造型弱毒株后，改造型病毒可以在感染猪靶细胞中利用PCV2野毒编码出的Cap蛋白进行自我组装成完整病毒继续感染细胞。从而起到了与野毒毒株竞争性的利用Cap蛋白，导致野毒组装成完整病毒粒子的效率降低，对机体免疫系统的损伤也相应的降低。在没有野毒株存在的情况下，Cap蛋白就不能产生，基因改造型弱毒株由于缺乏资源也就不能组装完成，从而也丧失了感染性。因此，这种改造型弱毒株既起到了疾病治疗的效果，又激发了机体的细胞免疫应答，具有双重的疫病防控效果。有望作为基因标记弱毒疫苗应用于对猪圆环病毒感染的防治。
在一个实施方案中，所述含PCV2 Cap蛋白基因的重组表达质粒的构建方法包括：
(A)根据猪圆环病毒流行毒株序列获得PCV2 Cap基因序列并对其进行密码子优化以设计并合成PCV2 Cap基因序列；
(B)将步骤(A)合成的PCV2 Cap基因序列并插入质粒载体中构建重组质粒并转化感受态细胞；
(C)提取重组质粒，采用鉴定正确的重组质粒转染细胞进行传代培养；
(D)对转染细胞进行检测，筛选出具有Cap高表达的细胞株。
在一个实施方案中，本发明根据目前猪圆环病毒疾病病原学分析和流行病学调查，比对目前流行毒株病毒全基因组序列，筛选出当下流行毒株序列。
在一个实施方案中，在根据毒株序列，获得PCV2 ORF2基因序列后，对ORF2基因序列进行了密码子优化和亲疏水性分析及修正。
ORF2基因序列优化前(SEQ ID No.3)：ATGACGTATCCAAGGAGGCGTTTCCGCAGACGAAGACACCGCCCCCGCAGCCATCTTGGCCAGATCCTCCGCCGCCGCCCCTGGCTCGTCCACCCCCGCCACCGTTACCGCTGGAGAAGGAAAAATGGCATCTTCAACACCCGCCTCTCCCGCACCATCGGTTATACTGTCAACAAAACCACAGTCAGAACTCCCTCCTGGAATGTGGACATGATGAGATTTAATATTAATGATTTTCTTCCCCCAGGAGGGGGCTCAAACCCCCTCACTGTGCCCTTTGAATACTACAGAATAAGGAAGGTTAAGGTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCAATCACCCAGGGTGACAGGGGAGTGGGCTCCACTGCTGTTATTCTAGATGATAACTTTGTAACAAAGGCCAATGCCCTAACCTATGACCCCTATGTAAACTACTCCTCCCGCCATACCATAACCCAGCCCTTCTCCTACCACTCCCGGTACTTTACCCCGAAACCTGTCCTTGATGGAACAATCGATTACTTCCAACCCAATAACAAAAGAAATCAACTCTGGCTGAGACTACAAACTACTGGAAATGTAGACCATGTAGGCCTCGGCACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGACCAGGACTACAATATCCGTATAACCATGTATGTACAATTCAGAGAATTTAATCTTAAAGACCCCCCACTTAAACCCTAA。
ORF2基因序列优化后(SEQ ID No.4)：ATGACCTACCCCCGCCGCCGCTTCCGCCGCCGCCGCCACCGCCCCCGCAGCCACCTGGGCCAGATCCTGCGCCGCCGCCCCTGGCTGGTGCACCCCCGCCACCGCTACCGCTGGCGCCGCAAGAACGGCATCTTCAACACCCGCCTGAGCCGCACCATCGGCTACACCGTGAACAAGACCACCGTGCGCACCCCCAGCTGGAACGTGGACATGATGCGCTTCAACATCAACGACTTCCTGCCCCCCGGCGGCGGCAGCAACCCCCTGACCGTGCCCTTCGAGTACTACCGCATCCGCAAGGTGAAGGTGGAGTTCTGGCCCTGCAGCCCCATCACCCAGGGCGACCGCGGCGTGGGCAGCACCGCCGTGATCCTGGACGACAACTTCGTGACCAAGGCCAACGCCCTGACCTACGACCCCTACGTGAACTACAGCAGCCGCCACACCATCACCCAGCCCTTCAGCTACCACAGCCGCTACTTCACCCCCAAGCCCGTGCTGGACGGCACCATCGACTACTTCCAGCCCAACAACAAGCGCAACCAGCTGTGGCTGCGCCTGCAGACCACCGGCAACGTGGACCACGTGGGCCTGGGCACCGCCTTCGAGAACAGCATCTACGACCAGGACTACAACATCCGCATCACCATGTACGTGCAGTTCCGCGAGTTCAACCTGAAGGACCCCCCCCTGAAGCCCTAA。
在一个具体的实施方案中，在获得优化后的ORF2序列后，在序列两端插入BamH I和Not I酶切位点，序列由上海生物工程公司合成。将合成的序列与重组质粒载体片段(载体预先经限制性内切酶BamH I和Not I酶切)(例如pcDNA3.1)连接。
进一步地，将连接好的重组质粒转化感受态细胞(例如BL21感受态细胞)后，筛选阳性重组转化体。然后进行重组质粒的提取与鉴定，将鉴定正确的重组质粒转染细胞(例如PK-15细胞)；对转染细胞进行分子生物学检测，确定Cap的表达情况，最终筛选出具有高表达的细胞株。
在一个具体的实施方案中，所述联合使用为采用构建的Cap基因改造型重组质粒和含PCV2 Cap蛋白基因的重组表达质粒共同转染细胞以构建感染性的猪圆环病毒2型基因缺失弱毒株。
由于猪圆环病毒在复制中需要依靠细胞有丝分裂S期表达的相关酶，造成病毒合成Cap蛋白的效率较低，这也是目前普遍存在的病毒滴度较低的一个重要原因。本发明提供的与基因改造型疫苗毒株联合使用的重组表达质粒，其插入了PCV2 Cap蛋白基因，并且在该基因的上游加入有利于蛋白高效表达的强启动子。将该表达质粒转染含基因改造型弱毒株基因组的宿主细胞后，能够组装大量完整的具有感染性的基因缺陷病毒，这些病毒只有一个细胞周期的侵染，生物安全性极高，是疫苗研制的有利候选毒株。
在一个方面，本发明提供了猪圆环病毒基因改造型弱毒株在猪圆环病毒含量测定中的应用。
在一个实施方案中，所述病毒含量测定包括以下步骤：
(i)培养所述基因改造型弱毒株并测定病毒含量，每毫升病毒的含量不高于100个病毒；
(ii)将PK-15细胞悬液接种到96孔板中培养过夜；
(iii)弃去所述96孔板中的培养液，并接种所述基因改造型弱毒株；
(iv)将待测猪圆环病毒毒液进行梯度稀释后，分别接种于步骤(iii)的96孔板中进行培养；
(v)在倒置荧光显微镜下观察细胞感染及荧光表达情况；统计每个稀释度含有PCV2阳性细胞的孔数，根据Reed-Muench法计算病毒TCID50。
在一个实施方案中，所述步骤(i)中通过浓缩的方式提高病毒的滴度；
进一步地，所述步骤(ii)中，PK-15细胞悬液的密度为0.2～1×105cells/ml，每孔添加80-100μL；
进一步地，所述步骤(iii)中，每孔接种所述基因改造型弱毒株80～100μL；
进一步地，所述步骤(iv)中，将待检测猪圆环病毒毒液用DMEM维持液进行10倍系列稀释，同时设置对照孔；
进一步地，所述步骤(v)中，对照孔无特异性绿色荧光，病毒接种细胞孔细胞核内出现特异性绿色荧光。
在一个具体的实施方案中，猪圆环病毒病毒含量测定方法包括以下步骤：
