CN112301043A - 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子、其构建方法及应用 - Google Patents

一种新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子、其构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒SARS‑CoV‑2复制子、其构建方法及应用，属于病毒学和分子生物学技术领域。所述新型冠状病毒SARS‑CoV‑2复制子为带有单报告基因的SARS‑CoV‑2‑GFP复制子或者带有双报告基因的SARS‑CoV‑2‑GFP‑Luc复制子。本发明还公开了上述新型冠状病毒SARS‑CoV‑2复制子的构建方法及应用。本发明的新型冠状病毒SARS‑CoV‑2复制子，无感染性病毒颗粒的产生，有效降低了利用感染性病毒颗粒筛选抗病毒药物过程中的生物安全风险；同时该复制子所带的报告基因可以允许开展高通量筛选，极大地提高了针对抗新型冠状病毒药物筛选的效率。

Description

一种新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子、其构建方法及应用
技术领域
本发明涉及一种新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子、其构建方法及应用，属于病毒学和分子生物学技术领域。
背景技术
通过实验室高通量深度测序技术及流行病学的病因学调查，引起该肺炎的病原体被鉴定为一种新型的冠状病毒。2020年2月11日，国际病毒分类委员会(ICTV)发表 声明，将新型冠状病毒(2019-nCoV)正式分类名命名为“SARS-CoV-2”，即严重急性 呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)。截 至2020年8月，世界卫生组织共收到了全球范围内超过2000万的感染病例和超76万 的死亡病例报道。新型冠状病毒疫情发生以来，世界各国的科学家开始联合起来，致 力于疫苗、抗病毒药物和抗体药物等的研究。目前，就抗病毒药物而言，虽然一些药 物已被用于临床治疗并开展了临床实验，但临床疗效并不显著。特异性抗病毒药物的 筛选和研发是当前应对疫情工作的重点。
病毒的反向遗传学是研究病毒生命周期、研发和评价抗病毒药物的重要工具。复制 子是反向遗传学的一种重要研究手段，在RNA病毒的研究中广泛应用。复制子的核心 是在细胞内能够进行自我复制的核酸，包括来源于病毒基因组的病毒复制所需的所有 信号、用于调控RNA合成的元件以及报告基因。与病毒感染性cDNA克隆相比，复制子 缺少病毒的结构蛋白元件，不能产生感染性的病毒颗粒，因此，复制子可以作为一种 安全的工具应用于抗病毒药物、病毒复制过程的研究及复制相关宿主因子的筛选。但 是，目前并没有带有报告基因的SARS-CoV-2复制子的研究报道。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子。本发明的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子，无感染性病毒颗粒的产生，有效降低了利用感染性病毒 颗粒筛选抗病毒药物过程中的生物安全风险；同时该复制子所带的报告基因可以允许 开展高通量筛选，极大地提高了针对抗新型冠状病毒药物筛选的效率。
本发明解决上述技术问题的方案如下：一种新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子，所述新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子为带有单报告基因的SARS-CoV-2-GFP复制子或者 带有双报告基因的SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子，其中，所述SARS-CoV-2-GFP复制子 包括如下元件：CMV启动子、5'非翻译区、去除NSP1蛋白的ORF1ab编码序列、tGFP编 码序列、ORF8第238-366区间编码序列、核衣壳蛋白编码序列、3'非翻译区、丁肝病 毒核酶编码序列和牛生长激素多腺苷酸化信号；所述SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子包括 如下元件：CMV启动子、5'非翻译区、去除NSP1蛋白的ORF1ab编码序列、tGFP编码序 列、荧光素酶编码序列、杀稻瘟菌素抗性基因编码序列、ORF8第238-366区间编码序 列、核衣壳蛋白编码序列、3'非翻译区、丁肝病毒核酶编码序列和牛生长激素多腺苷 酸化信号。
本发明的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的原理是：
上述CMV启动子，从人巨细胞病毒(Cytomegalovirus)中发现的强启动子。CMV 启动子被认为是真核生物中最强的启动子之一。它能够在真核细胞中高效的启动其下 游的基因转录。
上述非翻译区(英文全称是Untranslated Region,简称UTR)，是指位于mRNA链编码区两端不翻译为蛋白质的片段，位于编码区上游的mRNA片段被称为5'非翻译区 (5'-Untranslated Region，5'-UTR)，位于编码区下游则被称为3'非翻译区 (3'-UntranslatedRegion，3'-UTR)。在冠状病毒基因组中，位于基因组5'端的非翻 译区称之为5'非翻译区；位于基因组3'端的非翻译区称之为3'非翻译区。非翻译区密 切调控基因转录前和转录后的表达，5'非翻译区能够影响基因的mRNA的翻译效率、稳 定性以及出核转运，从而导致蛋白表达水平的改变；3'非翻译区则主要影响mRNA的稳 定性和翻译。
上述ORF,英文全称是Open Reading Frame,中文名称是开放读码框。利用NCBI上的ORFfinder工具进行该病毒的基因组注释分析，发现新型冠状病毒SARS-CoV-2基因 组中共有14个开放阅读框(具有编码基因的能力)，ORF1a、ORF1b和4种结构蛋白：S 蛋白(Spikeprotein，刺突蛋白)、M蛋白(membrane protein膜蛋白)、E蛋白(envelope protein，包膜蛋白)和N蛋白(nucleocapsid，核衣壳蛋白)基因。
上述去除NSP1蛋白的ORF1ab编码序列，指在ORF1ab编码基因中删除能够编码NSP1蛋白的基因序列。
上述tGFP(turboGFP的简称)，是传统GFP的改进版本。GFP，英文名称是Greenfluorescent protein，中文名称是绿色荧光蛋白。绿色荧光蛋白是一类存在于水母、 水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白，在受到紫外或蓝光激发时，绿色荧光蛋 白发射绿色荧光，其检测方便，只需激发光源，不需任何底物或辅助因子，且材料可 活体观测。同时，绿色荧光蛋白生色基团的形成无种属特异性，在原核真核细胞中都 能表达，其表达产物对细胞基本没有毒害作用，并且不影响细胞的正常生长和功能。 绿色荧光蛋白是近年来发现的生物安全标记基因之一。在真核细胞中表达时，tGFP比 GFP的荧光强度更高，且可以稳定存在。
上述荧光素酶，英文名称是Firefly luciferase。荧光素酶是一种以ATP、荧光 素以及氧为底物，镁离子为激活剂，催化生物体内荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类 酶的总称。荧光素酶是由单一的多肽链组成的，在有O2、Mg2+和ATP存在的条件下，与 底物反应形成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，该复合物经过氧化脱羧作用成为 处于激活状态的氧化荧光素，将化学能转化为光能，并释放出光量子，发出荧光。荧 光素酶的活性可以直接通过生物发光的抑制进行检测，具有灵敏度高、特异性好、反 应迅速、操作简便等优点。
tGFP和荧光素酶基因编码的蛋白水平都可便于检测病毒基因组的复制。
上述杀稻瘟菌素，英文全称是Blasticidin。它是从灰色链霉菌分离到的一种核苷肽类抗生素。其作用机制主要通过干扰核糖体中肽键的形成来特异性的抑制原核和真 核细胞的蛋白质合成。带有杀稻瘟菌素抗性基因的真核细胞可以有效抵抗杀稻瘟菌素 的毒力作用，从而达到克隆筛选的目的。
上述ORF8第238-366区间编码序列是指能够表达ORF8第238-366区间的基因序列。
上述核衣壳蛋白,英文全称是Nucleocapsid Protein，简称是NP。
上述丁肝病毒核酶，英文全称是Hepatitis Delta Virus Ribozyme，简称是HDVRZ。
上述牛生长激素多腺苷酸化信号，英文全称是Bovine Growth Hormone PolyA，简称是BGH PolyA。
综上，本发明将上述有功能的各个基因元件依次组装在同一质粒载体中，最终形成新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子。各个基因元件行使各自的功能，使复制子在细胞 内能够完成自我复制、抗性筛选和报告基因表达等功能。
本发明的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的有益效果是：
1、本发明的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子，无感染性病毒颗粒的产生，有效 降低了利用感染性病毒颗粒筛选抗病毒药物过程中的生物安全风险；同时该复制子所 带的报告基因可以允许开展高通量筛选，极大地提高了针对抗新型冠状病毒药物筛选 的效率。
2、本发明的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子，可以为带有单报告基因(tGFP) 的SARS-CoV-2-GFP复制子，也可以带有双报告基因(tGFP和荧光素酶)的 SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子，这两种复制子均能稳定复制，并能高效表达tGFP和荧光 素酶。其中，SARS-CoV-2-GFP复制子可以用于荧光显微镜等检测手段，从而可以对待 筛选的药物进行高通量的直观的检测和筛选，方便快捷；SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子 对于所筛选的药物或宿主限制因子的覆盖范围更加广泛，适用性更强。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述5'非翻译区的 核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述去除NSP1蛋白的ORF1ab编码序列的核苷酸序 列如SEQID NO.3所示；所述tGFP编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述 荧光素酶编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述杀稻瘟菌素抗性基因编码 序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述ORF8第238-366区间编码序列的核苷酸 序列如SEQ ID NO.7所示；所述核衣壳蛋白编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所 示；所述3'非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述丁肝病毒核酶编码序列 的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述牛生长激素多腺苷酸化信号的核苷酸序列如 SEQ ID NO.11所示。
本发明的目的之二，是提供上述新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的构建方法。本发明的构建方法充分应用了基因重组技术和原理，可以准确、快捷的制备所需基因片 段，以酵母菌作为工程菌进行基因片段的装载，高效的依托片段之间以及片段与质粒 载体之间的同源臂序列进行同源重组和多片段的组装。
本发明解决上述技术问题的方案如下：上述新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：制备复制子基因片段
步骤1.1：提取新型冠状病毒SARS-CoV-2的RNA，进行反转录聚合酶链式反应， 得到cDNA；
步骤1.2：将CMV启动子和5'非翻译区通过基因合成后，进行PCR扩增，得到片 段1；
