CN104232797A - 一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒、检测方法及应用 - Google Patents

一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒、检测方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒及检测方法，选取鼠肝炎病毒主要亚型的共同特有的核酸恒定区而设计特异性核酸探针，选取6种鼠肝炎病毒的主要亚型(MHV-1、MHV-2、MHV-3、JHM、A59和S)的共同特有的结构蛋白S稳定区S2基因序列设计引物。采用一步法反转录聚合酶链式反应技术对鼠肝炎病毒的核酸进行检测；通过基因克隆和表达而生物合成鼠肝炎病毒的S2蛋白，并利用此特异性抗原筛选噬菌体抗体库，获得相应的单克隆抗体。在此基础上,利用酶联免疫吸附技术检测鼠肝炎病毒的抗原和鼠自身产生的抗体。本发明的复合型试剂盒及其检测方法，具有检测结果准确、灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便等特点。

Description

一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒、检测方法及应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种鼠肝炎病毒复合型检测试剂盒和检测方法。
背景技术
鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV，学术上又称为Murinecoronavirus)属冠状病毒科，是一种核糖核酸(RNA)正向病毒，核酸由单股RNA构成，其大小因动物来源不同有些差别，一般直径约为80nm-160nm，有很多毒株型。根据鼠肝炎病毒嗜组织特性的不同，可将其分为呼吸株和嗜肠株两型。呼吸株病毒在易感动物的鼻腔上皮细胞内复制后，可向多种靶器官扩散，常见型病毒包括MHV-1、MHV-3、MHV-JHM、MHV-S和MHV-A59等。嗜肠株病毒选择性地感染小肠黏膜，极少扩散到其他组织，此型病毒包括MHV-Y、MHV-RI和DVIM等(殷震等，1997；A.W.Gledhill et al,2006；Homberger FR et al,1997；Norio Hirano et al,2013；Casebolt D B etal,1997)。鼠肝炎病毒包裹着由核衣壳蛋白N与单链基因组RNA复合体组成的核衣壳，膜上结合着三种结构糖蛋白，分别为刺突蛋白S、膜蛋白M和小分子外膜蛋白E。在嗜神经毒株MHV-JHM的被膜上还有血凝素酯酶HE。鼠肝炎病毒侵入宿主后，可以刺激机体产生抗体。
鼠肝炎病毒具有传染性强、传播途径复杂、感染过程多样化、流行面广泛、不易发现等特点。鼠肝炎病毒极易感染小鼠，严重鼠肝炎病毒感染可在数周之内摧毁小鼠群，并可能需要数年才能恢复。据在1982年血清流行病学调查，我国小鼠群中鼠肝炎的感染率为20％-100％(孙靖，2004)。
鼠肝炎病毒可以通过空气和直接接触传播，已感染鼠肝炎病毒鼠的排泄物和其污染的物品很容易感染健康鼠。鼠肝炎病毒也可垂直传播。小鼠一旦感染后，很难在种群中根除，因此鼠肝炎病毒的检测非常重要。目前，小鼠肝炎病毒呈世界性分布，在中国的小鼠群中广泛流行。通常情况下，鼠肝炎病毒感染小鼠后，多数带病毒小鼠呈隐性、亚临床或慢性感染，不易察觉，为鼠肝炎病毒的检测增加了难度。
由于鼠肝炎病毒侵入实验类鼠群后，会改变各种免疫应答参数，严重影响实验小鼠的质量和科学研究的准确性，不利于科学研究的开展。并且鼠肝炎病毒具有传染性强、传播途径复杂、感染过程多样化、流行面广泛、不易发现、危害严重等特点，因此快速、高效和方便的鼠肝炎检测病毒发法尤其重要。
目前，检测鼠肝炎病毒感染的依赖于血清学测定法，病理组织学，电子显微镜以及分子技术。目前市场上常用血清学检测方法有酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光试验等，由于各株抗原的差异，虽实践中使用了多价抗原检测法，但依然对不同亚型的鼠肝炎病毒不能统一检测，仍需用不同的检测试剂，这样不仅花费大、耗时长，而且严重影响科学研究的正常进行。另外，近年来市场上使用的鼠肝炎病毒核酸检测盒，其主要方法是通过病毒核酸的反转录聚合酶链式反应来检测病毒类型的存在，该类检测盒虽可以在样本量很少的情况下进行鼠肝炎病毒检测，但因病毒核酸变异快，亚类型多，检测盒仅能检测部分病毒类型，由于反转录聚合酶链式反应所需探针的序列、敏感性及热循环程度等不同导致结果不同，导致检测阳性率低和假阳性的存在，所得结果仍需要相互确证。因此，有必要在本领域中建立快速，有效和可靠的监测和检测鼠肝炎病毒的方法。不仅对提高实验动物质量具有重要意义，同时对于新型冠状病毒的研究也会有一定的帮助。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的缺陷，提供一种克服单一的聚合酶链式反应(PCR)方法所存在的不能统一检测和假阳性率较高等问题，具有高度的特异性、灵敏性与准确性，且技术操作简便的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，该试剂盒含有：
(1)一步法反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂，其中包括无核糖核酸酶去离子水、焦磷酸核苷酸混合物、五倍反应缓冲液、酶混合液、磷酸盐缓冲液(PBS)、阳性对照品、阴性对照品、鼠肝炎病毒探针Ⅰ、探针Ⅱ、探针Ⅲ；
鼠肝炎病毒探针Ⅰ如序列表中的SEQ ID NO.1所示：5′-GAGGATTACCATACACTAAC-3′；
鼠肝炎病毒探针Ⅱ如序列表中的SEQ ID NO.2所示：5′-AAGGTAGACGGTGTTAGCGG-3′；
鼠肝炎病毒探针Ⅲ如序列表中的SEQ ID NO.3所示：5′-TTTAACCCGCGCTCGGTTTG-3′；
所述的探针是通过美国国家生物技术信息中心检索和分析获得鼠肝炎病毒目前流行的6种已知主要亚型(MHV-1、MHV-2、MHV-3、JHM、A59和S)共同特有的恒定区连续性核酸序列为依据；探针Ⅰ和探针Ⅱ取自该6种亚型共同的膜蛋白基因序列，探针Ⅲ取自该6种亚型共同的核蛋白基因序列；由上海英骏生物技术有限公司合成；
酶混合液，包含莫洛尼氏鼠白血病毒(M-MLV)反转录酶和脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶，两种酶混合的酶单位比例为1：1.5；
磷酸盐缓冲液，成分为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸氢二钠、2mM磷酸二氢钾，pH为7.4；
阳性对照品(RT-PCR-CK+)，为含有MHV核酸的样品稀释液；
阴性对照品(RT-PCR-CK-)，为不含MHV核酸的样品稀释液；
(2)应用S2抗体的快速间接酶联免疫吸附技术检测试剂，其中包括应用S2抗体检测的阳性对照(KTJ-CK+)、应用S2抗体检测的阴性对照(KTJ-CK-)、S2抗体；