(1)将具有感染性改造型弱毒株进行大量培养，测定病毒含量；通过浓缩方法提高病毒滴度，要求每毫升病毒的含量不高于100个病毒；
(2)将提前准备好的PK-15细胞悬液(细胞密度为105cells/ml)接种到96孔板中，100μL/孔；37℃，5％CO2培养箱静置培养过夜。
(3)次日，弃去96孔板中培养液。将感染性改造型弱毒用维持液稀释至每毫升102.0TCID50，分别接种到各孔中，100μL/孔；同时设空白对照孔。
(4)将待测猪圆环病毒毒液按照传统检测方法进行10倍比稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，分别接种到相应稀释列的96孔中，37℃，5％CO2培养箱静置培养过夜。
(5)每日倒置荧光显微镜下观察细胞感染及荧光表达情况。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株，该基因改造型弱毒株仅能够复制基因组之外，不能够表达完整的Cap蛋白，病毒不能组装完整的病毒，丧失了对细胞的吸附、入侵以及释放。不但确保了病毒的安全性，还能够与野毒株在病原学上鉴别检测。
本发明还提供了所述基因改造型弱毒株的构建方法以及所述猪圆环病毒基因改造型弱毒株在制备预防猪圆环病毒病的药物或疫苗中的应用和在病毒含量测定中的应用。由于细胞感染病毒后没有细胞病变，传统方法是病毒感染细胞72～96小时后通过间接免疫荧光法检测病毒含量。本发明检测方法的原理是，在缺失Cap基因的位置插入了绿色荧光蛋白，改造型弱毒株需要利用完整毒株的Cap蛋白才能组装成具有感染能力的病毒，并产生荧光信号。因此，该方法有利于病毒含量的测定，实时监测，省时、省力、省成本。
本发明所提供的基因改造型弱毒株仅能够在供体细胞中组装出具有感染的完整病毒，缺乏供体细胞的条件下，病毒只能完成基因组的复制，不能组装或者组装的病毒粒子不能够进一步感染宿主细胞。这不仅降低了在工业化大生产中生物安全的风险，而且能够与野毒株在病原学上进行鉴别检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的猪圆环病毒2型改造型弱毒株构建流程图；
图2为发明提供的猪圆环病毒2型改造型弱毒株基因组序列设计图；
图3为本发明实施例1猪圆环病毒2型全基因组图谱；
图4为本发明实施例1改造好的猪圆环病毒2型基因改造型毒株全基因组图谱；
图5为本发明实施例1改造好的含猪圆环病毒2型基因改造型毒株全基因组的pSK-PCV2-△Cap-GFP质粒PCR鉴定结果图；
图6为本发明实施例1中pSK-PCV2-△Cap-GFP质粒转染细胞后24h间接免疫荧光(IFA)鉴定结果；
图7为本发明实施例2改造好的pcDNA3.1-Cap质粒PCR鉴定结果图；
图8为本发明实施例3m1PCV2-△Cap-GFP在PK-15细胞组装24h后IFA检测结果图；
图9是本发明实施例5病毒含量测定检测示意图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规方法操作，如《分子克隆实验指南(第四版)(原版)》(美)M.R.格林、J.萨姆布鲁克，2013年10月科学出版社出版中所述的方法进行。
实施例1.猪圆环病毒基因改造型弱毒株(PCV2-△Cap-GFP)的构建
按照如图1所示的流程，构建猪圆环病毒2型改造型弱毒株。
(1)目的片段的获得
根据目前猪圆环病毒疾病的病原学分析和流行病学调查，比对目前流行毒株病毒全基因组序列，筛选出当下流行毒株序列。
将确定的毒株序列进行人工合成(包括插入的绿色荧光蛋白序列)，基因序列如SEQ ID No.1所示，并插入到克隆载体pMD18T中，见图2序列设计图。此外，根据PCV2基因序列，利用Primer5.0设计一对引物：
引物1：5’-GAAGGGGGCCAGTTCGTCAC-3’(SEQ ID No.5)；
引物2：5’-TCCAATTGGCGATGGCCCTG-3’(SEQ ID No.6)。
该对引物用于鉴定ORF1和GFP基因，扩增产物片段大小284bp。引物由上海生工合成。
图3为猪圆环病毒2型全基因组图谱；图4为本发明改造好的猪圆环病毒2型基因改造型毒株全基因组图谱。
(2)重组质粒pBluescript SK-PCV2-△Cap-GFP的构建
酶切：采用限制性内切酶Kpn I与Hind III分别双酶切含PCV2基因组(含GFP基因)的pMD阳性质粒和质粒载体pBluescript SKⅡ(+)，具体反应体系如下：
pMD阳性质粒/质粒pBluescript SKⅡ(+) 2μL/4μL
KpnI 0.5μL
Hind III 0.5μL
10×Buffer K 5μL
水 42μL/40μL
加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，37℃3h，反应结束后，按照Qian公司DNA纯化试剂盒说明书对酶切片段进行纯化。
连接：纯化产物溶于30μL无DNA酶、RAN酶三蒸水中。按照Promega T4连接酶说明书，在200μL的硅化离心管中建立10μL连接体系：
酶切纯化产物 2μL
pBluescript SKⅡ(+)酶切纯化产物 1μL
10×连接酶缓冲液 1μL
T4 DNA连接酶 1μL
三蒸水 5μL
加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，室温连接3h。
转化：取新鲜制备的DH5α感受态细胞置于冰上，轻弹管壁使其混匀；吸取10μL的连接物加入感受态细胞的离心管中；轻弹管壁，混匀细胞和连接物，然后冰浴20min；于42℃水浴热激90s后，立即冰浴2min；加入900μL孵育至室温的LB液体培养基，置于37℃，150r/min振荡培养45～60min；吸取100μL菌液涂布于LB/Amp+/X-gal/IPTG平板上，37℃培养过夜(12～16h)，观察菌落生长情况，根据蓝白斑筛选重组转化体。
重组质粒的提取：挑取白色菌落(重组子)接种3mL LB/Amp+液体培养基中，37℃震荡过夜。按北京天根生物技术有限公司的高纯度质粒小提中量试剂盒说明书操作进行。用20～50μL含RNase A(20μg/mL)、无DNase的三蒸水(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀物，置-20℃冻存备用，将阳性菌落中获得的阳性质粒命名为pSK-PCV2-△Cap-GFP。
重组质粒鉴定：
酶切鉴定：将筛选的重组质粒按照如下体系进行酶切实验：
单酶切鉴定：
pSK-PCV2-△Cap-GFP 3μL
Sac II 0.5μL
10×Buffer H 5μL
三蒸水 41.5μL
加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，37℃3h，反应结束后，将酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。
PCR鉴定：根据PCV2全基因组序列设计一对引物(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)。该对引物可对ORF1和GFP部分基因进行扩增，片段大小284bp。通过用该引物既能对阳性质粒进行PCR鉴定，又能确定基因的插入方向是否正确。
图5为改造好的含猪圆环病毒2型基因改造型毒株全基因组的pSK-PCV2-△Cap-GFP质粒PCR鉴定结果图。
将重组质粒进行50倍稀释，取1μL为模板，在200μL的硅化管中建立25μL PCR反应体系：