步骤1.3：以步骤1.1得到的cDNA为模板，采用22对引物对，进行PCR扩增，分 别得到片段2-片段22和片段25；
步骤1.4：以pCMV6-AN-GFP质粒为模板，进行PCR扩增，得到tGFP编码序列，即 片段23；
步骤1.5：将杀稻瘟菌素抗性基因编码序列和ORF8第238-366区间编码序列通过基因合成后，进行PCR扩增，得到片段24；
步骤1.6：将3'非翻译区、丁肝病毒核酶编码序列和牛生长激素多腺苷酸化信号通过基因合成后，进行PCR扩增，得到片段26；
步骤1.7：分别PCR扩增杀稻瘟菌素抗性基因编码序列、PCR扩增ORF8第238-366 区间编码序列，在PGL3载体上PCR扩增荧光素酶编码序列，再采用重叠延伸PCR反应， 将杀稻瘟菌素抗性基因编码序列的PCR扩增产物、荧光素酶的编码序列的PCR扩增产 物和ORF8第238-366区间编码序列的PCR扩增产物进行拼接，得到片段24-Luc；
步骤1.8：采用重叠延伸PCR反应，将步骤1.2的片段1、步骤1.3的片段2-片段 22、步骤1.4的片段23、步骤1.5的片段24、步骤1.3的片段25和步骤1.6的片段 26进行组装缝合，得到如下基因片段：F1-4、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、 F20-22、F23-24和F25-26；
步骤1.9：将步骤1.8得到的基因片段F1-4连接T载体，通过缺失突变，得到去 掉NSP1的基因片段：F1-4：F1-4ΔNSP1；
步骤2：构建重组质粒
将步骤1得到的9个基因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23-24和F25-26，与pYES1L线性化质粒载体一同在酵母细胞内进行重组， 得到用于构建SARS-CoV-2-GFP复制子的重组质粒；
或者将步骤1得到的10个基因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23、F24-Luc和F25-26，与pYES1L线性化质粒载体一同在酵母细 胞内进行重组，得到用于构建SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子的重组质粒；
步骤3：得到阳性重组酵母质粒
将步骤2得到的重组质粒进行鉴定，得到阳性重组酵母质粒；
步骤4：得到阳性复制子克隆
将步骤3得到的阳性重组酵母质粒，电转化大肠杆菌感受态，得到阳性复制子大肠杆菌单克隆；
步骤5：复制子质粒的大量提取和测序验证
将步骤4得到的阳性复制子大肠杆菌单克隆，进行大量提取和测序验证，即得到SARS-CoV-2-GFP复制子或者SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子。
本发明的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的构建方法的原理是：
本发明的步骤1.1中，新型冠状病毒SARS-CoV-2在GenBank的登录号为 NC_045512.2。
本发明的步骤1.2、步骤1.5和步骤1.6中，基因合成均由北京睿博兴科生物技术有限公司完成。
本发明的步骤1.3中，根据新型冠状病毒SARS-CoV-2的基因序列，以每700-1400bp为一个扩增单位设计引物扩增病毒基因片段(片段2-片段22和片段25)，相邻两个片 段间重叠30bp，得到片段2-片段22和片段25，以便进行后续的重叠延伸聚合酶链式 反应(英文名称为Overlap extension PCR)和酵母重组组装。
本发明的步骤1.4中，pCMV6-AN-GFP质粒购自北京傲锐东源生物科技有限公司，货号为PS100019。
本发明的步骤1.7中，PGL3载体，购自Promega公司，货号为E1751。
本发明的步骤1.9中，T载体购自北京全式金生物技术有限公司，货号为CB501-01。
本发明的步骤2中，具有同源臂序列的基因片段与具有同源臂序列的pYES1L质粒载体在工程性的酵母菌细胞中可以通过同源重组进行多片段的、具有正确顺序的组装， 可以高效的组装形成复制子质粒。
本发明的步骤3中，组装正确的复制子质粒应包含所有组装片段。依靠特异性的片段引物对重组后的复制子质粒进行PCR扩增，通过PCR反应和琼脂糖凝胶电泳检测， 在正确DNA大小位置扩增出单一的DNA产物即验证组装的复制子酵母菌细胞克隆的正 确性。
本发明的步骤4中，通过电转化将组装完成的复制子质粒转化入大肠杆菌中，使复制子质粒可以在原核的大肠杆菌中存在。并通过使用特异性片段引物进行PCR反应 和琼脂糖凝胶电泳检测，在正确DNA大小位置扩增出单一的DNA产物即验证电转化入 大肠杆菌中的复制子质粒的稳定存在。
本发明的步骤5中，通过以大肠杆菌为生物载体对复制子质粒进行大规模的扩增，从而获得较高质量的复制子质粒。
综上，本发明通过制备SARS-CoV-2复制子元件相关的基因片段，并通过基因重组技术进行高效且严格的基因片段组装，最终形成了SARS-CoV-2-GFP复制子(带有单报 告基因复制子)或者SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子(带有双报告基因复制子)。
本发明的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的构建方法的有益效果是：
1、本发明的构建方法充分应用了基因重组技术和原理，可以准确、快捷的制备所需基因片段，以酵母菌作为工程菌进行基因片段的装载，高效的依托片段之间以及片 段与质粒载体之间的同源臂序列进行同源重组和多片段的组装。
2、本发明的构建方法简单，操作容易，适合规模化推广应用。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1.2中，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述 5'非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述PCR扩增所采用的引物对是如SEQ ID NO.12所示的引物1F和如SEQ ID NO.13所示的引物1R，反应程序为：98℃预变性 2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min； 所述片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述引物和反应程序，可以得到片段1。
PCR扩增的反应体系参照试剂盒的说明书进行，试剂盒购自北京擎科生物科技有限 公司，货号为TP001。
进一步，步骤1.3中，所述PCR扩增具体是：采用如SEQ ID NO.14所示的引物2F 和如SEQ ID NO.15所示的引物2R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.65所示的片 段2；采用如SEQ ID NO.16所示的引物3F和如SEQ ID NO.17所示的引物3R，对cDNA 进行扩增，得到如SEQ ID NO.66所示的片段3；采用如SEQ ID NO.18所示的引物4F 和如SEQ ID NO.19所示的引物4R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.67所示的片 段4；采用如SEQ ID NO.20所示的引物5F和如SEQ ID NO.21所示的引物5R，对cDNA 进行扩增，得到如SEQ ID NO.68所示的片段5；采用如SEQ ID NO.22所示的引物6F 和如SEQ ID NO.23所示的引物6R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.69所示的片 段6；采用如SEQ ID NO.24所示的引物7F和如SEQ IDNO.25所示的引物7R，对cDNA 进行扩增，得到如SEQ ID NO.70所示的片段7；采用如SEQ IDNO.26所示的引物8F 和如SEQ ID NO.27所示的引物8R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ IDNO.71所示的片 段8；采用如SEQ ID NO.28所示的引物9F和如SEQ ID NO.29所示的引物9R，对cDNA 进行扩增，得到如SEQ ID NO.72所示的片段9；采用如SEQ ID NO.30所示的引物10F和如SEQ ID NO.31所示的引物10R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.73所示的 片段10；采用如SEQ ID NO.32所示的引物11F和如SEQ ID NO.33所示的引物11R， 对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.74所示的片段11；采用如SEQ ID NO.34所示的 引物12F和如SEQ IDNO.35所示的引物12R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.75 所示的片段12；采用如SEQID NO.36所示的引物13F和如SEQ ID NO.37所示的引物 13R，对cDNA进行扩增，得到如SEQID NO.76所示的片段13；采用如SEQ ID NO.38 所示的引物14F和如SEQ ID NO.39所示的引物14R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.77所示的片段14；采用如SEQ ID NO.40所示的引物15F和如SEQ ID NO.41所示 的引物15R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.78所示的片段15；采用如SEQ ID NO.42 所示的引物16F和如SEQ ID NO.43所示的引物16R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.79所示的片段16；采用如SEQ ID NO.44所示的引物17F和如SEQID NO.45所示 的引物17R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.80所示的片段17；采用如SEQ ID NO.46 所示的引物18F和如SEQ ID NO.47所示的引物18R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.81所示的片段18；采用如SEQ ID NO.48所示的引物19F和如SEQ ID NO.49所示的引物19R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.82所示的片段19；采用如SEQ ID NO.50 所示的引物20F和如SEQ ID NO.51所示的引物20R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.83所示的片段20；采用如SEQ ID NO.52所示的引物21F和如SEQ ID NO.53所示 的引物21R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.84所示的片段21；采用如SEQ ID NO.54 所示的引物22F和如SEQ ID NO.55所示的引物22R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.85所示的片段22；采用如SEQ ID NO.60所示的引物25F和如SEQ ID NO.61所示 的引物25R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.88所示的片段25；反应程序均为： 98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃ 延伸5min。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述引物和反应程序，可以得到片段2-片段22和片段25。
PCR扩增的反应体系参照试剂盒的说明书进行，试剂盒购自北京擎科生物科技有限 公司，货号为TP001。
进一步，步骤1.4中，所述PCR扩增所采用的引物对是如SEQ ID NO.56所示的引 物23F和如SEQ ID NO.57所示的引物23R；反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性 15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min；所述片段23的核 苷酸序列如SEQ IDNO.86所示。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述引物和反应程序，可以得到片段23。