应用S2抗体检测的阳性对照(KTJ-CK+)，为经试验检测含有MHV抗原S2的稀释液；
应用S2抗体检测的阴性对照(KTJ-CK-)，为经试验检测不含MHV抗原S2的稀释液；
S2抗体为抗原蛋白S2通过噬菌体抗体库筛选后生产获得的单克隆抗体；
(3)应用抗原S2的快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术检测试剂，其中包括酶联免疫吸附试剂盒包括应用抗原S2检测的阳性对照(KYJ-CK+)、应用抗原S2检测的阴性对照(KYJ-CK-)、S2蛋白稀释液；
应用抗原S2检测的阳性对照(KYJ-CK+)，为经试验检测含有MHV的S2抗体的稀释液；
应用抗原S2检测的阴性对照(KYJ-CK-)为经试验检测不含MHV的S2抗体的稀释液；
S2蛋白稀释液为通过基因工程技术获得的S2重组蛋白，由大肠杆菌BL21(DE3)表达后纯化获得；
(4)包被液，成分为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸氢二钠、2mM磷酸二氢钾，pH为7.4；
(5)洗涤液，包括洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ；所述洗涤液Ⅰ成分为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸氢二钠、2mM磷酸二氢钾，pH为7.4；所述洗涤液Ⅱ成分为137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸氢二钠、2mM磷酸二氢钾，加0.1％Tween-20，pH为7.4，0.45μm滤膜过滤除菌；
(6)封闭液，为5g的脱脂奶粉溶于100ml包被液；
(7)辣根过氧化酶-蛋白A偶联物，为使用辣根过氧化酶标记的蛋白A；
(8)酶反应底物，包括酶反应底物A、酶反应底物B和酶反应底物C；所述酶反应底物A成分为5mg/ml乙二胺四乙酸二钠,其中溶剂为二甲基亚砜；所述酶反应底物B成分为质量分数0.34％冰乙酸，0.23M醋酸钠，pH为5.0；所述酶反应底物C成分为质量分数30％双氧水；酶反应底物A、酶反应底物B和酶反应底物C需要新鲜配置，配置时底物酶反应A和酶反应B按照1：50比例混合，然后加入质量分数1‰酶反应底物C混匀；
(9)终止液，为2M硫酸；
(10)脱氧核糖核酸(DNA)酶Ⅰ；
(11)肝素。
本发明实施例还提供利用所述的复合型试剂盒检测鼠肝炎病毒的检测方法，包括下列步骤：
(1)采集样品以及对样品进行预处理:
采集组织或待检测标本，取自鼠尾或鼠背部静脉血液、唾液、粪便、鼠笼架擦拭物和鼠笼内饮用水等；
血液的采集及预处理，从鼠尾或鼠背部静脉收集5-10μl血液到含有5-10单位肝素(抗凝剂)和1单位/毫升DNA酶Ⅰ的50μl PBS溶液内；
唾液的采集及预处理，收集5-10μl唾液并稀释到含有1单位/毫升DNA酶Ⅰ的50μl PBS溶液中；
鼠便的采集及预处理，收集10mg鼠便，并溶解于5倍体积(W/V)含有1单位/毫升DNA酶Ⅰ的PBS中，在3000g下离心15分钟，然后收集上清液，并调节pH到7.0-7.4；
鼠笼架表面擦拭物采集及预处理，用微湿棉签擦拭鼠笼架表面，然后将微湿棉浸入含有1单位/毫升DNA酶Ⅰ的500μl PBS的1.5ml试管中并静置20分钟，在3000g下离心15分钟，保留上清液；
鼠饮用水的采集及预处理，收集500μl鼠笼内饮用水，并溶于含有1单位/毫升DNA酶Ⅰ的500μl PBS的1.5ml试管内，并静置20分钟，在3000g下离心10分钟，保留上清液；
(2)一步法RT-PCR检测鼠肝炎病毒的核酸：
将经过预处理样品加入核酸扩增反应管，50μl反转录体系包括：混合经预处理的待测样品5μl和45μl反应混合液,内含10M鼠肝炎病毒探针Ⅰ1μl、10M鼠肝炎病毒探针Ⅱ1μl、10μM鼠肝炎病毒探针Ⅲ2μl、10mM焦磷酸核苷酸混合物1μl、酶混合液1μl、五倍反应缓冲液5μl、无RNA酶去离子水34μl。具体操作过程中，可将除5μl样品外的其他PCR体系中其它反应物先配成混合液，然后再直接加入5μl样品；反应条件：扩增条件：58℃30min，94℃5min预变性，然后94℃30sec，55℃30sec，72℃1min 30sec，30个循环，最后72℃10min，4℃保温；
以鼠肝炎病毒探针Ⅰ作为正向引物和鼠肝炎病毒探针Ⅲ作为反向引物进行PCR得到的基因大小为400bp，以鼠肝炎病毒探针Ⅱ作为正向引物和鼠肝炎病毒探针Ⅲ作为反向引物进行PCR得到的基因大小为240bp，经琼脂糖凝胶电泳检测观察是在400bp和270bp处有明显条带，若同时有这两种条带，则判定为MHV阳性，若只有其中一种条带或两种条带都没有，则判定为MHV阴性；
(3)快速间接酶联免疫吸附法检测检测鼠肝炎病毒的抗原:
a、编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照1孔、阳性对照1孔；
b、包被：分别在聚苯乙烯微孔板条的阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照(标准品)100μl，然后在待测样品孔依次加入包被液80μl，待测样品20μl，37℃温育2小时；
c、用200μl洗涤液Ⅰ洗涤三次，每次3分钟，然后加入100μl用洗涤液Ⅰ按1：4000的S2单克隆抗体，室温缓缓摇动1小时；
d、用200μl洗涤液Ⅱ洗涤三次，再用200μl洗涤液Ⅰ洗涤两次,每次3分钟，然后加入100μl用洗涤液Ⅰ按1：6000稀释的辣根过氧化酶-蛋白A偶联物，室温缓缓摇动1小时；
e、用200μl洗涤液Ⅱ洗涤三次，再用200μl洗涤液Ⅰ洗涤两次,每次3分钟，加入100μl酶反应底物，避光静置10-20min，显色后呈蓝色；
f、显色结束后加入100μl终止液终止，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)；
g、分析结果
结果判定标准：
试验有效性：阳性对照孔平均值≥0.8；阴性对照平均值≤0.1；
临界值：临界值＝阴性对照孔平均值+0.1；
阴性判定：样品OD值<临界值者为MH阴性；
阳性判定：样品OD值≥临界值者为MHV阳性；
(4)快速双抗体夹心酶联免疫吸附法检测检测鼠肝炎病毒的抗体:
a、编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照1孔、阳性对照1孔；
b、包被：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照(标准品)100μl。然后在待测样品孔先加包被液80μl，然后再加待测样品20μl，37℃温育2小时；
c、用200μl洗涤液Ⅰ洗涤三次，每次3分钟，然后加入100μl用洗涤液Ⅰ按1：2000的S2抗原，室温缓缓摇动1小时；
d、用200μl洗涤液Ⅱ洗涤三次，每次3分钟，然后加入100μl用洗涤液Ⅰ按1：2000稀释的S2蛋白特异性单克隆抗体偶联物，室温缓缓摇动1小时；