反应程序如下：98℃10s，55℃30s，72℃2min，共30个循环。
酶切：采用限制性内切酶Sac II对阳性质粒pSK-PCV2-△Cap进行酶切，具体反应体系如下：
pSK-PCV2-△Cap-GFP 4μL
Sac II 0.5μL
10×Buffer H 5μL
三蒸水 40.5μL
加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，37℃3h，反应结束后，按照Qian公司DNA纯化试剂盒说明书对酶切片段进行纯化。
连接、环化：纯化产物溶于30μL无DNA酶、RAN酶三蒸水中。按照Promega T4连接酶说明书，在200μL的硅化中建立50μL连接体系：
酶切纯化产物 10μL
10×连接酶缓冲液 5μL
T4 DNA连接酶 5μL
三蒸水 30μL
加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，室温连接3h。
(3)重组质粒pBluescript SK-PCV2-△Cap的构建
载体设计：在上述方法的基础上，创新设计使ORF2基因不缺失，但不表达其编码的Cap蛋白。利用宿主细胞表达的Cap蛋白为其提供自我组装的原料。具体操作如下：PCV2全基因组中ORF2基因的起始密码子进行点突变。将确定的序列进行人工合成，基因序列如SEQID No.2所示，并插入到克隆载体pMD-18T中。
酶切：采用限制性内切酶Kpn I与Hind III分别双酶切含PCV2基因组的pMD阳性质粒和质粒载体pBluescript SKⅡ(+)，具体反应体系如下：
pMD阳性质粒/质粒pBluescript SKⅡ(+) 2μL/4μL
KpnI 0.5μL
Hind III 0.5μL
10×Buffer K 5μL
水 42μL/40μL
加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，37℃3h，反应结束后，按照Qian公司DNA纯化试剂盒说明书对酶切片段进行纯化。
连接：纯化产物溶于30μL无DNA酶、RAN酶三蒸水中。按照Promega T4连接酶说明书，在200μL的硅化离心管中建立10μL连接体系：
酶切纯化产物 2μL
pBluescript SKⅡ(+)酶切纯化产物 1μL
10×连接酶缓冲液 1μL
T4 DNA连接酶 1μL
三蒸水 5μL
加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，室温连接3h。
转化：取新鲜制备的DH5α感受态细胞置于冰上，轻弹管壁使其混匀；吸取10μL的连接物加入感受态细胞的离心管中；轻弹管壁，混匀细胞和连接物，然后冰浴20min；于42℃水浴热激90s后，立即冰浴2min；加入900μL孵育至室温的LB液体培养基，置于37℃，150r/min振荡培养45～60min；吸取100μL菌液涂布于LB/Amp+/X-gal/IPTG平板上，37℃培养过夜(12～16h)，观察菌落生长情况，根据蓝白斑筛选重组转化体。
重组质粒的提取：挑取白色菌落(重组子)接种3mL LB/Amp+液体培养基中，37℃震荡过夜。按北京天根生物技术有限公司的高纯度质粒小提中量试剂盒说明书操作进行。用20～50μL含RNase A(20μg/mL)、无DNase的三蒸水(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀物，置-20℃冻存备用，将阳性菌落中获得的阳性质粒命名为pSK-PCV2-△Cap。
重组质粒鉴定：
酶切鉴定：将筛选的重组质粒按照如下体系进行酶切实验：
单酶切鉴定：
pSK-PCV2-△Cap 3μL
EcoR I 0.5μL
10×Buffer H 5μL
三蒸水 41.5μL
加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，37℃3h，反应结束后，将酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳。由于载体和PCV2 ORF2基因中均含有EcoR I酶切位点，因此但酶切就能分析出PCV2基因组插入的位置与方向。
酶切：采用限制性内切酶Sac II对阳性质粒pSK-PCV2-△Cap进行酶切，具体反应体系如下：
pSK-PCV2-△Cap 4μL
Sac II 0.5μL
10×Buffer H 5μL
三蒸水 40.5μL
加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，37℃3h，反应结束后，按照Qian公司DNA纯化试剂盒说明书对酶切片段进行纯化。
连接、环化：纯化产物溶于30μL无DNA酶、RAN酶三蒸水中。按照Promega T4连接酶说明书，在200μL的硅化中建立50μL连接体系：
酶切纯化产物 10μL
10×连接酶缓冲液 5μL
T4 DNA连接酶 5μL
三蒸水 30μL
加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，室温连接3h。
(4)PK-15细胞转染：
采用Invitrogen公司脂质体LipofectamineTM2000进行转染。具体步骤如下：
(a)在六孔细胞培养板中每孔加入2mL含10％胎牛血清的DMEM培养液，并接种105个细胞，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。至细胞达到40％～60％丰度时，各孔细胞用2mL平衡至室温的Opti-MEM无血清培养洗涤一次。
(b)在两个1.5mL Eppendorf管中分别加入250μL Opti-MEM，前者加入4μL质粒DNA颠倒混匀；后者加入10μL LipofectamineTM2000轻轻混匀，并在室温孵育5min。待反应结束后将两个管子的反应物加在一起上下混匀后，在室温反应20min。
(c)在无血清Opti-MEM洗涤过的细胞培养板中加入1.5mL Opti-MEM，待上一步的反应结束后，立即将脂质体和质粒的反应混合物加入细胞培养孔中。
(d)37℃作用5h后吸取转染液，加入含10％胎牛血清的DMEM，反应18～48h。转染时，设一孔细胞直接转染脂质体，作为阴性对照。
(e)取转染细胞培养上清接种PK-15细胞，连续盲传5代后取样检测，观察荧光蛋白表达情况或者qPCR检测分析病毒基因组载量。
图6为本发明中pSK-PCV2-△Cap-GFP质粒转染细胞后24h间接免疫荧光(IFA)鉴定结果。
(5)病毒检测：
(a)全基因组测序：按照病毒全基因组提取试剂盒标准操作方法，提取病毒基因组，送往测序公司测序。
(b)PCR鉴定，步骤同上，此处省略。
实施例2.猪圆环病毒2型Cap蛋白重组质粒(pcDNA3.1-PCV2-Cap)构建
(1)PCV2 ORF2基因合成
参照GenBank已有的PCV2全基因组序列，截取ORF2基因，通过序列分析和密码子优化，获得优化后ORF2序列，并在序列两端插入BamH I和Not I酶切位点，序列由上海生物工程公司合成。
(2)重组质粒(pcDNA3.1-PCV2-Cap)构建
合成序列回收：将重组质粒通过限制性内切酶BamH I和Not I酶切，在1％琼脂糖凝胶上电泳后回收酶切产物，切下目的条带放入eppendorf管，用Promga公司生产的DNA片段回收试剂盒回收。具体操作如下：