PCR扩增的反应体系参照试剂盒的说明书进行，试剂盒购自北京擎科生物科技有限 公司，货号为TP001。
进一步，步骤1.5中，所述杀稻瘟菌素抗性基因编码序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示；所述ORF8第238-366区间编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所 述PCR扩增所采用的引物对是如SEQ ID NO.58所示的引物24F和如SEQ ID NO.59所 示的引物24R，反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延 伸30s，共30个循环；72℃延伸5min；所述片段24的核苷酸序列如SEQ ID NO.87所 示。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述引物和反应程序，可以得到片段24。
PCR扩增的反应体系参照试剂盒的说明书进行，试剂盒购自北京擎科生物科技有限 公司，货号为TP001。
进一步，步骤1.6中，所述3'非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述 丁肝病毒核酶编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述牛生长激素多腺苷酸 化信号的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述PCR扩增所采用的引物对是如SEQ ID NO.62所示的引物26F和如SEQ ID NO.63所示的引物26R；反应程序为：98℃预变性 2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min； 所述片段26的核苷酸序列如SEQ ID NO.89所示。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述引物和反应程序，可以得到片段26。
PCR扩增的反应体系参照试剂盒的说明书进行，试剂盒购自北京擎科生物科技有限 公司，货号为TP001。
进一步，步骤1.7中，所述PCR扩增杀稻瘟菌素抗性基因编码序列所采用的引物 对是如SEQ ID NO.58所示的引物24F和如SEQ ID NO.93所示的引物Bla-R，反应程序 为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环； 72℃延伸5min；所述杀稻瘟菌素抗性基因编码序列如SEQ ID NO.6所示；所述PCR扩 增ORF8第238-366区间编码序列所采用的引物对是如SEQ ID NO.94所示的引物ORF8-F 和如SEQ ID NO.59所示的引物24R，反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s， 58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min；所述ORF8第238-366区 间编码序列如SEQ ID NO.7所示；所述PCR扩增荧光素酶编码序列所采用的引物对是 如SEQ ID NO.91所示的引物Luc-F和如SEQ ID NO.92所示的引物Luc-R，反应程序为： 98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃ 延伸5min；所述荧光素酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述重叠延伸PCR反应 所采用的引物对是如SEQ ID NO.58所示的引物24F和如SEQ ID NO.59所示的引物24R， 反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸2min，共30 个循环；72℃延伸5min；所述片段24-Luc的核苷酸序列如SEQ ID NO.90所示。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述引物和反应程序，可以得到片段24-Luc。
PCR扩增的反应体系参照试剂盒的说明书进行，试剂盒购自北京擎科生物科技有限 公司，货号为TP001。
进一步，步骤1.8中，所述重叠延伸PCR反应具体是：采用如SEQ ID NO.12所示 的引物1F和如SEQ ID NO.19所示的引物4R，对片段1-片段4进行组装缝合，得到基 因片段F1-4；采用如SEQ ID NO.20所示的引物5F和如SEQ ID NO.27所示的引物8R， 对片段5-片段8进行组装缝合，得到基因片段F5-8；采用如SEQ ID NO.28所示的引 物9F和如SEQ ID NO.33所示的引物11R，对片段9-片段11进行组装缝合，得到基因 片段F9-11；采用如SEQ ID NO.34所示的引物12F和如SEQ ID NO.37所示的引物13R， 对片段12-片段13进行组装缝合，得到基因片段F12-13；采用如SEQ ID NO.38所示 的引物14F和如SEQ ID NO.45所示的引物17R，对片段14-片段17进行组装缝合，得 到基因片段F14-17；采用如SEQ ID NO.46所示的引物18F和如SEQ ID NO.49所示的 引物19R，对片段18-片段19进行组装缝合，得到基因片段F18-19；采用如SEQ ID NO.50 所示的引物20F和如SEQ ID NO.55所示的引物22R，对片段20-片段22进行组装缝合， 得到基因片段F20-22；采用如SEQ ID NO.56所示的引物23F和如SEQ ID NO.59所示 的引物24R，对片段23-片段24进行组装缝合，得到基因片段F23-24；采用如SEQ ID NO.60所示的引物25F和如SEQ ID NO.63所示的引物26R，对片段25-片段26进行组 装缝合，得到基因片段F25-26；反应程序均为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃延伸10min。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述引物对和反应程序，可以得到9个用于构建单报告基因复制子的基因片段。
重叠延伸PCR的反应体系参照试剂盒的说明书进行，试剂盒购自北京擎科生物科技有限公司，货号为TP001。
进一步，步骤2中，所述重组质粒的构建方法具体是：
步骤2.1：分别取步骤1得到的9个基因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23-24和F25-26各200ng，或者取步骤1得到的10个基 因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23、F24-Luc 和F25-26各200ng，均与100ng的pYES1L线性化质粒载体混合，真空蒸发浓缩至总体 系≤10μL，得到DNA片段混合液；
步骤2.2：将基因组装系统试剂盒中的PEG和LiAc试剂置于室温水浴中融化，充 分颠倒混匀，得到融化后的PEG和LiAc试剂；
步骤2.3：将MaV203酵母感受态细胞置于30℃水浴中，在90s内融化，得到融化 后的MaV203酵母感受态细胞；
步骤2.4：将步骤2.3得到的融化后的MaV203酵母感受态细胞转移至室温，轻轻 弹散混匀；
步骤2.5：将100μL步骤2.4得到的复苏后的MaV203酵母感受态细胞转移至步骤2.1得到的DNA片段混合液中，轻轻弹散混匀，得到酵母感受态细胞和DNA的混合液；
步骤2.6：将600μL步骤2.2得到的融化后的PEG和LiAc试剂加入到步骤2.5得 到的MaV203酵母感受态细胞和DNA的混合液中，颠倒混匀5-8次，直至体系完全混匀， 得到混合体系；
步骤2.7：将步骤2.6得到的混合体系置于30℃水浴中30min，每10min颠倒混匀 一次；再加入35.5μL的DMSO试剂，颠倒混匀5-8次；然后置于42℃水浴中20min， 每10min颠倒混匀一次，得到热激处理后的混合体系；
步骤2.8：将步骤2.7得到的热激处理后的混合体系，400g室温离心5min，弃去 上清后，用1ml无菌的0.9g/100ml氯化钠溶液重悬酵母细胞，得到悬液；
步骤2.9：吸取100μL步骤2.8得到的悬液，涂布CSM-Trp平板；
步骤2.10：将步骤2.9的CSM-Trp平板置于30℃孵箱培养3天，至酵母单克隆可 见，得到重组质粒酵母菌细胞单克隆。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，可以快速、准确地得到本发明所需要的重组质粒。其中步骤2.1中，真空蒸发的温度为30℃，时间为20min。
步骤2.2中，基因组装系统试剂盒购自赛默飞世尔公司，名称为GeneArt高阶基 因组装系统，货号为A13286。
进一步，步骤3中，所述鉴定的方法是：
步骤3.1：吸取15μL裂解液至Ep管，再挑取加入步骤2得到的重组质粒酵母菌 细胞单克隆，混匀，得到单克隆悬液；
步骤3.2：每个步骤3.1的Ep管均吸取5μL单克隆悬液，转移至新的Ep管中，4℃ 储存备用；
步骤3.3：将每个步骤3.1的Ep管剩余的10μL单克隆悬液，于95℃煮沸5min 后冷却至4℃，采用转速为500g离心1min，得到离心后的Ep管；
步骤3.4：在步骤3.3每个离心后的Ep管中均加入40μL无核酶的水，混匀，得 到稀释后的单克隆悬液；
步骤3.5：进行PCR扩增和电泳判断结果，具体是：采用如SEQ ID NO.34所示的 引物12F和如SEQ ID NO.37所示的引物13R，对F12-13进行扩增，得到的PCR产物经 质量百分数为1％的琼脂糖凝胶电泳，如果在2000bp处扩增出阳性条带，则为阳性重组 酵母质粒；采用如SEQ ID NO.46所示的引物18F和如SEQ ID NO.49所示的引物19R， 对F18-19进行扩增，得到的PCR产物经质量百分数为1％的琼脂糖凝胶电泳，如果在 2000bp处扩增出阳性条带，则为阳性重组酵母质粒；采用如SEQ ID NO.56所示的引物 23F和如SEQ ID NO.61所示的引物25R，对F23-25进行扩增，得到的PCR产物经质量 百分数为1％的琼脂糖凝胶电泳，如果在2700bp处扩增出阳性条带，则为阳性重组酵母 质粒；反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min， 共30个循环；72℃延伸5min。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，可以快速、准确地鉴定得到阳性重组酵母质粒。
反应体系参照试剂盒的说明书进行，试剂盒购自北京擎科生物科技有限公司，货号为TP001。
进一步，步骤4中，所述电转化大肠杆菌感受态的方法是：
步骤4.1：在Ep管中放入4-5颗玻璃珠，加入10μL裂解液，得到混合体系；
步骤4.2：在步骤4.1得到的混合体系中，加入5μL单克隆悬液至体系中，混匀， 室温振荡斡旋5min，得到裂解后的细胞悬液；
步骤4.3：将50μL大肠杆菌感受态细胞在冰上融化后，加入1μL步骤4.2得到 的裂解后的细胞悬液，混匀后，进行电转，得到电转后的培养物；
步骤4.4：在步骤4.3得到的电转后的培养物中，加入250μL室温放置的SOC培 养基，轻轻吹打混匀，转移所有液体至新的Ep管中，置于37℃摇床孵育1h，得到电 转化后细胞悬液；
步骤4.5：取100μL步骤4.4得到的电转化后细胞悬液，涂布含有50μg/ml壮观 霉素的LB平板，37℃培养12h；
步骤4.6：挑取单克隆，进行菌落PCR鉴定，采用如SEQ ID NO.34所示的引物12F 和如SEQ ID NO.37所示的引物13R，反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s， 58℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；如果在2000bp位置处 扩增出阳性条带，则为阳性复制子大肠杆菌单克隆。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，可以实现阳性酵母克隆转化大肠杆菌感受态，且可以通过大肠杆菌为介质得到高拷贝数的复制子质粒。其中，步骤4.2 中，单克隆悬液来自于步骤3.2。