e、用200μl洗涤液Ⅱ洗涤三次，再用200μl洗涤液Ⅰ洗涤两次,每次3分钟，然后加入100μl用洗涤液Ⅰ按1：6000稀释的辣根过氧化酶-蛋白A偶联物，室温缓缓摇动1小时；
f、用200μl洗涤液Ⅱ洗涤三次，再用200μl洗涤液Ⅰ洗涤两次，每次3分钟，加入100μl酶反应底物，避光静置10-30min，显色后呈蓝色；
g、显色结束后加入100μl终止液终止，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)；
h、分析结果
结果判定标准：
试验有效性：阳性对照孔平均值≥0.8；阴性对照平均值≤0.1；
临界值：临界值＝阴性对照孔平均值+0.1；
阴性判定：样品OD值<临界值者为MHV阴性；
阳性判定：样品OD值≥临界值者为MHV阳性。
(5)结果分析判断:
当一步法RT-PCT检测结果为阳性时，若间接法酶联免疫吸附检测结果和夹心法酶联免疫吸附检测结果均为阴性时，说明样品为MHV阳性，样品属MHV感染前早期，体内MHV量极少,且尚无S2抗体产生；若间接法酶联免疫吸附检测结果为阳性且夹心法酶联免疫吸附检测结果均为阴性时，说明样品为MHV阳性，样品属于MHV感染初期，体内MHV有一定积累，但暂无S2抗体产生；若间接法酶联免疫吸附检测结果和夹心法酶联免疫吸附检测结果均为阳性时，说明样品为MHV阳性，样品属于MHV感染中后期，体内有抗原蛋白S2，且产生了S2抗体；当一步法RT-PCT检测结果、间接法酶联免疫吸附检测结果和夹心法酶联免疫吸附检测结果均为阴性时，说明样品为MHV阴性。
本发明的有益效果是：本发明的复合型试剂盒利用一步法RT-PCR技术，快速间接酶联免疫吸附技术和快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术，三种方法互相配合，分别针对鼠肝炎病毒的核酸颗粒和其在侵染宿主过程中产生的抗原抗体标志物进行快速、准确和系统检测。
在上述技术方案的基础上，本发明还做了如下改进：
根据小鼠肝炎病毒株的基因组恒定区域设计和合成的核酸探针，用探针通过检测MHV核酸从而检测鼠体内和周围环境病毒颗粒的存在；
根据小鼠肝炎病毒株外膜刺状蛋白S基因组保守区域设计并合成了病毒抗原蛋白S2，用该抗原蛋白检测病毒感染鼠自身产生的抗体以检测感染鼠的免疫反应水平和可能感染；
用上述共同抗原蛋白S2蛋白通过筛选噬菌体抗体库筛选到特异性S2单克隆抗体，并用该抗体检测鼠体内和周围环境中是否存在MHV颗粒；
本发明进一步发展了直接应用粗提样本进行反转录聚合酶链式反应反应、S2蛋白特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术和抗原蛋白S2检测实验鼠产生的抗体的快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术。在酶联免疫吸附技术中使用了用辣根过氧化酶标记的蛋白A(HRP-proteinA)代替酶联免疫吸附试验中的酶标二抗，使病毒检测试剂的应用更简单快捷、成本更低，易于大规模推广和应用。
本发明所涉及的复合型试剂盒及检测方法也为其他类型的病毒的检测提供了思路，因此如果将本发明所述的试剂盒及检测方法用于其他病毒的检测也属于本发明的保护范围。
本说明书中所涉及的溶液无特别说明溶剂成分时，溶剂均为水。
附图说明
图1为利用本发明的复合型试剂盒检测鼠肝炎病毒的过程。编号1代表鼠肝炎病毒MHV核酸；编号2代表鼠肝炎病毒MHV外膜S蛋白；编号3带表小鼠血液样本；编号a代表一步法反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测MHV核酸的过程；编号b代表应用S2抗体的快速间接酶联免疫吸附技术检测MHV外膜蛋白S的过程；编号c代表应用抗原蛋白S2的快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术检测小鼠血液的过程。
图2为本发明本发明一步法反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的电泳结果图：M为Marker，购买于宝生物工程(大连)有限公司(Marker中的条带从上到下大小依次为1000bp、700bp、500bp、400bp、300bp、200bp和100bp)；编号1-10为一步法RT-PCR检测鼠血液样本的实验结果，其中编号1为阳性对照，编号2为阴性对照，编号3为实验组1中的1只慢性MHV感染的ICR小鼠血液，编号4和编号5分别为实验组1中的2只新感染的具有正常免疫功能的鼠血液，编号6为实验组2中的1只慢性MHV感染的ICR小鼠血液，编号7和编号8分别为实验组2中的2只新感染的严重联合性免疫缺陷(SCID)鼠血液，编号9和编号10分别为对照组中的2只阴性无病毒感染鼠血液；编号11-20为一步法RT-PCR检测鼠唾液样本的实验结果，其中编号11为阳性对照，编号12为阴性对照，编号13为实验组1中的1只慢性MHV感染的ICR小鼠唾液，编号14和编号15分别为实验组1中的2只新感染的具有正常免疫功能的鼠唾液，编号16为实验组2中的1只慢性MHV感染的ICR小鼠唾液，编号17和编号18分别为实验组2中的2只新感染的SCID鼠唾液，编号19和编号20分别为对照组中的2只阴性无病毒感染鼠唾液；编号21-30为一步法RT-PCR检测鼠便样本的实验结果，其中编号21为阳性对照，编号22为阴性对照，编号23为实验组1中的1只慢性MHV感染的ICR小鼠鼠便，编号24和编号25分别为实验组1中的2只新感染的具有正常免疫功能的鼠便，编号26为实验组2中的1只慢性MHV感染的ICR小鼠便，编号27和编号28分别为实验组2中的2只新感染的SCID鼠鼠便，编号29和编号30分别为对照组中的2只阴性无病毒感染鼠便；编号31-35为一步法RT-PCR检测鼠笼表面擦拭物的实验结果，其中编号31为阳性对照，编号32为阴性对照，编号33为实验组1鼠笼表面擦拭物，编号34为实验组2鼠笼表面擦拭物，编号35为对照组鼠笼表面擦拭物；编号36-40为一步法RT-PCR检测鼠笼内饮用水样本的实验结果，其中36为阳性对照，编号37为阴性对照，编号38为实验组1鼠笼内饮用水，编号39为实验组2鼠笼内饮用水，编号40为对照组鼠笼内饮用水。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明提供了一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，该试剂盒含有：一步法反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂(包括焦磷酸核苷酸混合物、五倍反应缓冲液、探针Ⅰ、探针Ⅱ、探针Ⅲ、无RNA酶去离子水、酶混合液、磷酸盐缓冲液、阳性对照品和阴性对照品)、应用S2抗体的类似间接酶联免疫吸附技术检测试剂(包括阳性对照、阴性对照、S2抗体)、应用抗原S2的夹心酶联免疫吸附技术检测试剂(包括阳性对照、阴性对照和S2蛋白稀释液)、包被液、洗涤液(包括洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ)、封闭液、HRP-proteinA偶联物、酶反应底物、终止液、DNA酶Ⅰ和肝素。