先准确称量出胶块质量，按照1：1的比例加入溶胶液(以100μL体积胶加入100μL溶胶液)，55℃水浴放置5～10min，期间偶尔晃动Eppendorf管几次，使胶体完全溶化；将溶化的混合液装柱，9,000r/min，离心30s，去废液；加入500μL漂洗液漂洗，12,000r/min离心30s，重复漂洗一次，倒掉废液后，12,000r/min离心2min；在柱子中加入合适体积的洗脱缓冲液(50μL)，12,000r/min离心洗脱备用。
连接：合成序列回收产物与pcDNA3.1连接反应，按照pcDNA3.0Vetor操作说明书，在200μL的硅化管中建立20μL连接体系：
回收产物 4μL
pcDNA3.1 2μL
三蒸水 4μL
Solution I 10μL
加入以上各成分后，作瞬时离心混匀，16℃连接30min。
转化：取新鲜制备的BL21感受态细胞置于冰上，轻弹管壁使其混匀；吸取10μL的连接物加入感受态细胞的离心管中；轻弹管壁，混匀细胞和连接物，然后冰浴20min；于42℃水浴热激90s后，立即冰浴2min；加入900μL孵育至室温的LB液体培养基(Amp-)，置于37℃，150r/min振荡培养45～60min；吸取100μL菌液涂布于LB/Amp+/X-gal/IPTG平板上，37℃培养过夜(12～16h)，观察菌落生长情况，根据蓝白斑筛选重组转化体。
重组质粒的提取：挑取白色菌落(重组子)接种3mL LB/Amp+液体培养基中，37℃震荡过夜。按北京全式金生物技术有限公司Plasmid Purification Kit试剂盒说明书操作进行。用20～50μL含RNase A(20μg/mL)、无DNase的TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀物，置-20℃冻存备用。
重组质粒PCR鉴定：将提取的质粒作适当稀释后，取1μL质粒作模板，PCR扩增，能扩增出与目的片段大小相同的质粒即为阳性重组质粒。
图7为本发明改造好的pcDNA3.1-Cap质粒PCR鉴定结果图。
(3)PK-15细胞转染系:
采用Invitrogen公司脂质体LipofectamineTM2000进行转染。具体步骤如下：
(a)在六孔细胞培养板中每孔加入2mL含10％胎牛血清的DMEM培养液，并接种105个细胞，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。至细胞达到40％～60％丰度时，各孔细胞用2mL平衡至室温的Opti-MEM无血清培养洗涤一次。
(b)A和B两个1.5mL Eppendorf管中分别加入250μL Opti-MEM，A加入4μg质粒DNA颠倒混匀；B加入10μL LipofectamineTM2000轻轻混匀，并在室温孵育5min。待反应结束后将两个管子的反应物加在一起上下混匀后，在室温反应20min。
(c)在无血清Opti-MEM洗涤过的细胞培养板中加入1.5mL Opti-MEM，待上一步的反应结束后，立即将脂质体和质粒的反应混合物加入细胞培养孔中。
(d)37℃作用5h后吸取转染液，加入含10％胎牛血清的DMEM，反应18～48h。转染时，设一孔细胞直接转染脂质体，作为阴性对照。取转染细胞培养上清接种PK-15细胞，进行目的蛋白定性检测。
实施例3.感染性猪圆环病毒2型基因改造型弱毒株的构建
由于猪圆环病毒基因改造型弱毒株(PCV2-△Cap-GFP)不具有感染性，将获得的pcDNA3.1-PCV2-Cap表达载体(或者PCV2-△Cap-GFP)转染含有PCV2-△Cap-GFP(或者pcDNA3.1-PCV2-Cap表达载体)的PK-15细胞，通过表达产物在细胞中借助细胞的加工与修饰，完成病毒的组装，从而筛选出具有感染性的基因改造型猪圆环病毒弱毒株，命名为m1PCV2-△Cap-GFP。具体操作如下：
用pSK-PCV2-△Cap-GFP转染处于对数生长期的PK-15细胞。培养24小时后，将细胞液吸出，基础细胞培养液洗涤细胞3次。采用脂质体转染法将pcDNA3.1-PCV2-Cap转染上述细胞。48小时后收集细胞，并进行荧光检测，观察细胞感染情况。图8为本发明感染性猪圆环病毒2型基因改造型毒株在PK-15细胞组装24h后IFA检测结果图。
实施例4.感染性猪圆环病毒2型基因改造型弱毒株的构建
由于猪圆环病毒基因改造型弱毒株(PCV2-△Cap)不具有感染性，将获得的pcDNA3.1-PCV2-Cap表达载体(或者PCV2-△Cap)转染含有PCV2-△Cap(或者pcDNA3.1-PCV2-Cap表达载体)的PK-15细胞，通过表达产物在细胞中借助细胞的加工与修饰，完成病毒的组装，从而筛选出具有感染性的基因改造型猪圆环病毒弱毒株，命名为m2PCV2-△Cap。具体操作如下：
用pSK-PCV2-△Cap转染处于对数生长期的PK-15细胞。培养24小时后，将细胞液吸出，基础细胞培养液洗涤细胞3次。采用脂质体转染法将pcDNA3.1-PCV2-Cap转染上述细胞。48小时后收集细胞，并进行荧光定量PCR检测，分析病毒基因组复制情况。应用间接免疫荧光，检测病毒的感染情况。
间接免疫荧光检测：将上述转染细胞盲传5代，感染细胞培养72小时后进行如下操作：
(1)细胞固定：培养72小时后取出细胞培养板，将病毒液倒入含有2％NaOH的废液桶中，然后每孔加入1000μl的PBST(0.1mol/L的PBS中加入0.05％的吐温20),洗4次，每孔加入200μl 80％预冷丙酮，室温固定10分钟。弃去固定液，放置于生物安全柜中约5分钟使细胞板自然干燥。
(2)一抗反应：每孔加入1000μl PBST，洗4次。然后每孔加入用1％PBA1000倍稀释的PCV2单克隆抗体，每孔200μl，置4℃缓慢振荡感作过夜。
(3)二抗反应：去除一抗后，每孔加入1000μl PBST，洗4次。每孔加入用1％PBA200倍稀释的荧光二抗，每孔200μl，置室温感作4小时。最后每孔加入1000μl PBST洗4次。
(4)结果的判定：将PBST倒干后，再加入100μl PBST，并于倒置荧光显微镜下判读，空白细胞对照孔和阴性血清对照孔应无特异性绿色荧光，而病毒接种细胞孔细胞胞核或胞浆应出现特异性绿色荧光。
实施例5.猪圆环病毒病毒含量测定
(1)将mPCV2-△Cap-GFP稀释至病毒含量每毫升为2×101TCID50。
(2)取生长为单层的PK-15细胞，0.25％胰蛋白酶消化细胞后用0.04％台盼蓝染色进行细胞计数，用含8％胎牛血清的DMEM将细胞密度调整至1×105个细胞/ml。将细胞加入到96孔板中，每孔加入100μL。37℃，5％CO2培养箱静置过夜培养。
(3)弃去培养液，将稀释好的mPCV2-△Cap-GFP加入到实验孔中，每孔加入100μL。同时设置孔板对照组。
(4)将检测毒用DMEM维持液作10倍系列稀释(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7)，取各稀释度毒液，分别接种于96孔培养板，每个稀释倍数8个重复，100μL/孔。同时设对照孔。然后将96孔细胞培养板置37℃含5％CO2培养箱中培养。
(5)接种后每日置于倒立荧光显微镜下观察，细胞对照孔应无特异性绿色荧光，病毒接种细胞孔细胞核内应出现特异性绿色荧光。统计每个稀释度含有PCV2阳性细胞的孔数，根据Reed-Muench法计算病毒TCID50。
(6)结果判定：3日后统计病毒阳性孔数量。检测毒阳性孔因存在病毒能够感染细胞，产生Cap蛋白，基因改造型弱毒能够利用检测毒的Cap蛋白组装成具有感染性的基因改造型毒继续感染周围细胞，阳性细胞数量明显多于只含有基因改造型毒株的细胞孔。图9是本发明病毒含量测定检测示意图。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天康制药（苏州）有限公司