电转化的试剂盒，购自赛默飞世尔公司，名称为One ShotTMTOP10ElectrocompTME.coli，货号为C404052。电转仪购自美国伯乐公司(BIO-RAD)， 型号为MicroPμLser，设置参数参照说明书进行。
进一步，步骤5中，所述大量提取和测序的具体方法是：将步骤4得到的阳性复 制子大肠杆菌单克隆接种于500ml含有50μg/ml壮观霉素的LB液体培养基中，37℃ 摇床培养生长12h，采用质粒大提试剂盒提取质粒，测定浓度并测序验证全长序列，得 到SARS-CoV-2-GFP复制子或者SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子。
采用上述进一步的有益效果是：采用上述方法，可以得到高拷贝数的 SARS-CoV2-GFP或SARS-CoV2-GFP-Luc复制子质粒。
其中，质粒的大量提取，采用QIAGEN质粒大提试剂盒，货号为12663。
本发明的目的之三，是提供上述新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的应用。上述新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子可以用于抗新型冠状病毒药物的筛选，且筛选效率高。
本发明解决上述技术问题的方案如下：上述新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子在抗新型冠状病毒药物筛选中的应用。
本发明的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的应用的有益效果是：
本发明的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子可以用于抗新型冠状病毒药物的筛选，且筛选效率高。
附图说明
图1为新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子所需基因片段构建示意图。图中数字标注表示各基因片段的序号，1-4ΔNSP1表示去除NSP1序列的1-4片段。
图2为新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子组装构建示意图。图中，SARS-CoV-2-GFPReplicon/pYES1L表示以pYES1L为载体的带GFP报告基因的SARS-CoV-2复制子。
图3为使用酵母重组组装构建复制子过程中在CSM-Trp平板上长出的酵母克隆。
图4为对酵母单克隆进行酵母克隆PCR鉴定部分复制子片段。图中，Yeast-1、Yeast-2、Yeast-3和Yeast-4分别表示挑取的酵母单克隆的序号。
图5为对TOP10大肠杆菌单克隆进行细菌克隆PCR鉴定复制子片段。图中，TOP10-1、TOP10-2、TOP10-3、TOP10-4和TOP10-5分别表示挑取的大肠杆菌单克隆序号。
图6为对复制子质粒载体中的全部组装片段进行PCR鉴定。
图7为空白对照组293T细胞，在明场视野下拍摄细胞。
图8为空白对照组293T细胞，在荧光视野下拍摄检测tGFP。
图9为SARS-CoV-2-GFP复制子转染组293T细胞，在明场视野下拍摄细胞。
图10为SARS-CoV-2-GFP复制子转染组293T细胞，在荧光视野下拍摄检测tGFP。
图11为Western Blot检测SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞后报告基因tGFP的表达。图中，Anti-tGFP指使用识别tGFP蛋白的抗体检测到的特异性蛋白条带。
图12为Western Blot检测SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞后SARS-CoV-2 核衣壳蛋白的表达。图中，Anti-N指使用识别N蛋白的抗体检测到的特异性蛋白条带。
图13为Western Blot检测SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞后细胞内 β-actin蛋白的表达。图中，Anti-actin指使用识别actin蛋白的抗体检测到的特异 性蛋白条带。
图14为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞不加E64-D组，在明场视野下拍摄 细胞。
图15为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞不加E64-D组，在荧光视野下拍摄 检测tGFP。
图16为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞加0.1mg/ml浓度的E64-D组，在 明场视野下拍摄细胞。
图17为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞加0.1mg/ml浓度的E64-D组，在 荧光视野下拍摄检测tGFP。
图18为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞加0.2mg/ml浓度的E64-D组，在 明场视野下拍摄细胞。
图19为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞加0.2mg/ml浓度的E64-D组，在 荧光视野下拍摄检测tGFP。
图20为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞，使用0mg/ml、0.1mg/ml和0.2mg/ml浓度梯度的E64-D处理细胞后，Western Blot检测报告基因tGFP的表达。图中， tGFP-BlaR指tGFP报告蛋白与杀稻瘟菌素抗性蛋白融合表达的蛋白。
图21为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞，使用0mg/ml、0.1mg/ml和0.2mg/ml浓度梯度E64-D处理细胞后，Western Blot检测细胞内β-actin蛋白的表达。图中， Actin指细胞内β-actin蛋白。
图22为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞不加瑞德西韦组，在明场视野下拍摄细胞。
图23为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞不加瑞德西韦组，在荧光视野下拍摄检测tGFP。
图24为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞加5μM瑞德西韦组，在明场视野 下拍摄细胞。
图25为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞加5μM瑞德西韦组，在荧光视野 下拍摄检测tGFP。
图26为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞加10μM瑞德西韦组，在明场视野 下拍摄细胞。
图27为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞加10μM瑞德西韦组，在荧光视野 下拍摄检测tGFP。
图28为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞加20μM瑞德西韦组，在明场视野 下拍摄细胞。
图29为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞加20μM瑞德西韦组，在荧光视野 下拍摄检测tGFP。
图30为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞，使用0μM、5μM、10μM和 20μM浓度梯度的瑞德西韦处理细胞后，Western Blot检测报告基因tGFP的表达。图 中，tGFP-BlaR指tGFP报告蛋白与杀稻瘟菌素抗性蛋白融合表达的蛋白。
图31为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞，使用0μM、5μM、10μM和 20μM浓度梯度的瑞德西韦处理细胞后，Western Blot检测细胞内β-actin蛋白的表 达。图中，Actin指细胞内β-actin蛋白。
图32为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞，使用0-60μM浓度梯度的瑞德西 韦处理细胞后，Western Blot检测报告基因tGFP的表达。图中，tGFP-BlaR指tGFP 报告蛋白与杀稻瘟菌素抗性蛋白融合表达的蛋白。
图33为SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞，使用0-60μM浓度梯度的瑞德西 韦处理细胞后，Western Blot检测细胞内β-actin蛋白的表达。图中，Actin指细胞 内β-actin蛋白。
图34为Western Blot检测到的tGFP-Bla/β-actin灰度值测定瑞德西韦的EC50值。图中，Cell viability表示通过CCK8测定的细胞活力；Relatively replication 表示相对复制值。
图35为SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子结构示意图。图中，SARS-CoV-2-GFP-LucReplicon/pYES1L指以pYES1L为载体的带tGFP报告基因和Luciferase报告基因的 SARS-CoV-2复制子。
图36为SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子转染293T细胞，使用0-1000μM浓度梯度 E64-D处理细胞后检测荧光素酶活性读值测定E64-D的EC50值。图中，Cell viability 表示通过CCK8测定的细胞活力；Relatively replication表示相对复制值。
具体实施方式
以下结合具体图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本实施例的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的构建方法，包括如下步骤：
步骤1：制备复制子基因片段
步骤1.1：提取新型冠状病毒SARS-CoV-2的RNA，进行反转录聚合酶链式反应， 得到cDNA。
步骤1.2：将如SEQ ID NO.1所示的CMV启动子和如SEQ ID NO.2所示的5'非翻 译区，通过基因合成(基因合成由北京睿博兴科生物技术有限公司完成，下同)后， 进行PCR扩增。所述PCR扩增所采用的引物对是如SEQ ID NO.12所示的引物1F和如 SEQ ID NO.13所示的引物1R，反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退 火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min，得到如SEQ ID NO.64所示的片 段1。