试剂盒的构造：
1、试剂：
本试剂盒制造过程中所用的试剂主要购自宝生物工程(大连)有限公司。
2、一步法反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂的制备:
(1)探针的设计与合成：
通过美国国家生物技术信息中心检索和分析获得鼠肝炎病毒目前流行的6种已知主要亚型(MHV-1、MHV-2、MHV-3、JHM、A59和S)共同特有的抗原蛋白的恒定区连续核酸序列为依据的。本发明探针序列为：鼠肝炎病毒探针Ⅰ：5′-GAGGATTACCATACACTAAC-3′，SEQ ID NO.1所示；鼠肝炎病毒探针Ⅱ：5′-AAGGTAGACGGTGTTAGCGG-3′，SEQ ID NO.2所示；鼠肝炎病毒探针Ⅲ：5′-TTTAACCCGCGCTCGGTTTG-3′，为SEQ ID NO.3所示。鼠肝炎病毒探针Ⅰ和鼠肝炎病毒探针Ⅱ取自该6种亚型共同的膜蛋白基因序列，鼠肝炎病毒探针Ⅲ取自该6种亚型共同的核蛋白基因序列。鼠肝炎病毒探针由上海英骏生物技术有限公司合成。
对待检测样品进行反转录聚合酶链式反应时分别以鼠肝炎病毒探针Ⅰ作为正向引物和鼠肝炎病毒探针Ⅲ作为反向引物及以鼠肝炎病毒探针Ⅱ作为正向引物和鼠肝炎病毒探针Ⅲ作为反向引物进行复式扩增。以鼠肝炎病毒探针Ⅰ作为正向引物和鼠肝炎病毒探针Ⅲ作为反向引物进行PCR得到的基因片段大小为400个核酸碱基对(base pair,bp)，以鼠肝炎病毒探针Ⅱ作为正向引物和鼠肝炎病毒探针Ⅲ作为反向引物进行PCR得到的基因片段大小为270bp，经琼脂糖凝胶电泳检测即可判定结果。
(2)RT-PCR混合液配制：混合经预处理的待检样品5μμl和45μμl反应混合物，内含10μM鼠肝炎病毒探针探针Ⅰ1μl、10μM鼠肝炎病毒探针探针Ⅱ1μl、10μM鼠肝炎病毒探针探针Ⅲ2μl、10mM焦磷酸核苷酸混合物1μl、酶混合液1μl、五倍反应缓冲液和无RNA酶去离子水34μl。
3、抗原蛋白S2的制备:
(1)设计抗原蛋白构建方案:
本发明所使用的抗原蛋白是我们通过美国国家生物技术信息中心检索和分析获得鼠肝炎病毒目前流行的6种主要亚型(MHV-1、MHV-2、MHV-3、JHM、A59和S)共同特有的结构蛋白S(gi|298199707)的稳定区S2区域。S2抗原蛋白序列为序列表中的SEQ ID NO.4所示，蛋白理论大小为50.4kDa。S2抗原蛋白序列所对应的核酸序列为序列表中的SEQ ID NO.5所示，基因大小为1383bp。根据抗原蛋白S2的核酸序列设计引物，上游引物S2-f含有NcoI限制性内切酶位点，序列为SEQ ID NO.6所示，5′-CATGCCATGGCATGGATGGCAGCGCAAGGG-3′；下游引物S2-r含有XhoI限制性内切酶位点，序列为SEQ ID NO.7所示，5′-CCGCTCGAGATCCTCATGGGAGGA-3′。
(2)S2基因的克隆与蛋白表达:
以S2-f和S2-r为引物，以MHV核酸为模板，在50μl DNA扩增反应体系中加入上下游引物各1μl，核酸模板1μl，dNTP(2.5mM)4μl，10×EX buffer5μl，ddH2O 36.5μl，EXtaq 0.5μl。扩增所用的原料购买于宝生物工程(大连)有限公司，扩增条件：94℃5min预变性，然后94℃30sec，55℃30sec，72℃1min 30sec，30个循环，最后72℃10min。获得S2基因片段后，Nco Ⅰ和Xho Ⅰ酶双切S2基因片段，将其连接至同样限制性内切酶酶切的pET-28b上，构建pET-28b-S2表达质粒，测序成功后，将表达质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)中进行表达，表达条件为：0.5mM IPTG，37℃诱导4个小时。经SDS-PAGE跑胶鉴定该融合蛋白可溶性太低，因此进行亲和变性纯化，然后再进行生物活性复性处理，以恢复蛋白原有结构。
4、S2单克隆抗体制备:
我们已经把人B淋巴细胞中的重链可变区基因片段和轻链可变区基因片断，通过反转录和聚合酶链式反应技术进行克隆和扩增，并随机组合插入表达载体噬菌粒中，并进一步通过抗体核酸的链式反应突变，形成抗体结构更多形性，从而构建了含有7×1011个单链片段的通用性噬菌体基因抗体库，抗体为scFv片段，结构呈V形，并已进一步完善了噬菌体抗体筛选技术和高亲和力及高产量的原核细胞表达性生产。S2蛋白单克隆抗体的筛选过程如下：
(1)筛选S2蛋白对应的噬菌体抗体库：
辅助噬菌体感染：将含有抗体库TG1菌在2TY培养基中培养至OD＝1.5左右，然后用辅助噬菌体感染后，加入含有质量分数0.1％葡萄糖、100μg/ml氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素的2TY培养基，25℃生长16-20小时。然后离心取上清，加入PEG沉淀噬菌体，再用PBS悬浮噬菌体沉淀，离心取上清，获得噬菌体抗体库。
筛选：将S2抗原蛋白包被于聚苯乙烯96孔免疫反应板中，4℃过夜后用洗涤液洗涤，然后37℃下封闭2小时后再次洗涤，然后加入噬菌体抗体库溶液，37℃静止孵育2小时后，用洗涤液充分洗涤，洗涤后，加入胰蛋白酶溶液室温缓缓搅拌1小时后收集噬菌体，然后感染OD＝0.5的TG1细菌，最后涂抹于含有氨苄青霉素100μg/ml，质量分数4％葡萄糖的TYE平板上，37℃培养过夜，然后用玻璃涂棒刮板收集含噬菌体的TG1细胞。然后反复二轮同样的噬菌体筛选过程，最终获得S2蛋白对应含有特异性的噬菌体。
(2)酶联免疫吸附反应(ELISA)筛选单克隆：
挑取单克隆并诱导表达抗体：经过三轮辅助噬菌体筛选，再感染TG1，进行菌液梯度稀释，以获得TG1单菌落。挑取单菌落于含有200μl含有100μg/ml氨苄青霉素，质量分数4％葡萄糖的2TY培养基的96深圆孔底培养平板上，37℃过夜培养。第二天，从每孔中取5μl过夜培养液接种至一个新的每孔含有100μg/ml氨苄青霉素、质量分数4％葡萄糖的2TY培养基的96深孔圆底培养平板上，37℃培养3小时。然后离心弃上清，加入含有氨苄青霉素100μg/ml和1mM IPTG的200μl 2TY培养基重悬菌体，25℃培养过夜。第二天，离心后将上清液(含可溶性抗体片段)移至新的96孔培养板中，4℃储存。
ELISA筛选可溶性抗体片段：将S2抗原包被于聚苯乙烯96孔免疫反应板中，4℃过夜后用洗涤液洗涤，然后37℃下封闭2小时后再次洗涤后加入溶于质量分数3％牛血清白蛋白的可溶性抗体片段，室温下孵育1小时，经洗涤液充分洗涤后加入辣根过氧化酶与蛋白A偶联物溶液，室温下轻轻摇动孵育1小时，经洗涤液充分洗涤后加入四甲基联苯胺(TMB)溶液，室温避光显色10min-30min后，记录阳性反应孔并拍照，最后加入终止液终止反应，颜色由蓝色变为黄色。分析结果，显色最强的孔所加的可溶性抗体片段即为S2蛋白对应的单克隆抗体。
(3)S2蛋白单克隆抗体的生产及检测：
确定免疫反应板上最强反应孔所对应的96孔TG1细菌板上的孔位，取适量接种于5ml含有氨苄青霉素100μg/ml，质量分数4％葡萄糖到2TY培养基中，37℃培养过夜；取2.5ml到100ml含有100μg/ml氨苄青霉素的2TY培养基中，37℃培养3小时。加入1mM IPTG，25℃培养过夜；离心，将上清保存于新的容器中，然后用蛋白A柱进行亲和纯化，保存抗体；将获得的S2蛋白单克隆抗体用ELISA和免疫印迹法进行检测。
5、辣根过氧化物酶-蛋白A偶联：
溶解2mg辣根过氧化物酶在500μl去离子水中，加入100μl新鲜制备的0.1M高碘酸钠，室温下避光搅拌20min，溶液颜色由橙色到变为淡绿；在1升1.0mM醋酸钠缓冲液中在4℃隔夜透析修饰后的酶化合物；溶解2毫克蛋白A在500μl 10mM碳酸钠缓冲液(pH为9.5)；通过加入250μl 0.2M的碳酸钠缓冲液(pH为9.5)调整透析后酶溶液到pH为9.0-9.5，并立即添加辣根过氧化物酶溶液，在室温下搅拌该混合物3小时；加入50μl新鲜配制的硼氢化钠溶液(4mg/ml)，混匀后，4℃搅拌2小时；在1L PBS中透析6-16小时候后，更换新的PBS透析液继续透析6-16小时，加入牛血清白蛋白到5mg/ml的终浓度，并分装储存偶联物在-20℃。
实施例
本发明涉及了一种检测鼠肝炎病毒的复合型试剂盒，包含鼠肝炎病毒核酸检测试剂、病毒表面共同性抗原检测试剂以及使用同样抗原筛选鼠自身体内产生的病毒特异性抗体检测试剂的组合。其中,鼠病毒核酸检测试剂和病毒表面共同性抗原试剂检测鼠体内和周围环境中存在的病毒颗粒,而病毒特异性抗体检测试剂测定鼠自身体内产生的病毒特异性抗体.这些病毒核酸试剂\病毒抗原和抗体试剂特异性针对目前已知全部MHV亚病毒株。在这个复合型试剂盒中,每单个检测试剂可单独也可组合使用，针对某个标本样品进行多方面的MHV快速检测。
小鼠在接触鼠肝炎病毒后15天开始产生微量抗体，并大概在21天抗体效价增加，在大多数情况下，鼠肝炎病毒具有较高的突变频率和慢性感染的感染鼠可以再次感染先前已免疫或其他实验鼠。本发明的复合型检测试剂盒使用了病毒恒定区核酸和病毒表面共同抗原及其产生的抗体来检测病毒感染的状态，因而避免了病毒核酸和抗原突变或而引起的假阴性反应。当确定实验鼠感染病毒后，迅速清离鼠肝炎病毒污染区和污染物以及清除所有已感染病毒的小鼠，可以避免大规模鼠肝炎病毒扩散。
在本发明中，设立2个实验组，1个对照组。每个组内的鼠生活在一个鼠笼内并分别隔离在单独房间内。实验组1包括一只慢性鼠肝炎病毒(MHV)的ICR小鼠和二只正常免疫功能幼鼠；实验组2包括一只慢性鼠肝炎病毒感染的ICR小鼠和二只严重联合免疫缺陷型病(SCID)鼠；对照组3为2只阴性无病毒感染鼠。培养15天后收集样本进行检测。分别采集上述样品采取图1所示的方法进行检测。
实施例1：利用本发明的复合型试剂盒快速准确的检测小鼠血液中的鼠肝炎病毒
使用鼠血液作为待测样品，用一步法RT-PCR、快速间接酶联免疫吸附试验和快速双抗体夹心酶联免疫吸附试验来检测鼠肝炎病毒的存在情况和该病毒刺激实验鼠体内产生的抗体情况。血液标本来源分别取自实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠和2只新感染的SCID鼠、对照组中2只阴性无病毒感染鼠。
(1)样本处理：分别从上述各小鼠鼠尾或鼠背部静脉收集5-10μl血液到含有5-10单位肝素(抗凝剂)和1单位/ml DNA酶Ⅰ的50μl PBS溶液内。
(2)一步法RT-PCR检测鼠血液样本：
试剂包括100μM四种焦磷酸核苷酸混合物(dNTP)、五倍反应缓冲液(5xBuffer)、3个鼠肝炎病毒探针(鼠肝炎病毒探针Ⅰ、鼠肝炎病毒探针Ⅱ和鼠肝炎病毒探针Ⅲ)、无RNA酶去离子水、酶混合液、磷酸盐缓冲液(pH为7.4)、阳性对照品和阴性对照品。
a、样品编号：阳性对照(编号1)、阴性对照(编号2)、实验组1中慢性MHV感染的ICR小鼠血液(编号3)和2只新感染的具有正常免疫功能的小鼠血液(编号4、5)、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠血液(编号6)和2只新感染的SCID鼠血液(编号7、8)、对照组中2只阴性无病毒感染鼠血液(编号9、10)。
b、将5μl样品液分别直接加入到含有45μl的RT-PCR反应混合液的反应管中。
c、将反应管放入PCR仪中，扩增条件：58℃30min，94℃5min预变性，然后94℃30sec，55℃30sec，72℃1min 30sec，30个循环，最后72℃10min，4℃保温。
d、PCR反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳检测结果。
(3)应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术检测血液样本：
ELISA试剂盒包括聚苯乙烯微孔板条、应用S2抗体检测阳性对照(KTJ-CK+)、应用S2抗体检测阴性对照(KTJ-CK-)、S2蛋白单克隆抗体、包被液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、脱脂奶粉、HRP-proteinA偶联物、酶反应底物、终止液。
a、样品编号：阳性对照(编号A1)、阴性对照(编号A2)、实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠血液(编号A3)和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠血液(编号A4、A5)、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠血液(编号A6)和2只新感染的严重联合性免疫缺陷病(SCID)鼠血液(编号A7、A8)、对照组中2只阴性无病毒感染鼠血液(编号A9、A10)。
b、包被：分别在阳性、阴性对照孔中加入阴性对照(KTJ-CK+)、阳性对照(KTJ-CK-)100μl。然后在待测样品孔先加包被液80μl，然后再加待测样品20μl，37℃温育2小时。
c、用200μl洗涤液Ⅰ洗涤三次，每次3分钟，然后加入100μl用洗涤液Ⅰ按1：4000的S2单克隆抗体，室温缓缓摇动1小时。
d、用200μl洗涤液Ⅱ洗涤三次，再用200μl洗涤液Ⅰ洗涤二次，每次3分钟，然后加入100μl用洗涤液1按1：6000稀释的HRP-proteinA偶联物，室温缓缓摇动1小时。
e、用200μl洗涤液Ⅱ洗涤三次，再用200μl洗涤液Ⅰ洗涤二次，每次3分钟，加入100μl酶反应底物，避光静置10-30min，显色后呈蓝色。
f、显色结束后加入100μl终止液终止，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。实验结果见表1。
g、分析结果。
结果判定标准：
试验有效性：阳性对照孔平均值≥0.8；阴性对照平均值≤0.1；
临界值：临界值＝阴性对照孔平均值+0.1；
阴性判定：样品OD值<临界值者为MHV阴性；
阳性判定：样品OD值≥临界值者为MHV阳性。
(4)应用抗原蛋白S2检测实验鼠产生的抗体的快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术检测血液样本：
ELISA试剂盒包括聚苯乙烯微孔板条、应用抗原S2检测阳性对照(KYJ-CK+)、应用抗原S2检测阴性对照(KYJ-CK-)、S2蛋白稀释液、包被液、洗涤液Ⅰ，洗涤液Ⅱ、脱脂奶粉、HRP-proteinA偶联物、酶反应底物、终止液。
a、样品编号：阳性对照(编号2A1)、阴性对照(编号2A2)、实验组1中1只慢性MHV感染鼠血液(编号2A3)和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠血液(编号2A4、2A5)、实验组2中1只慢性MHV感染鼠血液(编号2A6)和2只新感染的SCID鼠血液(编号2A7、2A8)、对照组中2只阴性无病毒感染鼠血液(编号2A9、2A10)。
b、包被：分别在阳、阴性对照孔中加入阳性对照(KYJ-CK+)、阴性对照(KYJ-CK-)100μl。然后在待测样品孔先加样品包被液80μl，然后再加待测样品20μl，37℃温育2小时。
c、用200μl洗涤液Ⅰ洗涤三次，每次3分钟，然后加入100μl用洗涤液Ⅰ按1：2000的S2抗原，室温缓缓摇动1小时。
d、用200μl洗涤液Ⅰ洗涤三次，每次3分钟，然后加入100μl用洗涤液Ⅰ按1：2000稀释的S2蛋白特异性单克隆抗体，室温缓缓摇动1小时。
e、用200μl洗涤液Ⅱ洗涤三次，再用200μl洗涤液Ⅰ洗涤二次，每次3分钟，然后加入100μl用洗涤液Ⅰ按1：6000稀释的HRP-proteinA偶联物，室温缓缓摇动1小时。
f、用200μl洗涤液Ⅱ洗涤三次，再用200μl洗涤液Ⅰ洗涤二次，每次3分钟，加入100μl酶反应底物，避光静置10-30min，显色后呈蓝色。
g、显色结束后加入100μl终止液终止，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)。实验结果见表2。
h、分析结果。
结果判定标准：
试验有效性：阳性对照孔平均值≥0.8；阴性对照平均值≤0.1；
临界值：临界值＝阴性对照孔平均值+0.1；
阴性判定：样品OD值<临界值者为MHV阴性；
阳性判定：样品OD值≥临界值者为MHV阳性。
实施例2：利用本发明的复合型试剂盒快速准确的检测小鼠唾液中的鼠肝炎病毒
用鼠唾液作为待测样品，一步法RT-PCR和快速间接酶联免疫吸附试验来检测鼠肝炎病毒的存在。唾液标本分别取自实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠和2只新感染的SCID鼠、对照组中2只阴性无病毒感染鼠。
(1)样品处理：分别收集上述小鼠10μl唾液到含有1单位/毫升DNA酶Ⅰ的50μl PBS溶液中。
(2)一步法RT-PCR检测鼠唾液样本:
样品编号：阳性对照(编号11)、阴性对照(编号12)、实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠唾液(编号13)和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠唾液(编号14、编号15)、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠唾液(编号16)和2只新感染的SCID鼠唾液(编号17、18)、对照组中2只阴性无病毒感染鼠唾液(编号19、20)。其余具体操作步骤详见实施例1中一步法RT-PCR检测血液样本的操作步骤。
(3)应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术检测鼠唾液样本:
样品编号：阳性对照(编号B1)、阴性对照(编号B2)、实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠唾液(编号B3)和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠唾液(编号B4、B5)、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠唾液(编号B6)和2只新感染的SCID鼠唾液(编号B7和编号B8)、对照组中2只阴性无病毒感染鼠唾液(编号B9和B10)。
具体操作步骤详见实施例1中应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的间接酶联免疫吸附技术检测血液样本的操作步骤。实验结果见表1。
实施例3：利用本发明的复合型试剂盒快速准确的检测小鼠鼠便中的鼠肝炎病毒
使用鼠便作为实验标本并用一步法RT-PCR和快速间接酶联免疫吸附试验来检测鼠肝炎病毒的存在。鼠便标本分别取自实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠和2只新感染的SCID鼠、对照组中2只阴性无病毒感染鼠。
(1)样品处理：分别收集上述小鼠10mg鼠便，并完全溶解于5倍体积(W/V)含有1单位/毫升DNA酶Ⅰ的100μl PBS中，在3000g下离心15分钟，然后收集上清液，并调节pH到7.0-7.4之间。
(2)一步法RT-PCR检测鼠便样本:
样品编号：阳性对照(编号21)、阴性对照(编号22)、实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠鼠便(编号23)和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠便(编号24和编号25)、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠鼠便(编号26)和2只新感染的SCID鼠便(编号27和编号28)、对照组中2只阴性无病毒感染鼠鼠便(编号29和编号30)。其余具体操作步骤详见实施例1中一步法RT-PCR检测血液样本的操作步骤。
(3)应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术检测鼠便样本:
样品编号：阳性对照(编号C1)、阴性对照(编号C2)、实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠鼠便(编号C3)和2只新感染的具有正常免疫功能的鼠便(编号C4、C5)、实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠鼠便(编号C6)和2只新感染的SCID鼠便(编号C7、C8)、对照组中2只阴性无病毒感染鼠鼠便(编号C9、C10)。其余具体操作步骤详见实施例1中应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的间接酶联免疫吸附技术检测血液样本的操作步骤。实验结果见表1。
实施例4：利用本发明的复合型试剂盒快速准确的检测鼠笼架表面擦拭物中的鼠肝炎病毒
使用鼠笼表面擦拭物作为实验标本并用RT-PCR和快速间接酶联免疫吸附试验来检测鼠肝炎病毒的存在。鼠笼表面尘埃标本来源分别取自实验组1、实验组2和对照组三个鼠笼。
(1)样品处理：用微湿棉签擦拭上述实验组鼠笼架表面，然后浸入含有1单位/毫升DNA酶Ⅰ1500μl PBS中并静置20分钟。在3000g下离心15分钟，保留上清液。
(2)一步法RT-PCR检测鼠笼表面擦拭物
样品编号：阳性对照(编号31)、阴性对照(编号32)、实验组1鼠笼表面擦拭物(编号33)、实验组2鼠笼表面擦拭物(编号34)和对照组鼠笼表面擦拭物(编号35)。其余具体操作步骤详见实施例1中一步法RT-PCR检测血液样本的操作步骤。
(3)应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术检测鼠笼表面擦拭物
样品编号：阳性对照(编号D1)、阴性对照(编号D2)、实验组1鼠笼表面擦拭物(编号D3)、实验组2鼠笼表面擦拭物(编号D4)和对照组鼠笼表面擦拭物(编号D5)。其余具体操作步骤详见实施例1中应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术检测血液样本的操作步骤。实验结果见表1。
实施例5：利用本发明的复合型试剂盒快速准确的检测鼠笼内饮用水中的鼠肝炎病毒
使用鼠饮用水作为实验标本并用RT-PCR和快速间接酶联免疫吸附试验来检测鼠肝炎病毒的存在。鼠饮用水标本来源分别取自实验组1、实验组2和对照组鼠笼中的饮用水。
(1)样本处理：轻轻收集上述鼠笼中饮用水500μl，并溶于含有1单位/毫升DNA酶Ⅰ1500μl PBS的3ml试管内，静置20分钟，然后3000g下离心10分钟，取上清液作为样本。
(2)一步法RT-PCR检测鼠笼内饮用水样本:
样品编号：阳性对照(编号36)、阴性对照(编号37)、实验组1鼠笼内饮用水(编号38)、实验组2鼠笼内饮用水(编号39)和对照组鼠笼内饮用水(编号40)。其余具体操作步骤详见实施例1中一步法RT-PCR检测血液样本的操作步骤。
(3)应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术检测鼠笼内饮用水样本:
样品编号：阳性对照(编号D6)、阴性对照(编号D7)、实验组1鼠笼内饮用水(编号D8)、实验组2鼠笼内饮用水(编号D9)和对照组鼠笼内饮用水(编号D10)。其余具体操作步骤详见实施例1中应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的间接酶联免疫吸附技术检测血液样本的操作步骤。实验结果见表1。
实验结果和分析：
(1)一步RT-PCR检测鼠肝炎病毒的结果：
图2显示了利用一步法反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的检测鼠肝炎病毒的电泳结果。根据判断标准，以鼠肝炎病毒探针Ⅰ、鼠肝炎病毒探针Ⅱ和鼠肝炎病毒探针Ⅲ进行PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳检测观察是在400bp和240bp处有明显条带，若同时有这两种条带，则判定为MHV阳性，若只有其中一种条带或两种条带都没有，则判定为MHV阴性，从图中可以看出：样品中阳性对照可以扩出目的条带，阴性对照无条带扩出，证明实验有效；样品9号、10号、19号、20号、29号、30号和35号，未能扩出目的条带，说明样品中鼠肝炎病毒核酸颗粒检测为阴性；其余样品均可以扩增出两条带，说明样品中鼠肝炎病毒核酸颗粒检测为阳性。
(2)应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的快速间接酶联免疫吸附技术：
表1 快速间接酶联免疫吸附反应(ELISA)实验结果
表1为快速间接酶联免疫吸附反应(ELISA)实验结果。A1-A10为应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的间接酶联免疫吸附技术检测血液样本的实验结果，其中样品A1为阳性对照，样品A2为阴性对照，样品A3为实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠血液，样品A4和样品A5分别为实验组1中的2只新感染的具有正常免疫功能的鼠血液，样品A6为实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠血液，样品A7和样品A8分别为实验组2中的2只新感染的严重联合性免疫缺陷(SCID)鼠血液，样品A9和样品A10分别为对照组中的2只阴性无病毒感染鼠血液；样品B1-B10为应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的间接酶联免疫吸附技术检测鼠唾液样本的实验结果，其中样品B1为阳性对照，样品B2为阴性对照，样品B3为实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠唾液，样品B4和样品B5分别为实验组1中的2只新感染的具有正常免疫功能的鼠唾液，样品B6为实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠唾液，样品B7和样品B8分别为实验组2中的2只新感染的SCID鼠唾液，样品B9和样品B10分别为对照组中的2只阴性无病毒感染鼠唾液；样品C1-C10为应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的间接酶联免疫吸附技术检测鼠便样本的实验结果，其中样品C1为阳性对照，样品C2为阴性对照，样品C3为实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠鼠便，样品C4和样品C5分别为实验组1中的2只新感染的具有正常免疫功能的鼠便，样品C6为实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠鼠便，样品C7和样品C8分别为实验组2中的2只新感染的SCID鼠便，样品C9和C10分别为对照组中的2只阴性无病毒感染鼠便；样品D1-D5为应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的间接酶联免疫吸附技术检测鼠笼表面擦拭物的实验结果，其中样品D1为阳性对照，样品D2为阴性对照，样品D3为实验组1鼠笼表面擦拭物，样品D4为实验组2鼠笼表面擦拭物，样品D5为对照组鼠笼表面擦拭物；样品D6-D10为应用S2特异性单克隆抗体检测实验鼠抗原的间接酶联免疫吸附技术检测鼠笼内饮用水样本的实验结果，其中样品D6为阳性对照，样品D7为阴性对照，样品D8为实验组1鼠笼内饮用水，样品D9为实验组2鼠笼内饮用水，样品D10为对照组鼠笼内饮用水。根据判定标准，样品A1-D1为阳性对照，测得结果均大于0.8，并且A2-D2作为阴性对照，测得结果小于0.1，说明实验有效；其中，样品D3、样品D4、样品D5、样品D7、样品D8、样品A9-D9及样品A10-D10测得OD值小于临界值，样品中鼠肝炎病毒抗原水平检测为阴性；其余样品测得OD值大于临界值，样品中鼠肝炎病毒抗原水平检测为阳性。
(3)应用抗原蛋白S2检测实验鼠产生的抗体的快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术检测血液样本：
表2 快速双抗体夹心酶联免疫吸附反应(ELISA)实验结果
表2为快速双抗体夹心酶联免疫吸附反应(ELISA)实验结果，2A1-A10为应用抗原蛋白S2检测实验鼠产生的抗体的快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术检测血液样本的实验结果，其中样品2A1为阳性对照，样品2A2为阴性对照，样品2A3为实验组1中1只慢性MHV感染的ICR小鼠血液，样品2A4和样品2A5分别为实验组1中的2只新感染的具有正常免疫功能的鼠血液，样品2A6为实验组2中1只慢性MHV感染的ICR小鼠血液，样品2A7和样品2A8分别为实验组2中的2只新感染的SCID鼠血液，样品2A9和样品2A10分别为对照组中的2只阴性无病毒感染鼠血液。根据判定标准，样品2A1为阳性对照，测得结果大于0.8，并且样品2A2作为阴性对照，测得结果小于0.1，说明实验有效；其中，样品2A9和样品2A10测得OD值均小于临界值，说明鼠肝炎病毒抗体水平检测为阴性；其余样品测得OD值均大于临界值，说明鼠肝炎病毒抗体水平检测为阳性。
在感染鼠和未感染鼠共同生活15天后，慢性感染和原未感染免疫力正常的实验鼠，3种试剂血液检测都为阳性，其中慢性感染鼠抗体量较低，但严重免疫缺陷型鼠仅显示病毒核酸和抗原反应阳性，而无抗体可测到；所有鼠的粪便样品检测都查出含有病毒颗粒，鼠消化道是病毒体外传播的主要途径。各只鼠唾液，笼架表面擦拭物和鼠接触饮用水均显示病毒核酸和抗原反应阳性，说明新加入的鼠包括免疫力正常的实验鼠和免疫缺陷型鼠都已感染鼠肝炎病毒，并已转移到血液和全身主要器官，其中免疫缺陷型鼠缺乏抗体产生。小鼠肝炎病毒有很多不同的亚类型鼠肝炎病毒毒株并有不同毒力和细胞嗜性，而且不断经历天然存在的突变和重组演变。普遍存在高度传染性，MHV通常感染呼吸道或胃肠道并引起多种疾病，如肝炎，肠炎和脑脊髓炎。该疾病的严重程度取决于周围环境变化，鼠龄和受感染的小鼠的免疫状态。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有： 
(1)一步法反转录聚合酶链式反应试剂，其中包括焦磷酸核苷酸混合物、五倍反应缓冲液、鼠肝炎病毒探针、无核糖核酸酶去离子水、酶混合液、磷酸盐缓冲液、阳性对照品和阴性对照品，所述鼠肝炎病毒探针包括鼠肝炎病毒探针Ⅰ、鼠肝炎病毒探针Ⅱ、鼠肝炎病毒探针Ⅲ； 
鼠肝炎病毒探针Ⅰ如序列表中的SEQ ID NO.1所示：5′-GAGGATTACCATACACTAAC-3′； 
鼠肝炎病毒探针Ⅱ如序列表中的SEQ ID NO.2所示：5′-AAGGTAGACGGTGTTAGCGG-3′； 
鼠肝炎病毒探针Ⅲ如序列表中的SEQ ID NO.3所示：5′-TTTAACCCGCGCTCGGTTTG-3′； 
(2)应用S2抗体的快速间接酶联免疫吸附技术检测试剂，其中包括应用S2抗体检测的阳性对照、应用S2抗体检测的阴性对照、S2抗体； 
应用S2抗体检测的阳性对照为经试验检测含有鼠肝炎病毒抗原蛋白S2的稀释液； 
应用S2抗体检测的阴性对照为经试验检测不含鼠肝炎病毒抗原蛋白S2的稀释液； 
S2抗体为抗原蛋白S2通过噬菌体抗体库筛选后生产获得的单克隆抗体； 
(3)应用抗原蛋白S2的快速双抗体夹心酶联免疫吸附技术检测试剂，其中包括应用抗原蛋白S2检测的阳性对照、应用抗原S2检测的阴性对照、S2蛋白稀释液； 
应用抗原蛋白S2检测的阳性对照为经试验检测含有鼠肝炎病毒S2抗体的稀释液； 
应用抗原蛋白S2检测的阴性对照为经试验检测不含鼠肝炎病毒S2抗体的稀释液； 
S2蛋白稀释液为溶于磷酸盐缓冲液中的S2抗原蛋白； 
(4)包被液； 
(5)洗涤液，包括洗涤液Ⅰ和洗涤液Ⅱ； 
(6)封闭液； 
(7)辣根过氧化物酶-蛋白A偶联物； 
(8)酶反应底物； 
(9)终止液； 
(10)脱氧核糖核酸酶Ⅰ； 
(11)肝素。 
2.根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述鼠肝炎病毒探针选自鼠肝炎病毒核酸的共同恒定区序列。 
3.根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述酶混合液含有莫洛尼氏鼠白血病毒反转录酶和脱氧核糖核酸聚合酶。 
4.根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有鼠肝炎病毒核酸的样品稀释液；所述阴性对照品为不含有鼠肝炎病毒核酸的样品稀释液。 
5.根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述S2蛋白基因序列选自鼠肝炎病毒目前流行的6种主要亚型的共同特有的结构蛋白S稳定区S2基因区域，并通过基因工程技术生物合成S2蛋白；所述6种主要亚型为MHV-1、MHV-2、MHV-3、JHM、A59和S。 
6.根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述S2抗体通过噬菌体抗体库筛选技术和酶联免疫吸附技术制备。 
7.根据权利要求1所述的鼠肝炎病毒的复合型检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶-蛋白A偶联物直接用于特异性抗体检测；所述辣根过氧化物酶-蛋白A偶联物由以下步骤制备： 
(1)溶解2毫克过氧化物酶于500μl去离子水中； 
(2)加入100μl新鲜制备的0.1M高碘酸钠，室温下避光搅拌20min； 
(3)将上述修饰后的酶化合物在1升1.0mM醋酸钠缓冲液中于4℃隔夜透析； 
(4)溶解2毫克蛋白A在500μl 10mM碳酸钠缓冲液，溶液pH为9.5； 
(5)通过加入250μl pH为9.5的0.2M的碳酸钠缓冲液调整透析后酶溶液pH为9.0-9.5，在室温下搅拌该混合物3小时； 
(6)加入50μl新鲜配制的4mg/ml硼氢化钠溶液，混匀后，4℃搅拌 2-3小时； 
(7)在1L磷酸盐缓冲液中透析上述溶液，透析6-16小时后更换新的磷酸盐缓冲液透析液继续透析6-16小时； 
(8)按照每1ml上述溶液加入5mg牛血清蛋白的比例添加牛血清蛋白，将溶液储存于-20℃； 
8.一种利用权利要求1–7任一项所述的鼠肝炎病毒的复合型试剂盒检测鼠肝炎病毒的检测方法，其特征在于，包括采集待测样品以及对样品进行预处理、一步法反转录聚合酶链式反应检测、快速间接酶联免疫吸附法检测和快速双抗体夹心酶联免疫吸附法检测；所述待测样品为组织或污染标本，选取鼠尾或鼠背部静脉血液、唾液、粪便、鼠笼架表面擦拭物和鼠笼内饮用水一种或几种；所述样品预处理方法为：收集样品，加入脱氧核糖核酸酶Ⅰ处理，加入磷酸盐缓冲液悬浮，静置20分钟，3000g离心1-20分钟，取上清；所述一步法反转录聚合酶链式反应检测用于检测鼠肝炎病毒核酸；所述快速间接酶联免疫吸附法检测用于检测鼠肝炎病毒的表面蛋白抗原；所述快速双抗体夹心酶联免疫吸附法用于检测待测样品中鼠体内自身产生的鼠肝炎病毒抗体。 
9.一种利用权利要求1–7任一项所述的复合型试剂盒在鼠肝炎病毒检测中的应用。 
10.一种利用权利要求8所述的复合型试剂盒检测方法在致病微生物检测中的应用。 
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