<120> 一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用
<130> PA21007744
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1894
<212> DNA
<213> 截短插入GFP后PCV2基因组序列
<400> 1
ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg attggaagac 60
gaatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggcaaa agcaaatggg ctgctaattt 120
tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg atggttacca 180
tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg atgatctact 240
gagactctgt gatcgatatc ctttgtctgt tgagactaaa ggtggaactg tacctttttt 300
ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact cctcaactgc 360
tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt ggaagaatgc 420
tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc catgccctga 480
atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt ttttattatt 540
cacttactac ataccgtgtg taataccagc agctgttaca aactcaagaa gcaccatatg 600
gtctctcttt tcgttgggat ctttagaaag agcagattgt gtggacaggt aatggttgtc 660
tggtaaaaga acagggccat cgccaattgg agtattttgt tgataatggt ctgctagttg 720
aacacttcca tcttcaatgt tgtgtctaat tttgaagtta actttgattc cattcttttg 780
tttgtctgcc ataatgtata cattgtgtga gttatagttg tattccaatt tgtgtccaag 840
aatgtttcca tcttctttaa aatcaatacc ttttaactcg attctattaa caagggtatc 900
accttcaaac ttaacttcag cacgtgtctt gtagttaccg tcatctttga aaaaaatagt 960
tctttcttgt acataacctt cgggcattgc actcttgaaa aagtcgtgcc gtttcatgtg 1020
atctgggtat cttgaaaaac attgaacacc ataagtcaaa gtagtaacaa gtgttggcca 1080
gggaacaggt agttttccag tagtacaaat aaatttaagg gtaagttttc cgtatgttgc 1140
atcaccttca ccctctccac taacagaaaa tttgtgacca ttaacatcac catctaattc 1200
aacaagaatt gtcacaactc cagtgaaaag ttcttctcct tttttccttc tccagcggta 1260
acggtggcgg gggtggacga gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa gatggctgcg 1320
ggggcggtgt cttcttctcc ggtaacgcct ccttggatac gtcatagctg aaaacgaaag 1380
aagtgcgctg taagtattac cagcgcactt cggcagcggc agcacctcgg cagcacctca 1440
gcagcaacat gcccagcaag aagaatggaa gaagcggacc ccaaccacat aaaaggtggg 1500
tgttcacgct gaataatcct tccgaagacg agcgcaagaa aatacgggag ctcccaatct 1560
ccctatttga ttattttatt gttggcgagg agggtaatga ggaaggccga acaccccacc 1620
tacaggggtt cgctaatttt gtgaagaagc aaacttttaa taaagtgaag tggtatttgg 1680
gtgcccgctg ccacatcgag aaagcgaaag gaacagatca gcagaataaa gaatactgca 1740
gtaaagaagg caacttactg atggaatgtg gagctcctag atcacaagga caacggagtg 1800
acctctctac tgctgtgagt accttgttgg agagcggggg tctggtgacc gttgcagagc 1860
agtaccctgt aacgtttgtc agaaatttcc gcgg 1894
<210> 2
<211> 1777
<212> DNA
<213> 基因突变后PCV2基因组序列
<400> 2
ccgcgggctg gctgaacttt tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg attggaagac 60
gaatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggcaaa agcaaatggg ctgctaattt 120
tgcagacccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaac aagtggtggg atggttacca 180
tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg atgatctact 240
gagactctgt gatcgatatc ctttgtctgt tgagactaaa ggtggaactg tacctttttt 300
ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact cctcaactgc 360
tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt ggaagaatgc 420
tacagaacaa tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc catgccctga 480
atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt ttttattatt 540