步骤1.3：以步骤1.1得到的cDNA为模板，采用22对引物对，进行PCR扩增，分 别得到片段2-片段22和片段25。所述PCR扩增具体是：采用如SEQ ID NO.14所示的 引物2F和如SEQ ID NO.15所示的引物2R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.65 所示的片段2；采用如SEQ ID NO.16所示的引物3F和如SEQ ID NO.17所示的引物3R， 对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.66所示的片段3；采用如SEQ ID NO.18所示的 引物4F和如SEQ ID NO.19所示的引物4R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.67 所示的片段4；采用如SEQ ID NO.20所示的引物5F和如SEQ ID NO.21所示的引物5R， 对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.68所示的片段5；采用如SEQ ID NO.22所示的 引物6F和如SEQ ID NO.23所示的引物6R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.69 所示的片段6；采用如SEQ ID NO.24所示的引物7F和如SEQ IDNO.25所示的引物7R， 对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.70所示的片段7；采用如SEQ IDNO.26所示的 引物8F和如SEQ ID NO.27所示的引物8R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ IDNO.71 所示的片段8；采用如SEQ ID NO.28所示的引物9F和如SEQ ID NO.29所示的引物9R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.72所示的片段9；采用如SEQ ID NO.30所示的 引物10F和如SEQ ID NO.31所示的引物10R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.73 所示的片段10；采用如SEQ ID NO.32所示的引物11F和如SEQ ID NO.33所示的引物 11R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.74所示的片段11；采用如SEQ ID NO.34 所示的引物12F和如SEQ IDNO.35所示的引物12R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.75所示的片段12；采用如SEQ IDNO.36所示的引物13F和如SEQ ID NO.37所示 的引物13R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ IDNO.76所示的片段13；采用如SEQ ID NO.38 所示的引物14F和如SEQ ID NO.39所示的引物14R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.77所示的片段14；采用如SEQ ID NO.40所示的引物15F和如SEQ ID NO.41所示 的引物15R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.78所示的片段15；采用如SEQ ID NO.42 所示的引物16F和如SEQ ID NO.43所示的引物16R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.79所示的片段16；采用如SEQ ID NO.44所示的引物17F和如SEQ IDNO.45所示 的引物17R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.80所示的片段17；采用如SEQID NO.46 所示的引物18F和如SEQ ID NO.47所示的引物18R，对cDNA进行扩增，得到如SEQID NO.81所示的片段18；采用如SEQ ID NO.48所示的引物19F和如SEQ ID NO.49所示 的引物19R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.82所示的片段19；采用如SEQ ID NO.50 所示的引物20F和如SEQ ID NO.51所示的引物20R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.83所示的片段20；采用如SEQ ID NO.52所示的引物21F和如SEQ ID NO.53所示 的引物21R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.84所示的片段21；采用如SEQ ID NO.54 所示的引物22F和如SEQID NO.55所示的引物22R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.85所示的片段22；采用如SEQID NO.60所示的引物25F和如SEQ ID NO.61所示 的引物25R，对cDNA进行扩增，得到如SEQID NO.88所示的片段25；反应程序均为： 98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃ 延伸5min。
步骤1.4：以pCMV6-AN-GFP质粒为模板，进行PCR扩增，得到tGFP编码序列，即 如SEQ ID NO.86所示的片段23。所述PCR扩增所采用的引物对是如SEQ ID NO.56所 示的引物23F和如SEQ ID NO.57所示的引物23R；反应程序为：98℃预变性2min；98℃ 变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min。
步骤1.5：将如SEQ ID NO.6所示的杀稻瘟菌素抗性基因编码序列和如SEQ IDNO.7 所示的ORF8第238-366区间编码序列通过基因合成后，进行PCR扩增，得到如SEQ IDNO.87所示的片段24。所述PCR扩增所采用的引物对是如SEQ ID NO.58所示的引物24F 和如SEQ ID NO.59所示的引物24R，反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s， 58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min。
步骤1.6：将如SEQ ID NO.9所示的3'非翻译区、如SEQ ID NO.10所示的丁肝病 毒核酶编码序列和如SEQ ID NO.11所示的牛生长激素多腺苷酸化信号通过基因合成后， 进行PCR扩增，得到如SEQ ID NO.89所示的片段26。所述PCR扩增所采用的引物对是 如SEQ IDNO.62所示的引物26F和如SEQ ID NO.63所示的引物26R；反应程序为：98℃ 预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸 5min。
步骤1.7：分别PCR扩增如SEQ ID NO.6所示的杀稻瘟菌素抗性基因编码序列，所采用的引物对是如SEQ ID NO.58所示的引物24F和如SEQ ID NO.93所示的引物Bla-R， 反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30 个循环；72℃延伸5min；
PCR扩增如SEQ ID NO.7所示的ORF8第238-366区间编码序列，所采用的引物对 是如SEQ ID NO.94所示的引物ORF8-F和如SEQ ID NO.59所示的引物24R，反应程序 为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环； 72℃延伸5min；
在PGL3载体上PCR扩增如SEQ ID NO.5所示的荧光素酶编码序列，所采用的引物对是如SEQ ID NO.91所示的引物Luc-F和如SEQ ID NO.92所示的引物Luc-R，反应程 序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环； 72℃延伸5min；
再采用重叠延伸PCR反应，将杀稻瘟菌素抗性基因编码序列的PCR扩增产物、荧 光素酶的编码序列的PCR扩增产物和ORF8第238-366区间编码序列的PCR扩增产物进 行拼接，得到如SEQ ID NO.90所示的片段24-Luc；所述重叠延伸PCR反应所采用的引 物对是如SEQID NO.58所示的引物24F和如SEQ ID NO.59所示的引物24R，反应程序 为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸2min，共30个循环； 72℃延伸5min。
步骤1.8：采用重叠延伸PCR反应，将步骤1.2的片段1、步骤1.3的片段2-片段 22、步骤1.4的片段23、步骤1.5的片段24、步骤1.3的片段25和步骤1.6的片段 26进行组装缝合，得到如下基因片段：F1-4、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、 F20-22、F23-24和F25-26；所述重叠延伸PCR反应具体是：采用如SEQ ID NO.12所 示的引物1F和如SEQ ID NO.19所示的引物4R，对片段1-片段4进行组装缝合，得到 基因片段F1-4；采用如SEQ ID NO.20所示的引物5F和如SEQ ID NO.27所示的引物 8R，对片段5-片段8进行组装缝合，得到基因片段F5-8；采用如SEQ ID NO.28所示 的引物9F和如SEQ ID NO.33所示的引物11R，对片段9-片段11进行组装缝合，得到 基因片段F9-11；采用如SEQ ID NO.34所示的引物12F和如SEQID NO.37所示的引物 13R，对片段12-片段13进行组装缝合，得到基因片段F12-13；采用如SEQ ID NO.38 所示的引物14F和如SEQ ID NO.45所示的引物17R，对片段14-片段17进行组装缝合， 得到基因片段F14-17；采用如SEQ ID NO.46所示的引物18F和如SEQ ID NO.49所示 的引物19R，对片段18-片段19进行组装缝合，得到基因片段F18-19；采用如SEQ IDNO.50所示的引物20F和如SEQ ID NO.55所示的引物22R，对片段20-片段22进行组 装缝合，得到基因片段F20-22；采用如SEQ ID NO.56所示的引物23F和如SEQ ID NO.59 所示的引物24R，对片段23-片段24进行组装缝合，得到基因片段F23-24；采用如SEQ ID NO.60所示的引物25F和如SEQ ID NO.63所示的引物26R，对片段25-片段26进行 组装缝合，得到基因片段F25-26；反应程序均为：98℃预变性2min；98℃变性15s， 58℃退火15s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃延伸10min。
步骤1.9：将步骤1.8得到的基因片段F1-4连接T载体，通过缺失突变，得到去 掉NSP1的基因片段：F1-4：F1-4ΔNSP1。
步骤2：构建重组质粒
将步骤1得到的9个基因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23-24和F25-26，与pYES1L线性化质粒载体一同在酵母细胞内进行重组， 得到用于构建SARS-CoV-2-GFP复制子的重组质粒；
或者将步骤1得到的10个基因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23、F24-Luc和F25-26，与pYES1L线性化质粒载体一同在酵母细 胞内进行重组，得到用于构建SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子的重组质粒；
所述重组质粒的构建方法具体是：
步骤2.1：分别取步骤1得到的9个基因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23-24和F25-26各200ng，或者取步骤1得到的10个基 因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23、F24-Luc 和F25-26各200ng，均与100ng的pYES1L线性化质粒载体混合，真空蒸发浓缩至总体 系≤10μL，得到DNA片段混合液；
步骤2.2：将基因组装系统试剂盒中的PEG和LiAc试剂置于室温水浴中融化，充 分颠倒混匀，得到融化后的PEG和LiAc试剂；
步骤2.3：将MaV203酵母感受态细胞置于30℃水浴中，在90s内融化，得到融化 后的MaV203酵母感受态细胞；
步骤2.4：将步骤2.3得到的融化后的MaV203酵母感受态细胞转移至室温，轻轻 弹散混匀；
步骤2.5：将100μL步骤2.4得到的复苏后的MaV203酵母感受态细胞转移至步骤2.1得到的DNA片段混合液中，轻轻弹散混匀，得到酵母感受态细胞和DNA的混合液；
步骤2.6：将600μL步骤2.2得到的融化后的PEG和LiAc试剂加入到步骤2.5得 到的MaV203酵母感受态细胞和DNA的混合液中，颠倒混匀5-8次，直至体系完全混匀， 得到混合体系；
步骤2.7：将步骤2.6得到的混合体系置于30℃水浴中30min，每10min颠倒混匀 一次；再加入35.5μL的DMSO试剂，颠倒混匀5-8次；然后置于42℃水浴中20min， 每10min颠倒混匀一次，得到热激处理后的混合体系；
步骤2.8：将步骤2.7得到的热激处理后的混合体系，400g室温离心5min，弃去 上清后，用1ml无菌的0.9g/100ml氯化钠溶液重悬酵母细胞，得到悬液；
步骤2.9：吸取100μL步骤2.8得到的悬液，涂布CSM-Trp平板；
步骤2.10：将步骤2.9的CSM-Trp平板置于30℃孵箱培养3天，至酵母单克隆可 见，得到重组质粒酵母菌细胞单克隆。
步骤3：得到阳性重组酵母质粒
将步骤2得到的重组质粒进行鉴定，得到阳性重组酵母质粒，具体是：
步骤3.1：吸取15μL裂解液至Ep管，再挑取加入步骤2得到的重组质粒酵母菌 细胞单克隆，混匀，得到单克隆悬液；
步骤3.2：每个步骤3.1的Ep管均吸取5μL单克隆悬液，转移至新的Ep管中，4℃ 储存备用；
步骤3.3：将每个步骤3.1的Ep管剩余的10μL单克隆悬液，于95℃煮沸5min 后冷却至4℃，采用转速为500g离心1min，得到离心后的Ep管；
步骤3.4：在步骤3.3每个离心后的Ep管中均加入40μL无核酶的水，混匀，得 到稀释后的单克隆悬液；
步骤3.5：进行PCR扩增和电泳判断结果，具体是：采用如SEQ ID NO.34所示的 引物12F和如SEQ ID NO.37所示的引物13R，对F12-13进行扩增，得到的PCR产物经 质量百分数为1％的琼脂糖凝胶电泳，如果在2000bp处扩增出阳性条带，则为阳性重组 酵母质粒；采用如SEQ ID NO.46所示的引物18F和如SEQ ID NO.49所示的引物19R， 对F18-19进行扩增，得到的PCR产物经质量百分数为1％的琼脂糖凝胶电泳，如果在 2000bp处扩增出阳性条带，则为阳性重组酵母质粒；采用如SEQ ID NO.56所示的引物 23F和如SEQ ID NO.61所示的引物25R，对F23-25进行扩增，得到的PCR产物经质量 百分数为1％的琼脂糖凝胶电泳，如果在2700bp处扩增出阳性条带，则为阳性重组酵母 质粒；反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min， 共30个循环；72℃延伸5min。
步骤4：得到阳性复制子克隆
将步骤3得到的阳性重组酵母质粒，电转化大肠杆菌感受态，得到阳性复制子大肠杆菌单克隆，具体是：
步骤4.1：在Ep管中放入4-5颗玻璃珠，加入10μL裂解液，得到混合体系；
步骤4.2：在步骤4.1得到的混合体系中，加入5μL单克隆悬液至体系中，混匀， 室温振荡斡旋5min，得到裂解后的细胞悬液；
步骤4.3：将50μL大肠杆菌感受态细胞在冰上融化后，加入1μL步骤4.2得到 的裂解后的细胞悬液，混匀后，进行电转，得到电转后的培养物；
步骤4.4：在步骤4.3得到的电转后的培养物中，加入250μL室温放置的SOC培 养基，轻轻吹打混匀，转移所有液体至新的Ep管中，置于37℃摇床孵育1h，得到电 转化后细胞悬液；
步骤4.5：取100μL步骤4.4得到的电转化后细胞悬液，涂布含有50μg/ml壮观 霉素的LB平板，37℃培养12h；
步骤4.6：挑取单克隆，进行菌落PCR鉴定，采用如SEQ ID NO.34所示的引物12F 和如SEQ ID NO.37所示的引物13R，反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s， 58℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；如果在2000bp位置处 扩增出阳性条带，则为阳性复制子大肠杆菌单克隆。
步骤5：复制子质粒的大量提取和测序验证
将步骤4得到的阳性复制子大肠杆菌单克隆接种于500ml含有50μg/ml壮观霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养生长12h，采用质粒大提试剂盒提取质粒，测定浓 度并测序验证，得到SARS-CoV-2-GFP复制子或者SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子。
所述SARS-CoV-2-GFP复制子带有单报告基因，包括如下元件：CMV启动子、5'非 翻译区、去除NSP1蛋白的ORF1ab编码序列、tGFP编码序列、ORF8第238-366区间编 码序列、核衣壳蛋白编码序列、3'非翻译区、丁肝病毒核酶编码序列和牛生长激素多 腺苷酸化信号。
所述SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子，带有双报告基因，包括如下元件：CMV启动子、5'非翻译区、去除NSP1蛋白的ORF1ab编码序列、tGFP编码序列、荧光素酶编码序列、 杀稻瘟菌素抗性基因编码序列、ORF8第238-366区间编码序列、核衣壳蛋白编码序列、 3'非翻译区、丁肝病毒核酶编码序列和牛生长激素多腺苷酸化信号。
本发明采用酵母高效重组组装构建了新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子： SARS-CoV2-GFP复制子和SARS-CoV2-GFP-Luc复制子，上述两种复制子均可以用于 SARS-CoV-2的抗病毒药物的筛选和评价。首先，从病毒RNA中通过RT-PCR的方法调取 了病毒基因序列，与部分合成序列共同进行了拼接和组装，通过在酵母细胞中进行转 化相关的重组(transformation-associated recombination)，成功构建了带有报告 基因的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子(如图1-图6所示)。经全长测序确认后，复 制子的序列特征(存在的突变位点)如表1所示。
表1
编码蛋白 基因位点 核苷酸改变 氨基酸改变
NSP2 2397 C→T Thr→Met
NSP3 6969 T→C Leu→Pro
NSP12 14559 G→A 无
实验例1：
检测本发明的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子中tGFP报告基因和SARS-CoV-2NP蛋白的表达，具体方法是：
步骤1：293T细胞接种12孔板，接种密度为4×105个细胞/孔；
步骤2：接种12h后，用Lipofectamine 3000转染试剂进行转染，每孔转染2μg 上述SARS-CoV-2-GFP复制子质粒；
步骤3：转染36h后，荧光显微镜下观察tGFP表达，拍照留存；收集细胞至Ep管 中，进行Western Blot，检测tGFP-Bla基因的表达和SARS-CoV-2NP蛋白的表达；
步骤4：使用细胞裂解液，裂解Ep管中的细胞沉淀，每个样本60μL，按体积比 为1:100，加入蛋白酶抑制剂，冰上裂解30min；
步骤5：12000g，4℃离心15min，吸取上清液至新的Ep管中，加入12μL的5倍 浓缩的蛋白上样缓冲液，95℃煮样10min；
步骤6：12000g，室温离心1min，取上清，采用质量百分数为10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，20mA恒流2h；
步骤7：转膜：400mA恒流电转1.5h，使凝胶中的蛋白转移至NC膜介质上；
步骤8：采用质量百分数为5％的脱脂奶粉溶液(溶剂为TBS溶液)室温封闭1h；
步骤9：一抗：抗tGFP(体积比1：1000稀释使用，溶剂为质量百分数为0.1％的TBST)；抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白(体积比1：1000稀释使用，溶剂为质量百分数为0.1％的TBST)；抗β-actin(体积比1：5000稀释使用，溶剂为质量百分数为0.1％的 TBST)，4℃孵育过夜；
步骤10：采用质量百分数为0.1％的TBST洗膜液，洗膜3次，每次5min；
步骤11：二抗：采用IRDye 680(体积比1：20000稀释使用，溶剂为质量百分数 为0.1％的TBST)或IRDye 800标记的二抗(体积比1：5000稀释使用，溶剂为质量百 分数为0.1％的TBST)，室温避光孵育2h；
步骤12：采用质量百分数为0.1％的TBST洗膜液，洗膜3次，每次5min；
步骤13：采用Odyssey双色红外激光扫描成像系统，进行拍照，检测特异蛋白条带。
上述步骤2中，Lipofectamine 3000转染试剂购自赛默飞世尔公司。
步骤4中，细胞裂解液购自百泰克公司，货号为PP1801。蛋白酶抑制剂购自罗氏 公司，货号为04693132001。
步骤9中，抗tGFP，购自傲锐东源，Origene公司,货号为TA150041；抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白购自Sino Biological公司,货号为40143-R019。抗β-actin购自Sigma 公司,货号为A1978。
步骤11中，IRDye 680、IRDye 800购自licor公司，货号为926-68072，926-32213。
实施例2：
检测瑞德西韦(英文名称Remdesivir)和E64-D(中文名称阿洛司他丁)对本发 明的新型冠状病毒SARS-CoV-2-GFP复制子的抑制作用，具体方法是：
步骤1：瑞德西韦购自selleck，以DMSO配置成10mM的瑞德西韦储存液备用；E64-D购自selleck，以DMSO配置成40mg/ml的E64-D储存液备用；
步骤2：293T细胞接种12孔板，接种密度为4×105个细胞/孔；
步骤3：转染前，瑞德西韦组分别按0μM、5μM、10μM和20μM加瑞德西韦储存 液至细胞培养上清中；
步骤4：接种12h后，用Lipofectamine 3000转染试剂进行转染，每孔转染2μg 上述SARS-CoV-2-GFP复制子质粒；
步骤5：转染后12h，E64-D组分别按0mg/ml、0.1mg/ml和0.2mg/ml加E64-D储 存液至细胞培养上清中；
步骤3：转染36h后，荧光显微镜下观察tGFP表达，拍照留存；并收集细胞进行Western Blot检测tGFP-Bla基因的表达。
实验例3：
利用SARS-CoV-2-GFP复制子测定瑞德西韦的半最大效应浓度(concentrationfor 50％of maximal effect,EC50)，具体方法是：
步骤1：瑞德西韦以3倍倍比稀释的方法，以完全培养基配置成10个浓度梯度(分别为0μM、0.14μM、0.43μM、1.37μM、4.12μM、12.35μM、37.03μM、111.11μM、 333.33μM和1000μM)，每个浓度的瑞德西韦以50μL/孔加入96孔板，每个浓度设 三个平行孔；
步骤2：消化重悬293T细胞，按接种密度为4×104个细胞/孔/50μL计算，从重 悬的293T细胞中取出需转染的细胞数；
步骤3：按200ng DNA/孔，转染上述SARS-CoV-2-GFP复制子；
步骤4：在步骤3的转染体系中，按50μL/孔，加入步骤1的含有不同浓度瑞德 西韦的96孔板中；
步骤5：转染36h后，荧光显微镜下观察tGFP表达，拍照留存；并收集细胞进行Western Blot检测tGFP-Bla基因的表达，同时检测细胞内β-actin的表达；
步骤6：采用Odyssey双色红外激光扫描成像系统，对步骤5所得tGFP-Bla和β -actin蛋白条带进行灰度值定量分析，计算tGFP-Bla和β-actin的灰度值比值，以 不加药组的比值为1，计算出各组的相对复制值(Relatively replication)，用 GraphPad Prism软件制图并计算EC50值。
其中，步骤1中，完全培养基为含10％FBS的DMEM培养基，购自Gibco公司,货 号为C11995500BT。
实验例4：
利用SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子测定E64-D的半最大效应浓度(concentrationfor 50％of maximal effect,EC50)，具体方法是：
步骤1：293T细胞接种96孔板，接种密度为4×104个细胞/孔；
步骤2：接种12h后，按200ng DNA/孔，转染上述SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子， 共转染30孔细胞；
步骤3：E64-D以3倍倍比稀释的方法以完全培养基配置成10个浓度梯度(分别 为0μM、0.14μM、0.43μM、1.37μM、4.12μM、12.35μM、37.03μM、111.11μM、 333.33μM和1000μM)；
转染后12h，每个浓度的E64-D以100μL/孔加入96孔板，每个浓度设三个平行 孔；
步骤4：转染后36h，每孔加入20μL的1×细胞裂解液20μL，室温静置裂解15min 后，检测Luciferase的活性；
步骤5：每孔加入100μL新鲜配制的底物溶液，吹打混匀后，吸取 100μL混合液至96孔白板中，采用Modulus微孔板多功能检测仪读板；
步骤6：根据读值，以0μM浓度组的读值为1，计算相对复制值(Relativelyreplication)，用GraphPad Prism软件制图并计算EC50值。
其中，步骤3中，完全培养基为含10％FBS的DMEM培养基，购自Gibco公司,货 号为C11995500BT。
步骤4中，细胞裂解液购自Promega公司，货号为E1531。
步骤5中，底物溶液购自Promega公司，货号为E150A。ModμLus微孔板多功能 检测仪购自美国TurnerBioSystems公司。
结论：
SARS-CoV-2-GFP复制子转染293T细胞，可以检测到报告基因和SARS-CoV-2核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NP)的表达(如图7-图13所示)，证明该复制子可 以在转染细胞内进行复制。
使用已知对冠状病毒复制具有抑制作用的化合物E64-D和瑞德西韦(Remdesivir)可以明显降低报告基因的表达水平(如图14-图31所示)，并呈剂量依赖关系，说明 该复制子可以用于药物的高通量筛选。
利用SARS-CoV2-GFP复制子转染293T细胞，根据Western Blot检测到的tGFP-Bla的灰度测定值测定瑞德西韦的EC50值为4.49μM(如图32-图34所示)。
使用SARS-CoV2-GFP-Luc复制子转染293T细胞，根据荧光素酶活性值测定E64-D的EC50为32.1μM(如图35-图36所示)，说明本发明的复制子可以用于针对SARS-CoV-2 抗病毒药物的细胞水平的评价。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子，其特征在于，所述新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子为带有单报告基因的SARS-CoV-2-GFP复制子或者带有双报告基因的SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子，其中，所述SARS-CoV-2-GFP复制子包括如下元件：CMV启动子、5'非翻译区、去除NSP1蛋白的ORF1ab编码序列、tGFP编码序列、ORF8第238-366区间编码序列、核衣壳蛋白编码序列、3'非翻译区、丁肝病毒核酶编码序列和牛生长激素多腺苷酸化信号；所述SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子包括如下元件：CMV启动子、5'非翻译区、去除NSP1蛋白的ORF1ab编码序列、tGFP编码序列、荧光素酶编码序列、杀稻瘟菌素抗性基因编码序列、ORF8第238-366区间编码序列、核衣壳蛋白编码序列、3'非翻译区、丁肝病毒核酶编码序列和牛生长激素多腺苷酸化信号。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子，其特征在于，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述5'非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述去除NSP1蛋白的ORF1ab编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述tGFP编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述荧光素酶编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述杀稻瘟菌素抗性基因编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述ORF8第238-366区间编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述核衣壳蛋白编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述3'非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述丁肝病毒核酶编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述牛生长激素多腺苷酸化信号的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
3.权利要求1或2所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：制备复制子基因片段
步骤1.1：提取新型冠状病毒SARS-CoV-2的RNA，进行反转录聚合酶链式反应，得到cDNA；
步骤1.2：将CMV启动子和5'非翻译区通过基因合成后，进行PCR扩增，得到片段1；
步骤1.3：以步骤1.1得到的cDNA为模板，采用22对引物对，进行PCR扩增，分别得到片段2-片段22和片段25；
步骤1.4：以pCMV6-AN-GFP质粒为模板，进行PCR扩增，得到tGFP编码序列，即片段23；
步骤1.5：将杀稻瘟菌素抗性基因编码序列和ORF8第238-366区间编码序列通过基因合成后，进行PCR扩增，得到片段24；
步骤1.6：将3'非翻译区、丁肝病毒核酶编码序列和牛生长激素多腺苷酸化信号通过基因合成后，进行PCR扩增，得到片段26；
步骤1.7：分别PCR扩增杀稻瘟菌素抗性基因编码序列、PCR扩增ORF8第238-366区间编码序列，在PGL3载体上PCR扩增荧光素酶编码序列，再采用重叠延伸PCR反应，将杀稻瘟菌素抗性基因编码序列的PCR扩增产物、荧光素酶的编码序列的PCR扩增产物和ORF8第238-366区间编码序列的PCR扩增产物进行拼接，得到片段24-Luc；
步骤1.8：采用重叠延伸PCR反应，将步骤1.2的片段1、步骤1.3的片段2-片段22、步骤1.4的片段23、步骤1.5的片段24、步骤1.3的片段25和步骤1.6的片段26进行组装缝合，得到如下基因片段：F1-4、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23-24和F25-26；
步骤1.9：将步骤1.8得到的基因片段F1-4连接T载体，通过缺失突变，得到去掉NSP1的基因片段：F1-4：F1-4ΔNSP1；
步骤2：构建重组质粒
将步骤1得到的9个基因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23-24和F25-26，与pYES1L线性化质粒载体一同在酵母细胞内进行重组，得到用于构建SARS-CoV-2-GFP复制子的重组质粒；
或者将步骤1得到的10个基因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23、F24-Luc和F25-26，与pYES1L线性化质粒载体一同在酵母细胞内进行重组，得到用于构建SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子的重组质粒；
步骤3：得到阳性重组酵母质粒
将步骤2得到的重组质粒进行鉴定，得到阳性重组酵母质粒；
步骤4：得到阳性复制子克隆
将步骤3得到的阳性重组酵母质粒，电转化大肠杆菌感受态，得到阳性复制子大肠杆菌单克隆；
步骤5：复制子质粒的大量提取和测序验证
将步骤4得到的阳性复制子大肠杆菌单克隆，进行大量提取和测序验证，即得到SARS-CoV-2-GFP复制子或者SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子。
4.根据权利要求3所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的构建方法，其特征在于，步骤1.2中，所述CMV启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述5'非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述PCR扩增所采用的引物对是如SEQ ID NO.12所示的引物1F和如SEQ ID NO.13所示的引物1R，反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min；所述片段1的核苷酸序列如SEQ ID NO.64所示；
步骤1.3中，所述PCR扩增具体是：采用如SEQ ID NO.14所示的引物2F和如SEQ IDNO.15所示的引物2R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.65所示的片段2；采用如SEQ IDNO.16所示的引物3F和如SEQ ID NO.17所示的引物3R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ IDNO.66所示的片段3；采用如SEQ ID NO.18所示的引物4F和如SEQ ID NO.19所示的引物4R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.67所示的片段4；采用如SEQ ID NO.20所示的引物5F和如SEQ ID NO.21所示的引物5R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.68所示的片段5；采用如SEQ ID NO.22所示的引物6F和如SEQ ID NO.23所示的引物6R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.69所示的片段6；采用如SEQ ID NO.24所示的引物7F和如SEQ ID NO.25所示的引物7R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.70所示的片段7；采用如SEQ ID NO.26所示的引物8F和如SEQ ID NO.27所示的引物8R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.71所示的片段8；采用如SEQ ID NO.28所示的引物9F和如SEQ ID NO.29所示的引物9R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.72所示的片段9；采用如SEQ ID NO.30所示的引物10F和如SEQ IDNO.31所示的引物10R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.73所示的片段10；采用如SEQ IDNO.32所示的引物11F和如SEQ ID NO.33所示的引物11R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ IDNO.74所示的片段11；采用如SEQ ID NO.34所示的引物12F和如SEQ ID NO.35所示的引物12R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.75所示的片段12；采用如SEQ ID NO.36所示的引物13F和如SEQ ID NO.37所示的引物13R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.76所示的片段13；采用如SEQ ID NO.38所示的引物14F和如SEQ ID NO.39所示的引物14R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.77所示的片段14；采用如SEQ ID NO.40所示的引物15F和如SEQ IDNO.41所示的引物15R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.78所示的片段15；采用如SEQ IDNO.42所示的引物16F和如SEQ ID NO.43所示的引物16R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ IDNO.79所示的片段16；采用如SEQ ID NO.44所示的引物17F和如SEQ ID NO.45所示的引物17R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.80所示的片段17；采用如SEQ ID NO.46所示的引物18F和如SEQ ID NO.47所示的引物18R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.81所示的片段18；采用如SEQ ID NO.48所示的引物19F和如SEQ ID NO.49所示的引物19R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.82所示的片段19；采用如SEQ ID NO.50所示的引物20F和如SEQ IDNO.51所示的引物20R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.83所示的片段20；采用如SEQ IDNO.52所示的引物21F和如SEQ ID NO.53所示的引物21R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ IDNO.84所示的片段21；采用如SEQ ID NO.54所示的引物22F和如SEQ ID NO.55所示的引物22R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.85所示的片段22；采用如SEQ ID NO.60所示的引物25F和如SEQ ID NO.61所示的引物25R，对cDNA进行扩增，得到如SEQ ID NO.88所示的片段25；反应程序均为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；
