CN112746059A - 基于病毒结构蛋白遗传互补的冠状病毒细胞模型 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组的冠状病毒及其制备疫苗的用途，所述重组的冠状病毒的基因组在编码结构蛋白的基因中存在缺失，该缺失导致仅由该重组病毒的基因组产生的重组病毒缺乏所述结构蛋白。本发明还涉及所述重组的冠状病毒的制备方法，包括(1)体外扩增病毒基因组片段并进行体外拼接；(2)体外转录制备重组病毒的基因组RNA，其中该基因组RNA在编码结构蛋白的基因中存在突变，导致仅由该重组病毒的基因组产生的重组病毒缺乏所述结构蛋白；(3)制备包装细胞系，所述包装细胞系稳定表达所述重组病毒所缺乏的结构蛋白；(4)转染重组病毒的基因组RNA至包装细胞系，产生重组病毒。本发明还涉及用于制备本发明的重组的冠状病毒的包装细胞系。

Description

基于病毒结构蛋白遗传互补的冠状病毒细胞模型
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体地涉及基于病毒结构蛋白遗传互补的冠状病毒的细胞模型。更具体的，本发明涉及基于病毒衣壳蛋白遗传互补的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)细胞模型。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒科(Coronaviridae family)，正冠状病毒亚科(Orthocoronavirinae)，乙型冠状病毒属(Betacoronavirus)。乙型冠状病毒属还包括引起严重急性呼吸综合征(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的SARS-CoV和引起中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS)的MERS-CoV。
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)为正链单链RNA病毒，基因组长约30kb，两端为非编码区，中间为非结构蛋白编码区和结构蛋白编码区。非结构蛋白编码区主要包括开放读码框架(open reading frame，ORF)1a和ORF1b基因，编码16个非结构蛋白(non-structuralproteins，NSP)，即NSP1-16，负责病毒基因组的复制和转录。结构蛋白编码区主要编码刺突蛋白(spike protein，S)、包膜蛋白(envelope protein，E)、膜蛋白(membrane protein，M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)。N蛋白与病毒RNA结合形成复合物，随后在M蛋白、E蛋白和S蛋白的共同作用下，包装成感染性的病毒颗粒。
RNA病毒的反向遗传(Reverse genetics)系统，是采用病毒的遗传材料，在培养细胞或易感宿主中重新拯救(rescue)出活病毒或类似病毒物质。能够拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆，一般是在细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA拷贝，使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性。RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列，检测被拯救的人工改造病毒的表型，可以在体内有效地研究病毒基因结构、功能和病毒-宿主相互作用。
冠状病毒是目前已知最大基因组长度的RNA病毒(27-30kb)，也被认为是最难拯救的正链RNA病毒。实现冠状病毒拯救的难点在于其基因组片段太大，常规的基因工程质粒不能容纳，需要另找替代载体；此外还存在“不稳定克隆”问题。Ralph Baric以及Peiyong Shi实验室尝试分段克隆，并在体外拼接基因组中插入荧光蛋白报告基因的新型冠状病毒的全长cDNA，直接体外转录产生RNA，用RNA转染细胞拯救病毒，其优点是简便、直接，避免了不稳定克隆的出现。重组病毒在感染能力和物理特性方面和细胞扩增临床来源的病毒没有显著的区别，可用于研究病毒突变的功能，以及评价抗病毒药物以及高通量筛选抗病毒药物。
发明内容
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
目前，由于通过现有新型冠状病毒的反向遗传学技术制备的携带报告基因的重组病毒的感染能力和物理特性与细胞扩增的临床来源的病毒没有显著区别，因此该反向遗传学制备方法仍然需要在生物安全三级实验室操作。
本发明通过体外分段扩增和拼接病毒cDNA，体外转录RNA转染细胞制备的病毒结构蛋白编码基因缺失的重组病毒只能在过表达所缺失的结构基因的细胞中进行扩增，安全性得到了有效的保证，使得该方法能够在生物安全二级实验室进行。通过遗传学修饰插入的报告基因可以用于高通量筛选抗病毒药物，以及评价药物的抗病毒活性。此方法获得的重组病毒颗粒具有和真病毒类似的结构，因此可以作为潜在的候选疫苗。
本发明的第一个方面涉及重组的冠状病毒，其基因组在编码结构蛋白的基因中存在缺失，该缺失导致仅由该重组病毒的基因组产生的重组病毒缺乏所述结构蛋白。
在一些优选实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV-2。在一些优选实施方案中，缺失包括缺失编码一种或更多种结构蛋白的序列。在一些优选实施方案中，缺失包括缺失编码刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白中的一种或更多种的序列。在一些优选实施方案中，缺失是缺失编码核衣壳蛋白的序列。
本发明的第二个方面涉及一种产生重组的冠状病毒的方法，该重组的冠状病毒的基因组在编码结构蛋白的基因中存在缺失，该缺失导致仅由该重组病毒的基因组产生的重组病毒缺乏所述结构蛋白，所述方法包括：
(1)体外扩增病毒基因组片段并进行体外拼接；
(2)体外转录制备重组病毒的基因组RNA，其中该基因组RNA在编码结构蛋白的基因中存在突变，导致仅由该重组病毒的基因组产生的重组病毒缺乏所述结构蛋白；
(3)制备包装细胞系，所述包装细胞系稳定表达所述重组病毒所缺乏的结构蛋白；
(4)转染重组病毒的基因组RNA至包装细胞系，产生重组病毒。
在一些优选实施方案中，缺失包括缺失编码一种或更多种结构蛋白的序列。在一些优选实施方案中，缺失包括缺失编码刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白中的一种或更多种的序列。在一些优选实施方案中，缺失是缺失编码核衣壳蛋白的序列。
在一些优选实施方案中，重组病毒的基因组还包含编码标记物的RNA。在一些优选实施方案中，标记物是荧光蛋白。在一些优选实施方案中，标记物是绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、它们的增强型荧光蛋白或者荧光素酶蛋白。在一些优选实施方案中，标记物是绿色荧光蛋白。
体外扩增病毒基因组片段可以通过本领域普通技术人员熟知的核酸扩增方法进行。在一些优选实施方案中，体外扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。
在一些实施方案中，包装细胞系是Caco-2细胞、Vero细胞、VeroE6细胞或Calu-3细胞，优选地，所述包装细胞系是Caco-2细胞、Vero细胞或VeroE6细胞，最优选地，所述包装细胞系是Caco-2细胞。在一些优选实施方案中，用携带重组病毒缺失的结构蛋白的编码序列的载体转染细胞，以形成包装细胞系。在一些优选实施方案中，结构蛋白的碳端插入有可检测标签，以便于检测所述结构蛋白，优选地，所述可检测标签是FLAG标签。在一些优选实施方案中，利用流式细胞术分选经转染的Caco-2细胞。
在一些优选实施方案中，还可以利用蛋白质内含肽(Intein)介导的蛋白质连接技术来制备表达冠状病毒的结构蛋白的包装细胞系。以N蛋白为例，可以在N蛋白的多个位点进行拆分，最优选地，将N蛋白的氮端211位和212位氨基酸之间拆分。合成编码序列，一个序列编码N蛋白的氮端前211个氨基酸和内含肽氮端部分的融合肽，另一个序列编码内含肽碳端部分和N蛋白的氮端212位至碳端的融合肽，其中N蛋白的氮端212位的氨基酸从从甘氨酸(G)突变成半胱氨酸(C)。分别包装有两个编码序列的慢病毒，转导、形成包装细胞系。如此，进一步降低了病毒基因组和N基因的重组可能性，提高了安全性。
本发明的第三个方面涉及本发明的重组冠状病毒在制备预防冠状病毒感染的疫苗中的用途。在优选实施方案中，冠状病毒是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
目前已经发现，核衣壳蛋白在SARS-CoV-2的不同毒株之间是保守的，与SARS-CoV的N蛋白也具有一定的保守性。因此，本发明的第四个方面涉及一种过表达冠状病毒的一种或更多种结构蛋白的包装细胞系，所述包装细胞系能够产生缺乏该一种或更多种结构蛋白的编码基因的重组冠状病毒。
在一些实施方案中，所述包装细胞系过表达SARS-CoV-2的N蛋白，并且可用于包装重组的SARS-CoV或SARS-CoV-2，所述重组的SARS-CoV或SARS-CoV-2各自的基因组缺乏编码N蛋白的序列。
在一些实施方案中，过表达SARS-CoV的N蛋白的包装细胞系可以用于包装重组的SARS-CoV，其中重组的SARS-CoV的基因组缺乏N蛋白编码基因。本发明的第五个方面涉及本发明的重组冠状病毒和包装细胞系在药物筛选中的应用。在一些优选实施方案中，药物筛选在生物安全二级实验室进行。
附图说明
附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。
图1描述了基于病毒衣壳蛋白反式互补的新型冠状病毒细胞培养模型。(A)产生重组的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法的示意图。(B)病毒基因组的cDNA片段的电泳图。(C)T4连接酶连接的cDNA片段。(D)T4连接酶连接的cDNA为模板体外转录产生的RNA转录物的电泳图。(E)Caco-2-N细胞、Vero E6细胞和Vero E6-N细胞表达N蛋白的情况的免疫印迹图。
图2说明了SARS-CoV-2GFP/ΔN病毒能够感染Caco-2-N细胞。(A)SARS-CoV-2GFP/ΔN病毒感染后48h和72h的Caco-2-N细胞和Caco-2细胞的GFP荧光图。(B)SARS-CoV-2GFP/ΔN病毒感染Caco-2-N细胞和Caco-2细胞72h后，免疫印迹检测病毒刺突蛋白的表达。(C)SARS-CoV-2GFP/ΔN病毒感染Caco-2-N细胞和Caco-2细胞72h后，RT-qPCR检测病毒核酸的水平。(D)SARS-CoV-2GFP/ΔN病毒感染Caco-2-N细胞72h后，RT-PCR检测病毒携带GFP基因。(E)SARS-CoV-2中和性抗体1F11和2F6可以有效抑制SARS-CoV-2GFP/ΔN病毒感染Caco-2-N细胞，VRC01为HIV-1中和性抗体，为阴性对照。
图3展示了干扰素以及其他抗病毒药物抑制SARS-CoV-2GFP/ΔN感染Caco-2-N细胞的抗病毒效果。(A)按图示指定剂量的干扰素(IFN-β)处理Caco-2-N细胞12小时后，感染SARS-CoV-2GFP/ΔN病毒，48小时后流式细胞仪分析GFP阳性细胞的比例，确定病毒感染情况。(B-D)分别将不同浓度的瑞德西韦(remdesivir)、洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)和SARS-CoV-2GFP/ΔN病毒一起与Caco-2-N细胞孵育。48小时后，流式细胞仪分析GFP阳性细胞的比例，确定病毒感染情况，并计算半数抑制浓度(IC50)。
图4展示了SARS-CoV的N蛋白可以高效的包装SARS-CoV-2GFP/ΔN基因组产生感染性病毒。表达SARS-CoV N基因的慢病毒转导Caco-2细胞(Caco-2-N(SARS1))，免疫杂交实验检测SARS-CoV N蛋白表达情况。SARS-CoV-2GFP/ΔN在Caco-2-N(SARS1)细胞中的感染能力和Caco-2-N(该细胞表达SARS-CoV-2的N蛋白)细胞的能力基本相同。
图5展示了利用蛋白质内含肽(Intein)介导的蛋白质连接技术，实现SARS-CoV-2的N蛋白连接，该连接后的N蛋白携带G212C突变，但是仍可以高效的包装SARS-CoV-2GFP/ΔN基因组产生感染性病毒。(A)将SARS-CoV-2的N蛋白编码前211氨基酸的基因(NN)和蛋白质内含肽编码基因N段融合表达，SARS-CoV-2的N蛋白212氨基酸之后的基因(NC)和蛋白质内含肽编码基因C段融合表达。此两个重组基因转导Caco-2细胞(Caco-2-Nint)后，两个蛋白会在蛋白质内含肽的作用下实现剪切和连接成全长的N蛋白(携带G212C突变)；(B)免疫杂交实验验证N蛋白的连接效果；(C)SARS-CoV-2GFP/ΔN基因组电转Caco-2-Nint细胞，72小时后收集细胞上清，感染Caco-2-N细胞。48小时后，部分细胞抽提细胞RNA，进行RT-qPCR实验测定病毒亚基因组转录水平；(D)另外一部分细胞进行流式细胞仪分析GFP阳性细胞比例。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明做进一步描述，这些描述并不是对本发明内容做进一步限定。本领域的技术人员应理解，对本发明技术特征所做的等同替换，或相应改进，仍属于本发明的保护范围之内。
本发明的第一个方面涉及重组的冠状病毒，其基因组在编码结构蛋白的基因中存在缺失，该缺失导致仅由该重组病毒的基因组产生的重组病毒缺乏所述结构蛋白。
在一些优选实施方案中，所述冠状病毒是SARS-CoV或SARS-CoV-2。在一些优选实施方案中，缺失包括缺失编码一种或更多种结构蛋白的序列。在一些优选实施方案中，缺失包括缺失编码刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白中的一种或更多种的序列。在一些优选实施方案中，缺失是缺失编码核衣壳蛋白的序列。
本发明的第二个方面涉及一种产生重组的冠状病毒的方法，该重组的冠状病毒的基因组在编码结构蛋白的基因中存在缺失，该缺失导致仅由该重组病毒的基因组产生的重组病毒缺乏所述结构蛋白，所述方法包括：
(1)体外扩增病毒基因组片段并进行体外拼接；
(2)体外转录制备重组病毒的基因组RNA，其中该基因组RNA在编码结构蛋白的基因中存在突变，导致仅由该重组病毒的基因组产生的重组病毒缺乏所述结构蛋白；
(3)制备包装细胞系，所述包装细胞系稳定表达所述重组病毒所缺乏的结构蛋白；
(4)转染重组病毒的基因组RNA至包装细胞系，产生重组病毒。
在一些优选实施方案中，缺失包括缺失编码一种或更多种结构蛋白的序列。在一些优选实施方案中，缺失包括缺失编码刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白中的一种或更多种的序列。在一些优选实施方案中，缺失是缺失编码核衣壳蛋白的序列。
在一些优选实施方案中，重组病毒的基因组还包含编码标记物的RNA。在一些优选实施方案中，标记物是荧光蛋白。在一些优选实施方案中，标记物是是绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、它们的增强型荧光蛋白或者荧光素酶蛋白。在一些优选实施方案中，标记物是绿色荧光蛋白。
体外扩增病毒基因组片段可以通过本领域普通技术人员熟知的核酸扩增方法进行。在一些优选实施方案中，体外扩增通过聚合酶链式反应(PCR)进行。
在一些优选实施方案中，结构蛋白的碳端插入有可检测标签，以便于检测所述结构蛋白，优选地，所述可检测标签是FLAG标签。在一些优选实施方案中，利用流式细胞术分选经转染的Caco-2细胞。
在一些优选实施方案中，还可以利用蛋白质内含肽(Intein)介导的蛋白质连接技术来制备表达冠状病毒的结构蛋白的包装细胞系。以N蛋白为例，可以在N蛋白的多个位点进行拆分，最优选地，将N蛋白的氮端211位和212位氨基酸之间拆分。合成编码序列，一个序列编码N蛋白的氮端前211个氨基酸和内含肽氮端部分的融合肽，另一个序列编码内含肽碳端部分和N蛋白的氮端212位至碳端的融合肽，其中N蛋白的氮端212位的氨基酸从从甘氨酸(G)突变成半胱氨酸(C)。分别包装有两个编码序列的慢病毒，转导、形成包装细胞系。如此，进一步降低了病毒基因组和N基因的重组可能性，提高了安全性。
基于同样的原理，冠状病毒其他的结构蛋白，例如刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)也可以实现反式互补。
本发明的第三个方面涉及本发明的重组冠状病毒在制备预防冠状病毒感染的疫苗中的用途。在优选实施方案中，冠状病毒是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。疫苗可以根据本领域已知的方法制备。
目前已经发现，核衣壳蛋白在SARS-CoV-2的不同毒株之间是保守的，与SARS-CoV的N蛋白也具有一定的保守性。因此，本发明的第四个方面涉及一种过表达冠状病毒的一种或更多种结构蛋白的包装细胞系，所述包装细胞系能够产生缺乏该一种或更多种结构蛋白的编码基因的重组冠状病毒。
在一些实施方案中，所述包装细胞系过表达SARS-CoV-2的N蛋白，并且可用于包装重组的SARS-CoV或SARS-CoV-2，所述重组的SARS-CoV或SARS-CoV-2各自的基因组缺乏编码N蛋白的序列。
在一些实施方案中，过表达SARS-CoV的N蛋白的包装细胞系可以用于包装重组的SARS-CoV，其中重组的SARS-CoV的基因组缺乏N蛋白编码基因。
本发明的第五个方面涉及本发明的重组冠状病毒和包装细胞系在药物筛选中的应用。在一些优选实施方案中，药物筛选在生物安全二级实验室进行。
实施例1
以下以NCBI数据库中的SARS-CoV-2病毒的Wuhan-Hu-1毒株(MN908947)为例，描述本发明的示例性实施方案。
(1)体外扩增病毒基因组片段并进行体外拼接
将病毒编码N基因完全删除，用编码GFP的cDNA代替。同时在病毒的5’UTR上游放置T7启动子序列，用于体外转录起始病毒基因组转录。整个病毒基因组长29k，分为A、B、C、D、E五个片段由金斯瑞生物科技公司化学合成并克隆到pCC1载体中(图1A，片段A-E的序列见SEQ ID NO：1-5)，其中片段E中的N蛋白编码基因用GFP的编码基因代替。分别以克隆有片段A-E的pCC1载体为模板，利用以下引物进行PCR扩增并在每个片段两端引入IIS型限制性内切酶切割位点，获得病毒基因组cDNA产物(A、B、C、D、E)(图1A和B)。
PCR扩增的引物序列如下：
Figure BDA0002683040870000091
Figure BDA0002683040870000101
PCR扩增DNA片段的实验使用高保真度的DNA聚合酶
Figure BDA0002683040870000102
Max DNAPolymerase(购自TAKARA BIO INC.)进行。其中，片段A和B的反应体系和反应条件完全一致，片段C和D的反应体系和反应条件完全一致。各个片段的反应体系和反应条件具体如下：
片段A或者B的反应体系和反应条件如下：
试剂 剂量
PrimeSTAR Max Premix(2×) 50ul
模板DNA(pCC1-A(片段A)或者pCC1-B(片段B)) 100ng
10uM正向引物(THU-2170(片段A)或者THU-2174(片段B)) 5ul
10uM反向引物(THU-2173(片段A)或者THU-2177(片段B)) 5ul
灭菌蒸馏水 加到100微升
反应条件如下：
预变性98℃，5分钟
变性98℃，15秒
退火58℃，15秒
延伸72℃，10分钟
再延伸72℃，10分钟
变性到延伸进行32循环。
片段C或者D的反应体系和反应条件：
试剂 剂量
PrimeSTAR Max Premix(2×) 50ul
模板DNA(pCC1-C(片段C)或者pCC1-D(片段D)) 100ng
10uM正向引物(THU-2178(片段C)或者THU-2256(片段D)) 5ul
10uM反向引物(THU-2255(片段C)或者THU-2257(片段D)) 5ul
灭菌蒸馏水 加到100微升
反应条件如下：
预变性98℃，5分钟
变性98℃，15秒
退火58℃，15秒
延伸72℃，10分钟
再延伸72℃，6分钟
变性到延伸进行32循环。
片段E的反应体系和反应条件：
试剂 剂量
PrimeSTAR Max Premix(2×) 50ul
模板DNA(pCC1-E) 100ng
10uM正向引物(THU-2258) 5ul
10uM反向引物(THU-2261) 5ul
灭菌蒸馏水 加到100微升
反应条件如下：
预变性98℃，5分钟
变性98℃，15秒；
退火58℃，15秒
延伸72℃，1分钟
再延伸72℃，6分钟
变性到延伸进行32循环。
1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增的A、B、C、D和E五种DNA产物，实验结果表明PCR产物均是单一目的条带，片段大小正确(如图1B所示)。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(
Figure BDA0002683040870000122
Gel Extraction Kit，OMEGA)按照试剂盒操作指南回收DNA，最后一步使用30微升灭菌去离子水洗脱DNA两次。回收后的DNA利用超微量分光光度计NanoDrop2000(ThermoFisher Scientific)进行核酸定量，并进行DNA序列测定，比对结果表明，各个片段序列正确，然后DNA片段用于后续内切酶消化。其中片段A、B、C和E使用限制性内切酶BsaI(NewEngland Biolabs,货号R0535L)消化，D片段使用限制性内切酶BsmBI(New EnglandBiolabs,货号#R0739)消化。限制性内切酶的消化反应条件如下：
片段A、B、C或者E的内切酶消化体系：
试剂 剂量
10×Cutsmart缓冲液(New England Biolabs购买) 5微升
DNA片段 15微克
BsaI 5微升
灭菌蒸馏水 加到50微升
片段D的内切酶消化体系：
Figure BDA0002683040870000121
Figure BDA0002683040870000131
反应在37℃进行12小时。反应结束后，1％琼脂糖凝胶电泳分析A、B、C、D和E的酶切产物。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒(
Figure BDA0002683040870000132
Gel Extraction Kit，OMEGA)按照试剂盒操作指南回收DNA，最后一步使用20微升灭菌去离子水洗脱DNA两次。回收后的DNA利用超微量分光光度计NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific)进行核酸定量。回收后的cDNA按照等摩尔比混合，用T4 DNA连接酶(New England Biolabs,货号M0202L)连接过夜(图1A和C)。
T4连接反应体系设置如下：
试剂 剂量
10×T4连接酶缓冲液(New England Biolabs购买) 5微升
DNA片段A 1.86微克
DNA片段B 1.76微克
DNA片段C 1.23微克
DNA片段D 0.82微克
DNA片段E 0.22微克
T4 DNA连接酶 5微升
灭菌蒸馏水 加到50微升
反应置于4℃，反应进行16小时。然后通过酚氯仿方法抽提连接后的DNA产物。具体过程为：分别加等体积Tris饱和苯酚至上述样品反应液中，温和、充分混匀3分钟；离心5000g×10分钟，取上层水相到另一1.5ml离心管中；加等体积Tris饱和苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，轻轻混匀，离心5000g×10分钟，取上层水相到另一离心管中；加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10分钟，取上层水相到另一离心管中；加1/10体积的3M醋酸钠(购自碧云天，货号ST351)(pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。待絮状物出现后，离心5000g×5分钟，弃上清液；沉淀用75％乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液；室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加20微升灭菌蒸馏水溶解。利用超微量分光光度计NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific)进行核酸定量。连接的DNA回收后进行体外转录，制备病毒基因组RNA(图1A)。
(2)体外转录制备重组病毒的基因组RNA
DNA回收后作为模板，利用T7聚合酶体外转录试剂盒(mMESSAGE mMACHINETMT7Transcription Kit,Thermo Fisher Scientific,货号AM1344)进行体外转录(反应温度为32℃，反应时间为5个小时；其他操作参照试剂盒说明书进行)，制备病毒基因组RNA。
试剂 剂量
10X T7反应缓冲液 2微升
2X NTP/ARCA 10微升
DNA模板 1微克
T7聚合酶 1.23微克
灭菌蒸馏水 加到20微升
反应结束后，加入1微升DNA酶(试剂盒自带)，37℃消化15分钟，按照试剂盒说明书，采用氯化锂(试剂盒自带)沉淀法，回收并纯化RNA。纯化RNA后，通过1％琼脂糖凝胶电泳分析RNA转录质量，保证RNA完整性(图1A和D)。利用超微量分光光度计NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific)进行RNA核酸定量。高质量的RNA是拯救重组病毒的关键。
(3)制备稳定表达病毒N蛋白的包装细胞系
在转染RNA之前，需要制备表达SARS-CoV-2病毒N蛋白的包装细胞系。将连接有FLAG标签的编码序列的SARS-CoV-2病毒的N基因(N基因的序列见SEQ ID NO：6)克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry中。具体克隆构建过程如下：连接有FLAG标签的编码序列的SARS-CoV-2病毒N蛋白基因序列由金斯瑞生物科技有限公司化学合成。以该化学合成的序列为模板，通过PCR实验扩增，使用的引物如下：正向引物THU-2197：tctatttccggtgaattcctcgagATGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAG；反向游引物THU-2198：ggcgggatccgcggccgctctagaTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTC。将以上PCR合成的DNA片段和pLVX-IRES-mCherry载体分别用XhoI和XbaI进行双酶切，回收经酶切的DNA片段，将其连接至pLVX-IRES-mCherry载体，记为pLVX-SARS-CoV-2N-IRES-mCherry。用所得的pLVX-SARS-CoV-2N-IRES-mCherry转化DH5-α感受态细胞(天根生物)。将经转化的DH5-α感受态细胞涂布于Ampr LB平板(1.0％胰蛋白胨、0.5％酵母粉、1.0％氯化钠、1.5％琼脂粉、氨苄青霉素(100μg/mL))，挑单克隆进行菌落PCR鉴定，并对PCR鉴定为阳性的克隆进行测序验证。
慢病毒包装过程：实验前一天，HEK293T细胞以6×105细胞/孔接种6孔板，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。转染前1小时，将培养基换成新鲜的含2％FBS的DMEM培养基，每孔2mL。转染时，将慢病毒包装质粒混合(pMD2.G：0.25μg；psPAX2:1μg；pLVX-SARS-CoV-2N-IRES-mCherry:1μg)，加入到200μL无FBS的DMEM培养基中，混匀，加入转染试剂3μL，轻轻混匀，室温放置15分钟。将质粒和转染试剂混合液轻轻滴加到6孔板中，轻摇混匀。HEK293T细胞于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，5小时后将培养基换成新鲜的含10％FBS的DMEM培养基，48小时后收集细胞上清，0.22微米过滤后分装冻存-80℃备用。
表达SARS-CoV-2N基因的慢病毒转导Caco-2细胞的具体过程如下：实验前一天，Caco-2细胞以1×105细胞/孔接种于含DMEM培养基的12孔板中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养过夜。第二天，由pLVX-SARS-CoV-2N-IRES-mCherry质粒包装的慢病毒感染Caco-2细胞，然后于37℃、5％CO2细胞培养箱中用含10％FBS的DMEM培养基继续培养细胞。成功转导的Caco-2细胞携带mCherry荧光蛋白信号，利用流式细胞分选仪进一步获得稳定表达N蛋白的Caco-2细胞(命名为Caco-2-N细胞)。免疫杂交实验(Western blot)进一步确定病毒N蛋白的表达。
(4)转染重组病毒基因组RNA至Caco-2-N细胞，产生重组病毒
实验前一天给Caco-2-N细胞换新鲜的DMEM培养基，确保细胞处于活跃增殖状态。实验前，将细胞用胰酶消化后，用预冷的磷酸缓冲液(购自ThermoFisher,货号10010023)重悬细胞，并对细胞进行计数。将0.8ml含有8×106个Caco-2-N细胞加入到4毫米电击杯(伯乐生物)，然后加入20微克体外转录的病毒基因组RNA，使用Gene Pulser电穿孔仪(伯乐生物)进行电击转染实验。电击条件为270V，电阻950uF。电击后将细胞用移液器转移到预热到37℃的细胞培养液中，在5％CO2、37℃继续培养细胞。
(5)收集重组病毒，测定病毒效价
电击转化72小时后，收集细胞培养上清，在1600rpm离心10分钟后，将上清液分装并保存在-80℃，并测定病毒效价。病毒效价测试采用梯度稀释法。用DMEM培养基将重组新冠病毒进行10倍倍比稀释(100～10-5)，在单层致密Caco-2-N细胞的24孔培养板中加入不同稀释倍数的病毒悬液，100μL/孔，37℃吸附1h，每隔15min轻轻摇动1次。吸附后弃病毒液，每孔加入100μL琼脂盖(2％琼脂糖和细胞培养液1:1混合液)，37℃继续培养。在感染3天后加入100μL固定液(4％甲醛)，37℃固定1h，然后弃固定液和营养琼脂盖，并用磷酸缓冲液(购自ThermoFisher,货号10010023)清洗2～3次，荧光显微镜下观察形成的GFP阳性细胞集落并计数，计算病毒效价。病毒效价(ffu/mL)的计算公式如下：感染滴度(ffu/mL)＝视野的阳性细胞数×每孔视野数/(病毒体积(mL)×稀释度)。
实施例2
用过表达SARS-CoV的N蛋白的细胞系，产生重组的SARS-CoV-2病毒体的实验，其中重组的SARS-CoV-2病毒体的基因组缺乏其自身N蛋白的编码基因。
该实施例中展示了构建稳定表达SARS-CoV的N蛋白(该序列信息来源于SARS-CoVUrbani毒株，基因ID:MK062182.1)的Caco-2细胞系，命名为Caco-2-N(SARS1)。该细胞系也可以用于支持包装基因组缺失N基因的SARS-CoV-2GFP病毒，提示了N蛋白在SARS相关病毒中的功能十分具有保守性。也提示实施例1的方案在SARS-CoV病毒中也具有适用性。
(1)构建表达SARS-CoV N蛋白的慢病毒表达载体
将连接有FLAG标签的编码序列的SARS-CoV病毒N基因克隆到慢病毒载体pLVX-IRES-mCherry中，将其命名为pLVX-SARS-CoV N-IRES-mCherry。构建过程和pLVX-SARS-CoV-2N-IRES-mCherry的构建过程一致。用于扩增SARS-CoV N蛋白基因的PCR引物序列如下：正向引物THU-2623：atctatttccggtgaattcctcgagATGTCTGATAATGGACCCCAATCAAAC；反向引物THU-2198：ggcgggatccgcggccgctctagaTTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTC。
(2)利用pLVX-SARS-CoV N-IRES-mCherry载体包装慢病毒并转导Caco-2细胞
慢病毒包装以及转导Caco-2细胞的方法以及检测方法和实施例1中的方法完全相同。
(3)按照实施例1中的方法，转染缺失N基因的重组SARS-CoV-2GFP/ΔN病毒基因组RNA至Caco-2-N(SARS1)细胞，产生重组病毒。
实施例3：药物评价实验
该SARS-CoV-2细胞培养模型可用于快速、高效的评价抗病毒方案。本实施例评价了I型干扰素IFN-β、瑞德西韦(remdesivir)、利托那韦(ritonavir)和洛匹那韦(lopinavir)对病毒的抑制作用。
(1)抗病毒药物：
本实例中选择的抗病毒药物有I型干扰素IFN-β(Sino Bioligical,10704-HNAS-5)；瑞德西韦(MedChemexpress，HY-104077)；洛匹那韦(biochempartner，BCP01395)以及利托那韦(biochempartner，BCP03777)。
(2)抗病毒药物效果评价实验：
I型干扰素IFN-β抗病毒效果实验：实验前一天将Caco-2-N细胞以每孔5×104细胞铺到含DMEM培养液的24孔培养板中。第二天，弃去24孔培养板中的培养液，将IFN-β用DMEM培养液稀释到图3所示的相应浓度，以每孔0.5ml的量加入到Caco-2-N细胞刺激12个小时。刺激结束前，从-80℃取SARS-CoV-2GFP/ΔN病毒室温融化后，用DMEM培养液稀释至所需浓度(感染moi＝0.05)。刺激结束后，将细胞培养液吸走，换成含有SARS-CoV-2GFPΔN病毒的培养基感染。48小时后，弃细胞上清，胰酶消化细胞，磷酸缓冲液(购自ThermoFisher,货号10010023)重悬细胞，并用4％多聚甲醛固定30分钟后，流式细胞仪分析干扰素不同浓度处理的细胞中GFP阳性细胞比例，计算相对感染百分比。
瑞德西韦、洛匹那韦以及利托那韦抗病毒效果评价实验：该三种化合物抗病毒效果评价的实验方案相同，具体方案如下。实验前一天将Caco-2-N细胞以每孔5×104细胞铺到含DMEM培养液的24孔培养板中。实验前用DMEM将化合物稀释到图3所示的相应浓度的2倍。同时，用DMEM培养液稀释SARS-CoV-2GFP/ΔN病毒，保证每250微升培养基中含有2500ffu病毒。化合物和病毒准备完成后，弃细胞培养上清，分别加入250微升病毒和250微升的抗病毒化合物的稀释液，在5％CO2、37℃继续培养。48小时后，弃细胞上清，胰酶消化细胞，磷酸缓冲液(购自ThermoFisher,货号10010023)重悬细胞，并用4％多聚甲醛固定30分钟后，流式细胞仪分析不同浓度的抗病毒化合物处理的细胞中GFP阳性细胞比例，计算相对感染百分比。瑞德西韦、洛匹那韦以及利托那韦对重组病毒的IC50分别为186.3nM、8.747μM和7.538μM。
实施例4：利用蛋白质内含肽介导的蛋白连接技术，制备SARS-CoV-2N细胞系，包装重组的SARS-CoV-2GFP/ΔN病毒
为了进一步降低SARS-CoV-2GFP/ΔN基因组和上述包装细胞系中N基因的重组可能性，我们将SARS-CoV-2N基因在编码212位氨基酸进行由甘氨酸到半胱氨酸突变，以提高蛋白质内含肽的连接效率。编码SARS-CoV-2N蛋白氮端前211个氨基酸和内含肽氮端部分的基因序列(SEQ ID NO：8)由金斯瑞生物科技公司合成并克隆到pLVX-IRES-mCherry载体中，命名为pLVX-SARS2-N(G212C)N-IntN-IRES-mCherry；内含肽碳端部分的基因序列和N蛋白氮端212位氨基酸之后的基因序列(SEQ ID NO：9)由金斯瑞生物科技公司合成并克隆到pLVX-IRES-Puro载体中，命名为pLVX-IntC-SARS2-N(G212C)C-Flag-IRES-Puro。分别按照如实施例1所述的方法包装含pLVX-SARS2-N(G212C)N-IntN-IRES-mCherry或pLVX-IntC-SARS2-N(G212C)C-Flag-IRES-Puro的慢病毒，转导Caco-2细胞，制备Caco-2-Nint细胞，在蛋白质内含肽作用下，剪切连接成N蛋白。如图5所示，Caco-2-Nint细胞可以跟Caco-2-N细胞一样具有支持病毒复制、转录和包装出SARS-CoV-2GFP/ΔN病毒。
序列表
SEQ ID NO：1用于SARS-CoV-2GFP/ΔN拼接的DNA片段A(9325个碱基)
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SEQ ID NO：2用于SARS-CoV-2 GFP/ΔN拼接的DNA片段B(8817个碱基)
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SEQ ID NO：3用于SARS-CoV-2 GFP/ΔN拼接的DNA片段C（6178个碱基）
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SEQ ID NO：4用于SARS-CoV-2 GFP/ΔN拼接的DNA片段D（4194碱基）:
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SEQ ID NO：5用于SARS-CoV-2 GFP/ΔN拼接的DNA片段E，其中N蛋白编码基因用GFP的编码基因代替（1118个碱基）
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SEQ ID NO：6 SARS-CoV-2 N基因（Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1毒株，基因编号：MN908947）序列
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SEQ ID NO：7 SARS-CoV N基因（Urbani毒株，基因编号：MK062182.1）序列
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SEQ ID NO：8 SARS2-N(G212C)N-IntN编码序列
atgtctgataatggaccccaaaatcagcgaaatgcaccccgcattacgtttggtggaccctcagattcaactggcagtaaccagaatggagaacgcagtggggcgcgatcaaaacaacgtcggccccaaggtttacccaataatactgcgtcttggttcaccgctctcactcaacatggcaaggaagaccttaaattccctcgaggacaaggcgttccaattaacaccaatagcagtccagatgaccaaattggctactaccgaagagctaccagacgaattcgtggtggtgacggtaaaatgaaagatctcagtccaagatggtatttctactacctaggaactgggccagaagctggacttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagggagccttgaatacaccaaaagatcacattggcacccgcaatcctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagaagggagcagaggcggcagtcaagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaatggctgcagagtattgcctgtcctacgagacagagatcctgacagtggagtatggcctgctgccaatcggcaagatcgtggagaagaggatcgagtgtaccgtgtactctgtggataacaatggcaacatctatacacagcccgtggcacagtggcacgataggggagagcaggaggtgttcgagtattgcctggaggacggcagcctgatcagggcaaccaaggaccacaagttcatgacagtggatggccagatgctgcccatcgacgagattttcgagcgggagctggacctgatgagagtggataacctgcctaattaa
SEQ ID NO：9 IntC-SARS2-N(G212C)C-Flag编码序列
atgatcaagattgctacacggaaatacctgggaaagcagaacgtgtacgacatcggcgtgggcgaaccccacaacttcgccctgaagaatggctttatcgccagcaattgcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagagcaaaatgtctggtaaaggccaacaacaacaaggccaaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcttctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccactaaagcatacaatgtaacacaagctttcggcagacgtggtccagaacaaacccaaggaaattttggggaccaggaactaatcagacaaggaactgattacaaacattggccgcaaattgcacaatttgcccccagcgcttcagcgttcttcggaatgtcgcgcattggcatggaagtcacaccttcgggaacgtggttgacctacacaggtgccatcaaattggatgacaaagatccaaatttcaaagatcaagtcattttgctgaataagcatattgacgcatacaaaacattcccaccaacagagcctaaaaaggacaaaaagaagaaggctgatgaaactcaagccttaccgcagagacagaagaaacagcaaactgtgactcttcttcctgctgcagatttggatgatttctccaaacaattgcaacaatccatgagcagtgctgactcaactcaggcctctagagattacaaggatgacgacgataagtaa
序列表
<110> 清华大学
<120> 基于病毒结构蛋白遗传互补的冠状病毒细胞模型
<130> 012028339
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9325
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaatactca agcttatcgg atccatccgg tctcggcgag attaatacga ctcactatag 60
attaaaggtt tataccttcc caggtaacaa accaaccaac tttcgatctc ttgtagatct 120
gttctctaaa cgaactttaa aatctgtgtg gctgtcactc ggctgcatgc ttagtgcact 180
cacgcagtat aattaataac taattactgt cgttgacagg acacgagtaa ctcgtctatc 240
ttctgcaggc tgcttacggt ttcgtccgtg ttgcagccga tcatcagcac atctaggttt 300
cgtccgggtg tgaccgaaag gtaagatgga gagccttgtc cctggtttca acgagaaaac 360
acacgtccaa ctcagtttgc ctgttttaca ggttcgcgac gtgctcgtac gtggctttgg 420
agactccgtg gaggaggtct tatcagaggc acgtcaacat cttaaagatg gcacttgtgg 480
cttagtagaa gttgaaaaag gcgttttgcc tcaacttgaa cagccctatg tgttcatcaa 540
acgttcggat gctcgaactg cacctcatgg tcatgttatg gttgagctgg tagcagaact 600
cgaaggcatt cagtacggtc gtagtggtga gacacttggt gtccttgtcc ctcatgtggg 660
cgaaatacca gtggcttacc gcaaggttct tcttcgtaag aacggtaata aaggagctgg 720
tggccatagt tacggcgccg atctaaagtc atttgactta ggcgacgagc ttggcactga 780
tccttatgaa gattttcaag aaaactggaa cactaaacat agcagtggtg ttacccgtga 840
actcatgcgt gagcttaacg gaggggcata cactcgctat gtcgataaca acttctgtgg 900
ccctgatggc taccctcttg agtgcattaa agaccttcta gcacgtgctg gtaaagcttc 960
atgcactttg tccgaacaac tggactttat tgacactaag aggggtgtat actgctgccg 1020
tgaacatgag catgaaattg cttggtacac ggaacgttct gaaaagagct atgaattgca 1080
gacacctttt gaaattaaat tggcaaagaa atttgacacc ttcaatgggg aatgtccaaa 1140
ttttgtattt cccttaaatt ccataatcaa gactattcaa ccaagggttg aaaagaaaaa 1200
gcttgatggc tttatgggta gaattcgatc tgtctatcca gttgcgtcac caaatgaatg 1260
caaccaaatg tgcctttcaa ctctcatgaa gtgtgatcat tgtggtgaaa cttcatggca 1320
gacgggcgat tttgttaaag ccacttgcga attttgtggc actgagaatt tgactaaaga 1380
aggtgccact acttgtggtt acttacccca aaatgctgtt gttaaaattt attgtccagc 1440
atgtcacaat tcagaagtag gacctgagca tagtcttgcc gaataccata atgaatctgg 1500
cttgaaaacc attcttcgta agggtggtcg cactattgcc tttggaggct gtgtgttctc 1560
ttatgttggt tgccataaca agtgtgccta ttgggttcca cgtgctagcg ctaacatagg 1620
ttgtaaccat acaggtgttg ttggagaagg ttccgaaggt cttaatgaca accttcttga 1680
aatactccaa aaagagaaag tcaacatcaa tattgttggt gactttaaac ttaatgaaga 1740
gatcgccatt attttggcat ctttttctgc ttccacaagt gcttttgtgg aaactgtgaa 1800
aggtttggat tataaagcat tcaaacaaat tgttgaatcc tgtggtaatt ttaaagttac 1860
aaaaggaaaa gctaaaaaag gtgcctggaa tattggtgaa cagaaatcaa tactgagtcc 1920
tctttatgca tttgcatcag aggctgctcg tgttgtacga tcaattttct cccgcactct 1980
tgaaactgct caaaattctg tgcgtgtttt acagaaggcc gctataacaa tactagatgg 2040
aatttcacag tattcactga gactcattga tgctatgatg ttcacatctg atttggctac 2100
taacaatcta gttgtaatgg cctacattac aggtggtgtt gttcagttga cttcgcagtg 2160
gctaactaac atctttggca ctgtttatga aaaactcaaa cccgtccttg attggcttga 2220
agagaagttt aaggaaggtg tagagtttct tagagacggt tgggaaattg ttaaatttat 2280
ctcaacctgt gcttgtgaaa ttgtcggtgg acaaattgtc acctgtgcaa aggaaattaa 2340
ggagagtgtt cagacattct ttaagcttgt aaataaattt ttggctttgt gtgctgactc 2400
tatcattatt ggtggagcta aacttaaagc cttgaattta ggtgaaacat ttgtcacgca 2460
ctcaaaggga ttgtacagaa agtgtgttaa atccagagaa gaaactggcc tactcatgcc 2520
tctaaaagcc ccaaaagaaa ttatcttctt agagggagaa acacttccca cagaagtgtt 2580
aacagaggaa gttgtcttga aaactggtga tttacaacca ttagaacaac ctactagtga 2640
agctgttgaa gctccattgg ttggtacacc agtttgtatt aacgggctta tgttgctcga 2700
aatcaaagac acagaaaagt actgtgccct tgcacctaat atgatggtaa caaacaatac 2760
cttcacactc aaaggcggtg caccaacaaa ggttactttt ggtgatgaca ctgtgataga 2820
agtgcaaggt tacaagagtg tgaatatcac ttttgaactt gatgaaagga ttgataaagt 2880
acttaatgag aagtgctctg cctatacagt tgaactcggt acagaagtaa atgagttcgc 2940
ctgtgttgtg gcagatgctg tcataaaaac tttgcaacca gtatctgaat tacttacacc 3000
actgggcatt gatttagatg agtggagtat ggctacatac tacttatttg atgagtctgg 3060
tgagtttaaa ttggcttcac atatgtattg ttctttctac cctccagatg aggatgaaga 3120
agaaggtgat tgtgaagaag aagagtttga gccatcaact caatatgagt atggtactga 3180
agatgattac caaggtaaac ctttggaatt tggtgccact tctgctgctc ttcaacctga 3240
agaagagcaa gaagaagatt ggttagatga tgatagtcaa caaactgttg gtcaacaaga 3300
cggcagtgag gacaatcaga caactactat tcaaacaatt gttgaggttc aacctcaatt 3360
agagatggaa cttacaccag ttgttcagac tattgaagtg aatagtttta gtggttattt 3420
aaaacttact gacaatgtat acattaaaaa tgcagacatt gtggaagaag ctaaaaaggt 3480
aaaaccaaca gtggttgtta atgcagccaa tgtttacctt aaacatggag gaggtgttgc 3540
aggagcctta aataaggcta ctaacaatgc catgcaagtt gaatctgatg attacatagc 3600
tactaatgga ccacttaaag tgggtggtag ttgtgtttta agcggacaca atcttgctaa 3660
acactgtctt catgttgtcg gcccaaatgt taacaaaggt gaagacattc aacttcttaa 3720
gagtgcttat gaaaatttta atcagcacga agttctactt gcaccattat tatcagctgg 3780
tatttttggt gctgacccta tacattcttt aagagtttgt gtagatactg ttcgcacaaa 3840
tgtctactta gctgtctttg ataaaaatct ctatgacaaa cttgtttcaa gctttttgga 3900
aatgaagagt gaaaagcaag ttgaacaaaa gatcgctgag attcctaaag aggaagttaa 3960
gccatttata actgaaagta aaccttcagt tgaacagaga aaacaagatg ataagaaaat 4020
caaagcttgt gttgaagaag ttacaacaac tctggaagaa actaagttcc tcacagaaaa 4080
cttgttactt tatattgaca ttaatggcaa tcttcatcca gattctgcca ctcttgttag 4140
tgacattgac atcactttct taaagaaaga tgctccatat atagtgggtg atgttgttca 4200
agagggtgtt ttaactgctg tggttatacc tactaaaaag gctggtggca ctactgaaat 4260
gctagcgaaa gctttgagaa aagtgccaac agacaattat ataaccactt acccgggtca 4320
gggtttaaat ggttacactg tagaggaggc aaagacagtg cttaaaaagt gtaaaagtgc 4380
cttttacatt ctaccatcta ttatctctaa tgagaagcaa gaaattcttg gaactgtttc 4440
ttggaatttg cgagaaatgc ttgcacatgc agaagaaaca cgcaaattaa tgcctgtctg 4500
tgtggaaact aaagccatag tttcaactat acagcgtaaa tataagggta ttaaaataca 4560
agagggtgtg gttgattatg gtgctagatt ttacttttac accagtaaaa caactgtagc 4620
gtcacttatc aacacactta acgatctaaa tgaaactctt gttacaatgc cacttggcta 4680
tgtaacacat ggcttaaatt tggaagaagc tgctcggtat atgagatctc tcaaagtgcc 4740
agctacagtt tctgtttctt cacctgatgc tgttacagcg tataatggtt atcttacttc 4800
ttcttctaaa acacctgaag aacattttat tgaaaccatc tcacttgctg gttcctataa 4860
agattggtcc tattctggac aatctacaca actaggtata gaatttctta agagaggtga 4920
taaaagtgta tattacacta gtaatcctac cacattccac ctagatggtg aagttatcac 4980
ctttgacaat cttaagacac ttctttcttt gagagaagtg aggactatta aggtgtttac 5040
aacagtagac aacattaacc tccacacgca agttgtggac atgtcaatga catatggaca 5100
acagtttggt ccaacttatt tggatggagc tgatgttact aaaataaaac ctcataattc 5160
acatgaaggt aaaacatttt atgttttacc taatgatgac actctacgtg ttgaggcttt 5220
tgagtactac cacacaactg atcctagttt tctgggtagg tacatgtcag cattaaatca 5280
cactaaaaag tggaaatacc cacaagttaa tggtttaact tctattaaat gggcagataa 5340
caactgttat cttgccactg cattgttaac actccaacaa atagagttga agtttaatcc 5400
acctgctcta caagatgctt attacagagc aagggctggt gaagctgcta acttttgtgc 5460
acttatctta gcctactgta ataagacagt aggtgagtta ggtgatgtta gagaaacaat 5520
gagttacttg tttcaacatg ccaatttaga ttcttgcaaa agagtcttga acgtggtgtg 5580
taaaacttgt ggacaacagc agacaaccct taagggtgta gaagctgtta tgtacatggg 5640
cacactttct tatgaacaat ttaagaaagg tgttcagata ccttgtacgt gtggtaaaca 5700
agctacaaaa tatctagtac aacaggagtc accttttgtt atgatgtcag caccacctgc 5760
tcagtatgaa cttaagcatg gtacatttac ttgtgctagt gagtacactg gtaattacca 5820
gtgtggtcac tataaacata taacttctaa agaaactttg tattgcatag acggtgcttt 5880
acttacaaag tcctcagaat acaaaggtcc tattacggat gttttctaca aagaaaacag 5940
ttacacaaca accataaaac cagttactta taaattggat ggtgttgttt gtacagaaat 6000
tgaccctaag ttggacaatt attataagaa agacaattct tatttcacag agcaaccaat 6060
tgatcttgta ccaaaccaac catatccaaa cgcaagcttc gataatttta agtttgtatg 6120
tgataatatc aaatttgctg atgatttaaa ccagttaact ggttataaga aacctgcttc 6180
aagagagctt aaagttacat ttttccctga cttaaatggt gatgtggtgg ctattgatta 6240
taaacactac acaccctctt ttaagaaagg agctaaattg ttacataaac ctattgtttg 6300
gcatgttaac aatgcaacta ataaagccac gtataaacca aatacctggt gtatacgttg 6360
tctttggagc acaaaaccag ttgaaacatc aaattcgttt gatgtactga agtcagagga 6420
cgcgcaggga atggataatc ttgcctgcga agatctaaaa ccagtctctg aagaagtagt 6480
ggaaaatcct accatacaga aagacgttct tgagtgtaat gtgaaaacta ccgaagttgt 6540
aggagacatt atacttaaac cagcaaataa tagtttaaaa attacagaag aggttggcca 6600
cacagatcta atggctgctt atgtagacaa ttctagtctt actattaaga aacctaatga 6660
attatctaga gtattaggtt tgaaaaccct tgctactcat ggtttagctg ctgttaatag 6720
tgtcccttgg gatactatag ctaattatgc taagcctttt cttaacaaag ttgttagtac 6780
aactactaac atagttacac ggtgtttaaa ccgtgtttgt actaattata tgccttattt 6840
ctttacttta ttgctacaat tgtgtacttt tactagaagt acaaattcta gaattaaagc 6900
atctatgccg actactatag caaagaatac tgttaagagt gtcggtaaat tttgtctaga 6960
ggcttcattt aattatttga agtcacctaa tttttctaaa ctgataaata ttataatttg 7020
gtttttacta ttaagtgttt gcctaggttc tttaatctac tcaaccgctg ctttaggtgt 7080
tttaatgtct aatttaggca tgccttctta ctgtactggt tacagagaag gctatttgaa 7140
ctctactaat gtcactattg caacctactg tactggttct ataccttgta gtgtttgtct 7200
tagtggttta gattctttag acacctatcc ttctttagaa actatacaaa ttaccatttc 7260
atcttttaaa tgggatttaa ctgcttttgg cttagttgca gagtggtttt tggcatatat 7320
tcttttcact aggtttttct atgtacttgg attggctgca atcatgcaat tgtttttcag 7380
ctattttgca gtacatttta ttagtaattc ttggcttatg tggttaataa ttaatcttgt 7440
acaaatggcc ccgatttcag ctatggttag aatgtacatc ttctttgcat cattttatta 7500
tgtatggaaa agttatgtgc atgttgtaga cggttgtaat tcatcaactt gtatgatgtg 7560
ttacaaacgt aatagagcaa caagagtcga atgtacaact attgttaatg gtgttagaag 7620
gtccttttat gtctatgcta atggaggtaa aggcttttgc aaactacaca attggaattg 7680
tgttaattgt gatacattct gtgctggtag tacatttatt agtgatgaag ttgcgagaga 7740
cttgtcacta cagtttaaaa gaccaataaa tcctactgac cagtcttctt acatcgttga 7800
tagtgttaca gtgaagaatg gttccatcca tctttacttt gataaagctg gtcaaaagac 7860
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taaaggttca ttgcctatta atgttatagt ttttgatggt aaatcaaaat gtgaagaatc 7980
atctgcaaaa tcagcgtctg tttactacag tcagcttatg tgtcaaccta tactgttact 8040
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tgcttacgtt aatacgtttt catcaacttt taacgtacca atggaaaaac tcaaaacact 8160
agttgcaact gcagaagctg aacttgcaaa gaatgtgtcc ttagacaatg tcttatctac 8220
ttttatttca gcagctcggc aagggtttgt tgattcagat gtagaaacta aagatgttgt 8280
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ctatatgctc acctataaca aagttgaaaa catgacaccc cgtgaccttg gtgcttgtat 8400
tgactgtagt gcgcgtcata ttaatgcgca ggtagcaaaa agtcacaaca ttgctttgat 8460
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gttaattaaa gttacacttg tgttcctttt tgttgctgct attttctatt taataacacc 8700
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tgttagagtg gtaacaactt ttgattctga gtactgtagg cacggcactg gagaccatcc 9300
ggatcccgcc gcataggctg agggg 9325
<210> 2
<211> 8817
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tagaatactc aagcttatcg gatccatccg gtctcgcact tgtgaaagat cagaagctgg 60
tgtttgtgta tctactagtg gtagatgggt acttaacaat gattattaca gatctttacc 120
aggagttttc tgtggtgtag atgctgtaaa tttacttact aatatgttta caccactaat 180
tcaacctatt ggtgctttgg acatatcagc atctatagta gctggtggta ttgtagctat 240
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accagtttac tcattcttac ctggtgttta ttctgttatt tacttgtact tgacatttta 420
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gtattttagt ggagcaatgg atacaactag ctacagagaa gctgcttgtt gtcatctcgc 780
aaaggctctc aatgacttca gtaactcagg ttctgatgtt ctttaccaac caccacaaac 840
ctctatcacc tcagctgttt tgcagagtgg ttttagaaaa atggcattcc catctggtaa 900
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tgttcaactc agggttattg gacattctat gcaaaattgt gtacttaagc ttaaggttga 1140
tacagccaat cctaagacac ctaagtataa gtttgttcgc attcaaccag gacagacttt 1200
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tgttgctaca tcacgaacgc tttcttatta caaattggga gcttcgcagc gtgtagcagg 3000
tgactcaggt tttgctgcat acagtcgcta caggattggc aactataaat taaacacaga 3060
ccattccagt agcagtgaca atattgcttt gcttgtacag taagtgacaa cagatgtttc 3120
atctcgttga ctttcaggtt actatagcag agatattact aattattatg aggactttta 3180
aagtttccat ttggaatctt gattacatca taaacctcat aattaaaaat ttatctaagt 3240
cactaactga gaataaatat tctcaattag atgaagagca accaatggag attgattaaa 3300
cgaacatgaa aattattctt ttcttggcac tgataacact cgctacttgt gagctttatc 3360
actaccaaga gtgtgttaga ggtacaacag tacttttaaa agaaccttgc tcttctggaa 3420
catacgaggg caattcacca tttcatcctc tagctgataa caaatttgca ctgacttgct 3480
ttagcactca atttgctttt gcttgtcctg acggcgtaaa acacgtctat cagttacgtg 3540
ccagatcagt ttcacctaaa ctgttcatca gacaagagga agttcaagaa ctttactctc 3600
caatttttct tattgttgcg gcaatagtgt ttataacact ttgcttcaca ctcaaaagaa 3660
agacagaatg attgaacttt cattaattga cttctatttg tgctttttag cctttctgct 3720
attccttgtt ttaattatgc ttattatctt ttggttctca cttgaactgc aagatcataa 3780
tgaaacttgt cacgcctaaa cgaacatgaa atttcttgtt ttcttaggaa tcatcacaac 3840
tgtagctgca tttcaccaag aatgtagttt acagtcatgt actcaacatc aaccatatgt 3900
agttgatgac ccgtgtccta ttcacttcta ttctaaatgg tatattagag taggagctag 3960
aaaatcagca cctttaattg aattgtgcgt ggatgaggct ggttctaaat cacccattca 4020
gtacatcgat atcggtaatt atacagtttc ctgtttacct tttacaatta attgccagga 4080
acctaaattg ggtagtcttg tagtgcgttg ttcgttctat gaagactttt tagagtatca 4140
tgacgttcgt gttgttttag atttcatcta aacgaacaaa ctaagagacg atcc 4194
<210> 5
<211> 1118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atccggtctc aactaaaatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca 60
tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg 120
agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc 180
ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct 240
accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc 300
aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt 360
tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg 420
gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg 480
ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg 540
gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc 600
tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga 660
agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg 720
acgagctgta caagtaaact catgcagacc acacaaggca gatgggctat ataaacgttt 780
tcgcttttcc gtttacgata tatagtctac tcttgtgcag aatgaattct cgtaactaca 840
tagcacaagt agatgtagtt aactttaatc tcacatagca atctttaatc agtgtgtaac 900
attagggagg acttgaaaga gccaccacat tttcaccgag gccacgcgga gtacgatcga 960
gtgtacagtg aacaatgcta gggagagctg cctatatgga agagccctaa tgtgtaaaat 1020
taattttagt agtgctatcc ccatgtgatt ttaatagctt cttaggagaa tgacaaaaaa 1080
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaagga gaccatcc 1118
<210> 6
<211> 1260
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60
tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120
cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180
aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240
gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300
atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360
cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420
acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480
cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540
caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600
agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660
ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720
caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780
aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840
caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900
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gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080
aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140
gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200
gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260
<210> 7
<211> 1269
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atgtctgata atggacccca atcaaaccaa cgtagtgccc cccgcattac atttggtgga 60
cccacagatt caactgacaa taaccagaat ggaggacgca atggggcaag gccaaaacag 120
cgccgacccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcacagctct cactcagcat 180
ggcaaggagg aacttagatt ccctcgaggc cagggcgttc caatcaacac caatagtggt 240
ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctacccgac gagttcgtgg tggtgacggc 300
aaaatgaaag agctcagccc cagatggtac ttctattacc taggaactgg cccagaagct 360
tcacttccct acggcgctaa caaagaaggc atcgtatggg ttgcaactga gggagccttg 420
aatacaccca aagaccacat tggcacccgc aatcctaata acaatgctgc caccgtgcta 480
caacttcctc aaggaacaac attgccaaaa ggcttctacg cagagggaag cagaggcggc 540
agtcaagcct cttctcgctc ctcatcacgt agtcgcggta attcaagaaa ttcaactcct 600
ggcagcagta ggggaaattc tcctgctcga atggctagcg gaggtggtga aactgccctc 660
gcgctattgc tgctagacag attgaaccag cttgagagca aagtttctgg taaaggccaa 720
caacaacaag gccaaactgt cactaagaaa tctgctgctg aggcatctaa aaagcctcgc 780
caaaaacgta ctgccacaaa acagtacaac gtcactcaag catttgggag acgtggtcca 840
gaacaaaccc aaggaaattt cggggaccaa gacctaatca gacaaggaac tgattacaaa 900
cattggccgc aaattgcaca atttgctcca agtgcctctg cattctttgg aatgtcacgc 960
attggcatgg aagtcacacc ttcgggaaca tggctgactt atcatggagc cattaaattg 1020
gatgacaaag atccacaatt caaagacaac gtcatactgc tgaacaagca cattgacgca 1080
tacaaaacat tcccaccaac agagcctaaa aaggacaaaa agaaaaagac tgatgaagct 1140
cagcctttgc cgcagagaca aaagaagcag cccactgtga ctcttcttcc tgcggctgac 1200
atggatgatt tctccagaca acttcaaaat tccatgagtg gagcttctgc tgattcaact 1260
caggcataa 1269
<210> 8
<211> 951
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60
tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120
cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180
aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240
gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300
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cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420
acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480
cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540
caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600
agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctgcagagt attgcctgtc ctacgagaca 660
gagatcctga cagtggagta tggcctgctg ccaatcggca agatcgtgga gaagaggatc 720
gagtgtaccg tgtactctgt ggataacaat ggcaacatct atacacagcc cgtggcacag 780
tggcacgata ggggagagca ggaggtgttc gagtattgcc tggaggacgg cagcctgatc 840
agggcaacca aggaccacaa gttcatgaca gtggatggcc agatgctgcc catcgacgag 900
attttcgagc gggagctgga cctgatgaga gtggataacc tgcctaatta a 951
<210> 9
<211> 765
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgatcaaga ttgctacacg gaaatacctg ggaaagcaga acgtgtacga catcggcgtg 60
ggcgaacccc acaacttcgc cctgaagaat ggctttatcg ccagcaattg caatggcggt 120
gatgctgctc ttgctttgct gctgcttgac agattgaacc agcttgagag caaaatgtct 180
ggtaaaggcc aacaacaaca aggccaaact gtcactaaga aatctgctgc tgaggcttct 240
aagaagcctc ggcaaaaacg tactgccact aaagcataca atgtaacaca agctttcggc 300
agacgtggtc cagaacaaac ccaaggaaat tttggggacc aggaactaat cagacaagga 360
actgattaca aacattggcc gcaaattgca caatttgccc ccagcgcttc agcgttcttc 420
ggaatgtcgc gcattggcat ggaagtcaca ccttcgggaa cgtggttgac ctacacaggt 480
gccatcaaat tggatgacaa agatccaaat ttcaaagatc aagtcatttt gctgaataag 540
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gctgatgaaa ctcaagcctt accgcagaga cagaagaaac agcaaactgt gactcttctt 660
cctgctgcag atttggatga tttctccaaa caattgcaac aatccatgag cagtgctgac 720
tcaactcagg cctctagaga ttacaaggat gacgacgata agtaa 765

Claims (27)

1.一种重组的冠状病毒，其基因组在编码结构蛋白的基因中存在缺失，该缺失导致仅由该重组病毒的基因组产生的重组病毒缺乏所述结构蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组的冠状病毒，其中所述冠状病毒是非典型肺炎冠状病毒(SARS-CoV)或新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
3.根据权利要求1或2所述的重组的冠状病毒，其中所述缺失包括缺失编码一种或更多种结构蛋白的序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组的冠状病毒，其中所述缺失包括缺失编码刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)中的一种或更多种的序列，优选地，所述缺失是缺失编码核衣壳蛋白的序列。
5.一种产生重组的冠状病毒的方法，所述重组的冠状病毒的基因组在编码结构蛋白的基因中存在缺失，所述缺失导致仅由所述重组病毒的基因组产生的重组病毒缺乏所述结构蛋白，所述方法包括：
(1)体外扩增病毒基因组片段并进行体外拼接；
(2)体外转录制备重组病毒的基因组RNA，其中该基因组RNA在编码结构蛋白的基因中存在突变，导致仅由该重组病毒的基因组产生的重组病毒缺乏所述结构蛋白；
(3)制备包装细胞系，所述包装细胞系稳定表达所述重组病毒所缺乏的结构蛋白；
(4)转染重组病毒的基因组RNA至包装细胞系，产生重组病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV或SARS-CoV-2。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述缺失包括缺失编码一种或更多种结构蛋白的序列。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的方法，其中所述缺失包括缺失编码刺突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白中的一种或更多种的序列，优选地，所述缺失是缺失编码核衣壳蛋白的序列。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，所述重组的冠状病毒的基因组还包含编码标记物的RNA。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述标记物是荧光蛋白，优选地，所述标记物是是绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、它们的增强型荧光蛋白或者荧光素酶蛋白，更优选地，所述标记物是绿色荧光蛋白。
11.根据权利要求5-10中任一项所述的方法，其中体外扩增病毒基因组片段通过聚合酶链式反应(PCR)进行。
12.根据权利要求5-11中任一项所述的方法，其中所述包装细胞系是Caco-2细胞、Vero细胞、VeroE6细胞或Calu-3细胞，优选地，所述包装细胞系是Caco-2细胞、Vero细胞或VeroE6细胞，最优选地，所述包装细胞系是Caco-2细胞。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞用携带重组病毒缺失的结构蛋白的编码序列的载体转染，优选地，所述载体是哺乳动物表达载体，更优选地，所述载体是慢病毒载体。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述载体是pcDNA3.0、pcDNA3.1、pCAG、pLVX-IRES-Puro、pLVX-IRES-zsGreen或pLVX-IRES-mCherry载体，优选地，所述载体是pLVX-IRES-mCherry载体。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述结构蛋白的碳端插入有可检测标签，优选地，所述可检测标签是FLAG标签。
16.根据权利要求15所述的方法，其中利用流式细胞术分选经转染的细胞。
17.根据权利要求5-16中任一项所述的方法，其中使用过表达SARS-CoV的N蛋白的包装细胞系包装重组的SARS-CoV-2，其中所述重组的SARS-CoV-2的基因组缺乏N蛋白编码基因。
18.根据权利要求5-16中任一项所述的方法，其中使用过表达SARS-CoV的N蛋白的包装细胞系包装重组的SARS-CoV，其中所述重组的SARS-CoV的基因组缺乏N蛋白编码基因。
19.根据权利要求5-18中任一项所述的方法，其中步骤(3)利用蛋白质内含肽介导的蛋白质连接技术来进行。
20.根据权利要求19所述的方法，制备编码以下氨基酸序列的质粒，包装慢病毒，转导、形成包装细胞系：
(1)编码结构蛋白氮端氨基酸1-Xi和内含肽氮段部分的融合肽，和
(2)编码内含肽碳段部分和结构蛋白氮端氨基酸Xi+1至Xn的融合肽，其中n为结构蛋白的总氨基酸数目，且1＜i＜n。
21.根据权利要求1-4中任一项所述的重组的冠状病毒在制备预防冠状病毒感染的疫苗中的用途。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述冠状病毒是新型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
23.一种用于包装冠状病毒的包装细胞系，其中所述包装细胞系过表达冠状病毒的一种或更多种结构蛋白。
24.根据权利要求23所述的包装细胞系，其中所述包装细胞系是Caco-2细胞、Vero细胞、VeroE6细胞或Calu-3细胞，优选地，所述包装细胞系是Caco-2细胞、Vero细胞或VeroE6细胞，最优选地，所述包装细胞系是Caco-2细胞。
25.根据权利要求23或24所述的包装细胞系，其中所述包装细胞系过表达冠状病毒的核衣壳蛋白。
26.根据权利要求1-4中任一项所述的重组冠状病毒和根据权利要求23-25中任一项所述的包装细胞系在药物筛选中的应用。
27.根据权利要求26所述的应用，其中药物筛选在生物安全二级实验室进行。
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