cacttagggt ttaagtgggg ggtctttaag attaaattct ctgaattgta catacatggt 600
tatacggata ttgtagtcct ggtcgtatat actgttttcg aacgcagtgc cgaggcctac 660
atggtctaca tttccagtag tttgtagtct cagccagagt tgatttcttt tgttattggg 720
ttggaagtaa tcgattgttc catcaaggac aggtttcggg gtaaagtacc gggagtggta 780
ggagaagggc tgggttatgg tatggcggga ggagtagttt acataggggt cataggttag 840
ggcattggcc tttgttacaa agttatcatc tagaataaca gcagtggagc ccactcccct 900
gtcaccctgg gtgattgggg agcagggcca gaattcaacc ttaaccttcc ttattctgta 960
gtattcaaag ggcacagtga gggggtttga gccccctcct gggggaagaa aatcattaat 1020
attaaatctc atcatgtcca cattccagga gggagttctg actgtggttt tgttgacagt 1080
ataaccgatg gtgcgggaga ggcgggtgtt gaagatgcca tttttccttc tccagcggta 1140
acggtggcgg gggtggacga gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa gatggctgcg 1200
ggggcggtgt cttcgtctgc ggaaacgcct ccttggatac gtcatttaag ctgaaaacga 1260
aagaagtgcg ctgtaagtat taccagcgca cttcggcagc ggcagcacct cggcagcacc 1320
tcagcagcaa catgcccagc aagaagaatg gaagaagcgg accccaacca cataaaaggt 1380
gggtgttcac gctgaataat ccttccgaag acgagcgcaa gaaaatacgg gagctcccaa 1440
tctccctatt tgattatttt attgttggcg aggagggtaa tgaggaaggc cgaacacccc 1500
acctacaggg gttcgctaat tttgtgaaga agcaaacttt taataaagtg aagtggtatt 1560
tgggtgcccg ctgccacatc gagaaagcga aaggaacaga tcagcagaat aaagaatact 1620
gcagtaaaga aggcaactta ctgatggaat gtggagctcc tagatcacaa ggacaacgga 1680
gtgacctctc tactgctgtg agtaccttgt tggagagcgg gggtctggtg accgttgcag 1740
agcagtaccc tgtaacgttt gtcagaaatt tccgcgg 1777
<210> 3
<211> 702
<212> DNA
<213> ORF2基因序列优化前
<400> 3
atgacgtatc caaggaggcg tttccgcaga cgaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60
cagatcctcc gccgccgccc ctggctcgtc cacccccgcc accgttaccg ctggagaagg 120
aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccatcg gttatactgt caacaaaacc 180
acagtcagaa ctccctcctg gaatgtggac atgatgagat ttaatattaa tgattttctt 240
cccccaggag ggggctcaaa ccccctcact gtgccctttg aatactacag aataaggaag 300
gttaaggttg aattctggcc ctgctcccca atcacccagg gtgacagggg agtgggctcc 360
actgctgtta ttctagatga taactttgta acaaaggcca atgccctaac ctatgacccc 420
tatgtaaact actcctcccg ccataccata acccagccct tctcctacca ctcccggtac 480
tttaccccga aacctgtcct tgatggaaca atcgattact tccaacccaa taacaaaaga 540
aatcaactct ggctgagact acaaactact ggaaatgtag accatgtagg cctcggcact 600
gcgttcgaaa acagtatata cgaccaggac tacaatatcc gtataaccat gtatgtacaa 660
ttcagagaat ttaatcttaa agacccccca cttaaaccct aa 702
<210> 4
<211> 702
<212> DNA
<213> ORF2基因序列优化后
<400> 4
atgacctacc cccgccgccg cttccgccgc cgccgccacc gcccccgcag ccacctgggc 60
cagatcctgc gccgccgccc ctggctggtg cacccccgcc accgctaccg ctggcgccgc 120
aagaacggca tcttcaacac ccgcctgagc cgcaccatcg gctacaccgt gaacaagacc 180
accgtgcgca cccccagctg gaacgtggac atgatgcgct tcaacatcaa cgacttcctg 240
ccccccggcg gcggcagcaa ccccctgacc gtgcccttcg agtactaccg catccgcaag 300
gtgaaggtgg agttctggcc ctgcagcccc atcacccagg gcgaccgcgg cgtgggcagc 360
accgccgtga tcctggacga caacttcgtg accaaggcca acgccctgac ctacgacccc 420
tacgtgaact acagcagccg ccacaccatc acccagccct tcagctacca cagccgctac 480
ttcaccccca agcccgtgct ggacggcacc atcgactact tccagcccaa caacaagcgc 540
aaccagctgt ggctgcgcct gcagaccacc ggcaacgtgg accacgtggg cctgggcacc 600
gccttcgaga acagcatcta cgaccaggac tacaacatcc gcatcaccat gtacgtgcag 660
ttccgcgagt tcaacctgaa ggaccccccc ctgaagccct aa 702