步骤1.4中，所述PCR扩增所采用的引物对是如SEQ ID NO.56所示的引物23F和如SEQID NO.57所示的引物23R；反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min；所述片段23的核苷酸序列如SEQ ID NO.86所示；
步骤1.5中，所述杀稻瘟菌素抗性基因编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述ORF8第238-366区间编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述PCR扩增所采用的引物对是如SEQ ID NO.58所示的引物24F和如SEQ ID NO.59所示的引物24R，反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min；所述片段24的核苷酸序列如SEQ ID NO.87所示；
步骤1.6中，所述3'非翻译区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述丁肝病毒核酶编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述牛生长激素多腺苷酸化信号的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述PCR扩增所采用的引物对是如SEQ ID NO.62所示的引物26F和如SEQ ID NO.63所示的引物26R；反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min；所述片段26的核苷酸序列如SEQ ID NO.89所示。
5.根据权利要求3所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的构建方法，其特征在于，步骤1.7中，所述PCR扩增杀稻瘟菌素抗性基因编码序列所采用的引物对是如SEQ ID NO.58所示的引物24F和如SEQ ID NO.93所示的引物Bla-R，反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min；所述杀稻瘟菌素抗性基因编码序列如SEQ ID NO.6所示；所述PCR扩增ORF8第238-366区间编码序列所采用的引物对是如SEQ ID NO.94所示的引物ORF8-F和如SEQ ID NO.59所示的引物24R，反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃延伸5min；所述ORF8第238-366区间编码序列如SEQ ID NO.7所示；所述PCR扩增荧光素酶编码序列所采用的引物对是如SEQ ID NO.91所示的引物Luc-F和如SEQ ID NO.92所示的引物Luc-R，反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；所述荧光素酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述重叠延伸PCR反应所采用的引物对是如SEQ ID NO.58所示的引物24F和如SEQ ID NO.59所示的引物24R，反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸5min；所述片段24-Luc的核苷酸序列如SEQ ID NO.90所示；
步骤1.8中，所述重叠延伸PCR反应具体是：采用如SEQ ID NO.12所示的引物1F和如SEQID NO.19所示的引物4R，对片段1-片段4进行组装缝合，得到基因片段F1-4；采用如SEQ IDNO.20所示的引物5F和如SEQ ID NO.27所示的引物8R，对片段5-片段8进行组装缝合，得到基因片段F5-8；采用如SEQ ID NO.28所示的引物9F和如SEQ ID NO.33所示的引物11R，对片段9-片段11进行组装缝合，得到基因片段F9-11；采用如SEQ ID NO.34所示的引物12F和如SEQ ID NO.37所示的引物13R，对片段12-片段13进行组装缝合，得到基因片段F12-13；采用如SEQ ID NO.38所示的引物14F和如SEQ ID NO.45所示的引物17R，对片段14-片段17进行组装缝合，得到基因片段F14-17；采用如SEQ ID NO.46所示的引物18F和如SEQ ID NO.49所示的引物19R，对片段18-片段19进行组装缝合，得到基因片段F18-19；采用如SEQ ID NO.50所示的引物20F和如SEQ ID NO.55所示的引物22R，对片段20-片段22进行组装缝合，得到基因片段F20-22；采用如SEQ ID NO.56所示的引物23F和如SEQ ID NO.59所示的引物24R，对片段23-片段24进行组装缝合，得到基因片段F23-24；采用如SEQ ID NO.60所示的引物25F和如SEQ ID NO.63所示的引物26R，对片段25-片段26进行组装缝合，得到基因片段F25-26；反应程序均为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min30s，共30个循环；72℃延伸10min。
6.根据权利要求3所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的构建方法，其特征在于，步骤2中，所述重组质粒的构建方法具体是：
步骤2.1：分别取步骤1得到的9个基因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23-24和F25-26各200ng，或者取步骤1得到的10个基因片段：F1-4ΔNSP1、F5-8、F9-11、F12-13、F14-17、F18-19、F20-22、F23、F24-Luc和F25-26各200ng，均与100ng的pYES1L线性化质粒载体混合，真空蒸发浓缩至总体系≤10μL，得到DNA片段混合液；
步骤2.2：将基因组装系统试剂盒中的PEG和LiAc试剂置于室温水浴中融化，充分颠倒混匀，得到融化后的PEG和LiAc试剂；
步骤2.3：将MaV203酵母感受态细胞置于30℃水浴中，在90s内融化，得到融化后的MaV203酵母感受态细胞；
步骤2.4：将步骤2.3得到的融化后的MaV203酵母感受态细胞转移至室温，轻轻弹散混匀；
步骤2.5：将100μL步骤2.4得到的复苏后的MaV203酵母感受态细胞转移至步骤2.1得到的DNA片段混合液中，轻轻弹散混匀，得到酵母感受态细胞和DNA的混合液；
步骤2.6：将600μL步骤2.2得到的融化后的PEG和LiAc试剂加入到步骤2.5得到的MaV203酵母感受态细胞和DNA的混合液中，颠倒混匀5-8次，直至体系完全混匀，得到混合体系；
步骤2.7：将步骤2.6得到的混合体系置于30℃水浴中30min，每10min颠倒混匀一次；再加入35.5μL的DMSO试剂，颠倒混匀5-8次；然后置于42℃水浴中20min，每10min颠倒混匀一次，得到热激处理后的混合体系；
步骤2.8：将步骤2.7得到的热激处理后的混合体系，400g室温离心5min，弃去上清后，用1ml无菌的0.9g/100ml氯化钠溶液重悬酵母细胞，得到悬液；
步骤2.9：吸取100μL步骤2.8得到的悬液，涂布CSM-Trp平板；
步骤2.10：将步骤2.9的CSM-Trp平板置于30℃孵箱培养3天，至酵母单克隆可见，得到重组质粒酵母菌细胞单克隆。
7.根据权利要求3所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的构建方法，其特征在于，步骤3中，所述鉴定的方法是：
步骤3.1：吸取15μL裂解液至Ep管，再挑取加入步骤2得到的重组质粒酵母菌细胞单克隆，混匀，得到单克隆悬液；
步骤3.2：每个步骤3.1的Ep管均吸取5μL单克隆悬液，转移至新的Ep管中，4℃储存备用；
步骤3.3：将每个步骤3.1的Ep管剩余的10μL单克隆悬液，于95℃煮沸5min后冷却至4℃，采用转速为500g离心1min，得到离心后的Ep管；
步骤3.4：在步骤3.3每个离心后的Ep管中均加入40μL无核酶的水，混匀，得到稀释后的单克隆悬液；
步骤3.5：进行PCR扩增和电泳判断结果，具体是：采用如SEQ ID NO.34所示的引物12F和如SEQ ID NO.37所示的引物13R，对F12-13进行扩增，得到的PCR产物经质量百分数为1％的琼脂糖凝胶电泳，如果在2000bp处扩增出阳性条带，则为阳性重组酵母质粒；采用如SEQID NO.46所示的引物18F和如SEQ ID NO.49所示的引物19R，对F18-19进行扩增，得到的PCR产物经质量百分数为1％的琼脂糖凝胶电泳，如果在2000bp处扩增出阳性条带，则为阳性重组酵母质粒；采用如SEQ ID NO.56所示的引物23F和如SEQ ID NO.61所示的引物25R，对F23-25进行扩增，得到的PCR产物经质量百分数为1％的琼脂糖凝胶电泳，如果在2700bp处扩增出阳性条带，则为阳性重组酵母质粒；反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min。
8.根据权利要求3所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的构建方法，其特征在于，步骤4中，所述电转化大肠杆菌感受态的方法是：
步骤4.1：在Ep管中放入4-5颗玻璃珠，加入10μL裂解液，得到混合体系；
步骤4.2：在步骤4.1得到的混合体系中，加入5μL单克隆悬液至体系中，混匀，室温振荡斡旋5min，得到裂解后的细胞悬液；
步骤4.3：将50μL大肠杆菌感受态细胞在冰上融化后，加入1μL步骤4.2得到的裂解后的细胞悬液，混匀后，进行电转，得到电转后的培养物；
步骤4.4：在步骤4.3得到的电转后的培养物中，加入250μL室温放置的SOC培养基，轻轻吹打混匀，转移所有液体至新的Ep管中，置于37℃摇床孵育1h，得到电转化后细胞悬液；
步骤4.5：取100μL步骤4.4得到的电转化后细胞悬液，涂布含有50μg/ml壮观霉素的LB平板，37℃培养12h；
步骤4.6：挑取单克隆，进行菌落PCR鉴定，采用如SEQ ID NO.34所示的引物12F和如SEQID NO.37所示的引物13R，反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；如果在2000bp位置处扩增出阳性条带，则为阳性复制子大肠杆菌单克隆。
9.根据权利要求3-8任一项所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子的构建方法，其特征在于，步骤5中，所述大量提取和测序的具体方法是：将步骤4得到的阳性复制子大肠杆菌单克隆接种于500ml含有50μg/ml壮观霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养生长12h，采用质粒大提试剂盒提取质粒，测定浓度并测序验证全长序列，得到SARS-CoV-2-GFP复制子或者SARS-CoV-2-GFP-Luc复制子。
10.权利要求1或2所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2复制子在抗新型冠状病毒药物筛选中的应用。
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