CN110592031B - 一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用 - Google Patents

一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用。本发明是将野生型传染性支气管炎病毒(IBV)的S蛋白水解切割位点处第539位插入HiBiT的氨基酸，并在HiBiT前后各加上4个连接氨基酸，获得IBV突变型病毒株。该突变株的获得有助于研究IBV HiBiT‑S2融合蛋白的结构、病毒的增殖能力、形成空斑的大小，并可判断病毒的复制能力和致病力是否发生改变，并且为定量IBV提供了新方法。

Description

一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒及制备方法 与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用。
背景技术
传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)属于冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)的γ冠状病毒亚属，是该亚群的代表病毒，也是最早分离获得的冠状病毒。IBV可引起鸡急性、高度接触性传染病，是影响全球禽业的主要病原之一，自1931年首次分离以来，世界各地发现了数量惊人的IBV变异体。IBV病原变异不断出现，且缺乏有效、广谱保护的IBV疫苗，因此，对IBV这一经济上重要的病原生物学进行研究是十分关键的。以IBV作为冠状病毒的原型的几十年的研究揭示了分子细胞生物学和冠状病毒发病机制中的一些最基本的概念，但是冠状病毒成功建立反向遗传系统的却只有少数几种。
IBV是单股正链RNA病毒，含有一个长27.6KB的RNA基因组，排列顺序为5’-ORF1a-ORF1b-S-3a-3b-E-M-5a-5b-N-3’，S、M、N和E是其结构蛋白，参与病毒粒子的组成。S蛋白是冠状病毒分子量最大的结构蛋白，属于I型跨膜蛋白，具有巨大的N端胞外域，1个跨膜域和极短的C-端域。在IBV中，S蛋白被宿主蛋白酶切割成大小大致相同的两个功能亚基，N端的S1域和C端S2域。
目前常规使用的IBV定量方法主要是半数组织培养感染剂量实验(TCID50)和噬斑实验，这两种方法都是通过连续稀释病毒液后取一定体积的病毒稀释液感染细胞，时隔三四天后观察细胞病变情况计算病毒的滴度。操作复杂，误差大，其准确性有待考察，当需要大批定量IBV病毒样品时，此类方法极其耗时耗力，因此急需一种更高通量并且更快更精确的IBV病毒定量方法。
HiBiT是一种11-氨基酸肽标签，与目的蛋白质融合表达后可与底物腔肠素和LgBiT紧密结合(KD＝0.7nM)，促进细胞裂解物复合物的形成，产生明亮的发光酶。继而可确定细胞中目的蛋白质的量，发光量与细胞裂解物目的蛋白质的浓度呈正线性相关，发光型发光信号稳定数小时。利用此特性，将HiBiT标签插入某一IBV结构蛋白，获得重组病毒，将能快速、准确的定量IBV。但IBV病毒基因组十分紧凑，对外源序列的插入敏感，在庞大的基因组序列内找到稳定遗传并成功表达外源基因的位点较为困难。
发明内容
本发明的首要目的在于弥补现有技术的缺点与不足，提供一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒。此重组病毒传代稳定，能够精确定量IBV病毒。
本发明的另一目的在于提供上述S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的应用。
本发明的目的通过下列技术方案实现：一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒，是将野生型传染性支气管炎病毒(IBV)的S蛋白水解切割位点处第539位插入HiBiT的氨基酸，并在HiBiT前后各加上4个连接氨基酸得到。
所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的S蛋白氨基酸序列如SEQNO.1所示。
编码所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的S蛋白核苷酸序列如SEQ NO.2所示。
上述S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，是采用反向遗传学技术，获得IBV全长感染性克隆，再以其为模板，在IBV S蛋白第539位氨基酸插入HiBiT，体外转录电转染细胞，获得IBV突变型病毒株(rS1-HiBiT-S2)；具体包括以下步骤：
(1)将横跨整个IBV基因组的片段A、片段B、片段C、片段D和片段E，纯化，克隆入载体中，得到重组载体A、重组载体B、重组载体C、重组载体D和重组载体E；在构建过程中，将限制性位点BsmBI或BsaI分别导入到5个片段的5’端和3’端，并且在A片段中将T7启动子序列插入IBV基因组5’端的上游，利用T7聚合酶促进体外转录；
(2)扩增含有HiBiT片段的S蛋白部分序列，无缝克隆到S蛋白所在的E片段，获得S蛋白第539位插入HiBiT的E片段质粒；
(3)将片段A、B、C、D和S蛋白第539位插入HiBiT的E片段连接，纯化，体外转录，得到全长转录本；以线性化的pKT0-N质粒为模板，体外转录，得到N转录本；
(4)将步骤(3)得到的全长转录本和N转录本电转至Vero细胞，培养，出现典型细胞病变(细胞融合)，即得到S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒。
步骤(1)中所述的片段A、片段B、片段C、片段D和片段E是利用RT-PCR技术从IBV感染的非洲绿猴肾细胞中提取总RNA，再扩增得到。
步骤(1)中所述的将限制性位点BsmBI或BsaI分别导入到5个片段的5’端和3’端是通过扩增所用的引物引入。
步骤(1)中所述的片段A是传染性支气管炎病毒的第1～5752位核苷酸，引入的限制性位点为BsmBI。
步骤(1)中所述的片段B是传染性支气管炎病毒的第5753～8693位核苷酸，引入的限制性位点为BsaI。
步骤(1)中所述的片段C是传染性支气管炎病毒的第8694～15528位核苷酸，引入的限制性位点为BsaI。
步骤(1)中所述的片段D是传染性支气管炎病毒的第15529～20900位核苷酸，引入的限制性位点为BsaI。
步骤(1)中所述的片段E是传染性支气管炎病毒的第20901～25180位核苷酸，引入的限制性位点为BsaI。
步骤(1)中所述的载体为pKT0、pCR-TOPO-XL或pGEM-T Easy。
步骤(1)中所述的片段A适用的载体优选为pKT0。
步骤(1)中所述的片段B适用的载体优选为pGEM-T Easy。
步骤(1)中所述的片段C适用的载体优选为pCR-TOPO-XL。
步骤(1)中所述的片段D适用的载体优选为pGEM-T Easy。
步骤(1)中所述的片段E适用的载体优选为pGEM-T Easy。
步骤(1)中所述的将T7启动子序列插入IBV基因组5’端的上游是通过扩增所用的引物引入。
步骤(2)中所述的扩增含有HiBiT片段的S蛋白部分序列的引物如下：
S-Hbt-Ins-Fwd：ATCACTAATGGAACACGTCG；
S-Hbt-Ins-Rev：ATCCAGAGAACTGCCACAAA。
步骤(2)中所述的S蛋白所在的E片段的扩增引物如下：
S-Hbt-Vec-Rev：CGACGTGTTCCATTAGTGAT；
S-Hbt-Vec-Fwd：TTTGTGGCAGTTCTCTGGAT。
步骤(2)中所述的S蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.3所示。
编码步骤(2)中所述的S蛋白的核苷酸序列如SEQ NO.4所示。
步骤(3)中所述的片段A、B、C、D和S蛋白第539位插入HiBiT的E片段是通过BsmBI和BsaI酶切步骤(1)的重组载体A、重组载体B、重组载体C、重组载体D和步骤(2)的S蛋白第539位插入HiBiT的E片段质粒得到。
步骤(3)中所述的连接是通过T4DNA连接酶连接。
步骤(3)中所述的全长转录本和N转录本还包括采用DNaseⅠ处理，然后用酚/氯仿进行纯化的步骤。
步骤(3)中所述的全长转录本的体外转录的条件优选为：GTP：CAD类似物＝1：1进行转录反应，反应体系为20μL，反应条件为：37℃3h。
步骤(3)中所述的N转录本的体外转录的条件为：GTP：CAD类似物＝1：2进行转录反应，反应体系为10μL，反应条件为：37℃3h。
步骤(4)中所述的电转的条件优选为：0.22μm电击杯、450V、50μF进行一次脉冲。
步骤(4)中所述的培养是将电转后的Vero细胞用含1％(v/v)的FBS的DMEM培养基隔夜培养，再换成不含FBS的DMEM培养基继续培养5天得到。
上述S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒在制备鸡胚中病毒量检测试剂盒中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明提供了一种可行的IBV反向遗传操作技术。
(2)本发明提供了一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒。测定病毒增殖曲线，发现IBV S蛋白水解切割位点处插入HiBiT不影响IBV病毒在细胞内的增殖。HiBiT发光值与病毒增殖曲线成线性关系，可定量IBV病毒颗粒数，可替代TCID50，大大节省时间人力物力。
(3)本发明的突变株的获得有助于研究IBV HiBiT-S2融合蛋白的结构、病毒的增殖能力、形成空斑的大小，并可判断病毒的复制能力和致病力是否发生改变，并且为定量IBV提供了新方法。
附图说明
图1为IBV全长基因组的5个片段A、B、C、D、E的划分示意图。
图2为实施例8中突变型rS1-HiBiT-S2病毒发光值的稳定性检测结果图。
图3为合成的pUC57-Amp_S1-HiBiT-S2质粒图谱。
图4为实施例9中野生型rIBV-p65病毒和突变型rS1-HiBiT-S2病毒的EID50检测结果(A)和尿囊液发光值检测结果图(B)。
图5为实施例1中E片段质粒测序结果图；其中，A为含S1-HiBiT-S2的E片段质粒测序结果图，B为含M-HiBiT的E片段质粒测序结果图，C为含N-HiBiT的E片段质粒测序结果图。
图6为实施例2中不同代次的突变型rS1-HiBiT-S2病毒与rM-HiBiT病毒基因稳定性检测结果图；其中，A为不同代次的突变型rS1-HiBiT-S2病毒基因稳定性检测结果图，B为rM-HiBiT病毒基因稳定性检测结果图。
图7为实施例3中野生型rIBV-p65病毒和突变型rS1-HiBiT-S2病毒的噬斑实验结果图。
图8为实施例4中野生型rIBV-p65病毒和突变型rS1-HiBiT-S2病毒的蛋白表达电泳验证结果图。
图9为实施例5中野生型rIBV-p65病毒和突变型rS1-HiBiT-S2病毒的增殖曲线图。
图10为实施例6中野生型rIBV-p65病毒和突变型rS1-HiBiT-S2病毒感染Vero细胞后的发光曲线图。
图11为实施例7中突变型rS1-HiBiT-S2病毒的TCID50与发光值的关系图。
具体实施方式
下面将结合实施方式和附图对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1IBV HiBiT-S2融合蛋白突变株rS1-HiBiT-S2全长感染性克隆的构建
(1)将非洲绿猴肾细胞(Vero细胞，
Figure BDA0002214570980000041
CCL-81)培养于10cm培养皿中，添加10mL含5％(v/v)FBS(Gibco)和1％(v/v)PS(Gibco)的DMEM(Gibco)培养基，放置于含5％CO2的37℃恒温培养箱培养过夜。待单层细胞长满后，弃去DMEM培养基，用PBS(Gibco)洗两遍，添加9mL含1％(v/v)PS的DMEM培养基，再添加1mL野生型rIBV-p65(来源见文献“S.Shen,etal.Emergence of a coronavirus infectious bronchitis virus mutant with atruncated 3b gene:functional characterization of the 3b protein inpathogenesis and replication.”)病毒液，放置于含5％CO2的37℃恒温培养箱培养过夜，显微镜下观察Vero细胞出现典型细胞病变，即出现细胞融合时，表明病毒感染成功，待所有细胞都完全融合时，弃去DMEM培养基，用1mL trizol(全式金)裂解Vero细胞，提取细胞总RNA，利用RT-PCR技术从总RNA中扩增出片段A到E，引物见表1。
表1构建IBV全长感染性克隆的引物
Figure BDA0002214570980000042
(2)将野生型rIBV-p65病毒的全长A、B、C、D、E五个片段分别纯化并克隆到pKT0(pKT0载体已在文献“An arginine-to-proline mutation in a domain with undefinedfunctions within the helicase protein(Nsp13)is lethal to the coronavirusinfectious bronchitis virus in cultured cells”中公开)、pCR-TOPO-XL(Invitrogen)或pGEM-T Easy(Promega)载体中，得到重组质粒：pKT0-N、pKT0-A、pGEM-T Easy-B、pCR-TOPO-XL-C、pGEM-T Easy-D及pGEM-T Easy-E。这些重组质粒包含野生型rIBV-p65病毒的N基因及横跨整个病毒基因组的5个片段A到E(图1)，并将BsmBI或BsaI的限制性位点导入到片段的5’端和3’端。在A片段中，将T7启动子序列插入IBV基因组5’端的上游，利用T7聚合酶促进体外转录。
(3)用金唯智公司合成的质粒pUC57-Amp_S1-HiBiT-S2(图3)和引物(表2)对S蛋白所在的E片段进行无缝克隆，获得S蛋白第539位插入HiBiT(VSGWRLFKKIS)，并在HiBiT前后各加上4个连接氨基酸GSSG，即插入氨基酸GSSGVSGWRLFKKISGSSG的E片段质粒。同时设置对比：1、用引物扩增含HiBiT片段的部分N序列，对N蛋白所在的E片段进行定向克隆(引物见表3，参照《分子克隆》操作)，获得N蛋白第2位插入11个HiBiT的氨基酸，并在HiBiT后加上4个连接氨基酸GSSG，即插入氨基酸VSGWRLFKKISGSSG的E片段质粒；2、用引物扩增含HiBiT片段的部分M序列，对M蛋白所在的E片段进行无缝克隆(引物见表4)，获得M蛋白第11位插入11个HiBiT的氨基酸，并在HiBiT前后各加上4个连接氨基酸GSSG，即插入氨基酸GSSGVSGWRLFKKISGSSG的E片段质粒。
表2含S1-HiBiT-S2蛋白的S部分序列无缝克隆到E片段的引物
名称 序列(5’-3’) 长度(bp)
S-Hbt-Ins-Fwd ATCACTAATGGAACACGTCG 20
S-Hbt-Ins-Rev ATCCAGAGAACTGCCACAAA 20
S-Hbt-Vec-Rev CGACGTGTTCCATTAGTGAT 20
S-Hbt-Vec-Fwd TTTGTGGCAGTTCTCTGGAT 20
表3对N蛋白所在的E片段进行定向克隆的引物
Figure BDA0002214570980000051
表4对M蛋白所在的E片段进行定向克隆的引物
Figure BDA0002214570980000052
Figure BDA0002214570980000061
表5无缝克隆插入片段PCR反应体系
Figure BDA0002214570980000062
PCR条件为：预变性：95℃预变性3min；95℃变性30s、53℃退火30s，72℃延伸7min，进行18个循环；72℃终延伸10min。然后试剂盒回收纯化PCR产物，获得Ins。
表6无缝克隆载体片段PCR反应体系
Figure BDA0002214570980000063
PCR条件为：预变性：95℃预变性3min；95℃变性30sec、53℃退火10min，72℃延伸20min，进行18个循环；72℃终延伸10min。然后试剂盒回收纯化PCR产物，获得Vec。
将Ins和Vec在37℃下用Exnase II(Vazyme)反应30min，重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过氨苄筛选，挑单克隆送测序公司(金唯智)测序，结果如图5所示，证明得到了三个E片段插入HiBiT的重组质粒，分别是ES1-HiBiT-S2(A)、EM-HiBiT(B)和EN-HiBiT(C)。
(4)将步骤(2)和步骤(3)得到的质粒分别用BsmBI(A段)(NEB公司)和BsaI(B、C、D和E段)(NEB公司)酶切消化，用0.8％的琼脂糖凝胶进行结晶紫染色，电泳回收纯化。在16℃下用T4DNA连接酶(Thermo)连接过夜，用苯酚/氯仿提取连接产物(参照《分子克隆》操作)，乙醇沉淀，使用高产量加帽RNA转录试剂盒(mMessagemMachine T7kit，Ambion)在体外产生全长转录本，具体为：GTP：CAD类似物＝1：1进行转录反应，反应体系为20μL，反应条件为：37℃3h。
(5)以线性化的pKT0-N质粒(含IBV N基因和3’UTR区，其已在文献“An arginine-to-proline mutation in a domain with undefined functions within the helicaseprotein(Nsp13)is lethal to the coronavirus infectious bronchitis virus incultured cells”中公开)为模板，构建N转录本。用DNaseⅠ处理体外转录的全长RNA和N转录本，用酚/氯仿进行纯化(参照《分子克隆》操作)。N转录本的体外转录条件为GTP：CAD类似物＝1：2，反应体系为10μL，反应条件为：37℃3h。
(6)Vero细胞培养在DMEM培养基中，生长密度达到90％时，胰酶(Gibco)消化，用预冷的PBS洗涤两次，重悬于600μL PBS中。取200μL Vero细胞悬液加入0.22μm电转杯(Bio-Rad)中，加入10μL步骤(4)制备的全长转录本和5μL步骤(5)制备的N转录本，放置于Bio-RadGene Pulser II电转仪内，用450V、50μF进行一次脉冲。电转后的Vero细胞置于60mm培养皿或6孔板中，用含1％(v/v)的FBS的DMEM培养基隔夜培养后换成不含FBS的DMEM培养基继续培养5天。发现典型细胞病变(细胞融合)，说明成功构建了突变型rS1-HiBiT-S2病毒和rM-HiBiT病毒，但未获得rN-HiBiT重组毒。将细胞连同培养基冻融三次后离心取上清，获得突变型rS1-HiBiT-S2病毒p0代和rM-HiBiT病毒p0代，于-80℃保存。
实施例2突变型rS1-HiBiT-S2病毒及rM-HiBiT病毒基因遗传稳定性测定
将实施例1获得的突变型rS1-HiBiT-S2-p0代病毒和rM-HiBiT病毒p0代病毒在长满的Vero细胞上传代至p20代(培养过程同实施例1)。rS1-HiBiT-S2病毒每五代病毒提取一次细胞总RNA，rM-HiBiT病毒每两代病毒提取一次细胞总RNA，利用RT-PCR技术从总RNA中扩增出S基因或M基因，引物见表5。送测序公司测序并分析。结果如图6所示，突变型rS1-HiBiT-S2病毒的S基因能够稳定遗传至p20代，而突变型rM-HiBiT病毒在p8代丢失了部分HiBiT序列，不能稳定遗传。
表7扩增突变型rS1-HiBiT-S2病毒和rM-HiBiT病毒的引物
Figure BDA0002214570980000071
实施例3野生型rIBV-p65病毒和突变型rS1-HiBiT-S2病毒的噬斑实验
将实施例1获得的突变型rS1-HiBiT-S2-p0代病毒，在长满的Vero细胞上传代至第20代(培养过程同实施例1)，获得rS1-HiBiT-S2-p20重组毒。分别取100倍稀释后的野生型rIBV-p65病毒和突变型rS1-HiBiT-S2-p20病毒100μL感染接种于6孔板中长满的Vero细胞，37℃孵育培养1h后，用PBS冲洗两次，分别在含1％羧甲基纤维素(Sigma)和1％(v/v)FBS的2mL DMEM培养基中培养4天，用4％多聚甲醛固定15min，用0.1％甲苯胺蓝(Sigma)染色30min。
结果如图7所示，突变型rS1-HiBiT-S2-p20病毒和野生型rIBV-p65病毒感染所形成的病毒空斑的大小没有明显差异，说明突变型rS1-HiBiT-S2-p20病毒和野生型rIBV-p65病毒在单层培养细胞上增殖的速度一致。
实施例4Western blot验证突变病毒株蛋白的表达
用1×RIPA缓冲液(碧云天)裂解不被病毒感染的Vero细胞，得到mock组。同时裂解被野生型rIBV-p65病毒和实施例1获得的突变型rS1-HiBiT-S2病毒感染的Vero细胞，获得总蛋白，与含0.1mol/L DTT的5×Loading dye(鼎国)混合后，将细胞裂解液在95℃下煮沸5分钟，用三份SDS-PAGE胶进行处理。将三张转印后的NC膜在含5％脱脂奶粉的PBST缓冲液(80mmol/L Na2HPO4，20mmol/L NaH2PO4，100mmol/L NaCl，0.1％吐温20，pH7.5)中4℃孵育过夜。将一张NC膜与HiBiT Blotting试剂(promega)孵育1h，用PBST洗涤3次后，用化学发光检测试剂盒(ECL)(Bio-Rad)检测。第二张和第三张NC膜分别与IBV-S或IBV N抗体(S或N蛋白注射兔子得到，文献来源“Liu DX,Inglis SC.Association of the infectiousbronchitis virus 3c protein with the virion envelope.Virology.185(2),911–917(1991).Li FQ,Xiao H,Tam JP,Liu DX.Sumoylation of the nucleocapsid protein ofsevere acute respiratory syndrome coronavirus.FEBS Lett.579(11),2387–2396(2005).”)孵育1h，用PBST(谷歌生物)洗涤3次后，与辣根过氧化物酶(北京全式金)结合的抗兔IgG抗体孵育1h，用PBST洗涤3次后，用化学发光检测试剂盒(ECL)(Bio-Rad)检测。
结果如图8所示，HiBiT Blotting试剂与IBV S抗体同时检测到突变型rS1-HiBiT-S2病毒的S蛋白。同时野生型rIBV-p65病毒与突变型rS1-HiBiT-S2病毒的S蛋白和N蛋白没有明显差异，说明突变型rS1-HiBiT-S2病毒和野生型rIBV-p65病毒在Vero细胞上繁殖速度一致。
实施例5野生型rIBV-p65病毒和突变型rS1-HiBiT-S2病毒的增殖曲线
分别用野生型rIBV-p65病毒与实施例1获得的突变型rS1-HiBiT-S2病毒100μL感染6孔板中长满的Vero细胞，并在感染后不同时间收获，同时收获上清液，并在细胞中加入等体积的培养基，三次冻融后收获胞内病毒液，然后分别将上清液和胞内病毒液10倍连续稀释感染96孔板上长满的Vero细胞。感染后第3天，根据细胞病变(细胞融合)读取感染孔数，用Reed和Muench法测定每个样品的半数细胞感染量(TCID50)。
结果如图9所示，病毒增殖曲线说明突变型rS1-HiBiT-S2病毒和野生型rIBV-p65病毒株在细胞上的增殖没有显著差异。
实施例6Nano-Glo HiBiT Lytic检测系统检测发光值
分别用野生型rIBV-p65病毒与实施例1获得的突变型rS1-HiBiT-S2病毒100μL感染6孔板中长满的Vero细胞，并在感染后不同时间收获，同时收获上清液，并在细胞中加入等体积的培养基，三次冻融后收获胞内病毒液，取等量的上清液和胞内病毒液分别加入等体积的Nano-
Figure BDA0002214570980000081
HiBiT反应液，反应10min后在多功能酶标仪(BioTek)上检测发光值(RLU:relative light unit，相对光单位)。Nano-
Figure BDA0002214570980000082
HiBiT反应液的配方是100X稀释的LgBiT Protein和50X稀释的Nano-
Figure BDA0002214570980000083
HiBiT Lytic Substrate加入到适当体积的室温的Nano-
Figure BDA0002214570980000084
HiBiT Lytic Buffer。
结果如图10所示，野生型rIBV-p65病毒没有发光值，突变型rS1-HiBiT-S2病毒的发光值随感染时间先下降后上升，其中，胞内病毒液的发光值高于上清液的发光值。
实施例7突变型IBV病毒半数细胞感染量(TCID50)与发光值的关系测定
取实施例1获得的突变型rS1-HiBiT-S2病毒100μL，感染6孔板中长满的Vero细胞，并在感染后不同时间收获，三次冻融后收获细胞裂解液，然后分别将细胞裂解液10倍连续稀释，感染96孔板上长满的Vero细胞。感染后第3天，根据细胞病变(细胞融合)读取感染孔数，用Reed和Muench法(Stanic M.[A simplification of the estimation of the50percent endpoints according to the Reed and Muench method][J].Pathologia EtMicrobiologia,1963,26(503):298-302.)测定每个样品的半数细胞感染量(TCID50)。取等量的细胞裂解液分别加入等体积的Nano-
Figure BDA0002214570980000085
HiBiT反应液，反应10min后在多功能酶标仪检测发光值(同实施例6)。将TCID50值与发光值进行线性回归方程分析，获得结果如图11所示，突变型rS1-HiBiT-S2病毒的TCID50与发光值成线性关系。
实施例8突变型IBV病毒发光值的稳定性
取实施例1获得的突变型rS1-HiBiT-S2病毒在Vero细胞上持续传代至p20代，并测定每两代的病毒发光值(同实施例6)。
结果如图2所示，不同代次的突变型rS1-HiBiT-S2病毒发光值变化不大，说明突变型rS1-HiBiT-S2病毒能够维持稳定的发光。
实施例9野生型rIBV-p65病毒及突变型rS1-HiBiT-S2病毒鸡胚半数细胞感染量(EID50)及尿囊液发光值
取野生型rIBV-p65病毒及实施例1获得的突变型rS1-HiBiT-S2病毒100μL感染6孔板中长满的Vero细胞，并在感染24h后收获，三次冻融后获得细胞裂解液，然后将细胞裂解液10倍连续稀释感染10日龄的鸡胚，在37℃恒温箱继续培养5天后，记录死亡情况。感染突变型rS1-HiBiT-S2组仍然存活的鸡胚取等量的尿囊液用于发光，并记录鸡胚病变矮化情况。
结果如图4所示，突变型rS1-HiBiT-S2病毒与野生型rIBV-p65的EID50差异不大，表明病毒在鸡胚中繁殖能力一致。突变型rS1-HiBiT-S2病毒在感染鸡胚后未死亡的鸡胚尿囊液中仍能检测到发光值，表明此突变型病毒可以定量鸡胚中病毒的量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒及制备方法与应用
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1181
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IBV突变型病毒株rS1-HiBiT-S2的S蛋白氨基酸序列
<400> 1
Met Leu Val Thr Pro Leu Leu Leu Val Thr Leu Leu Cys Ala Leu Cys
1 5 10 15
Ser Ala Val Leu Tyr Asp Ser Ser Ser Tyr Val Tyr Tyr Tyr Gln Ser
20 25 30
Ala Phe Arg Pro Pro Ser Gly Trp His Leu Gln Gly Gly Ala Tyr Ala
35 40 45
Val Val Asn Ile Ser Ser Glu Phe Asn Asn Ala Gly Ser Ser Ser Gly
50 55 60
Cys Thr Val Gly Ile Ile His Gly Gly Arg Val Val Asn Ala Ser Ser
65 70 75 80
Ile Ala Met Thr Ala Pro Ser Ser Gly Met Ala Trp Ser Ser Ser Gln
85 90 95
Phe Cys Thr Ala His Cys Asn Phe Ser Asp Thr Thr Val Phe Val Thr
100 105 110
His Cys Tyr Lys His Gly Gly Cys Pro Ile Thr Gly Met Leu Gln Gln
115 120 125
Asn Phe Ile Arg Val Ser Ala Met Lys Asn Gly Gln Leu Phe Tyr Asn
130 135 140
Leu Thr Val Ser Val Ala Lys Tyr Pro Thr Phe Arg Ser Phe Gln Cys
145 150 155 160
Val Asn Asn Leu Thr Ser Val Tyr Leu Asn Gly Asp Leu Val Tyr Thr
165 170 175
Ser Asn Glu Thr Ile Asp Val Thr Ser Ala Gly Val Tyr Phe Lys Ala
180 185 190
Gly Gly Pro Ile Thr Tyr Lys Val Met Arg Glu Val Lys Ala Leu Ala
195 200 205
Tyr Phe Val Asn Gly Thr Ala Gln Asp Val Ile Leu Cys Asp Gly Ser
210 215 220
Pro Arg Gly Leu Leu Ala Cys Gln Tyr Asn Thr Gly Asn Phe Ser Asp
225 230 235 240
Gly Phe Tyr Pro Phe Thr Asn Ser Ser Leu Val Lys Gln Lys Phe Ile
245 250 255
Val Tyr Arg Glu Asn Ser Val Asn Thr Thr Cys Thr Leu His Asn Phe
260 265 270
Ile Phe His Asn Glu Thr Gly Ala Asn Pro Asn Pro Ser Gly Val Gln
275 280 285
Asn Ile Gln Thr Tyr Gln Thr Lys Thr Ala Gln Ser Gly Tyr Tyr Asn
290 295 300
Phe Asn Phe Ser Phe Leu Ser Ser Phe Val Tyr Lys Glu Ser Asn Phe
305 310 315 320
Met Tyr Gly Ser Tyr His Pro Ser Cys Lys Phe Arg Leu Glu Thr Ile
325 330 335
Asn Asn Gly Leu Trp Phe Asn Ser Leu Ser Val Ser Ile Ala Tyr Gly
340 345 350
Pro Leu Gln Gly Gly Cys Lys Gln Ser Val Phe Arg Gly Arg Ala Thr
355 360 365
Cys Cys Tyr Ala Tyr Ser Tyr Gly Gly Pro Ser Leu Cys Lys Gly Val
370 375 380
Tyr Ser Gly Glu Leu Asp His Asn Phe Glu Cys Gly Leu Leu Val Tyr
385 390 395 400
Val Thr Lys Ser Asp Gly Ser Arg Ile Gln Thr Ala Thr Glu Pro Pro
405 410 415
Val Ile Thr Gln His Asn Tyr Asn Asn Ile Thr Leu Asn Thr Cys Val
420 425 430
Asp Tyr Asn Ile Tyr Gly Arg Thr Gly Gln Gly Phe Ile Thr Asn Val
435 440 445
Thr Asp Ser Ala Val Ser Tyr Asn Tyr Leu Ala Asp Ala Gly Leu Ala
450 455 460
Ile Leu Asp Thr Ser Gly Ser Ile Asp Ile Phe Val Val Gln Gly Glu
465 470 475 480
Tyr Gly Leu Asn Tyr Tyr Lys Val Asn Pro Cys Glu Asp Val Asn Gln
485 490 495
Gln Phe Val Val Ser Gly Gly Lys Leu Val Gly Ile Leu Thr Ser Arg
500 505 510
Asn Glu Thr Gly Ser Gln Leu Leu Glu Asn Gln Phe Tyr Ile Lys Ile
515 520 525
Thr Asn Gly Thr Arg Arg Phe Arg Arg Ser Gly Ser Ser Gly Val Ser
530 535 540
Gly Trp Arg Leu Phe Lys Lys Ile Ser Gly Ser Ser Gly Ile Thr Glu
545 550 555 560
Asn Val Ala Asn Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Gly Lys Phe Cys Ile Lys
565 570 575
Pro Asp Gly Ser Ile Ala Thr Ile Val Pro Lys Gln Leu Glu Gln Phe
580 585 590
Val Ala Pro Leu Phe Asn Val Thr Glu Asn Val Leu Ile Pro Asn Ser
595 600 605
Phe Asn Leu Thr Val Thr Asp Glu Tyr Ile Gln Thr Arg Met Asp Lys
610 615 620
Val Gln Ile Asn Cys Leu Gln Tyr Val Cys Gly Ser Ser Leu Asp Cys
625 630 635 640
Arg Asn Leu Phe Gln Gln Tyr Gly Pro Val Cys Asp Asn Ile Leu Ser
645 650 655
Val Val Asn Ser Val Gly Gln Lys Glu Asp Met Glu Leu Leu Asn Phe
660 665 670
Tyr Ser Ser Thr Lys Pro Ala Gly Phe Asn Thr Pro Val Leu Ser Asn
675 680 685
Val Ser Thr Gly Glu Phe Asn Ile Ser Leu Leu Leu Thr Thr Pro Ser
690 695 700
Ser Arg Arg Arg Arg Ser Val Ile Glu Asp Leu Leu Phe Thr Ser Val
705 710 715 720
Glu Ser Val Gly Leu Pro Thr Asp Asp Ala Tyr Lys Asn Cys Thr Ala
725 730 735
Gly Pro Leu Gly Phe Leu Lys Asp Leu Ala Cys Ala Arg Glu Tyr Asn
740 745 750
Gly Leu Leu Val Leu Pro Pro Ile Ile Thr Ala Glu Met Gln Ala Leu
755 760 765
Tyr Thr Ser Ser Leu Val Ala Ser Met Ala Phe Gly Gly Ile Thr Ala
770 775 780
Ala Gly Ala Ile Pro Phe Ala Thr Gln Leu Gln Ala Arg Ile Asn His
785 790 795 800
Leu Gly Ile Thr Gln Ser Leu Leu Leu Lys Asn Gln Glu Lys Ile Ala
805 810 815
Ala Ser Phe Asn Lys Ala Ile Gly His Met Gln Glu Gly Phe Arg Ser
820 825 830
Thr Ser Leu Ala Leu Gln Gln Ile Gln Asp Val Val Ser Lys Gln Ser
835 840 845
Ala Ile Leu Thr Glu Thr Met Ala Ser Leu Asn Lys Asn Phe Gly Ala
850 855 860
Ile Ser Ser Val Ile Gln Glu Ile Tyr Gln Gln Phe Asp Ala Ile Gln
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Ala Asn Ala Gln Val Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ser Leu
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Ser Val Leu Ala Ser Ala Lys Gln Ala Glu Tyr Ile Arg Val Ser Gln
900 905 910
Gln Arg Glu Leu Ala Thr Gln Lys Ile Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln
915 920 925
Ser Ile Arg Tyr Ser Phe Cys Gly Asn Gly Arg His Val Leu Thr Ile
930 935 940
Pro Gln Asn Ala Pro Asn Gly Ile Val Phe Ile His Phe Ser Tyr Thr
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Pro Asp Ser Phe Val Asn Val Thr Ala Ile Val Gly Phe Cys Val Lys
965 970 975
Pro Ala Asn Ala Ser Gln Tyr Ala Ile Val Pro Ala Asn Gly Arg Gly
980 985 990
Ile Phe Ile Gln Val Asn Gly Ser Tyr Tyr Ile Thr Ala Arg Asp Met
995 1000 1005
Tyr Met Pro Arg Ala Ile Thr Ala Gly Asp Val Val Thr Leu Thr Ser
1010 1015 1020
Cys Gln Ala Asn Tyr Val Ile Val Asn Lys Thr Val Ile Thr Thr Phe
1025 1030 1035 1040
Val Asp Asn Asp Asp Phe Asp Phe Asn Asp Glu Leu Ser Lys Trp Trp
1045 1050 1055
Asn Asp Thr Lys His Glu Leu Pro Asp Phe Asp Lys Phe Asn Tyr Thr
1060 1065 1070
Val Pro Ile Leu Asp Ile Asp Ser Glu Ile Asp Arg Ile Gln Gly Val
1075 1080 1085
Ile Gln Gly Leu Asn Asp Ser Leu Ile Asp Leu Glu Lys Leu Ser Ile
1090 1095 1100
Leu Lys Thr Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Ala Ile Ala
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Phe Ala Thr Ile Ile Phe Ile Leu Ile Leu Gly Trp Val Phe Phe Met
1125 1130 1135
Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Cys Phe Gly Ile Met Pro Leu
1140 1145 1150
Met Ser Lys Cys Gly Lys Lys Ser Ser Tyr Tyr Thr Thr Phe Asp Asn
1155 1160 1165
Asp Val Val Thr Glu Gln Tyr Arg Pro Lys Lys Ser Val
1170 1175 1180
<210> 2
<211> 3546
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IBV突变型病毒株rS1-HiBiT-S2的S蛋白核苷酸序列
<400> 2
atgttggtaa cacctctttt actagtgact cttttgtgtg cactatgtag tgctgttttg 60
tatgacagta gttcttacgt ttactactac caaagtgcct tcagaccacc tagtggttgg 120
catttacaag ggggtgctta tgcggtagtt aacatttcta gcgaatttaa taatgcaggc 180
tcttcatcag ggtgtactgt tggtattatt catggtggtc gtgttgttaa tgcttcttct 240
atagctatga cggcaccgtc atcaggtatg gcttggtcta gcagtcagtt ttgtactgca 300
cactgtaatt tttcagatac tacagtgttt gttacacatt gttataaaca tggtgggtgt 360
cctataactg gcatgcttca acagaatttt atacgtgttt ctgctatgaa aaatggccag 420
cttttctata atttaacagt tagtgtagct aagtacccta cttttagatc atttcagtgt 480
gttaataatt taacatccgt atatttaaat ggtgatcttg tttacacctc taatgagacc 540
atagatgtta catctgcagg tgtttatttt aaagctggtg gacctataac ttataaagtt 600
atgagagaag ttaaagccct ggcttatttt gttaatggta ctgcacaaga tgttattttg 660
tgtgatggat cacctagagg cttgttagca tgccagtata atactggcaa tttttcagat 720
ggcttttatc cttttactaa tagtagttta gttaagcaga agtttattgt ctatcgtgaa 780
aatagtgtta atactacttg tacgttacac aatttcattt ttcataatga gactggcgcc 840
aaccctaatc ctagtggtgt tcagaatatt caaacttacc aaacaaaaac agctcagagt 900
ggttattata attttaattt ttcctttctg agtagttttg tttataagga gtctaatttt 960
atgtatggat cttatcaccc aagttgtaag tttagactag aaactattaa taatggcttg 1020
tggtttaatt cactttcagt ttcaattgct tacggtcctc ttcaaggtgg ttgcaagcaa 1080
tctgtcttta gaggtagagc aacttgttgt tatgcttatt catatggagg tccttcgctg 1140
tgtaaaggtg tttattcagg tgagttagat cataattttg aatgtggact gttagtttat 1200
gttactaaga gcgatggctc tcgtatacaa acagccactg aaccgccagt tataactcaa 1260
cacaattata ataatattac tttaaatact tgtgttgatt ataatatata tggcagaact 1320
ggccaaggtt ttattactaa tgtaaccgac tcagctgtta gttataatta tctagcagac 1380
gcaggtttgg ctattttaga tacatctggt tccatagaca tctttgttgt acaaggtgaa 1440
tatggtctta attattataa ggttaaccct tgcgaagatg tcaaccagca gtttgtagtt 1500
tctggtggta aattagtagg tattcttact tcacgtaatg agactggttc tcagcttctt 1560
gagaaccagt tttacatcaa aatcactaat ggaacacgtc gttttagacg ttctggcagc 1620
agcggcgtga gcggctggcg gctgttcaag aagattagcg gcagcagcgg cattactgaa 1680
aatgttgcaa attgccctta tgttagttat ggtaagtttt gtataaaacc tgatggctca 1740
attgccacaa tagtaccaaa acaattggaa cagtttgtgg cacctttatt taatgttact 1800
gaaaatgtgc tcatacctaa cagtttcaac ttaactgtta cagatgagta catacaaacg 1860
cgtatggata aggtccaaat taattgcctg cagtatgttt gtggcagttc tctggattgt 1920
agaaatttgt ttcaacaata tgggcctgtt tgcgacaaca tattgtctgt agtaaatagt 1980
gttggtcaaa aagaagatat ggaacttttg aatttctatt cttctactaa accggctggt 2040
tttaatacac cagttcttag taatgttagc actggtgagt ttaatatttc tcttctgtta 2100
acaactccta gtagtcgtag aaggcgttct gttattgaag accttctatt tacaagcgtt 2160
gaatctgttg gactaccaac agatgacgca tataaaaatt gcactgcagg acctttaggc 2220
tttcttaagg accttgcgtg tgctcgtgaa tataatggtt tgcttgtgtt gcctcctatt 2280
ataacagcag aaatgcaagc tttgtatact agttctctag tagcttctat ggcttttggt 2340
ggtattactg cagctggtgc tatacctttt gccacacaac tgcaggctag aattaatcac 2400
ttgggtatta cccagtcact tttgttgaag aatcaagaaa aaattgctgc ttcctttaat 2460
aaggccattg gtcatatgca ggaaggtttt agaagtacat ctctagcatt acaacaaatt 2520
caagatgttg ttagtaaaca gagtgctatt cttactgaga ctatggcatc acttaataaa 2580
aattttggtg ctatttcttc tgtgattcaa gaaatctacc agcaatttga cgccatacaa 2640
gcaaatgctc aagtggatcg tcttataact ggtagattgt catcactttc tgttttagca 2700
tctgctaagc aggcggagta tattagagtg tcacaacagc gtgagttagc tactcagaaa 2760
attaatgagt gtgttaagtc acagtctatt aggtactcct tttgtggtaa tggacgacat 2820
gttctaacca taccgcaaaa tgcacctaat ggtatagtgt ttatacactt ttcttatact 2880
ccagatagtt ttgttaatgt tactgcaata gtgggttttt gtgtaaagcc agctaatgct 2940
agtcagtatg caatagtgcc cgctaatggt aggggtattt ttatacaagt taatggtagt 3000
tactacatca ctgcacgaga tatgtatatg ccaagagcta ttactgcagg agatgtagtt 3060
acgcttactt cttgtcaagc aaattatgta attgtaaata agaccgtcat tactacattc 3120
gtagacaatg atgattttga ttttaatgac gaattgtcaa aatggtggaa tgatactaag 3180
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aaactttcaa tactcaaaac ttatattaag tggccttggt atgtgtggtt agccatagct 3360
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<211> 1162
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 野生型病毒株rIBV-p65的S蛋白氨基酸序列
<400> 3
Met Leu Val Thr Pro Leu Leu Leu Val Thr Leu Leu Cys Ala Leu Cys
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500 505 510
Asn Glu Thr Gly Ser Gln Leu Leu Glu Asn Gln Phe Tyr Ile Lys Ile
515 520 525
Thr Asn Gly Thr Arg Arg Phe Arg Arg Ser Ile Thr Glu Asn Val Ala
530 535 540
Asn Cys Pro Tyr Val Ser Tyr Gly Lys Phe Cys Ile Lys Pro Asp Gly
545 550 555 560
Ser Ile Ala Thr Ile Val Pro Lys Gln Leu Glu Gln Phe Val Ala Pro
565 570 575
Leu Phe Asn Val Thr Glu Asn Val Leu Ile Pro Asn Ser Phe Asn Leu
580 585 590
Thr Val Thr Asp Glu Tyr Ile Gln Thr Arg Met Asp Lys Val Gln Ile
595 600 605
Asn Cys Leu Gln Tyr Val Cys Gly Ser Ser Leu Asp Cys Arg Asn Leu
610 615 620
Phe Gln Gln Tyr Gly Pro Val Cys Asp Asn Ile Leu Ser Val Val Asn
625 630 635 640
Ser Val Gly Gln Lys Glu Asp Met Glu Leu Leu Asn Phe Tyr Ser Ser
645 650 655
Thr Lys Pro Ala Gly Phe Asn Thr Pro Val Leu Ser Asn Val Ser Thr
660 665 670
Gly Glu Phe Asn Ile Ser Leu Leu Leu Thr Thr Pro Ser Ser Arg Arg
675 680 685
Arg Arg Ser Val Ile Glu Asp Leu Leu Phe Thr Ser Val Glu Ser Val
690 695 700
Gly Leu Pro Thr Asp Asp Ala Tyr Lys Asn Cys Thr Ala Gly Pro Leu
705 710 715 720
Gly Phe Leu Lys Asp Leu Ala Cys Ala Arg Glu Tyr Asn Gly Leu Leu
725 730 735
Val Leu Pro Pro Ile Ile Thr Ala Glu Met Gln Ala Leu Tyr Thr Ser
740 745 750
Ser Leu Val Ala Ser Met Ala Phe Gly Gly Ile Thr Ala Ala Gly Ala
755 760 765
Ile Pro Phe Ala Thr Gln Leu Gln Ala Arg Ile Asn His Leu Gly Ile
770 775 780
Thr Gln Ser Leu Leu Leu Lys Asn Gln Glu Lys Ile Ala Ala Ser Phe
785 790 795 800
Asn Lys Ala Ile Gly His Met Gln Glu Gly Phe Arg Ser Thr Ser Leu
805 810 815
Ala Leu Gln Gln Ile Gln Asp Val Val Ser Lys Gln Ser Ala Ile Leu
820 825 830
Thr Glu Thr Met Ala Ser Leu Asn Lys Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser
835 840 845
Val Ile Gln Glu Ile Tyr Gln Gln Phe Asp Ala Ile Gln Ala Asn Ala
850 855 860
Gln Val Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Ser Ser Leu Ser Val Leu
865 870 875 880
Ala Ser Ala Lys Gln Ala Glu Tyr Ile Arg Val Ser Gln Gln Arg Glu
885 890 895
Leu Ala Thr Gln Lys Ile Asn Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Ile Arg
900 905 910
Tyr Ser Phe Cys Gly Asn Gly Arg His Val Leu Thr Ile Pro Gln Asn
915 920 925
Ala Pro Asn Gly Ile Val Phe Ile His Phe Ser Tyr Thr Pro Asp Ser
930 935 940
Phe Val Asn Val Thr Ala Ile Val Gly Phe Cys Val Lys Pro Ala Asn
945 950 955 960
Ala Ser Gln Tyr Ala Ile Val Pro Ala Asn Gly Arg Gly Ile Phe Ile
965 970 975
Gln Val Asn Gly Ser Tyr Tyr Ile Thr Ala Arg Asp Met Tyr Met Pro
980 985 990
Arg Ala Ile Thr Ala Gly Asp Val Val Thr Leu Thr Ser Cys Gln Ala
995 1000 1005
Asn Tyr Val Ile Val Asn Lys Thr Val Ile Thr Thr Phe Val Asp Asn
1010 1015 1020
Asp Asp Phe Asp Phe Asn Asp Glu Leu Ser Lys Trp Trp Asn Asp Thr
1025 1030 1035 1040
Lys His Glu Leu Pro Asp Phe Asp Lys Phe Asn Tyr Thr Val Pro Ile
1045 1050 1055
Leu Asp Ile Asp Ser Glu Ile Asp Arg Ile Gln Gly Val Ile Gln Gly
1060 1065 1070
Leu Asn Asp Ser Leu Ile Asp Leu Glu Lys Leu Ser Ile Leu Lys Thr
1075 1080 1085
Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Val Trp Leu Ala Ile Ala Phe Ala Thr
1090 1095 1100
Ile Ile Phe Ile Leu Ile Leu Gly Trp Val Phe Phe Met Thr Gly Cys
1105 1110 1115 1120
Cys Gly Cys Cys Cys Gly Cys Phe Gly Ile Met Pro Leu Met Ser Lys
1125 1130 1135
Cys Gly Lys Lys Ser Ser Tyr Tyr Thr Thr Phe Asp Asn Asp Val Val
1140 1145 1150
Thr Glu Gln Tyr Arg Pro Lys Lys Ser Val
1155 1160
<210> 4
<211> 3489
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 野生型病毒株rIBV-p65的S蛋白核苷酸序列
<400> 4
atgttggtaa cacctctttt actagtgact cttttgtgtg cactatgtag tgctgttttg 60
tatgacagta gttcttacgt ttactactac caaagtgcct tcagaccacc tagtggttgg 120
catttacaag ggggtgctta tgcggtagtt aacatttcta gcgaatttaa taatgcaggc 180
tcttcatcag ggtgtactgt tggtattatt catggtggtc gtgttgttaa tgcttcttct 240
atagctatga cggcaccgtc atcaggtatg gcttggtcta gcagtcagtt ttgtactgca 300
cactgtaatt tttcagatac tacagtgttt gttacacatt gttataaaca tggtgggtgt 360
cctataactg gcatgcttca acagaatttt atacgtgttt ctgctatgaa aaatggccag 420
cttttctata atttaacagt tagtgtagct aagtacccta cttttagatc atttcagtgt 480
gttaataatt taacatccgt atatttaaat ggtgatcttg tttacacctc taatgagacc 540
atagatgtta catctgcagg tgtttatttt aaagctggtg gacctataac ttataaagtt 600
atgagagaag ttaaagccct ggcttatttt gttaatggta ctgcacaaga tgttattttg 660
tgtgatggat cacctagagg cttgttagca tgccagtata atactggcaa tttttcagat 720
ggcttttatc cttttactaa tagtagttta gttaagcaga agtttattgt ctatcgtgaa 780
aatagtgtta atactacttg tacgttacac aatttcattt ttcataatga gactggcgcc 840
aaccctaatc ctagtggtgt tcagaatatt caaacttacc aaacaaaaac agctcagagt 900
ggttattata attttaattt ttcctttctg agtagttttg tttataagga gtctaatttt 960
atgtatggat cttatcaccc aagttgtaag tttagactag aaactattaa taatggcttg 1020
tggtttaatt cactttcagt ttcaattgct tacggtcctc ttcaaggtgg ttgcaagcaa 1080
tctgtcttta gaggtagagc aacttgttgt tatgcttatt catatggagg tccttcgctg 1140
tgtaaaggtg tttattcagg tgagttagat cataattttg aatgtggact gttagtttat 1200
gttactaaga gcgatggctc tcgtatacaa acagccactg aaccgccagt tataactcaa 1260
cacaattata ataatattac tttaaatact tgtgttgatt ataatatata tggcagaact 1320
ggccaaggtt ttattactaa tgtaaccgac tcagctgtta gttataatta tctagcagac 1380
gcaggtttgg ctattttaga tacatctggt tccatagaca tctttgttgt acaaggtgaa 1440
tatggtctta attattataa ggttaaccct tgcgaagatg tcaaccagca gtttgtagtt 1500
tctggtggta aattagtagg tattcttact tcacgtaatg agactggttc tcagcttctt 1560
gagaaccagt tttacatcaa aatcactaat ggaacacgtc gttttagacg ttctattact 1620
gaaaatgttg caaattgccc ttatgttagt tatggtaagt tttgtataaa acctgatggc 1680
tcaattgcca caatagtacc aaaacaattg gaacagtttg tggcaccttt atttaatgtt 1740
actgaaaatg tgctcatacc taacagtttc aacttaactg ttacagatga gtacatacaa 1800
acgcgtatgg ataaggtcca aattaattgc ctgcagtatg tttgtggcag ttctctggat 1860
tgtagaaatt tgtttcaaca atatgggcct gtttgcgaca acatattgtc tgtagtaaat 1920
agtgttggtc aaaaagaaga tatggaactt ttgaatttct attcttctac taaaccggct 1980
ggttttaata caccagttct tagtaatgtt agcactggtg agtttaatat ttctcttctg 2040
ttaacaactc ctagtagtcg tagaaggcgt tctgttattg aagaccttct atttacaagc 2100
gttgaatctg ttggactacc aacagatgac gcatataaaa attgcactgc aggaccttta 2160
ggctttctta aggaccttgc gtgtgctcgt gaatataatg gtttgcttgt gttgcctcct 2220
attataacag cagaaatgca agctttgtat actagttctc tagtagcttc tatggctttt 2280
ggtggtatta ctgcagctgg tgctatacct tttgccacac aactgcaggc tagaattaat 2340
cacttgggta ttacccagtc acttttgttg aagaatcaag aaaaaattgc tgcttccttt 2400
aataaggcca ttggtcatat gcaggaaggt tttagaagta catctctagc attacaacaa 2460
attcaagatg ttgttagtaa acagagtgct attcttactg agactatggc atcacttaat 2520
aaaaattttg gtgctatttc ttctgtgatt caagaaatct accagcaatt tgacgccata 2580
caagcaaatg ctcaagtgga tcgtcttata actggtagat tgtcatcact ttctgtttta 2640
gcatctgcta agcaggcgga gtatattaga gtgtcacaac agcgtgagtt agctactcag 2700
aaaattaatg agtgtgttaa gtcacagtct attaggtact ccttttgtgg taatggacga 2760
catgttctaa ccataccgca aaatgcacct aatggtatag tgtttataca cttttcttat 2820
actccagata gttttgttaa tgttactgca atagtgggtt tttgtgtaaa gccagctaat 2880
gctagtcagt atgcaatagt gcccgctaat ggtaggggta tttttataca agttaatggt 2940
agttactaca tcactgcacg agatatgtat atgccaagag ctattactgc aggagatgta 3000
gttacgctta cttcttgtca agcaaattat gtaattgtaa ataagaccgt cattactaca 3060
ttcgtagaca atgatgattt tgattttaat gacgaattgt caaaatggtg gaatgatact 3120
aagcatgagc taccagactt tgacaaattc aattacacag tacctatact tgacattgat 3180
agtgaaattg atcgtattca aggcgttata cagggtctta atgactctct aatagacctt 3240
gaaaaacttt caatactcaa aacttatatt aagtggcctt ggtatgtgtg gttagccata 3300
gcttttgcca ctattatctt catcttaata ctaggatggg ttttcttcat gactggatgt 3360
tgtggttgtt gttgtggatg ctttggcatt atgcctctaa tgagtaagtg tggtaagaaa 3420
tcttcttatt acacgacttt tgataacgat gtggtaactg aacaatacag acccaaaaag 3480
tctgtttga 3489
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T7-IBV
<400> 5
cgctagctaa tacgactcac tataggactt aagatagata ttaata 46
<223> IBV-5753R
<400> 6
cgggatccgt ctcgcgacaa cactcttaac 30
<223> IBV-5748F
<400> 7
attatggtct ctgtcgctag ctataagacc g 31
<223> IBV-8694R
<400> 8
gggtctcggc ctcaaattta tcacctatc 29
<223> IBV-8689F
<400> 9
cgggatccgg tctcgaggcc tacctttcag cg 32
<223> IBV-15532R
<400> 10
gcaaaaggtc tcaatgaatc ac 22
<223> IBV-15511F
<400> 11
cgggatccgt gattcattga gaccttttgc 30
<223> IBV-20930R
<400> 12
acacctgcag atgtaacatc 20
<223> IBV-20887F
<400> 13
gtttacacct ctaatgagac catag 25
<223> IBV-27608R
<400> 14
ggaattcggt ctcgtttttt tttttttttt tttttttttt tttttgctct aactctatac 64
tagc
<223> S-Hbt-Ins-Fwd
<400> 15
atcactaatg gaacacgtcg 20
<223> S-Hbt-Ins-Rev
<400> 16
atccagagaa ctgccacaaa 20
<223> S-Hbt-Vec-Rev
<400> 17
cgacgtgttc cattagtgat 20
<223> S-Hbt-Vec-Fwd
<400> 18
tttgtggcag ttctctggat 20
<223> S-F
<400> 19
ttacggtcct cttcaaggtg g 21
<223> S-R
<400> 20
atccagagaa ctgccacaaa 20
<223> M-F
<400> 21
cgctccaaca actaatacaa g 21
<223> M-R
<400> 22
aatgttaagg ggccaaaagc 20

Claims (10)

1.一株S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒，其特征在于：是将野生型传染性支气管炎病毒的S蛋白水解切割位点处第539位插入HiBiT的氨基酸，并在HiBiT前后各加上4个连接氨基酸得到；
所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的S蛋白氨基酸序列如SEQ NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒，其特征在于：编码所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的S蛋白核苷酸序列如SEQ NO.2所示。
3.权利要求1或2所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于：是采用反向遗传学技术，获得IBV全长感染性克隆，再以其为模板，在IBV S蛋白第539位氨基酸插入HiBiT，体外转录电转染细胞，获得IBV突变型病毒株。
4.根据权利要求3所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于具体包括以下步骤：
(1)将横跨整个IBV基因组的片段依次为片段A、片段B、片段C、片段D和片段E，纯化，克隆入载体中，得到重组载体A、重组载体B、重组载体C、重组载体D和重组载体E；在构建过程中，将限制性位点BsmBI或BsaI分别导入到5个片段的5’端和3’端，并且在A片段中将T7启动子序列插入IBV基因组5’端的上游，利用T7聚合酶促进体外转录；
(2)扩增含有HiBiT片段的野生型IBV的S蛋白部分序列，无缝克隆到野生型IBV的S蛋白所在的E片段，获得野生型IBV的S蛋白第539位插入HiBiT的E片段质粒；
(3)将片段A、B、C、D和野生型IBV的S蛋白第539位插入HiBiT的E片段连接，纯化，体外转录，得到全长转录本；以线性化的pKT0-N质粒为模板，体外转录，得到N转录本；
(4)将步骤(3)得到的全长转录本和N转录本电转至Vero细胞，培养，出现典型细胞病变，即得到S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒。
5.根据权利要求4所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的片段A、片段B、片段C、片段D和片段E是利用RT-PCR技术从IBV感染的非洲绿猴肾细胞中提取总RNA，再扩增得到；
步骤(1)中所述的将限制性位点BsmBI或BsaI分别导入到5个片段的5’端和3’端是通过扩增所用的引物引入；
步骤(1)中所述的将T7启动子序列插入IBV基因组5’端的上游是通过扩增所用的引物引入。
6.根据权利要求4所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的片段A引入的限制性位点为BsmBI；
步骤(1)中所述的片段B引入的限制性位点为BsaI；
步骤(1)中所述的片段C引入的限制性位点为BsaI；
步骤(1)中所述的片段D引入的限制性位点为BsaI；
步骤(1)中所述的片段E引入的限制性位点为BsaI；
步骤(1)中所述的片段A适用的载体为pKT0；
步骤(1)中所述的片段B适用的载体为pGEM-T Easy；
步骤(1)中所述的片段C适用的载体为pCR-TOPO-XL；
步骤(1)中所述的片段D适用的载体为pGEM-T Easy；
步骤(1)中所述的片段E适用的载体为pGEM-T Easy。
7.根据权利要求4所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的野生型IBV的S蛋白的氨基酸序列如SEQ NO.3所示；
编码步骤(2)中所述的野生型IBV的S蛋白的核苷酸序列如SEQ NO.4所示；
步骤(2)中所述的扩增含有HiBiT片段的野生型IBV的S蛋白部分序列的引物如下：S-Hbt-Ins-Fwd：ATCACTAATGGAACACGTCG；
S-Hbt-Ins-Rev：ATCCAGAGAACTGCCACAAA；
步骤(2)中所述的野生型IBV的S蛋白所在的E片段的扩增引物如下：S-Hbt-Vec-Rev：CGACGTGTTCCATTAGTGAT；
S-Hbt-Vec-Fwd：TTTGTGGCAGTTCTCTGGAT。
8.根据权利要求4所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的片段A、B、C、D和野生型IBV的S蛋白第539位插入HiBiT的E片段是通过BsmBI和BsaI酶切步骤(1)的重组载体A、重组载体B、重组载体C、重组载体D和步骤(2)的野生型IBV的S蛋白第539位插入HiBiT的E片段质粒得到；
步骤(3)中所述的连接是通过T4 DNA连接酶连接；
步骤(3)中所述的全长转录本和N转录本还包括采用DNaseⅠ处理，然后用酚/氯仿进行纯化的步骤；
步骤(3)中所述的全长转录本的体外转录的条件为：GTP：CAD类似物＝1：1进行转录反应，反应体系为20μL，反应条件为：37℃ 3h；
步骤(3)中所述的N转录本的体外转录的条件为：GTP：CAD类似物＝1：2进行转录反应，反应体系为10μL，反应条件为：37℃ 3h。
9.根据权利要求4所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的电转的条件为：0.22μm电击杯、450V、50μF进行一次脉冲；
步骤(4)中所述的培养是将电转后的Vero细胞用含1％体积比的FBS的DMEM培养基隔夜培养，再换成不含FBS的DMEM培养基继续培养5天得到。
10.权利要求1所述的S蛋白融合HiBiT的传染性支气管炎重组病毒在制备鸡胚中病毒量检测试剂盒中的应用。
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