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaagggggcc agttcgtcac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tccaattggc gatggccctg 20

Claims (7)

1.一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株在猪圆环病毒含量测定中的应用，其特征在于，所述弱毒株的基因中部分编码衣壳蛋白Cap的核苷酸序列被荧光蛋白编码基因的核苷酸序列替换；
所述病毒含量测定包括以下步骤：
(i)培养所述基因改造型弱毒株并测定病毒含量，将病毒浓度调整到每毫升不高于100个病毒；
(ii)将PK-15细胞悬液接种到96孔板中培养过夜；
(iii)弃去所述96孔板中的培养液，并接种所述基因改造型弱毒株；
(iv)将待测猪圆环病毒毒液进行梯度稀释后，分别接种于步骤(iii)的96孔板中进行培养；
(v)在倒置荧光显微镜下观察细胞感染及荧光表达情况；统计每个稀释度含有PCV2阳性细胞的孔数，根据Reed-Muench法计算病毒TCID50。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述弱毒株的基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示或如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(i)中通过浓缩的方式提高病毒的滴度。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(ii)中，PK-15细胞悬液的密度为0.2～1×105cells/ml，每孔添加80～100μL。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(iii)中，每孔接种所述基因改造型弱毒株80～100μL。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(iv)中，将待检测猪圆环病毒毒液用DMEM维持液进行10倍系列稀释，同时设置对照孔。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述步骤(v)中，对照孔无特异性绿色荧光，病毒接种细胞孔细胞核内出现特异性绿色荧光。
CN202110623057.7A 2021-06-04 2021-06-04 一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用 Active CN113355292B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110623057.7A CN113355292B (zh) 2021-06-04 2021-06-04 一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110623057.7A CN113355292B (zh) 2021-06-04 2021-06-04 一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113355292A CN113355292A (zh) 2021-09-07
CN113355292B true CN113355292B (zh) 2024-02-06

Family

ID=77532060

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110623057.7A Active CN113355292B (zh) 2021-06-04 2021-06-04 一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113355292B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109943590B (zh) * 2019-04-18 2022-11-18 西南大学 一种复制缺陷型猪圆环病毒、其制备方法及应用
CN114958776B (zh) * 2022-06-30 2024-02-06 天康制药股份有限公司 Pcv2单克隆抗体及分泌其的杂交瘤细胞株1a6

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001287720A1 (en) * 2000-09-08 2002-03-22 Medigene Aktiengesellschaft Host cells for packing a recombinant adeno-associated virus (RAAV), method for the production and use thereof
CA2816242A1 (en) * 2002-02-13 2003-08-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Signal for packaging of influenza virus vectors
CN101792743A (zh) * 2010-04-07 2010-08-04 西北农林科技大学 表达pcv-2免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用
CN102839189A (zh) * 2012-07-18 2012-12-26 华南农业大学 利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法
CN103275938A (zh) * 2013-05-07 2013-09-04 上海市农业科学院 猪圆环病毒弱毒疫苗株的制备方法
CN109943590A (zh) * 2019-04-18 2019-06-28 西南大学 一种复制缺陷型猪圆环病毒、其制备方法及应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0811281A2 (pt) * 2007-05-07 2014-10-21 Univ Colorado Flavivírus de genoma de dois componentes e seus usos
WO2017187277A2 (en) * 2016-03-07 2017-11-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric porcine circovirus type 2 (pcv2) vaccines

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001287720A1 (en) * 2000-09-08 2002-03-22 Medigene Aktiengesellschaft Host cells for packing a recombinant adeno-associated virus (RAAV), method for the production and use thereof
