CN113151359A - 一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒模型的包装体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒模型的包装体系及其应用，所述包装体系包括：携带有MHV病毒S基因的慢病毒包膜质粒、携带MHV病毒E基因和M基因的慢病毒包膜质粒。本发明利用MHV病毒获得与新冠病毒结构相似的病毒模型，包装病毒过程简单，所包装获得的嵌合病毒具有感染活力，而不是一个只有形态相似的假病毒；而且所获得的嵌合病毒颗粒直径与新冠病毒相近。该病毒模型的特点为呼吸型病毒，野生型可感染小鼠肺部，与新冠病毒相似，皆可通过呼吸道进行感染；该嵌合病毒模型不感染人源细胞，安全性高；嵌合病毒带有荧光标记，其感染能力可视化程度强。
Description
技术领域
本发明涉及病毒技术领域，具体地，涉及一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒模型的包装体系及其应用。
背景技术
冠状病毒是一类有包膜的单股正链RNA病毒，宿主范围广泛，是可引起人和动物发病的重要病原体。新型冠状病毒(2019-nCoV)是继严重急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合症冠状病毒(MERS-CoV)后，出现的第三个人群间突发传播的冠状病毒。自疫情爆发以来，科研工作者努力探寻病毒的传播机制，且生物气溶胶对病毒传播演变规律及干预手段尚未完全明晰。新冠病毒对人的致病风险较高，实验条件较苛刻，在进行一些病毒活性、气溶胶等研究时有较大风险，而选择低致病性且复制缺陷型的模式病毒可降低风险。同时，目前对于新冠病毒检测方式多采用核酸检测的方式，但其并不能代表病毒是否具有感染能力，故构建一种带有荧光示踪能力的复制缺陷型，对人不具有感染能力嵌合病毒模型是非常必要的。
成熟的冠状病毒体为多形态有包膜的颗粒，直径80～120nm，因在电子显微镜下观察可见其表面有形似日冕的棘突而得名。新型冠状病毒(2019-nCoV)又称为SARS-CoV-2，与严重急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)相似，皆属于β-冠状病毒属。已有研究表明，新型冠状病毒具有典型的冠状病毒特征，包膜上主要表达S蛋白(刺突蛋白)、E蛋白(膜蛋白)和M蛋白(膜蛋白)，病毒通过S蛋白识别细胞表面的ACE2受体进而感染宿主细胞。
在传染病的研究中，为了模拟野生型病毒，常用同源性高、结构相似的模式病毒进行研究。小鼠肝炎病毒(MHV)与上述3种致病性极强的冠状病毒是亲缘关系较为接近，皆属于冠状病毒科的β型冠状病毒属。MHV-1病毒的大小和结构与SARS/MERS/2019-nCoV病毒相似，且MHV-1病毒的M/E/S关键蛋白与此三种冠状病毒同源性较高(见图2)，其S蛋白主要识别受体为鼠癌胚抗原相关细胞黏附分子(ceacam1)。MHV-1病毒对人不致病且具有多种症状典型的动物模型的特点，是一种较理想的冠状病毒研究模型。
在传染病的研究中，假病毒技术是一种非常有效的研究手段。与活病毒相比，假病毒具有与野生型病毒相似的细胞感染特点，可以用来模拟真病毒感染细胞的早期过程，而且假病毒内携带的报告基因(EGFP、LacZ等)，可以快速方便地进行各种检测和分析。常用假病毒体系的构建主要包括以慢病毒载体和以逆转录病毒载体为基础的两种方式。
慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1为基础的病毒载体，其病毒颗粒大小约为100nm，是具有包膜结构的RNA病毒，在形态结构上与冠状病毒相近(见图3)。通过成熟的慢病毒包装体系，可将外源蛋白表达在慢病毒表面，为了降低传染毒力，可使用整合酶缺陷的包装体系，包装出不能整合至宿主基因组的病毒颗粒。如第二代慢病毒载体包装系统包括载体质粒、包膜质粒与包装质粒，通过共转染进行病毒包装，而对相关载体进行外源基因插入，可达到病毒模型改造的效果。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒模型的包装体系及其应用，本发明构建了一种带有荧光示踪能力的复制缺陷型，且对人不具有感染能力嵌合病毒模型。该嵌合病毒将为研究新冠病毒传播规律及活力检测提供科学有效的模型。
本发明的第一个目的是提供一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒模型的包装系统。
本发明的第二个目的是提供一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒模型的包装方法。
本发明的第三个目的是提供利用任一所述包装系统，和/或所述得包装方法得到的病毒。
本发明的第四个目的是提供一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒模型。
本发明的第五个目的是提供一套嵌合病毒活力的检测系统。
本发明的第六个目的是提供所述的病毒和/或所述的缺陷型嵌合病毒作为研究冠状病毒传播规律和/或冠状病毒感染能力的模型的应用。
本发明的第七个目的是提供所述的病毒和/或权利里要求8所述的缺陷型嵌合病毒在研究冠状病毒传播规律和/或冠状病毒感染能力中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明以慢病毒包装系统，将小鼠肝炎冠状病毒(MHV-1)的刺突结构蛋白重组至病毒包膜表面，构建复制缺陷型的嵌合病毒。主要技术方法为：将MHV病毒S基因克隆至慢病毒包膜质粒中，E基因和M基因克隆至另一包膜质粒中，表达包膜蛋白；载体质粒与包装质粒为常规的pLV-EGFP-N(或报告基因为荧光素酶的pNL4-3.Luc.R-E质粒)和psPAX2质粒；将四质粒转染进入293T细胞中，进行病毒组装，获得具有MHV-1冠状病毒特征结构的嵌合病毒(见图4)。嵌合病毒的外壳由冠状病毒刺突和包膜蛋白组成，病毒颗粒感染靶细胞后可表达EGFP蛋白，实现病毒的荧光示踪。病毒的顺式作用元件与反式激活蛋白分离，病毒只有一次感染性，无法自我复制，安全性高。
因此本发明要求保护一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒模型的包装系统，包括：携带有MHV病毒S基因的慢病毒包膜质粒、携带MHV病毒E基因和M基因的慢病毒包膜质粒。
优选地，所述MHV病毒为MHV-1病毒。
优选地，还包括载体质粒与包装质粒。
更优选地，所述载体质粒为携带有荧光蛋白。
更优选地，所述载体质粒为pLV-EGFP-N或pNL4-3.Luc.R-E。
更优选地，所述包装质粒为psPAX2。
进一步本发明还要保护一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒模型的包装方法，将所述包装系统转染进入细胞，培养细胞，收集病毒。
优选地，包装系统携带有MHV病毒S基因的慢病毒包膜质粒、携带MHV病毒E基因和M基因的慢病毒包膜质粒、包装质粒psPAX2、载体质粒pLV-EGFP-N的用量比1～3：1～3：1～2：1～2，所述慢病毒包膜质粒为pMD2.G质粒。
更优选地，包装系统携带有MHV病毒S基因的慢病毒包膜质粒、携带MHV病毒E基因和M基因的慢病毒包膜质粒、包装质粒psPAX2、载体质粒pLV-EGFP-N的用量比3：1：1：1，所述慢病毒包膜质粒为pMD2.G质粒。
优选地，所述细胞为293T细胞。
优选地，用PEI或脂质体作为转染试剂。
优选地，在无血清的条件下转染4～6小时后，将培养基更换为含2％血清的DMEM培养基后继续培养，在细胞换液后48小时～72小时时间段收取细胞上清。
任一所述包装系统得到的病毒，也属于本发明的保护范围。
本发明还要求保护一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒模型，所述缺陷型嵌合病毒模型的病毒颗粒的外壳由MHV病毒刺突和包膜蛋白组成，病毒颗粒表达荧光蛋白。
本发明还要求保护所述的病毒和/或权所述的缺陷型嵌合病毒作为研究冠状病毒传播规律和/或冠状病毒感染能力的模型的应用。
以及，所述的病毒和/或所述的缺陷型嵌合病毒在研究冠状病毒传播规律和/或冠状病毒感染能力中的应用。
优选地，所述应用选用17-CL上皮细胞(MHV适应性细胞)和/或Hela-CEACM1细胞(表达CEACM1受体)作为宿主细胞检测嵌合病毒的感染活力。
更优选地，检测目的基因EGFP的拷贝数以评价感染活力。
进一步优选地，使用如下引物检测EGFP的拷贝数：EGFP-F：5’-CAACCACTACCTGAGCACCCA-3’；EGFP-R：5’-CGAACTCCAGCAGGACCATG-3’。
优选地，所述冠状病毒为新冠病毒。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)MHV嵌合病毒同时表达S、E、M蛋白，在结构上更接近野生型病毒。由于新冠病毒的获取难度较大，危险系数高，在常规实验室中很难对其进行研究。已有研究将MERS或SARS-CoV冠状病毒刺突蛋白S表达在水疱性口炎病毒(VSV)上，构建冠状病毒的假病毒模型。较少研究将冠状病毒的S、E、M蛋白同时表达在假病毒模型上。本专利通过构建能表达S蛋白、E蛋白与M蛋白的重组质粒，采用慢病毒包装体系，将与新冠病毒、SASR病毒、MERS病毒同源性高的小鼠肝炎冠状病毒MHV-1的S、E、M蛋白插入到慢病毒脂膜上，所包装获得的MHV嵌合病毒具有感染活力，而不是一个只有形态相似的假病毒；由于同时具有S、E、M蛋白结构，该复制缺陷病毒模型在结构和生理功能上更加接近野生型的病毒，而且所获得的嵌合病毒颗粒直径与新冠病毒相近，皆为100nm左右。从病毒颗粒大小和病毒外部结构上与新冠病毒相似此为本专利的优点之一。
(2)MHV嵌合病毒感染特性与呼吸型冠状病毒相似，皆可感染肺泡上皮细胞。本专利中所构建的重组质粒，所插入的S基因，E/M基因序列为MHV-1病毒来源，MHV-1病毒为小鼠肝炎病毒MHV中的1型病毒株，该病毒模型的特点为呼吸型病毒，野生型可感染小鼠肺部，与新冠病毒相似，皆可通过呼吸道进行感染。
(3)该嵌合病毒模型不感染人源细胞，安全性高。由于病毒感染能力不同，感染的宿主细胞不同，为了降低病毒对人体的危害，大部分研究会在构建重组病毒时会敲除部分结构，使其感染能力降低或丧失。本发明所构建的MHV嵌合病毒由于重组的是MHV-1病毒的S蛋白、E蛋白和M蛋白，故其只能感染MHV适应性细胞或小鼠源肺泡上皮细胞，不感染人源细胞，此外该嵌合病毒为复制缺陷型病毒，只有一次感染能力，故安全性较高，降低了感染人的风险。
(4)MHV嵌合病毒带有荧光标记，其感染能力可视化程度强。目前构建病毒模型并对其进行示踪标记的方法多种多样，在活病毒的水平对其标记的方法主要是荧光标记和量子点标记，荧光标记是将荧光基因重组到病毒基因组中，当活病毒感染宿主细胞后，即可在细胞内表达荧光蛋白，通过常规荧光显微镜可观察到病毒感染情况，是目前最为有效的标记方法。本发明中的MHV嵌合病毒在病毒包装过程中将EGFP基因导入到病毒基因组，当前感染宿主细胞后，后续可通过流式细胞术或常规荧光显微镜镜下观察。还可将病毒对细胞感染力检测与qRT-PCR核酸检测实验联合使用，评估MHV嵌合病毒的核酸拷贝数与病毒感染活力的相关性，如将MHV嵌合病毒经各种实验条件处理(如化学、物理等条件)，再进行核酸检测与细胞感染力的检测，综合分析实验条件对其存活力的影响，与现有的常用的核酸检测病毒的方法相比，具有更直观的可视化优势。此外本方法采用的是慢病毒包装系统，载体质粒为pLV-EGFP-N，可根据后续实验需要在载体质粒上插入其他待研究的基因，或改为表达其他荧光蛋白的质粒，如pLV-mCherry等，用途多样，操作简便。
附图说明
图1为MHV-1病毒结构示意图。
图2为β属冠状病毒S/E/M蛋白同源性示意图。
图3为慢病毒结构示意图。
图4为MHV嵌合病毒包装过程示意图。
图5为琼脂糖凝胶电泳检测MHV-S基因。
图6为琼脂糖凝胶电泳检测MHV-E/M基因。
图7为pMD2.G-MHV-1-S重组质粒示意图。
图8为pMD2.G-MHV-1-E/M重组质粒示意图。
图9为293T细胞pLV-EGFP-N质粒转染效率检测(100×)。
图10为MHV嵌合病毒滴度检测(100×)。
图11为流式细胞术检测MHV嵌合病毒感染滴度。
图12为透射电镜检测MHV嵌合病毒。
图13为绝对定量法检测嵌合病毒核酸。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1构建带有MHV-1病毒S基因或E/M基因的pMD2.G重组质粒
(1)提取MHV-1病毒RNA；
(2)将提取的MHV-1病毒RNA反转录合成cDNA，采用PCR方法扩增S基因与E/M基因(E基因与M基因在MHV-1基因组中相邻)；扩增引物序列如下：
MHV-1-S-F：5’-GGACTCAGATCTCGAGATGCTGTTTGTCGTGTTTATTCTCC-3’；
MHV-1-S-R：5’-GCGGCCGCGTGGATCCTCAATCCTCGTGAGAGGATATATT-3’；
MHV-1-EM-F：5’-CTGAATTCTGACACTATGTTTAATTTATTCCTTACAGACA-3’；
MHV-1-EM-R：5’-TGTGCAGGATTTGAGTTAGATTCTCAACAATGCGGT-3’；
(3)pMD2.G质粒线性化：以pMD2.G质粒为模板进行PCR，获得质粒VSV-G区域以外的DNA片段；引物序列如下：
PMD线性化-F：5’-CTCAAATCCTGCACAACAGATTCT-3’；
PMD线性化-R：5’-AGTGTCAGAATTCAGATCTCACGTG-3’；
(4)使用In-Fusion酶进行片段连接：将S基因DNA和E/M基因DNA分别与PMD线性化DNA连接为重组质粒。由于MHV-1-S的引物(或MHV-1-EM的引物)与PMD线性化引物上有连续重复的序列，故利用In-Fusion酶的特性，可将插入片段与载体在同源序列处融合；
(5)将连接产物按常规转化流程，转化入大肠杆菌DH5α中，涂氨苄抗性LB平板培养过夜后挑取单克隆进行PCR检测，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对条带大小相符产物对应的单克隆菌落保种处理并对质粒全长测序(S基因约为4100bp，E/M基因约为980bp)，凝胶电泳结果见图5与图6。随后测序结果显示所重组质粒与所设计的pMD2.G-MHV-1-S重组质粒、pMD2.G-MHV-1-E/M重组质粒序列相符。
2、实验结果
上述菌落单克隆PCR扩增出MHV-S基因与MHV-E/M基因序列，琼脂糖凝胶电泳如图5和图6所示，所挑取的单克隆的PCR产物片段大小皆为4124bp左右或980bp左右，与目的片段大小相符，随后质粒全长测序结果也与所设计的重组质粒序列相符，无突变碱基，为阳性克隆。说明成功构建带有MHV病毒S基因或E/M基因的pMD2.G重组质粒，载体图如图7和图8所示，重组质粒所插入的MHV-1病毒S基因序列来源于NCBI，GenBank：FJ647223.1:23873-27964 Murine coronavirus MHV-1,complete genome；E/M基因序列来源于NCBI，GenBank：FJ647223.1:28775-29724 Murine coronavirus MHV-1,complete genome。
实施例2重组质粒包装MHV嵌合病毒的制备
1、实验方法
(1)质粒提取：用带氨苄抗性的LB培养基培养带有慢病毒包装质粒psPAX2、载体质粒pLV-EGFP-N、包膜质粒pMD2.G-MHV-1-S与pMD2.G-MHV-1-E/M的大肠杆菌，用无内毒素质粒提取试剂盒提取此4个质粒并测定浓度；
(2)细胞转染：将293T细胞接种到大皿中，用PEI(聚乙烯亚胺)或Lipo2000(脂质体)作为转染试剂，采用10mL转染体系，即10mL无血清培养基中加入30μL转染试剂、30-40μg质粒，其中4个质粒的用量需根据其浓度计算，按一定质量比例(如pMD2.G-MHV-1-S：pMD2.G-MHV-1-E/M：psPAX2、pLV-EGFP-N＝1：1：1：1、1：2：2：2或3：1：1：1等)混合；将配制好的10mL转染体系滴加入培养皿中，在无血清的条件下转染4-6小时后更换为含血清培养基；
(3)收取MHV嵌合病毒：在细胞换液后48小时-72小时时间段收取细胞上清，后续根据需要进行分装保存(-80℃)或病毒浓缩。
2、实验结果
在转染换液48小时后，通过荧光显微镜进行观察细胞EGFP荧光表达情况，通过明场与暗场联合分析，EGFP转染效率能达到50％～60％(见图9)。结果证明四质粒转染体系能顺利转染入293T细胞，制备得到MHV嵌合病毒。
实施例3病毒浓缩与病毒滴度检测
1、实验方法
(1)MHV嵌合病毒浓缩：将实施例2细胞转染后收取的病毒原液加入超高速离心专用的离心管中，以4℃，70000g条件超高速离心2小时，随后小心弃去上清，根据后续需要用培养基、水或PBS进行重悬，收集病毒浓缩液，进行滴度测定或-80℃保存；
(2)MHV嵌合病毒感染靶细胞：检测该MHV嵌合病毒可感染17-CL上皮细胞(MHV适应性细胞)与Hela-CEACM1细胞(表达CEACM1受体)的情况：在病毒感染实验前一天向96孔板中接种一定数量的靶细胞，按一定比例梯度用培养基稀释病毒浓缩液，用稀释好的病毒液感染细胞；
(3)MHV嵌合病毒滴度检测与计算：在病毒感染细胞48小时后观察细胞，采用荧光显微镜进行拍照记录或通过流式细胞术检测带有绿色荧光的细胞比例，计算MHV嵌合病毒浓缩液的病毒滴度。
2、实验结果
荧光显微镜检测结果：MHV嵌合病毒感染细胞48小时候，荧光检测如图10所示，根据荧光数量与稀释比例计算得，该MHV嵌合病毒包装滴度约为4×103TU/mL；流式细胞术检测结果：带荧光细胞数目(图11)，病毒稀释比例依次为10-1、10-2、10-3。
结果证明，所包装的MHV嵌合病毒明确具有S蛋白结构，可以感染靶细胞，在经过简单的超高速浓缩后滴度约为4×103TU/mL，根据需要可扩大浓缩体系进而提高病毒滴度。
实施例4电镜检测MHV嵌合病毒形态
1、实验方法
(1)病毒标本制备：将实施例2制备得到的MHV嵌合病毒液超高速离心后，用超纯水重悬病毒沉淀，将病毒浓缩液滴加到电镜检测专用的铜网上，吸去多余液体，滴加磷酸钨染液，染色1～2分钟后，用超纯水进行洗涤，静置干燥；
(2)透射电镜检测：将MHV嵌合病毒标本置于透射电镜下进行观察，将大小为100nm左右的病毒样颗粒进行拍照记录。
2、实验结果
透射电镜观察所包装得到的病毒形态，如图12所示，结果显示不同条件的质粒比例缩包装获得的病毒结构形态有所不同，如图12A(pMD2.G-MHV-1-S：pMD2.G-MHV-1-E/M：psPAX2、pLV-EGFP-N质粒质量比为1：2：2：2)明显为未成功构建嵌合病毒(无明显刺突且粒径较小)，而图12B(四质粒质量比例为2：1：1：1)和图12C(四质粒质量比例为3：1：1：1)皆有明显刺突，为成功构建的MHV嵌合病毒。成功构建的MHV嵌合病毒颗粒直径在100nm左右，MHV嵌合病毒具有脂质膜结构的同时，病毒颗粒表面还具有冠状结构。
结果证明，本发明制备的四质粒包装系统可包装出具有MHV-1病毒刺突结构的MHV嵌合病毒。
实施例5 qRT-PCT检测MHV嵌合病毒核酸拷贝数
1、实验方法
(1)病毒核酸提取，采用QIAamp viral RNA提取试剂盒提取实施例2制备得到的MHV-1嵌合病毒RNA；采用的Evo M-MLV RT试剂盒(艾科瑞生物，AG11603)，
对提取的嵌合病毒RNA进行反转录合成cDNA；
(2)绝对定量法检测核酸中EGFP基因的拷贝数：
①采用plv-EGFP-N质粒作为标准品，根据其拷贝数计算使用量，用纯净水对其进行稀释，10倍比稀释成拷贝数为107、106、105、104、103、102等梯度，配制qPCR反应体系；
②以嵌合病毒RNA反转录合成的cDNA为模板，与标准品管同时进行qPCR扩增，扩增的目的基因为EGFP，引物序列如下：EGFP-F：5’-CAACCACTACCTGAGCACCCA-3’；EGFP-R：5’-CGAACTCCAGCAGGACCATG-3’。
2、实验结果
分析qPCR扩增结果，根据标准品的CT值绘制标准曲线，通过标准曲线计算病毒核酸中EGFP基因的拷贝数，结果如图13所示，证明所包装的嵌合病毒基因组中带有EGFP序列，后续可利用此嵌合病毒模型在如传播途径、气溶胶、物理处理或化学处理等方面对冠状病毒进一步研究。
实施例6细胞荧光法检测MHV嵌合病毒感染活力
1、实验方法
(1)MHV病毒前处理：实施例2制备得到的MHV嵌合病毒经上述滴度检测后，根据需要将其稀释至所需浓度，如1×105TU/mL，根据研究目的对其进行物理或化学处理(如不同药物处理等)，并根据实验条件设置对照组，随后回收病毒(如果病毒液因处理而蒸发，需在超净台用培养基冲洗回收)，回收的病毒液需保存在-80℃或马上检测活力，避免反复冻融影响其活性；
(2)MHV嵌合病毒感染活力检测：
①提前一天将MHV嵌合病毒的靶细胞：17-CL上皮细胞(MHV适应性细胞)与Hela-CEACM1细胞(表达CEACM1受体)，以5000个/孔的密度接种至96孔细胞培养板中，37℃细胞培养箱恒温培养至完全贴壁；
②MHV嵌合病毒感染靶细胞：取已接种细胞的96孔板，每孔加入50μL回收的病毒液，或50μL对照组病毒液，设置三个平行复孔，在培养箱中自然沉降吸附细胞一段时间后，向孔中添加50μL含5％FBS的DMEM培养基，培养细胞；在病毒感染细胞后的24小时进行换液处理，更换为5％FBS的DMEM培养基；
③细胞荧光检测：在病毒感染细胞48小时后，在荧光显微镜下观察带有绿色荧光的细胞，记录每各孔带荧光细胞的总数量，随后根据回收的病毒液体积计算具有感染活力的病毒数量，评估所设置的实验条件(物理、化学条件等)对MHV嵌合病毒的活力影响。
2、实验结果
此方法流程目的是建立一套嵌合病毒模型活力的检测系统，综合qRT-PCR检测病毒核酸和细胞感染的方法评估MHV嵌合病毒的存活情况，发现有些实验处理条件下，如将其滴加在塑料材质上，静置一段时间后，MHV嵌合病毒的核酸尚可检测到，但经细胞感染实验发现其已经失去感染活力。结果说明本MHV嵌合病毒与qRT-PCR检测联合使用，能够用于评估外界对冠状病毒感染活力的影响。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒模型的包装系统，其特征在于，包括：携带有MHV病毒S基因的慢病毒包膜质粒、携带MHV病毒E基因和M基因的慢病毒包膜质粒。
2.根据权利要求1所述的包装系统，其特征在于，还包括载体质粒与包装质粒。
3.根据权利要求2所述的包装系统，其特征在于，所述载体质粒为携带有荧光蛋白。
4.一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒模型的包装方法，其特征在于，将权利要求1～3任一所述包装系统转染进入细胞，培养细胞，收集病毒。
5.根据权利要求4所述的包装方法，其特征在于，用PEI或Lipo2000作为转染试剂。
6.根据权利要求4所述的包装方法，其特征在于，在无血清的条件下转染4～6小时后，将培养基更换为含2％血清的DMEM培养基后继续培养，在细胞换液后48小时-72小时时间段收取细胞上清。
7.利用权利要求1到3任一所述包装系统，和/或权利要求4到6所述得包装方法得到的病毒。
8.一种冠状病毒的缺陷型嵌合病毒，其特征在于，所述缺陷型嵌合病毒模型的病毒颗粒的外壳由MHV病毒刺突和包膜蛋白组成，病毒颗粒表达荧光蛋白。
9.权利要求7所述的病毒和/或权利要求8所述的缺陷型嵌合病毒作为研究冠状病毒传播规律和/或冠状病毒感染能力的模型的应用。
10.权利要求7所述的病毒和/或权利要求8所述的缺陷型嵌合病毒在研究冠状病毒传播规律和/或冠状病毒感染能力中的应用。
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| CN1620500A (zh) * | 2001-05-17 | 2005-05-25 | 乌得勒支大学 | 包含功能性缺失的基因组的冠状病毒样颗粒 |
| CN104232797A (zh) * | 2014-09-28 | 2014-12-24 | 武汉科隆生物医学有限公司 | 一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒、检测方法及应用 |
-
2021
- 2021-02-26 CN CN202110218521.4A patent/CN113151359A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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