CA2816242A1 (en) * 2002-02-13 2003-08-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Signal for packaging of influenza virus vectors
CN101792743A (zh) * 2010-04-07 2010-08-04 西北农林科技大学 表达pcv-2免疫原基因的重组杆状病毒及其制备和应用
CN102839189A (zh) * 2012-07-18 2012-12-26 华南农业大学 利用pCold-sumo表达载体高效表达PCV 2 Cap蛋白的方法
CN103275938A (zh) * 2013-05-07 2013-09-04 上海市农业科学院 猪圆环病毒弱毒疫苗株的制备方法
CN109943590A (zh) * 2019-04-18 2019-06-28 西南大学 一种复制缺陷型猪圆环病毒、其制备方法及应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Dengue virus utilizes calcium modulating cyclophilin-binding ligand to subvert apoptosis";Li 等;《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》;第418卷(第4期);622-627 *
"SV40 VP4表达缺陷突变体表现出温度敏感的生长缺陷";Tange 等;《中国畜牧兽医》;第38卷(第5期);137 *
"The open reading frame 3 (ORF3) of porcine circovirus type 2 (PCV2) is dispensable for virus infection but evidence of reduced pathogenicity is limited in pigs infected by an ORF3-null PCV2 mutant";Juhan 等;《VIRUS RESEARCH》;第147 卷(第1期);60-66 *
"猪2型圆环病毒核酸疫苗及重组伪狂犬病毒二价基因工程疫苗的研究";宋云峰;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》(第2期);D050-36 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113355292A (zh) 2021-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105647971B (zh) 一种非洲猪瘟p30蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法
CN113355292B (zh) 一种猪圆环病毒基因改造型弱毒株、构建方法及其应用
CN112143712B (zh) 一种重组腺相关病毒及其制备方法和在抗体检测的应用
CN111676248A (zh) 表达新型冠状病毒S基因与流感M1基因嵌合SARS-CoV-2 VLP的构建
CN110951699B (zh) 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用
CN106755089B (zh) 表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用
CN109207441B (zh) 重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白及其构建方法与引物
CN112301043A (zh) 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子、其构建方法及应用
CN111518777A (zh) 一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白f1的重组杆状病毒的构建方法
CN111534547A (zh) 一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白f2的重组杆状病毒的构建方法
CN110468155B (zh) 一种用于拯救猪肠道甲型冠状病毒的系统、方法及应用
CN110144334B (zh) 一种共表达草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白vp4和vp35的重组杆状病毒的制备方法和应用
CN107298700B (zh) 人工改造的PCV2 Rep蛋白、重组PCV2病毒及其应用
CN114657213B (zh) 一种猪急性腹泻综合征冠状病毒人工染色体重组载体及其构建方法和应用
CN117025640A (zh) 一种稳定表达犬细小病毒衣壳蛋白vp1与vp2的细胞系及其制备方法
CN116463297A (zh) 一种表达鸡传染性贫血病病毒vp1蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法
CN108130340B (zh) 表达鸭源禽流感病毒ns1蛋白的方法以及该方法的应用
CN113061625B (zh) 一种复制缺陷型犬细小病毒包装载体、复制缺陷型重组犬细小病毒及制备与应用
CN114107389A (zh) 表达非洲猪瘟病毒b602l-b646l蛋白的重组腺病毒及构建方法
CN105749272B (zh) 表达大熊猫犬瘟热病毒h、f基因重组山羊痘病毒的疫苗、其制备方法及免疫应用方法
CN111394315A (zh) 表达猪CD163和CD169分子的悬浮Marc145细胞系
CN111349621A (zh) 一种重组杆状病毒及其在制备新城疫病毒样颗粒中的应用
CN111235114A (zh) 一种ev71复制缺陷型病毒及其制备方法和应用
CN110592139A (zh) 一种柞蚕核型多角体病毒穿梭载体的构建方法及应用
CN116376981A (zh) 一种重组犬细小病毒假病毒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: 215000 station 6-013, 6 / F, No. 88, modern Avenue, Suzhou Industrial Park, Suzhou area, China (Jiangsu) pilot Free Trade Zone, Suzhou, Jiangsu (cluster registration)

Applicant after: Tiankang Pharmaceutical Co.,Ltd.

Address before: 215000 station 6-013, 6 / F, No. 88, modern Avenue, Suzhou Industrial Park, Suzhou area, China (Jiangsu) pilot Free Trade Zone, Suzhou, Jiangsu (cluster registration)

Applicant before: Tiankang Pharmaceutical (Suzhou) Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant