JP4278174B2 - Ｈｉｖ−１のｏグループ（またはサブグループ）レトロウイルス性抗原のヌクレオチド配列 - Google Patents
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Description
本発明は、ヌクレオチド配列の発現、または化学合成（例えば、Applied Biosystemsブランドの合成機を使用したもの）により、得られる抗原であって、HIV-1グル−プ（またはサブグル−プ）変異体、より特にはウイルス粒子より単離することができるものに相当する抗原に関する。HIV-1ウイルスのOサブグル−プの例を挙げて、HIV-1(VAU)単離体、及びHIV-1(DUR)単離体に言及する。
本発明はまた、上記抗原により誘導される、モノクロナ−ル、またはポリクロ−ナル抗体に関する。
本発明はまた、上記したウイルスのゲノムＲＮＡに対して相補的か相同である配列を有する、クロ−ン化ＤＮＡ配列に関する。本発明は更に上記のクロ−ン化ＤＮＡ配列を調製するための方法に関する。本発明は更に上記したクロ−ン化ＤＮＡ配列によりコ−ドされるアミノ酸配列を含んだポリペプチドに関する。
更に本発明は、上記した抗原を、ある種のAIDSの形態にある危険な状態の人における、in vitroでの検出に適用することと、前記の人の一部に対しては、このレトロウイルスに対する免疫原性組成物とワクチン用組成物の産生へ適用することに関する。同様に本発明は、同じ目的のための上記した抗体の適用に関し、また、その目的の一部のため、ヒトAIDSに対する医薬品の活性素の産生への適用にも関する。
本発明はまた、クロ−ン化したＤＮＡ配列と、遺伝子増幅用プライマまたはプロ−ブとしての上記配列に由来するポリペプチドの、診断キット中での適用に関する。
本発明は更に、化学合成、または組み換え宿主細胞内での発現によって得られる抗原性組成物であって、これにより、HIV-1、またはHIV-2のサブタイプに関わらず、HIV型のヒトレトロウイルスによる感染の診断が可能になるものに関する。このような組成物は、HIV-1、HIV-2、HIV-1(DUR)、及びHIV-1(VAU)ウイルス、または同様の免疫原性特徴を有する抗原性ペプチドの変異体に共通する抗原性ペプチドより選択した、少なくとも一つのペプチドを具備している。
本発明は更に、HIV-1型のヒトレトロウイルス、より特にはHIV-1、Mグル−プ、HIV-2、またはOグル−プ（またはサブグル−プ）のHIV-1による感染の特異的診断を可能にする組成物であって、HIV-1ウイルスに特異的な抗原性ペプチド、HIV-2ウイルスに特異的な抗原性ペプチド、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）に特異的な抗原性ペプチド、または同様の免疫原性特徴を有するこれらの抗原性ペプチドの変異体の少なくとも一つを具備している組成物に向けれれている。より特には、上記抗原性ペプチドは、HIV-1のMグル−プと、HIV-2と、HIV-1のOグル−プ（サブグル−プ）のウイルスのエンベロ−プタンパク質に由来している。
本発明は更には、従来技術のペプチドでは必ずしも検出することができなかった抗HIV抗体の検出を可能にするペプチドに向けられていて、これは特には新規のHIV-1株であるHIV-1DURの発見に基づいている。それに対する抗血清は、必ずしも、現在使用されているようなHIVのコンセンサスペプチドとの反応性を有しているわけではない。「HIVのコンセンサス」という用語は、単離体間で保存されている領域を意味し、この証明は診断試薬の設計にとって必須であり、またこれが変異すると抗ウイルス医薬に対する抵抗性が付与される。本願で使用する「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドとポリペプチドの両方を意味する。
従来技術
LAS及びAIDSの進展の起因である２つのタイプのヒト免疫不全症ウイルス（HIV）が単離されていて、また特徴付けられている。LAV-1、またはHIV-1として知られる第一のウイルスは、単離されていて、GB特許出願8324,800、及び特許出願EP 84401,834（1984年09月14日）二記載されている。このウイルスはまた、エフ.バ−レ−シノッシ（F.Barre-Sinoussi）らにより記載されている（Science,1983,220:868-871）。
２型のHIVレトロウイルスは別のクラスに属し、１型のHIVレトロウイルスとの免疫原性の関係は非常に限られている。HIV-2レトロウイルスは、ヨ−ロッパ特許出願番号、87,400,151,4（発行番号は239,425）に記載されている。
HIV-1レトロウイルスは最も一般的であり、世界中の複数の地域では主要な存在となっている。HIV-2レトロウイルスに関しては、西アフリカではよく見られるものであるが、グレズ（Grez）らにより、最近になってこの地域から外への伝播が報告されている（J.Virol.,68:2161-2168）。
１型及び２型のヒト免疫不全症ウイルスはもちろん、ヒト以外の霊長類ウイルスを具備した、霊長類の免疫不全症レンチウイルス全体は、そのサイズ及び複雑さにおいて増大している。これらのウイルスで最も一般的なHIV-1は、現在、全世界的に流行しており、公衆衛生の主要な問題となっている。このウイルスの同定と分子的特徴付けのすぐ後で、このウイルスは非常に多様性があることが認識され、現在では幾つかのサブタイプを具備している（Myers,1994,Louwagie,et al.,1993,Louwagie et al.,1992,Myers G.1994“HIV-1 Subtypes and phylogenetics trees：Human Retrovirus and AIDS；Myers,G.,Korber,B.,Wain-Hobson,S.,Smith,R.F.and Pavlakis,G.N.,Eds.Los Alamos National Laboratory,Los Alamos,NM.III-2-III-9）。このサブタイプの分化は主に、gagとenv遺伝子の多様性に基づいている。少なくとも６つのサブタイプが同定されていて、AからFと命名されているが、幾つかは、HIV-1の単離体に関して進行中の世界的な集中的調査より出現する可能性がある。これらの種々のサブタイプはそれぞれ、スタ−系統樹と呼ばれている系統樹において等距離であることが判明していて、種々のHIV-1サブタイプは共通の祖先より同調して進化及び分化したことを示唆している。
最近、HIV-1に関するこのグル−プの２つの別個のウイルスが単離されて特徴付けされた。この２つのウイルスは、西中央アフリカのカメル−ン在住の患者より得られた（Gurter et al.,1994,Vanden Heasevelde et al.,1994）。これらの配列、より特にはそのenv（エンベロ−プ）遺伝子は、このウイルスがHIV-1関連ウイルス（HIV-1のOグル−プと呼ばれるもの）の別個の範疇に属することを明らかに示している（Nkengasong et la.,1993）。
しかしながら、HIV-1関連ウイルスのこのグル−プ内での単離体の多様性は知られておらず、またはアフリカから外への伝播も報告されてはいない。
HIV-1の血清学的試験における一般的な制約は、疑似陽性結果と疑似陰性結果の両方を避けることであり、また同時に、以前の試験で可能であった、陽性血清の検出における感度を保持するか、または改善することも制約である。
「env」遺伝子に必然的に由来する、コンセンサスペプチド（群）の使用に基づく試験は、HIV-1-O変異体の発見が、疑似陰性結果の可能性を明るみに出されるまでは、最も理想的な解決であると認識されていた（Genomic cloning and complete sequence analysis of a highly divergent African human immunodeficiency virus isolate.J.Virol.1994;68:1586-96;a new subtype of human immunodeficiency virus type 1（MPV-5180）from Cameroon.J.Virol.1994;68:1581-85）。
「env」ペプチド抗原との反応性が、ある種の試験ではないのに、患者において、AIDSの臨床的特徴やそれより前に起きるリンパ節腫脹症候群が見られるのは、現在ではHIV-1-Oグル−プによるとされることがしばしばある（HIV-1／HIV-2 seronegativity in HIV-1 subtype O infected patients,Lancet 1994;343:1393-94;New HIV-1 subtype in Switzerland.Lancet 1994;344:270-271）。
発明の記載
本発明の目的は、診断実験室に対して、方法、特には特異的ペプチドであって、これまでは検出されにくかった抗HIV-1抗体の検出を可能にするものを提供することにある。本発明は更に、「疑似陰性結果」の可能性を避けるための、HIV-1(DUR)のペプチドと、他のHIV群からの、それに対応したペプチドとの混合物に関する。
本発明は更には、生物学的試料中の、HIV-1-Mタイプレトロウイルスに特徴的な抗体と、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）レトロウイルスの検出と、それらの間での区別をつけるための方法に関する。
本発明は、在カメル−ンの陽性血清の女性であって、ウェスタ−ンブロッティング技術で確認された複数の試験中において、非定型な血清学的反応性を示した女性における観察より由来している。
この非定形の血清学的反応性を説明するため、特には、Oタイプに対して修飾されてさえある、ある種の第三世代試験に対する反応性の欠如を説明するため、発明者らは、このHIV-1(DUR)株のゲノムのある特定の部分、より特異的にはGAGとENV遺伝子の配列を決定することに興味を抱いた。
しかしながら、Mグル−プ由来のプライマと、Oグル−プの既知のプライマとを用いたPCRによる遺伝子増幅は、gp120のVP3ル−プをコ−ドしている部分と、gp41の免疫優性領域に対しては、うまくいかなかった。GAG領域のみが、従来技術の既知のプライマを使用して増幅することが可能であった（Loussert-Ajaka I,Lancet 1994;343:1393）。本発明の別の目的は、この問題を解決するプライマを決定することにある。
リンパ球ＤＮＡより、糖タンパク質gp41とgp120の部分配列を、カプシドタンパク質（GAG遺伝子）とともに決定し、このHIV-1DUR株が、その一部に関してHIV-1−Oグル−プに属し、また、特にはgp41とgp120とに関してはMグル−プとはかなり異なっていることが示された。
故に、特にHIV-1(DUR)のGAG配列に関して、Mグル−プの同じ領域のコンセンサス配列とは異なっている、Oグル−プ中のコンセンサス配列の存在を、幾つかの領域に証明することが可能であった。
HIV-1(DUR)のGAG、gp４１、gp１２０をコ−ドする配列のクロ−ニングは、PST1部位を有する、Bluescript（登録商標）を利用して行った。増幅産物は、T3及びT7ユニバ−サルプライマを使用した標準的な手法でクロ−ニングするか、または先立つ（preceding）増幅のプライマを利用して直接的に配列を決定した。次いで配列を、アプライド・バイオシステムズの373A自動配列決定機（EDGD Montigny le Bretonneux,France）を利用して決定した。
ヨ−ロッパ以外を旅行したことがなく、1992年にAIDSで死亡したフランス人患者より得られた、Oグル−プ単離体であるHIV-1(VAU)のenv遺伝子を、発明者らは本発明の面において単離して、配列を決定した。そのエンベロ−プ配列によると、HIV-1(VAU)は、最近特徴付けられた二つのカメル−ンウイルスである、HIV-1ANT、及びHIV-1MVP5180に関連している。env配列の系統樹的分析により、３つのウイルスが、以後本願ではHIV-1のOグル−プと呼ぶ、一つの独立したグル−プを構成していることが明らかになった。この患者からHIV-1(VAU)を単離したことはまた、アフリカ以外でHIV-1のOグル−プの、ある程度の広がりが起きていることを示している。
HIV-1(VAU)ウイルスの単離
HIV-1(VAU)は、1992年に４１歳のフランス人のAIDS患者より単離された。この患者は、1986年に、子宮頚部の癌に関連した重度のロイコ好中球減少症（leuconeutropenia）を発症している。しかしながらこの患者は次第に、日和見感染の症状を示し、循環しているCD4+のＴ細胞の数が減少して、1992年にAIDSで死亡した。抗−HIV-1抗体は、ELISA（Elavia,Sanofi Diagnositics Pasteur and Abbott test）により、1990年に最初に検出された。
ヨ−ロッパ以外を旅行したことのない該患者は、静脈性の医薬を使用したことがなく、また如何なる輸血もされていなかった。アフリカ系の性交パ−トナ−は、全く同定されていない。この患者は、1971年に健常な子供を出産しているが、1980年に出生した男子は、新生児性のAIDSを強く示唆する、症状を発症した後に、１歳で死亡した。該患者の三番目の子供は、1983年に出生しており、患者の配偶者（男）は現在も健常であって、感染していない。
このウイルスの単離は、次のようにして行った。患者のPBMC（末梢血リンパ球）に存在するCD8+細胞をIOT8抗体（Immunotech）でコ−ティングされたビ−ズを使用して除去する。残りのPBMCをPHAで刺激し、次いで健常なドナ−より得て、PHAで刺激済みのCD8枯渇済みPBMCと共培養した。共培養中のウイルス増殖を、上清中の逆転写（RT）活性をアッセイすることと、HIV-1のp24のELISA試験（Dupont de Nemoursにより販売の、診断キット）によりモニタ−した。初期の共培養より得られたウイルスを、CD8-枯渇済み、及びPHA刺激済みのPBMC培養で、継代を数回行った。MT4細胞（Harada,et al.,1985）、及びCEM細胞（Rey et al.,1989）はもちろん、Hela-CD4-LTRLacZ細胞株P4-2（Clavel and Charneau 1994）が含まれる形質転換細胞株の、HIV-1(VAU)による感染を幾度か試みた。
HIV-1(VAU)の生物学的特徴付け
患者のCD8-枯渇済み、PHA刺激済みPBMCと、健常なドナ−からの同様の細胞との共培養後２週間で、培養上清中のRT活性のピ−クを示して、ウイルス産生が検出された。次いでこのウイルスをCD8-枯渇済み、PHA刺激済みPBMCを使用して、連続した継代を行うことができた。図１においてプレ−トAは、HIV-1(VAU)の、感染済みPBMC培養上清中での産生を表し、これはRTアッセイ（黒丸）と、HIV-1p24捕獲ELISA（中抜きの丸）とで確認した。HIV-1のp24の濃度は、ng/mlで表され、RT活性はcpm/μlで表されている。プレ−トBでは、同じ実験を、AIDS患者からの標準的なHIV-1初代分離体で行った。
HIV-1(VAU)の増殖は、RTアッセイにより容易に検出できるが、HIV-1p24 ELISAによる、培養上清中のウイルス検出は、実質的に感度がよくない。図１は、RT、またはp24でアッセイしたときの、HIV-1(VAU)、またはAIDS患者からの初代HIV-1単離体での、PBMCの増殖性感染の特徴の比較を示している。アッセイ上清中のRT活性のアッセイで決定した、等量の粒子に対しては、他のHIV-1単離体の場合に比べてHIV-1(VAU)の場合に、約２５分の１のp24が検出された。この差異は、ELISAプレ−トのコ−ティングに使用される、HIV-1p24に特異的なモノクロ−ナル抗体には、HIV-1(VAU)のgag産物に対する弱い親和性しかないという事実による可能性がある。
HIV-1に感受性である、形質転換済みのヒトＴ細胞株で、HIV-1(VAU)を繁殖させる試みが幾つか行なわれたが、成功しなかった。特に、MT4細胞、またはCEM細胞の何れかと、HIV-1(VAU)感染済みPBMCとの間の共培養を行っても、ウイルスは繁殖しなかった。さらにこのウイルスは、tat遺伝子で誘導可能なlacZ遺伝子を有する、CD4+HeLa細胞（P4-2）を感染することができないことも判明した（Clavel and Charneu 1994）。同様に、HIV-1(VAU)の複製も、複数のチンパンジ−から由来の、活性化した末梢血リンパ球で検出することができなかった。
以下に詳細に記載する、HIV-1(VAU)のエンベロ−プ配列の分析、及び最近記載された２つのカメル−ン単離体との比較により、３つのウイルス全てはHIV-1関連ウイルスの同じグル−プに属することが示されている。更に、この比較により、該ウイルスの３つの変異体はそれぞれ、系統樹でほぼ等しく離れていることが示されている。結果的に、３つのウイルス変異体のそれぞれは、それ自身で、現在、Oグル−プと呼ばれているグル−プの内の、異なるサブタイプを構成している。このグル−プは、現在までに同定されていて、発明者らがMグル−プと本願で呼んでいる、そのほかのHIV-1単離体のグル−プとは異なっている。
この新規のグル−プの出現は、その起源に関しての疑問を投げかけている：Oグル−プはMグル−プウイルスより発生したのか、（またはこれとは逆か？）、あるいはそれぞれのグル−プは異なる歴史を有するのか？。Mグル−プとOグル−プの両方に関しては、同様の内部分岐の特徴を有しており、それぞれは、ヒトの異なるポピュレ−ションで、分岐した異なるウイルス祖先に相当していると、発明者らは考えている。現時点で入手可能な系統学的、及びウイルス学的デ−タによって、上記の２つのグル−プのそれぞれが、自然にヒトに影響したのか、それとも他の種よりヒトに導入されたのかどうかを調べることはできない。ヒト以外の霊長類に存在する、HIV-1と同様の唯一のウイルスは、明らかに自然的に感染したチンパンジ−より単離した、SIVCPZGAB単離体（Huet et al.,1990）であるが、これは明らかにMグル−プ、及びOグル−プからも異なっていて、これに相当するものはヒトでは発見されていない。HIV-1(VAU)のチンパンジ−リンパ球での複製が成功していない限り、Oグル−プのウイルスが最近になってチンパンジ−のウイルスより進化したとは考えにくい。
Mグル−プよりも１５から２０年後になって、現在のみに、Oグル−プの流行が現れたのであろうか？３つの可能な説明がある。第一には、Oグル−プウイルスの祖先の、ヒトへの導入は、Mグル−プのものよりもより最近であると考えられる。第二には、それぞれの起源の地域では社会的条件が異なっていたので、Mグル−プはOグル−プよりも速く伝播することができた。そして第三には、Oグル−プウイルスは、Mグル−プに比べてその伝播能力が低かった。このような性質は、感染患者でのより少ないウイルス負荷が低減した伝播性と関連しているHIV-2の全世界的伝播が顕著に起きていないことを説明すると、提案されている（De Cock et al.,1993）。この点に関して、HIV-1のOグル−プに感染した患者でのウイルス負荷に関するデ−タは入手できないが、これらのウイルスの病原性は、HIV-1のものとは異なっているとはいえないようである。HIV-1(VAU)が単離された患者は、HIV-1MVP5180Oグル−プ単離体が得られた患者のようにして、死亡した。
しかしながら、HIV-1(VAU)患者の自然な感染歴はいまだ不明であるが、AIDSに似た症候群の第二子の死亡日から示唆されるように、この患者は1980以前に感染したという幾つかの兆候がある。
本発明は、図６に記載の配列で、配列認識番号５にも記載の、「vau」とよばれる配列を具備したenv遺伝子によりコ−ドされる構造タンパク質と同等の免疫学的特徴を有する構造タンパク質を有する、HIV-1(VAU)ウイルスの核酸配列の如何なる変異体、またはOグル−プの同等の、如何なるウイルスに関する。
本発明は更に、本発明による抗原、あるいは本発明による抗原を、一方において、一つ以上のHIV-1のOグル−プウイルス若しくはそのほかの変異体ウイルスと、また他方において、一つ以上の、HIV-2、及び／またはHIV-1、に由来する抽出物と組み合わした混合物の何れかを含む組成物であって、該組成物が、適宜標識されている、組成物に関する。如何なるタイプの適切な標識（酵素性、蛍光性、放射性等）も使用することが可能である。
核酸
本発明は、ＤＮＡ、またはＤＮＡ断片に関し、特にはPCRやそのほかの遺伝子増幅法に使用可能な、ＲＮＡ、cDNA、またはプライマ由来の、クロ−ン化したＤＮＡとＤＮＡ断片で、HIV-1(VAU)レトロウイルスのＲＮＡ、またはＤＮＡ由来のものに関する。本発明は、より特異的には、等価なＤＮＡ全てに関し、特にはHIV-1(VAU)ＤＮＡ、特には図６に記載され、「vau」と呼ばれている配列に相当する配列を具備したHIV-1(VAU)株のenv領域をコ−ドする配列と、相同な配列を有するＤＮＡに関する。HIV-1のMグル−プとの相同性は少なくとも５０％、好ましくは７０％、更に有益には９０％である。慨して本発明は、HIV-1のOグル−プのレトロウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズすることができる、等価なＤＮＡ（またはＲＮＡ）に関する。
本発明は更に上記したＤＮＡ配列に相当する、ＲＮＡ配列に関する。
本発明は更に、配列認識番号７に記載の配列か、配列認識番号７の配列にハイブリダイズする配列を具備した、HIV-1(VAU)ウイルスのインテグラ−ゼ遺伝子に関する。本発明はまた、上記のＤＮＡに相当するＲＮＡに関する。
本発明の主題はまた、上記したＤＮＡ、またはＤＮＡ断片にコ−ドされるペプチド、またはポリペプチドである。
VAU配列あるいはHIV-1(VAU)ウイルスのインテグラ−ゼ遺伝子、特には少なくとも９つのヌクレオチドを具備したオリゴヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドは、PCR技術やそのほかの遺伝子増幅技術により、生物学的試料中、培養細胞中、または細胞抽出物中の、HIV-1のOグル−プウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出に使用することが可能である。これらの配列は遺伝子増幅用のプライマとして、または遺伝子増幅産物の特異的な検出用のプロ−ブの何れかに使用することが可能である。さらにハイブリダイゼーションプロ−ブとして利用されることが可能なものには、増幅産物、またはそれに相当する、化学合成（Applied Biosystems）により得られる合成配列がある。
本発明はまた、ハイブリダイゼーション反応にプロ−ブとして使用可能で、高厳密度条件下でのHIV-1(VAU)変異体のゲノムの一部との反応を許容する、少なくとも１００ヌクレオチドの、如何なる断片をも含んでいる。
HIV-1(VAU)env遺伝子のクロ−ニングと配列決定
HIV-1(VAU)ＤＮＡに関する、初回のPCR増幅に対しては、全ＤＮＡをHIV-1(VAU)感染PBMCより抽出し、以下の縮重したプライマを利用して、po1遺伝子のセグメント（インテグラ−ゼ領域）を増幅した：
反応液は、５０mM KCl、１０mMトリス−HCl（pH8.9）、1.5mM MgCl2、0.1mMゲラチン、0.2mM dNTP、１単位のTaqポリメラ−ゼ（Amersham）を含有している。PCRは、９２℃１０秒、５０℃１分、７２℃４０秒、を４３回の熱サイクルで実行した。
得られた増幅産物をpBluescriptベクタにクロ−ニングして、ph4クロ−ンを作成し、1994年10月20日にCNCMへ、番号I-1486の下に寄託し、次いでこれをプロ−ブとして使用して、HIV-1(VAU)感染細胞より得られ、またEcoRIで消化済みの、低分子量ＤＮＡのラムダライブラリ−のスクリ−ニングを行った。簡潔にいうと、HIV-1(VAU)感染済みPBMCを、PHAで刺激済み且つ、CD8+枯渇済みの細胞と２４時間共培養し、その後で高い細胞病変効果（CPE）が見られた。次いで低分子量ＤＮＡをハ−トの方法（Hirt,1967）により抽出して、酵素EcoRIで消化した。このＤＮＡに対して行った、以前のサザンブロット分析では実際に、HIV-1(VAU)ゲノムにはただ一つのEcoRI部位があることが示されており、全ウイルスゲノムを表す、非インテグレ−ト型の環状ＤＮＡ種のクロ−ニングが可能である。得られる消化産物をアガロ−スゲル電気泳動にかけて、約８−１２kbのサイズのＤＮＡのポピュレ−ションを精製して、EcoRIで消化済みのラムダZap ＤＮＡ（Stratagene）に連結した。カプシド形成後、プレ−ティングと、32Pで標識したph4 ＤＮＡでのハイブリダイゼーションによるスクリ−ニングで、クロ−ン、λH34が陽性として同定されて、増幅にかけられた。EcoRI挿入物を精製して、超音波処理し、「ショットガン」技術により、酵素SmaでI消化済みの、リン酸塩処理済みベクタM13mp18内でクロ−ニングした。得られた１５０クロ−ンを373A ＤＮＡ配列決定機（Applied Biosystems）で配列決定し、得られた配列をウィスコンシンGCG ＤＮＡ分析パッケ−ジを使用して単一の配列に組み立てた。
この配列を分析して、多くのナンセンスコドンを、全てのタンパク質読み取り枠内に見出したが、これは過度に変異したゲノムを強く示唆している（Vartanian,et al.,1991）。この配列は不安定であるため、結果的にはHIV-1(VAU)感染済みPBMC由来の全ＤＮＡと、λH３４配列より由来した以下のオリゴヌクレオチドプライマを使用して、PCRにより、HIV-1(VAU)のenv遺伝子を増幅させた：
PCR増幅を、９２℃１５秒、５２℃１分、６０℃２分、７２℃２分、を３５回の熱サイクルにより行った。サイズが3.5kbの、得られた増幅産物をM13mp18ベクタへクロ−ニングして、連続反応により、すなわちM13ユニバ−サルシ−ケンシングプライマを一回目に使用し、次いで上流配列より推定したプライマを使用して、配列決定を行った。ヌクレオチドとペプチドの配列分析は、ウィスコンシンGCG ＤＮＡ分析パッケ−ジを使用して行った。HIV-1(VAU)のenv遺伝子は、シグナルペプチドを含む、全８７７アミノ酸をコ−ドしている。HIV-1(VAU)のenv遺伝子のヌクレオチド配列は、配列認識番号５の配列に相当している（図３参照）。
プロ−ブとしての核酸の利用
本発明はまた当然のこととして、HIV-1(VAU)ウイルスのキャリア−であることが疑われている患者に由来する、血清試料、その他の生物学的液体、または組織中に、HIV-1(VAU)ウイルスが存在すること、あるいはその逆を検出するために、ＤＮＡ、cDNA、若しくはその断片、または組み換えプラスミド、若しくはその断片を含んだ、他の等価なベクタのいずれかをプロ−ブとして利用することにも関している。これらのプロ−ブは、適宜標識されている（放射性、酵素性、または蛍光性のような標識）。HIV-1(VAU)ウイルス、またはHIV-1(VAU)の変異体を検出するための方法を実行するために極めて有益であるプロ−ブは、HIV-1(VAU)ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡ全体、またはその一部、あるいは特には種々のクロ−ンに含まれる断片を具備することを特徴としていてもよい。env領域の全て、または一部を含む、HIV-1(VAU)のcDNA断片について、より特異的に言及する。
HIV-1(VAU)ウイルスの検出のためのこの方法、または診断キットにおいて使用されるプロ−ブは、すでに記載されているプロ−ブのみには決して限定されない。該プロ−ブは、HIV-1(VAU)ウイルス、HIV-1(VAU)の変異体、または構造的に同等のウイルス、の何れかのゲノム由来のヌクレオチド配列を具備しているが、ただしAIDSの可能性のある人に由来する生物学的液体を使用して、HIV-1(VAU)のＤＮＡ、またはＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより、HIV-1のOグル−プウイルス、特にはHIV-1(VAU)を検出することが可能なものでなくてはならない。
特に有益なのは、HIV-1とハイブリダイズしたときに、Oグル−プに属するHIV-1と強く反応し、Mグル−プに属するHIV-1と弱く反応するプロ−ブである。限定するためのものではない例を挙げると、HIV-1(VAU)ウイルスのインテグラ−ゼ遺伝子配列（配列認識番号７）より構築されたプロ−ブは、特許EP 178 978等に記載されているハイブリダイゼーション条件下でHIV-1とハイブリダイズすると、Oグル−プのHIVとは強く反応し、Mグル−プのHIVとは弱く反応する。
検出はすでに知られている方法自体で行えるが、特には次のようである：
まずプロ−ブを、生物学的液体（例えば髄液、唾液等）に含まれる細胞より由来した核酸、または上記の液体自体と接触させることにより行う。ただし、後者の場合には、当該核酸は、上記プロ−ブとのハイブリダイゼーションを許容する条件下で、上記プロ−ブとハイブリダイゼーションするようにされている。そして、産生するかもしれないハイブリダイゼーションを検出する。
ハイブリダイゼーション反応が関わる、上記の診断はまた、それぞれHIV-1(VAU)、HIV-1、及びHIV-2より由来したプロ−ブの混合物を使用して行うことができる。ただし、望むHIVウイルスのタイプを区別する必要は、必ずしもない。
本発明の主題はまた、HIV-1のエンベロ−プタンパク質をコ−ドした配列、またはインテグラ−ゼをコ−ドした配列を含む、発現ベクタでもある。
本発明はHIV-1(VAU)ウイルスの存在、またはその逆を、HIV-1(VAU)ウイルスのキャリア−であることが疑われている患者より由来した血清試料中、またはそのほかの生物学的液体や組織中に検出するための組成物を具備している。これらの組成物は、HIV-1(VAU)ウイルスゲノム、特にはHIV-1(VAU)ウイルス、若しくはHIV-1(VAU)の変異体のenvタンパク質をコ−ドする領域、若しくはその一部を含んだＤＮＡ断片より得られるか、または誘導されるヌクレオチド配列に由来したプロ−ブを、少なくとも一つ具備することを特徴とする。
有益には、上記した組成物はまた、HIV-1、またはHIV-2に由来する配列から得られるプロ−ブを具備している。
そのほかの診断組成物は、Oサブグル−プのレトロウイルス、またはこのレトロウイルスの変異体を遺伝子増幅する際に使用することが可能な、本発明のプライマを具備する。
抗原、特にはタンパク質及び糖タンパク質
本発明は、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）のレトロウイルス性タンパク質、または該タンパク質の少なくとも一部を具備した天然若しくは合成の、ペプチド、若しくはポリペプチドであって、HIV-1のOグル−プのVAU株、またはHIV-1のOグル−プのDUR株での感染後に得られる血清より単離することが可能な抗体によって認識されうるものに関する。
本発明は、HIV-1(VAU)レトロウイルスの外部エンベロ−プタンパク質で、配列認識番号５に相当する配列を具備した遺伝子でコ−ドされているものに関する。本発明の好ましい態様では、このタンパク質は更に、配列認識番号６に相当し、図３に記載され、アミノ酸残基の１から５２６を具備したアミノ酸配列を具備することで特徴付けられる。本発明の主題はまた、如何なるポリペプチド、または該配列より由来の変異体であって、HIV-1(VAU)ウイルスにより誘導される抗体により認識されうるエピト−プを有するものでもある。
上記のタンパク質は糖付加型、または非糖付加型の形態で得られる。
本発明の主題はまた、配列認識番号８に相当し、図３に記載され、アミノ酸残基５２７から８７７の間のアミノ酸を具備した、エンベロ−プ膜貫通型タンパク質でもある。この膜貫通型タンパク質は、本発明の範囲内においては、糖付加型、または非糖付加型である。
本発明は、HIV-1(VAU)ゲノムのコ−ド配列の発現により得られ、HIV-1(VAU)のものと同等の免疫学的特徴を有する、全ての抗原、特にはタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに関する。該抗原は、本発明の範囲内においては、同等であるといわれる。ただしこれらは、同じ抗体、特にはHIV-1(VAU)に感染した患者より得られた血清より単離されうる抗体により認識されうるものであること。
特には、本発明の主題は、化学的に合成されるペプチド、またはポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、図３に表示の配列であるか、または同等のペプチド若しくはポリペプチドである、HIV-1(VAU)エンベロ−プタンパク質のものに含まれるものである。
前記の同等なペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または糖タンパク質の中には、由来する元の抗原との免疫学的交差反応性があるかぎり、化学的合成、または遺伝子工学的に調製される上記の抗原の断片、またはペプチドが含まれるべきである。言い換えると、本発明は、上記した抗原のエピト−プに相当するか同等であるエピト−プを有し、また同じ抗体により認識されうる、どのようなペプチド、またはポリペプチドにも関する。上記したポリペプチド、または抗原をコ−ドするＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列の発現産物は、前記の後者のタイプのポリペプチドの一部を形成している。
より特には、HIV-1(VAU)ウイルスに由来するか、または遺伝子工学的、若しくは通常の化学合成により産生され、本発明の前後関係において非常に興味がもたれる上記抗原は、本発明のHIV-1(VAU)ウイルスと、HIV-1及びHIV-2のグル−プのウイルスとを明確に区別することを可能にする、抗原である。この点に関して、HIV-1(VAU)ウイルスのエンベロ−プタンパク質レベルにおいてはもちろん、PMタンパク質の外部の免疫優性エピト−プのレベルにおいても、かなりの差異が見られている。gag及びpolタンパク質は、エンベロ−プタンパク質よりも、HIV-1とのより高い類似度を示しているようである。
本発明は更に、HIV-1(VAU)のエンベロ−プの膜貫通型の糖タンパク質に免疫優性領域と同一であるペプチド、またはポリペプチドに関する。この領域は図３に表示されている。
この領域の好ましいポリペプチドは例えば、配列CKNRLICを含むか、またはこの配列に相当したものを含むものである。これらは配列
RLLALETFIQNWWLLNLWGCKNRLICに相当しているか、この配列を具備したペプチド、またはポリペプチドであってもよい。
以下で「vau」という名前で呼ばれる、別の好ましいペプチドは以下の配列に相当するか、またはこの配列、若しくはこの配列の一部であって、HIV-1(VAU)レトロウイルスのRARLLALETFIQNQQLLNLWGCKNRLICYTSVKWNKTに対する抗体により認識されうるものを具備している。
この配列のポリペプチド変異体は例えば、HIV-1(MVP5180)、及びHIV-1(ANT70)単離体のポリペプチドに対して図４に表示されているものである。これらのポリペプチドはまた、例えばアミノ酸残基による保存性の置換のような、挿入、及び／または欠失、及び／または置換による、先行物に由来するものであってもよい。
本発明は、照会番号I-1542の下、1995年2月23日にCNCMに寄託されたHIV-1-O DURウイルス由来のペプチド、あるいは、アミノ酸の置換、欠失、または付加により、配列が上記のものとは異なっているペプチドであるが、上記のものの抗原性の特徴を保持しているペプチドに関する。
本発明の範囲に含まれるその他のペプチドを、以下に定義している。
故に、本発明の好ましいペプチドは、図８に表示のGAG配列中か、またはGAG配列と免疫学的に同等な配列でHIV-1-O DURウイルスの変異体由来のものの中に含まれる、少なくとも４つの連続したアミノ酸を有するペプチドであって、該免疫学的に同等な配列が、図８のGAG配列に含まれる配列、AHPQQA,LWTTRAGNPのうち少なくとも一つをも特異的に認識する抗体により認識されるものである、ペプチドである。
好ましくは、このペプチドは、アミノ酸配列が以下の配列、
SPRTLNAWVKAVEEKAFNPEIIPMFMALSEGA（１）、
MLNAIGGHQGALQVLKEVIN（２）、
GPLPPGQIREPTGSDIAGTTSTQQEQI（３）、
IPVGDIYRKWIVLGLNKMVKMYSPVSILDI（４）、
QGPKEPFRDYVDRFYKTKLAE（５）、
AHPQQA（５ａ）、
LWTTRAGNP（５ｂ）、
のうちの一つか、
相当する免疫学的に同等の配列
の何れかの中に含まれるペプチドであって、このペプチドは、上記配列のうちの一つの、少なくとも４つの連続したアミノ酸配列を含んでいる、ペプチドからなっている。
また好ましくは、このペプチドは、アミノ酸配列が以下の配列、
SPRTLNAWVK（６）、
GSDIAGTTST（7）、
QGPKEPFRDYVDRF（8）、
のうち一つか、または
相当する免疫学的に同等の配列
の何れかに含まれるペプチドであって、このペプチドは、上記配列のうちの一つの、少なくとも４つの連続したアミノ酸配列を含んでいる、ペプチドからなっている。
本発明において特に好ましいペプチドは、
アミノ酸配列NPEI（9）、または
アミノ酸配列AVEEKAFNPEIIPMFM（10）を含むペプチドであって、より特には、アミノ酸配列が、
IGGHQGALQ（23）、
REPTGSDI（24）のうちの一つ、または
相当する免疫学的に同等の配列
のなかに含まれる、ペプチドであって、このペプチドは、上記配列のうちの一つの、少なくとも４つの連続したアミノ酸配列を含んでいる、ペプチドはもちろん、アミノ酸配列が以下の配列、
INDEAADWD（２５）、
または相当する免疫学的に同等の配列
の何れかの中に含まれるペプチドであって、このペプチドは、上記配列の少なくとも４つの連続するアミノ酸を含んでいる、ペプチドである
本発明は、ペプチド（２３）、（２４）、及び（２５）はもちろん、免疫学的に同等の配列をコ−ドする核酸配列だけでなく、これらの核酸配列の少なくとも一つを具備した組成物にも関する。
本発明は更に、HIV-1のMグル−プ株とHIV-1のOグル−プ株とに関する検出と区別のための、少なくとも一つの上記核酸の使用に関する。
上に定義した、HIV-1-O DURウイルス由来のペプチドはまた、本発明の範囲に含まれるが、該ペプチドは、HIV-1-O DURウイルスに由来する、図９に表示のgp120のVP3ル−プ、または相当する免疫学的に同等な配列の、少なくとも４つの連続するアミノ酸を含んでいるが、該免疫学的に同等な配列は、以下の配列、
KEIKI（12）、
EREGKGAN（13）、
CVRPGNNSVKEIKI（14）、
QIEREGKGANSR（15）、
のうち少なくとも一つをも特異的に認識する抗体により認識される。
このペプチドは好ましくは、
（a）配列CVRPGNNSVKEIKIGPMAWYSMQIEREGKGANSRTAFC（１１）、またはこの配列の一部であって少なくとも４つのアミノ酸を含むもの、の何れか、または、
（b）１以上のアミノ酸が１以上のアミノ酸で置換されていて、（a）の配列とは別個である、アミノ酸配列（ただし、当該ペプチドには、上記ペプチドに対する血清との反応性が保持されていること）；または、
（c）１以上のアミノ酸が欠失、または付加されていて、（a）または（b）とは別個である、アミノ酸配列（ただし当該ペプチドには、（a）のペプチドに対する血清との反応性が保持されていること）；または、
（d）相当する、免疫学的に同等な配列、若しくはその一部；
のうち何れかを含んでいる。
また好ましくは、このペプチドは、
配列KEIKI（１２）、または配列EREGKGAN（１３）、または配列GPMAWYSM（１６）の何れかを含んでいる。
特に好ましい方法においては、上に定義されるペプチドには、アミノ酸配列CVRPGNNSVKEIKI（14）、またはQIEREGKGANSR（15）の何れか一つが含まれる。
上に定義した、HIV-1-O DURウイルスより由来するペプチドはまた、本発明の範囲に含まれるが、該ペプチドは、その全アミノ酸配列が、HIV-1-O DURウイルスの変異体より由来する、図９に表示のgp41の免疫優性領域内の配列、または相当する免疫学的に同等の配列内に含まれる、少なくとも４つの連続するアミノ酸を含むが、該免疫学的に相同な配列は、以下の配列、
RLLALETLMQNQQL（17）、
LNLWGCRGKAICYTSVQWNETWG（18）、
CRGKAI（19）、
SVQWN（20）、
RLLALETLMONQQLLNLWGCRGKAICYTS（21）、
QNQQLLNLWGCRGKAICYTSVQWN（22）、
の少なくとも何れか一つをも特異的に認識する抗体により認識される。
このペプチドは好ましくは、配列RLLALETLMQNQQL（17）、配列LNLWGCRGKAICYTSVQWNETWG（18）、またはこのペプチド（18）の一部で以下を含むもの、を含んでいるペプチドである：
（a）配列CRGKAI（19）、またはQが、適切な場合には、K以外の異なるアミノ酸で置換された配列SVQWN（20）、あるいはこの二つの配列両方、
（b）１以上のアミノ酸が２つのアミノ酸で置換されていて、（a）の配列とは異なるアミノ酸配列（ただし当該ペプチドは、（a）のペプチドに対する血清との反応性を保持していること）、
（c）１以上のアミノ酸が欠失、または付加されていて、（a）または（b）とは異なるアミノ酸配列（ただし当該ペプチドは、（a）のペプチドに対する血清との反応性を保持していること）、または、
（d）相当する免疫学的に同等な配列、若しくはその一部。
また好ましくは、このペプチドは、以下の特徴のうち一方、または他方を有している：
・少なくとも８つのアミノ酸配列を含む、そのN末端配列は、HIV-1-LAI株のgp41の免疫優性領域内に含まれるRILAVERY配列に対して形成された抗体により免疫学的に認識されない；
・HIV-1-LAI株のSGKLICペプチドに対して形成された抗体により認識されない；
・以下の二つの配列の何れかを含んでいる：
RLLALETLMONQQLLNLWGCRGKAICYTS（21）、
QNQQLLNLWGCRGKAICYTSVQWN（22）。
VAUペプチドの合成
「連続フロ−（continuous flow）」Fmoc法を利用した、通常の固相ペプチド合成技術により、VAUペプチドを調製した。このペプチドは、Milligen9050 PEP合成機と、「Millipore」PEG PALレジンとを使用して、最初のC末端アミノ酸を置換して調製した。アミノ酸側鎖は、以下の基で保護した：アルギニンに対してはPmc；アスパラギン、グルタミン、及びシステインに対してはTrt；リジンに対してはBoc；グルタミン酸に対してはtBuエステル；セリン、スレオニン、及びチロシンに対してはtBuエ−テル。一過性のFmoc基は、DMF中の２０％ピペリジン溶液で除去した。それぞれのアミノ酸のカップリング反応は、６等量のDIPCDI及びHOBTで行った。残基の中には、特にアルギニン（１位及び２３位）、システイン（１９位及び２６位）、アスパラギン（１１位）、グルタミン（１０位、１２位、及び１３位）、アラニン（４位）、イソロイシン（９位）、及びロイシン（２位、３位、１４位、及び１５位）は、二重のカップリングが必要であった。
カップリング後、レジンを真空下で乾燥した。ペプチドを、室温で４時間K試薬による処理で支持体より開裂させた。粗ペプチドを沈殿させ、エチルエ−テルで洗浄した。産生物を高圧液体クロマトグラフィ−（HPLC:high pressure liquidchromatography）で精製した（WATERS LC PREP 4000装置、WATERS Delta Pak C18 40Ｘ100mmカ−トリッジ、流速30ml／分、アセトニトリル/0.1％TFAのグラジエント）。該ペプチドを含む画分を合わせて、ロ−タリ−エバポレ−タ−で濃縮後、凍結乾燥した。
環状化
ペプチド（0.025mM）を10mMの酢酸アンモニウム溶液に溶解した。１Ｍの水酸化アンモニウム溶液で、pHを8.5に調節した。pHは、３または４時間後に再び調節した。環状化は、HPLC（WATERS Delta Pak C18 5μカラム、アセトニトリル／0.1％TFAのグラジエント）で、２１４nm、及び２８０nmでモニタ−した。１５時間で環状化は完了した。９７−１００％の酢酸を使用して、pHを６にして、この溶液を凍結乾燥し、ついで粗ペプチドと同じ条件下で精製した。
このペプチドをHPLCと、エレクトロスプレ−技術（FISON VG Trio 2000分光器）を利用したマススペクトロスコピ−により検査した。
Fmoc:９−フルオロエニルメチルオキシカルボニル；
Pmc:８−メチルペンタン−６−スルフォニルクロマン；
Trt:トリトリル；
Boc:Tertブチルオキシカルボニル；
tBu:tertブチル；
DMF:ジメチルホルムアミド；
DIPCDI:ジイソプロピルカルボジイミド；
HOBT:１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル；
TFA:トリフルオロ酢酸
試薬K:フェノ−ル／水／チオアニソ−ル／エタンジチオ−ル/TFA；２．５ml／２．５ml／２．５ml／１．５ml／４１ml。
HIV-1(VAU)エンベロ−プタンパク質のアミノ酸と、その他のHIVの相当する配列との比較
HIV-1(VAU)に感染した患者由来の、一連の血清試料の、ウェスタ−ン−ブロット分析を図２に示してある。HIV粒子（LAV,BLOT,SANOFI DIAGNOSITIC PASTEUR）由来のタンパク質で、電気泳動により分離されたものを有してる、ニトロセルロ−スのストライプを、同じ血清試料でインキュベ−ションし、その反応性を、製造業者推奨の方法により評価した。得られた結果は以下のようであった：
ステップ１：HIV-1(VAU)患者から、1992年2月に得た血清試料と反応させた、HIV-2特異的タンパク質；
ステップ２−７：HIV-1陽性血清；
２：HIV-1(VAU)患者より、1990年11月に得た血清；
３：HIV-1(VAU)患者より、1990年12月に得た血清；
４：HIV-1(VAU)患者より、1991年2月に得た血清；
５：HIV-1(VAU)患者より、1992年2月に得た血清；
６：陰性の対照；
７：陽性の対照（HIV-1に感染した人より得た血清）。
タンパク質の名前とサイズ（kD）を余白に示した。
図３はHIV-1(VAU)のエンベロ−プのアミノ酸配列を、HIV-1-LAI参照用単離体（Wain-Hobson,et al.,1985）の相当するものと整列させたものである。シグナルペプチド、VP3ル−プ、及びgp41免疫優性エピト−プを網掛けで示した。外部エンベロ−プ糖タンパク質gp120と、膜貫通型gp41との間の開裂部位を矢印で示した。アミノ酸の間の垂直な線は完全な一致を示し、コロン（：）は高い相同性を示し、また点（.）はそれぞれのアミノ酸間での限られた相同性を示す。ウィスコンシンのGCGパッケ−ジのGAPプログラムを使用して、整列を行った。
GAPとBESTFITプログラムの元のバ−ジョン（1.0）は、ニ−ドルマンとバンシュ（Needleman and Vunsch,J.Mol.biol.48,443-453（1970））と、スミスとウォ−タ−マン（Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2;482-489（1981））の詳細な研究報告に基づき、ポ−ル・ヒバ−リ（Paul Haeberli）が記載したものである。この限定整列はポ−ル・ヒバ−リにより開発されて、バ−ジョン3.0に組み込まれた。そしてこれはフィリプ・マルケス（Philip Marquess）による単一のプログラムに融合されて、バ−ジョン4.0になった。整列中のギャップ欠失のペナルティ−は、文献（Rechid,Vingron and Argos CABIOS 5:107-113（1989））で示唆されているようにして修飾した。
図３の整列は、２、３のドメインがあちらこちらで保持されている、より高い分岐度の、数多くの領域を示している。この保持領域は、通常のHIV-1単離体でも保持されている領域にほぼ対応する（Alizon et a1.,1986,Benn et al.,1985）。分岐したドメインの中では、中和決定基とも呼ばれる（Javaherian et al.,1990,Javaherian et al.,1989,Matsushita et al.,1988）VP3ル−プが、明らかに最も分岐している（ただし、ル−プを限定している二つのシステインは保持されている）。HIV-1-LAIではGPGRAFである、ル−プのキャップ配列は、HIV-1(VAU)ではGPMAWYである。キャップのこのユニットは、カメル−ンのOグル−プ単離体（HIV(ANT70)）のものに相当しているが（Van den Heasevelde et al.,1994）、該モチ−フがGPMRWRである、その他のOグル−プ単位体（HIVMVP5180）のものとは異なっている。
エンベロ−プ全体においては、全部で２９の、可能性のあるN-糖付加部位が同定され、このうちの１３が、その他のHIV-1エンベロ−プタンパク質と比較して、保持されている。全部で１９のシステインが見られ、該タンパク質の全体の折畳み構造が保持されていることを示しているが、５つの非保持システインが見られている。
図４は種々のHIV-1単離体における、膜貫通型エンベロ−プ糖タンパク質の外部領域中の免疫優性ペプチドの、マルチプル整列を示している。配列は全て、HIV-1-LAI参照用配列と比較してある。ハイフンはHIV-1-LAIとの相同性を示す。整列は、ウィスコンシンGCGパッケ−ジのPILEUPプログラムを使用して行った。
PILEVPプログラムでは、樹状図で表示される組み立て戦略をUPGMAとよんでいて、これは代数的平均を利用した、「非偏重（unweighted）」ペア−グル−プ法を意味している（Smith,P.H.A.Sokal,R.R.（1973）Numerical Taxonomy（pp.230-234）,W.H.Freeman and Company,San Francisco,California,USA）。PILEVPでのそれぞれのペア−の整列には、ニ−ドルマンとバンシュの方法を使用した（Needleman and Wunsch,Journal of Molecular Biology 48:443-453（1970））。
図４に示されるように、TMタンパク質の外部領域の免疫優性エピト−プのアミノ酸配列は、その他のHIV-1やHIV-2の単離体のものとは、実質的に異なっている。しかしながら、HIV-1とHIV-2ウイルスの間で保存されている多くのアミノ酸は保持されていた。
ある特定のアミノ酸が、Oグル−プ間のみで保存されていることが判明したが、２６アミノ酸のペプチド中の２１位のリジン、７位のスレオニン、及び１１位のアスパラギンがそうである。HIV-1(VAU)患者由来の血清の一つ、そしておそらくはその他のOグル−プウイルスに感染した患者由来の血清によっては、通常のHIV-1エンベロ−プ抗原の検出がされないことが、上記の差異により説明がつく。全体では、HIV-1-LAIと、HIV-1(VAU)のエンベロ−プ配列の比較では、５０％の相同性が示された。HIV-1(VAU)のエンベロ−プ配列はまた、その他の代表的なHIV（報告済みで配列が決定されている、HIV-1のOグル−プの２つのメンバ−である、HIV-1ANT70、及びHIV-1MVP5180）、並びに代表的なSIVとも比較した。この分析の結果を表１に示したが、これによりHIV-1(VAU)がOグル−プに属することが確立された。HIV-1(VAU)のエンベロ−プはHIV-1ANT70のエンベロ−プとは７０％相同で、HIV-1MVP5180とは７１％相同である。
一般的なHIV-1のサブタイプのほとんどでは、エンベロ−プのレベルでの相同性は、同等であり、７４％から８０％の範囲であった。
HIV-1(VAU)、HIV-1ウイルスの系統樹中のその他のメンバ−、及び最近報告されたOグル−プ中の２つのウイルスの間の関係を、envの膜貫通領域のヌクレオチド配列を利用した、非偏重型節減（unweighted parsimony）の系統樹を構築して、分析した。この分析の結果は、図５に示してあるが、この図中の番号は、ヌクレオチドの変化の数を示してある。図５は、HIV-1(VAU)が他の２つのOグル−プとはほぼ等しく離れていることと、全体では上記の３つのウイルスがそれぞれほぼ等しく離れていることとを示している。実際には、HIV-1 MVP5180と、HIV-1(VAU)との間のヌクレオチドの変化は、分析したゲノムの断片中では１８３であり、HIV-1ANT70とHIV-1(VAU)との間では２１３である。この分岐の特徴は、その他のHIV-1のサブタイプ全てに存在するものと同等であり、二つの異なるサブタイプ間での単一のヌクレオチドの変化は１５７（サブタイプEからサブタイプF）から２１９（サブタイプAからサブタイプD）の範囲であった。
表１は、HIV-1に関連した、異なるウイルスのエンベロ−プ配列の比較である。番号は、GAPプラグラムを利用して計算した、エンベロ−プ配列間でのアミノ酸相同性の割合を示す：HIV-1 ANT70の場合には、外部エンベロ−プタンパク質のみを比較に使用した。
HIV-1(VAU)抗原を具備した組成物
慨して本発明は、生物学的試料、特にはHIV-1(VAU)、またはHIV-1(VAU)抗原の少なくとも一つに対する抗体と接触させられた人に由来する生物学的試料中での、存在をin vitroで検出するために使用可能な、如何なる組成物にも関する。この組成物は、特許出願EP 84401,834及びEP87400,1514に記載の診断技術を使用して、HIV-1のOグル−プによる感染の選択的診断に適用することが可能である。本発明の背景事情の範囲内で、HIV-1(VAU)に対して産生された抗体により認識されることが可能な抗原性決定基を具備した如何なる組成物（例えば組み換え抗原、ペプチド、またはHIV-1(VAU)のエンベロ−プの配列で定義される、化学的に合成されたペプチド）も使用可能である。この点に関して、本発明はより特には、少なくとも一つのHIV-1(VAU)エンベロ−プタンパク質を有する組成物に関する。例としては、HIV-1(VAU)のgp41タンパク質の５９０−６２０の全領域に対応する、エンベロ−プタンパク質に由来する、タンパク質、糖タンパク質、若しくはペプチド、あるいは上記領域の一部であって、ペプチド-TFIQN-または-WGCKNR-のようなHIV-1(VAU)特異的なものがあるであろう。
本発明は更に、
組み換え型、若しくは合成の、HIV-1(VAU)タンパク質、及び／または糖タンパク質、及び／またはペプチドと、
抽出、溶解、組み換え、または化学合成で得られる、HIV-1、及び／またはHIV-2、及び／または別の、HIV-1のOグル−プに由来した、タンパク質、及び／または糖タンパク質、及び／またはペプチド、及び／または
上記のタンパク質、または糖タンパク質由来であって、HIV-1、及び／またはHIV-2、及び／またはHIV-1のOグル−プにより誘導される抗体により認識されうるペプチド、とを組み合わせた組成物に関する。
診断用組成物であって、HIV-1(VAU)に対して向けられた抗体により認識されうる抗原決定基を有するもの、特にはペプチド組成物は、すでに入手可能である、HIV-1及び／またはHIV-2レトロウイルスによる感染検出用のキットまたは組成物中に含めるか、あるいはこれらと組み合わせて、キットの検出範囲をHIV-1のOグル−プにまで伸長することが可能である。
以下の例があるが、これらは限定するためのものではない：
コアタンパク質、特にはgag、pol、HIV-1及びHIV-2のタンパク質、若しくはそのペプチド、並びにHIV-1(VAU)のエンベロ−プタンパク質、若しくはそのペプチド、
HIV-1のエンベロ−プ糖タンパク質、HIV-2のエンベロ−プ糖タンパク質、及びHIV-1(VAU)のエンベロ−プ糖タンパク質、または
HIV-1タンパク質、及び／または糖タンパク質、HIV-2のタンパク質、及び／または糖タンパク質、並びにHIV-1(VAU)のエンベロ−プタンパク質、及び／または糖タンパク質、
の何れか。
HIV-1のOグル−プのウイルスに感染した患者から由来の抗体は、HIV-1のMグル−プのウイルス由来のgag、及びpol抗原と強く反応するが、Mグル−プのエンベロ−プ抗原との反応性は全くないことに注目するのは重要である。よって、本発明の組成物は、少なくとも一つの、HIV-1エンベロ−プタンパク質、若しくはペプチドを具備していて、このウイルスが確信をもって検出されるようになっていることが重要である。
このような組成物は、診断に用いると、結果的にAIDSの診断や、それに関連した症状の診断に役立ち、これはより広い病原体のスペクトラムにまで拡張される。HIV-1(VAU)エンベロ−プタンパク質、及び／または糖タンパク質のみを含む診断用組成物の使用は、それでもなお、該疾患を引き起こすかもしれないレトロウイルスの範疇の、より選択的な検出にとって有益であることはいうまでもない。
特にHIV-1(VAU)ウイルスにより引き起こされる感染の診断用の方法とキット
本発明は、AIDS、及び関連した症候群の病原体であるHIV-1ウイルスにより引き起こされる感染の、in vitroでの診断用の方法であって、診断する患者由来の血清、または生物学的液体を、HIV-1(VAU)由来のタンパク質、糖タンパク質、またはペプチドを少なくとも一つ含む組成物と接触させる工程と、可能な免疫学的反応を検出する工程とを具備した、方法に関する。このような組成物の例は上に記載してある。
好ましい方法には、例えば、免疫蛍光、またはELISA型の免疫酵素反応が関わる。検出は、直接、若しくは間接的な免疫蛍光の測定、または直接的、若しくは間接的な免疫酵素的アッセイにより影響されうる。
このような検出には、例えば、
マイクロプレ−トのウェルの中に、本発明に準じて、一定量の抽出物、または所望の抗原性組成物をいれる工程；
それぞれのウェルの中に、抗体を含むことが可能であってその存在をin vitroで検出する、希釈済み、または非希釈の血清を導入する工程；
該マイクロプレ−トをインキュベーションする工程；
適切な緩衝液でマイクロプレ−トを注意深く洗浄する工程；
該マイクロプレ−トのウェルの中に、ヒト免疫グロブリンに対する、特異的に標識した抗体を導入する工程であって、上記標識は、基質を加水分解し、後者の放射の吸収を、少なくとも決められた波長のバンドにおいて修飾することが可能なものより選択される酵素である、工程、そして、
好ましくは対照との比較において基質の加水分解の程度を測定して検出し、感染の危険性の目安、または実際の感染の事実とする、工程を具備する。
本発明はまた、以下を特に具備した、HIV-1(VAU)感染の検出用キット、またはボックス（boxes）に関する：
抽出物、より精製された画分、または上記したタイプのウイルスから派生した合成抗原（この抽出画分、または抗原は、例えば放射性、酵素性、蛍光性、若しくはその他の、標識がされている）；
ヒト免疫グロブリンに対する抗体、またはプロテインA（これは例えばアガロ−スビ−ズ、マイクロプレ−トなどのような、水に不溶の支持体に有益に固定される）；
適宜、陰性対照の検体より得た、同じ生物学的液体、若しくは細胞；
緩衝液、及び、適切であれば標識可視化基質。
本発明の主題はさらに、化学合成、または組み換えにより得られる抗原を認識する抗体の形成を誘導することが可能な、免疫原性組成物である。
血清学
HIV-1(VAU)に感染した患者由来の血清抗体が、HIV-1の抗原性調製物と反応する能力を、商業的に入手可能な種々のキット（Sanofi Diagnostic Pasteur,（Genelavai Mixt）Abbott,Wllcome,およびBehring）を利用して評価した。これらの抗体の、種々のHIV-1タンパク質との反応性を、サノフィ−診断パスツ−ル・ウェスタ−ン-ブロット・キットを製造業者推奨の方法で使用して調べた。
より正確には、患者の血清を、HIV-1特異的ELISAキットを使用して数回調べた。最初に試験されて1990年に陽性であると証明されたものは、（測定したODの、バックグラウンドODに対する比で）7.33（サノフィ−診断パスツ−ルキット使用時）、3.50（アボットキット使用時）、及び2.70（ウェルカムキット使用時）であった。HIV-1とHIV-2の両方に特異的な試薬の使用中には、1.42（ベ−リングキット使用時）、4.40（ウェルカムキット使用時）であった。
患者の血清の、異なる日における、異なるHIV-1構造タンパク質との反応性を、HIV-1 LAV BLOT免疫ブロットアッセイ（サノフィ−診断パスツ−ルで販売されている）を使用して調べた。図５に示されるように、調べた血清試料全てにおいて、envタンパク質gp160およびgp120との弱い反応性のみが見られた。しかしながら、該血清はHIV-1のgagタンパク質p55（gag前駆体）、及びp24（CA）、並びにpol産物p66（RT）、及びp34（IN）とは強く反応した。HIV-2免疫ブロッティングにより、非常に弱い反応性がgag p26に関して検出された。
これは、Oグル−プに特異的な抗体に関しての、商業的に入手可能な血清診断キットでの検出は、注意深く制御するべきであることを例示している。Oグル−プウイルスに感染した患者からの血清抗体は、Mグル−プのgag、及びpol抗原との強い交差性を示すが、それらはMグル−プのエンベロ−プ抗原とはほとんど反応しないか、全く反応しない。結果として、、Mグル−プに基づくキットの中には、上記患者のかなりの割合を検出しないものがあると推定できる。実際に、Oグル−プに感染した患者由来の、幾つかの血清を使った最近の予備的研究により、Oグル−プに特異的な抗体を検出する能力は、使用する検出キットにより、かなり異なっていることが明らかになった（Loussert-Ajaka,I.,Ly,T.D.,Chaix,M.L.,Ingrand,D.,Saragosti,S.,Courrouce,A.M.,Brun-Vezinet,F.,and Simon,F.,（1994）HIV-1／HIV-2seronegativity in HIV-1 subtype O infectedpatients）。これは、多くのOグル−プ血清の、市場で入手可能な診断キット全てとの反応性を、注意深く且つ徹底的に調べる必要があることを示唆している。
HIV-1(VAU)ウイルス由来で、組み換え、若しくは合成抗原より調製した、ポリクロ−ナル、若しくはモノクロ−ナル抗体を具備した組成物
本発明は、HIV-1(VAU)、特にはHIV-1(VAU)の抗原性エピト−プ、より特にはHIV-1(VAU)のエンベロ−プタンパク質の抗原性エピト−プを動物に接種して、該動物内で産生されうる血清に関する。本発明はより特には、それぞれの抗原、特には該ウイルスのタンパク質、または糖タンパク質に向けられたポリクロ−ナル抗体に関する。更には、種々の技術により産生されるモノクロ−ナル抗体であって、それぞれ種々のHIV-1(VAU)タンパク質、特にはHIV-1(VAU)のエンベロ−プタンパク質に向けられている抗体、より特には該タンパク質に対する抗体に関する。
上記のポリクロ−ナル、またはモノクロ−ナル抗体を、種々の適用において使用することができる。本質的には、相当するタンパク質の中和のための使用であり、またはウイルス全体の感染性の阻害のための使用でもよいであろう。例えば、生物学的調製物中の、ウイルス抗原の検出、または相当するタンパク質、及び／または糖タンパク質の精製工程（例えばアフィニティ−クロマトグラフィ−カラムでの使用）を行うのに使用してもよい。
例を挙げると、抗エンベロ−プ抗体、または抗gag抗体は、診断に使用可能な試薬であり、特にはHIV-1のOグル−プを、抗原捕獲ELISAにより検出するための試薬である。
本発明は、１以上のHIV-1(VAU)のアミノ酸配列より産生される、HIV-1(VAU)のウイルス抗原に向けられる抗体に関する。本発明のHIV-1(VAU)ウイルスの抗原性エピト−プと同等の抗原性エピト−プから、抗体を得る技術は、すでに記載されている。
当業者は、アルマ−（Ulmer et al.,1993）らにより報告済みの抗体調整用技術を使用して、本発明の抗体を調製することができるが、本発明の抗原に適応させることが可能な修飾は、当業者の知識の一部を形成する。
vauペプチドの免疫反応性の調査
抗HIV抗体のスクリ−ニングに対して確立されている方法にそって、ELISAプレ−トを調製して、vauペプチドの免疫反応性が確認された。この試験は、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）であるVAU株のエンベロ−プ糖タンパク質の免疫優性エピト−プを模倣するペプチドで調製した固相の検出に基づいている。該試験の実行は、Genelavia（登録商標）Mixtキットで提案されている方法により、該キットでの試薬を使用してモデル化された。
図２１及び図２２の二つの表で照合される実験デ−タは以下のことを示している：
（a）HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）ウイルスで汚染されている患者からの４つの血清は、vauペプチドと強く反応する；
（b）Pasteur Institute of Yacoundeから送られてきた１９の血清のうち、HIV-1のO（グル−プ、またはサブグル−プ）ウイルスで汚染されている患者からと見られる１０の血清もまた、同じペプチドとの高い反応性を示す；
（c）HIV-1のBサブタイプウイルスで汚染された人（急性期）からの血清（４つの試料）は、vauペプチドとの反応性は示さない；
（d）無症候性の血液ドナ−より得られた血清（４８の試料を試験した）は、vauペプチドとの反応性は示さない；
これらの実験デ−タは、（HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）の抗体陽性試料が不足（paupicity）しているが）選択したペプチドの感受性と特異性とに関する証拠となる。
上記のテキストからは、本発明は更に、上記した抗体を、種々の段階を有する方法で使用することにより、HIV-1(VAU)ウイルス、または変異体を検出することに関していると分かるが、前記の段階は特にHIV-1(VAU)ウイルスの特徴的性質を明らかにすることを目的としている。
本発明はまた、分子ハイブリダイゼーションによる、HIV-1(VAU)ウイルスの検出に関する。
慨して、HIV-1(VAU)ウイルスのキャリア−であると思われる患者由来の、生物学的試料、またはその他の生物学的液体若しくは組織中に、HIV-1(VAU)ウイルス、または変異体を検出するこの方法は、以下の段階を具備している：
適宜標識された少なくとも一つのプロ−ブを製造する段階；
疑いのある患者の試料中の核酸を前記の標識プロ−ブと接触させて、適宜該複合体を適切な固相支持体上に固定化する段階；
適切であれば、該固相支持体を適切な洗浄溶液で洗浄する段階；
該複合体を検出し、よってHIV-1(VAU)の存在、または非存在を当業者に知られる適切な検出方法により検出する段階。
本発明のこの方法に関する、別の好ましい態様においては、上記したハイブリダイゼーションは、非厳密な条件下で行なわれ、且つ、膜はハイブリダイゼーション用に適応した条件下で洗浄される。
血清学、またはポリメラ−ゼ連鎖反応（PCR）のような遺伝子増幅技術を使用して、HIV-1のOグル−プの流行度が正確に評価される。カメル−ンの、５から１０％のHIV-1感染患者は実際にOグル−プのウイルスに感染していることが判明した。しかしながら、本願で記載したウイルス単離体とは別に、西中央アフリカの外での、Oグル−プの伝播は記録に残っていない。HIV-1(VAU)が単離された前記の患者は、フランスにずっと居住していてアフリカには一度も旅行したことがない。現在までには、該患者の感染源に関する正確な証拠は全くないが、このケ−スはOグル−プウイルスのある程度の伝播がヨ−ロッパですでに起きていることを示す。
本発明はまた、生物学的試料中の、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）レトロウイルスに特徴の抗体と、HIV-1-Mタイプのレトロウイルスに特徴の抗体とを、検出、及び区別するための方法であって、該生物学的試料を、HIV-1-Mタイプのレトロウイルスに特徴的である抗体とは反応しないペプチド、特には上記した、ペプチド（１）、（２）、（３）、（４）、（５a）、（５b）、（９）及び（１０）から選択した一つと、接触させることを特徴とする、方法に関する。
更に本発明は、生物学的試料中の、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）レトロウイルスに特徴の抗体と、HIV-1-Mタイプのレトロウイルスに特徴の抗体とを、検出、及び区別するための方法であって、図８及び９で考慮に入れたHIV-1のMウイルスの中の一つに由来し、尚且つペプチド（１）、（２）、（３）、（４）、（５a）、（５b）、（９）及び（１０）から選択したペプチドと相同性であるものと、上記生物学的試料を接触させることを特徴とし、またこの相同性ペプチドの配列は、図８または９に記載される、該配列自身がHIV-1のMウイルスの対応した適切なペプチド配列中に含まれる、独自の連続したアミノ酸の垂直整列より得られるものであり、図８または９からもまた、該ペプチドの連続したアミノ酸配列が選択される、上記の方法に関する。
本発明によると、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）レトロウイルスによる感染と、HIV-1のMサブグル−プレトロウイルスによる感染とを検出、及び区別する方法はAIDSの診断試験にかけられる患者に由来する血清を、特にペプチドRILAVERYと接触させることで特徴付けられる。
更に、HIV-1のOサブグル−プまたはHIV-1のMサブグル−プレトロウイルスによる感染の検出方法は、二つの範疇のペプチドの混合物、すなわちその一方の範疇が、ペプチド（１）、（２）、（３）、（４）、（５a）、（５b）、（９）、及び（１０）に相当するものを使用することにより特徴付けられる。
更に、HIV-1-O DURレトロウイルスによる感染と、HIV-1-Oの別のタイプのレトロウイルスによる感染とを区別する方法は、生物学的試験試料を、ペプチド（１１）から（１５）、またはペプチド（１７）から（２０）の何れかと接触させることにより特徴付けられる。
あるいは、本発明は、HIV-1のOグル−プ（又はサブグル−プ）のレトロウイルスによる感染と、HIV-1のMサブグル−プレトロウイルスによる感染とを区別する方法であって、開裂作用部位がSRジペプチドであるセリンペプチダ−ゼを使用することと、このレトロウイルスがHIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）のレトロウイルスであるか、HIV-1のMサブグル−プのレトロウイルスであるかに応じて、該レトロウイルスのgp120のVP3の開裂、または非開裂を検出することを具備している方法である。
本発明は更に、生物学的試料中の、HIV-1のMサブグル−プレトロウイルスによる感染と、HIV-1のOグル−プ（サブグル−プ）による感染とを検出、及び区別するための組成物であって、一方が特に、（１）、９２）、（３）、（４）、（５a）、（５b）、（９）、及び（１０）である、二つの範疇のペプチドの混合物を具備している、組成物に関する。
ペプチド（１）から（２０）のそれぞれに特異的なモノクロ−ナル抗体もまた、本発明の範囲に含まれる。
本発明は更に照会番号I-1548,I-1549,I-1550の下に、1995年2月24日にCNCMに寄託されたもののなかより選択したプラスミドにも関する。
本発明は更に、本発明で定義されるペプチド（１）から（２０）のそれぞれをコ−ドする配列を有する核酸に向けられている。
好ましい核酸配列の中では、図１０、１１、または１２に表示のものが選択されるであろう。
本発明は更に、上で定義した核酸を含むベクタにも関する。
本発明は更に、前記核酸、または前記ベクタの何れか一つを含むと考えられる細胞に向けられている。
本発明は更に、照会番号I-1542の下に1995年2月23日にCNCMに寄託されたもののようなウイルスに関する。
本発明の範囲にも含まれるウイルスは、上記と同じグル−プのウイルスであって、このウイルスのコンセンサスペプチドが、上記したペプチド、またはポリペプチドを特異的に認識する抗体により認識されることを特徴とするものである。
このウイルスのゲノムＲＮＡもまた、本発明の範囲に入る。
更に本発明の範囲に入るものには、HIV-1タイプのヒトレトロウイルスに感染したと思われる患者からの血清、またはその他の生物学的試料中にある、抗体を検出するためのキット、またはボックスがあるが、これは以下を具備することを特徴としている：
配列が、特に上記した（１）から（２０）の配列の一つを有する、少なくとも一つのペプチド、またはポリペプチド；
上記のペプチド、または上記のポリペプチドと、試験する試料中に存在するかもしれない抗体との間の免疫複合体の形成反応を許容する手段（例えば、必要であるならば１以上のインキュベーション用緩衝液）；
陰性対照試料；
形成される、抗原／抗体複合体を可視化する手段。
更に本発明によると、このキットには、
HIV-1株より由来する少なくとも一つのコンセンサスペプチド若しくはポリペプチド、あるいは、
このポリペプチド若しくはペプチドの配列とは別個であり、その中の１以上のアミノ酸がその他のアミノ酸で置換されているアミノ酸配列（ただし、当該ペプチドには、コンセンサスペプチド若しくはポリペプチドに対する血清との反応性が保持されている）、または、
１以上のアミノ酸が欠失、付加されているアミノ酸配列（ただし、当該ペプチド、またはポリペプチドはには、コンセンサスペプチド若しくはポリペプチドに対する血清との反応性が保持されている）、
の何れかを具備したペプチド、若しくはポリペプチドに由来する少なくとも一つのコンセンサスペプチド若しくはポリペプチドを更に有している。
好ましくは本発明のキットは更に、別のHIV株、好ましくはHIV-1-LAI株に由来する、少なくとも一つのペプチド、またはペプチドを有する。
本発明は更に、本発明のレトロウイルスによる感染の、in vitroでの診断用の、ポリペプチド組成物、またはその変異体の一つに関するが、この診断は、上記の感染後に形成される抗体を含んでいると思われる生物学的試料に対して行なわれる。この組成物は、ペプチド（１）から（２０）のうち、少なくとも一つを具備していることを特徴とする。
生物学的試料は、特には血液、血漿、血清、またはその他の生物学的抽出物からなる。上記の組成物は、上記の生物学的試料のうちの一つの中の抗体を検出するのに使用することが可能である。
よって本発明は更に、特にHIVタイプのレトロウイルスによる感染の、in vitroでの診断方法であって、以下の工程で特徴付けられるものに向けられている：
HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）レトロウイルスに対する抗体を含むと思われる生物学的試料を、上に定義したペプチド、または上に定義したペプチド組成物と、抗原／抗体型の免疫複合体の形成を許容する適切な条件下で、接触させる工程；
存在する可能性のある上記の複合体を検出する工程。
本発明は更に、ワクチン作成に許容される薬学的媒介物（vehicle）と組み合わされた、少なくとも一つのペプチドを具備することを特徴とする、免疫学的組成物に関する。
本発明は更に、以下の工程を具備することを特徴とする、本発明のカプシドタンパク質、gp41、gp120の調製方法に関する：
本発明のHIV-1レトロウイルスに感染した細胞を溶解して、上清と感染細胞とを分離するか、または遠心により調製したウイルス沈殿物を溶解する工程；
細胞抽出物、及び／またはウイルス抽出物を、精製済み抗体を含む免疫吸着剤（immunoadsorbant）にかける工程（該抗体は、本発明のレトロウイルスに感染した人の血清より得られ、また有益には適切な支持体に固定されていて、感染者の該血清は、本発明のウイルスのエンベロ−プタンパク質と強く反応する能力がある）；
緩衝液の存在下で、抗原／抗体の免疫複合体の形成が起きるのに十分な時間だけ、インキュベーションする工程；
上記の免疫吸着剤を緩衝液で洗浄して、該支持体に保持されていない分子を除去する工程；
所望の抗原性タンパク質を回収する工程。
この調製方法の第一の態様によると、HIV-1 DURのカプシドタンパク質、並びに糖タンパク質gp41、及びgp120の分離と回収は、電気泳動法と、該タンパク質の電気的還元法により行える。
この調製方法の別の態様によると、該タンパク質は以下の工程により回収できる：
上記の免疫吸着剤に付着したタンパク質を溶出させる工程；
上記のように溶出された産物を、分離支持体に付着された抗体であって、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）DURのカプシドタンパク質、糖タンパク質gp41及びgp120を認識するものを有する、クロマトグラフィ−カラムにより精製する工程。
本発明の範囲に更に含まれるものには、本発明のペプチド、またはポリペプチドであって、以下のようにして産生される方法が含まれる：
本発明の核酸を発現する；または、
アミノ酸を付加して、該ペプチド、または該ポリペプチドが得られるまで化学合成する。
遺伝子工学の標準的な原理と方法を使用することが可能である（Molecular Cloning,Sambrook,Fritsch,Maniatis,CSH 1989）。
本発明の範囲に含まれるものにはまた、上記した核酸の産生方法があるが、これは本発明のウイルスより単離するか、化学合成か、または特異的プライマからの、核酸のin vitro増幅の技術により行なわれる。
本発明によるオリゴヌクレオチドプライマはまた、以下のヌクレオチド配列中の、少なくとも８つの連続するヌクレオチドを具備した配列を有する：
上記のプライマは、本発明のペプチドをコ−ドするヌクレオチド配列に関して、例えばPCRのような遺伝子増幅や、相当する技術において使用することが可能である。上記のプライマを使用して行った試験で、決定的な結果が得られた。
更に、本発明はPCRや上記した相当する技術にによる増幅を許容するキットに関する。
更に本発明の範囲には、本発明によるレトロウイルスを含んでいる、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）DURレトロウイルスに特徴的である核酸の、生物学的試料中での存在を検出する方法が含まれる。この方法は、上記の生物学的試料中に含まれるＲＮＡより形成したcDNAを、このcDNAとレトロウイルスゲノムとのハイブリダイゼーションを許容する条件下で接触させる工程と、このウイルス試料の遺伝子増幅を実行する工程とを具備している。
本発明はまた、本発明のウイルスで感染した細胞の溶解により得られるウイルス溶解物にも関する。
特に上記したペプチド、またはポリペプチドを含む、HIV-1(DUR)（またはHIV-1(VAU)）株もまた、本発明の範囲に含まれる。
本発明は、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）DURの構造、またはこのレトロウイルスの変異体より得られる、特異的ペプチドであって、以下を可能にするものに関する：
状況に応じて、
地球規模でOのカテゴリ−のHIV-1と、Mのカテゴリ−のHIV-1とを区別するか、または、
より特異的には、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）DURと、Oサブグル−プのその他のウイルスとを区別するか、あるいは、
一方で、全てではないにしろほとんどのレトロウイルスで、Oグル−プ（またはサブグル−プ）及びMサブグル−プの両方を認識する。
更に本発明の範囲に含まれるものには、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）、またはHIV-1のMサブグル−プの、対応する構造タンパク質に由来の、相当するペプチドであって、特にはGAG、gp120、およびgp41より由来する構造タンパク質でその一部が図に示されているものがあるが、上記の相同的なペプチドは整列により得られ、更にまたHIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）DUR、より特異的には本願で同定したものに由来するペプチドの図からも得られるものである。
同様に、ある種の相同性ペプチドは上記した区別を可能にする試験で使用することが可能であり、この場合にはGAG、gp120、及びgp41の構造タンパク質由来の、対応するペプチドにかわって使用される。
Oグル−プ特異的なオリゴヌクレオチドの決定
VAU配列、並びにMVP5180、及びANT70配列との相関関係を使用して、全体がVP3領域及びgp41領域に対してOサブグル−プ特異的であるようにしたプライマを決めた。これらのプライマにより、DUR株を増幅することが可能になり、結果としてぶちあたっていた増幅の問題の一つの解決となった。これらのHIVのOサブグル−ププライマの配列と部位を、図１３に記載してある。これらのプライマにより、臭化エチジウム染色で可視化できる増幅バンドを、３０サイクルの単一ステップのPCRで得ることが可能になる、部分配列が得られた：
GAG:513塩基対（１７１アミノ酸）＝配列認識番号９；
gp120 VP3ル−プ:５２５塩基対（７５アミノ酸）＝配列認識番号１０；
gp41免疫優性領域：３１２塩基対（１０４アミノ酸）＝配列認識番号１１。
DUR配列に関して、ヌクレオチド（図１５）、及びタンパク質（図１６）の比較をOサブグル−プのMVP5180、ANT、及びVAU配列、HIV-1のコンセンサス配列、代表的なアフリカンHIV-1のMAL配列であるLAI、ガボンチンパンジ−のCIVのCPZで行うと、その他の報告済みのHIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）株同士が遠縁であるのと同じように、DURも、その他の報告済みのHIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）株から離れている。
差異はGAG領域でより少なく、またgp120のVP3領域で最大であり、このタンパク質の比較では差異が４０％にまで達する（図１６）。系統樹により、DUR株がOサブグル−プの一部を形成することが一方で確認され、また記載された種々のO株間での差異の受容性が他方では証明されたが、明らかなサブタイプの枝分かれは起きていなかった（図１７）。
GAG配列の比較
得られたGAG配列とその他の報告済みの２つのO株（ANT70、及びMVP5180）との比較はもちろん、Mグル−プの代表的な配列（図８）との比較により、Oのコンセンサス配列が複数の領域内に存在し、これが同じ領域のMのコンセンサス配列とは異なっていることが判明した。MよりもOに対しての方がより多様である、２つの超可変領域、及び一方または他方における、２、３の部位変異もまた判明した。しかしながら、SPRT・・・SEGA、MLNAI・・・KEVIN、GPLPP・・・QQEQI、及びVGD・・・SPVの領域は、Oのコンセンサス配列と、Mのコンセンサス配列との間では異なっているようである。
QQA及びLWTTRAGNPの領域は超可変領域である。HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）DUR株は、M及びOのコンセンサス配列に対して、３つの部位で明らかに異なっていて（Iに対してL、Eに対して２回）、単離された３つの超可変部位に特異的なアミノ酸を有する（L9にV、A77にA、110にL）。
更に、GAG領域内に、例えばSPRTLNAWVK、GSDIAGTTST、及びQGPKEPFRDYVDRFのような、Oグル−プと、Mグル−プに共通な断片を決めることは可能である。
VP3ル−プ配列の比較
この比較実験では、HIV-1のMサブグル−プのコンセンサス配列とは、最高で５６％までのタンパク質の差異が見られ、、またHIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）のコンセンサス配列とは、３５から４２％のタンパク質の差異が見られた。
gp120中のVP3ル−プ領域中、及びgp41中の免疫優性領域中のペプチド配列の整列を、図９に示してある。DUR株のVP3ル−プの内部の配列は、HIV-1のMサブグル−プのコンセンサス配列のものとはかなり異なっている。VAU及びANT70株とは、GPMAWYSMモチ−フを共有しているが、２つの置換（Aに対してR、及びYに対してR）があるMVP株とは共有していない。
VP3ル−プの残りの左右部分は、他の既知のHIV全てとはかなり異なっていて、他の交差性を有するとは想像できないほどであった。更にDURのVP3ル−プは他のOコンセンサス配列よりも１アミノ酸だけ長く、これはHIV-1のMグル−プの配列よりも１アミノ酸だけ長い。
gp41の免疫優性領域に関する、整列の比較
配列CRGKAICを有する、DUR株の「ミニル−プ」はこの株に非常に特異的であることが証明された：これはエピト−プを構成するかもしれない（図９を参照）。更に、この配列は、gp41糖タンパク質のアンフォ−ルディングの状態の修飾に関わる可能性があり、結果的には該株の感染に関わる。
このル−プを挟む１１アミノ酸長の長い配列は、VAU配列と同じである。DUR株の多型性は、分析したクロ−ンでは、SまたはTの部位で見ることが可能である。
他の既知のレトロウイルス株より得た、対応するペプチドもまた、図９に示してある。
DUR株は更に、HIVのOサブグル−プの、gp41領域に関するコンセンサス配列の決定を可能にし、その中の幾つかの充分に長い相同性領域を使用することができる。これらの相同性領域は、とりわけ、RL*ALET,QNQQ,LWGL,及び
CYTV（*は可変アミノ酸を意味する）である。
血清学的相関関係
抗DUR血清は、HIV-1-Mのコンセンサス配列、HIV-1 MAL、HIV-1 CPZ、またはHIV-1のOグル−プ（またサブグル−プ）のMVP5180、の中のVP3ル−プのペプチドとは反応しないが、しかし、HIV-1-O ANT70のVP3ル−プのペプチドとは反応する。gp41の免疫優性領域に関しては、これは「標準的な」HIV-1のMサブグル−プのコンセンサス配列とは反応しないが、しかしながら驚くことに弱いながらも、HIV-1のMサブグル−プの右に伸長しているコンセンサス配列とは反応する。
参考文献
本発明はまた、上記抗原により誘導される、モノクロナ−ル、またはポリクロ−ナル抗体に関する。
本発明はまた、上記したウイルスのゲノムＲＮＡに対して相補的か相同である配列を有する、クロ−ン化ＤＮＡ配列に関する。本発明は更に上記のクロ−ン化ＤＮＡ配列を調製するための方法に関する。本発明は更に上記したクロ−ン化ＤＮＡ配列によりコ−ドされるアミノ酸配列を含んだポリペプチドに関する。
更に本発明は、上記した抗原を、ある種のAIDSの形態にある危険な状態の人における、in vitroでの検出に適用することと、前記の人の一部に対しては、このレトロウイルスに対する免疫原性組成物とワクチン用組成物の産生へ適用することに関する。同様に本発明は、同じ目的のための上記した抗体の適用に関し、また、その目的の一部のため、ヒトAIDSに対する医薬品の活性素の産生への適用にも関する。
本発明はまた、クロ−ン化したＤＮＡ配列と、遺伝子増幅用プライマまたはプロ−ブとしての上記配列に由来するポリペプチドの、診断キット中での適用に関する。
本発明は更に、化学合成、または組み換え宿主細胞内での発現によって得られる抗原性組成物であって、これにより、HIV-1、またはHIV-2のサブタイプに関わらず、HIV型のヒトレトロウイルスによる感染の診断が可能になるものに関する。このような組成物は、HIV-1、HIV-2、HIV-1(DUR)、及びHIV-1(VAU)ウイルス、または同様の免疫原性特徴を有する抗原性ペプチドの変異体に共通する抗原性ペプチドより選択した、少なくとも一つのペプチドを具備している。
本発明は更に、HIV-1型のヒトレトロウイルス、より特にはHIV-1、Mグル−プ、HIV-2、またはOグル−プ（またはサブグル−プ）のHIV-1による感染の特異的診断を可能にする組成物であって、HIV-1ウイルスに特異的な抗原性ペプチド、HIV-2ウイルスに特異的な抗原性ペプチド、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）に特異的な抗原性ペプチド、または同様の免疫原性特徴を有するこれらの抗原性ペプチドの変異体の少なくとも一つを具備している組成物に向けれれている。より特には、上記抗原性ペプチドは、HIV-1のMグル−プと、HIV-2と、HIV-1のOグル−プ（サブグル−プ）のウイルスのエンベロ−プタンパク質に由来している。
本発明は更には、従来技術のペプチドでは必ずしも検出することができなかった抗HIV抗体の検出を可能にするペプチドに向けられていて、これは特には新規のHIV-1株であるHIV-1DURの発見に基づいている。それに対する抗血清は、必ずしも、現在使用されているようなHIVのコンセンサスペプチドとの反応性を有しているわけではない。「HIVのコンセンサス」という用語は、単離体間で保存されている領域を意味し、この証明は診断試薬の設計にとって必須であり、またこれが変異すると抗ウイルス医薬に対する抵抗性が付与される。本願で使用する「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドとポリペプチドの両方を意味する。
従来技術
LAS及びAIDSの進展の起因である２つのタイプのヒト免疫不全症ウイルス（HIV）が単離されていて、また特徴付けられている。LAV-1、またはHIV-1として知られる第一のウイルスは、単離されていて、GB特許出願8324,800、及び特許出願EP 84401,834（1984年09月14日）二記載されている。このウイルスはまた、エフ.バ−レ−シノッシ（F.Barre-Sinoussi）らにより記載されている（Science,1983,220:868-871）。
２型のHIVレトロウイルスは別のクラスに属し、１型のHIVレトロウイルスとの免疫原性の関係は非常に限られている。HIV-2レトロウイルスは、ヨ−ロッパ特許出願番号、87,400,151,4（発行番号は239,425）に記載されている。
HIV-1レトロウイルスは最も一般的であり、世界中の複数の地域では主要な存在となっている。HIV-2レトロウイルスに関しては、西アフリカではよく見られるものであるが、グレズ（Grez）らにより、最近になってこの地域から外への伝播が報告されている（J.Virol.,68:2161-2168）。
１型及び２型のヒト免疫不全症ウイルスはもちろん、ヒト以外の霊長類ウイルスを具備した、霊長類の免疫不全症レンチウイルス全体は、そのサイズ及び複雑さにおいて増大している。これらのウイルスで最も一般的なHIV-1は、現在、全世界的に流行しており、公衆衛生の主要な問題となっている。このウイルスの同定と分子的特徴付けのすぐ後で、このウイルスは非常に多様性があることが認識され、現在では幾つかのサブタイプを具備している（Myers,1994,Louwagie,et al.,1993,Louwagie et al.,1992,Myers G.1994“HIV-1 Subtypes and phylogenetics trees：Human Retrovirus and AIDS；Myers,G.,Korber,B.,Wain-Hobson,S.,Smith,R.F.and Pavlakis,G.N.,Eds.Los Alamos National Laboratory,Los Alamos,NM.III-2-III-9）。このサブタイプの分化は主に、gagとenv遺伝子の多様性に基づいている。少なくとも６つのサブタイプが同定されていて、AからFと命名されているが、幾つかは、HIV-1の単離体に関して進行中の世界的な集中的調査より出現する可能性がある。これらの種々のサブタイプはそれぞれ、スタ−系統樹と呼ばれている系統樹において等距離であることが判明していて、種々のHIV-1サブタイプは共通の祖先より同調して進化及び分化したことを示唆している。
最近、HIV-1に関するこのグル−プの２つの別個のウイルスが単離されて特徴付けされた。この２つのウイルスは、西中央アフリカのカメル−ン在住の患者より得られた（Gurter et al.,1994,Vanden Heasevelde et al.,1994）。これらの配列、より特にはそのenv（エンベロ−プ）遺伝子は、このウイルスがHIV-1関連ウイルス（HIV-1のOグル−プと呼ばれるもの）の別個の範疇に属することを明らかに示している（Nkengasong et la.,1993）。
しかしながら、HIV-1関連ウイルスのこのグル−プ内での単離体の多様性は知られておらず、またはアフリカから外への伝播も報告されてはいない。
HIV-1の血清学的試験における一般的な制約は、疑似陽性結果と疑似陰性結果の両方を避けることであり、また同時に、以前の試験で可能であった、陽性血清の検出における感度を保持するか、または改善することも制約である。
「env」遺伝子に必然的に由来する、コンセンサスペプチド（群）の使用に基づく試験は、HIV-1-O変異体の発見が、疑似陰性結果の可能性を明るみに出されるまでは、最も理想的な解決であると認識されていた（Genomic cloning and complete sequence analysis of a highly divergent African human immunodeficiency virus isolate.J.Virol.1994;68:1586-96;a new subtype of human immunodeficiency virus type 1（MPV-5180）from Cameroon.J.Virol.1994;68:1581-85）。
「env」ペプチド抗原との反応性が、ある種の試験ではないのに、患者において、AIDSの臨床的特徴やそれより前に起きるリンパ節腫脹症候群が見られるのは、現在ではHIV-1-Oグル−プによるとされることがしばしばある（HIV-1／HIV-2 seronegativity in HIV-1 subtype O infected patients,Lancet 1994;343:1393-94;New HIV-1 subtype in Switzerland.Lancet 1994;344:270-271）。
発明の記載
本発明の目的は、診断実験室に対して、方法、特には特異的ペプチドであって、これまでは検出されにくかった抗HIV-1抗体の検出を可能にするものを提供することにある。本発明は更に、「疑似陰性結果」の可能性を避けるための、HIV-1(DUR)のペプチドと、他のHIV群からの、それに対応したペプチドとの混合物に関する。
本発明は更には、生物学的試料中の、HIV-1-Mタイプレトロウイルスに特徴的な抗体と、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）レトロウイルスの検出と、それらの間での区別をつけるための方法に関する。
本発明は、在カメル−ンの陽性血清の女性であって、ウェスタ−ンブロッティング技術で確認された複数の試験中において、非定型な血清学的反応性を示した女性における観察より由来している。
この非定形の血清学的反応性を説明するため、特には、Oタイプに対して修飾されてさえある、ある種の第三世代試験に対する反応性の欠如を説明するため、発明者らは、このHIV-1(DUR)株のゲノムのある特定の部分、より特異的にはGAGとENV遺伝子の配列を決定することに興味を抱いた。
しかしながら、Mグル−プ由来のプライマと、Oグル−プの既知のプライマとを用いたPCRによる遺伝子増幅は、gp120のVP3ル−プをコ−ドしている部分と、gp41の免疫優性領域に対しては、うまくいかなかった。GAG領域のみが、従来技術の既知のプライマを使用して増幅することが可能であった（Loussert-Ajaka I,Lancet 1994;343:1393）。本発明の別の目的は、この問題を解決するプライマを決定することにある。
リンパ球ＤＮＡより、糖タンパク質gp41とgp120の部分配列を、カプシドタンパク質（GAG遺伝子）とともに決定し、このHIV-1DUR株が、その一部に関してHIV-1−Oグル−プに属し、また、特にはgp41とgp120とに関してはMグル−プとはかなり異なっていることが示された。
故に、特にHIV-1(DUR)のGAG配列に関して、Mグル−プの同じ領域のコンセンサス配列とは異なっている、Oグル−プ中のコンセンサス配列の存在を、幾つかの領域に証明することが可能であった。
HIV-1(DUR)のGAG、gp４１、gp１２０をコ−ドする配列のクロ−ニングは、PST1部位を有する、Bluescript（登録商標）を利用して行った。増幅産物は、T3及びT7ユニバ−サルプライマを使用した標準的な手法でクロ−ニングするか、または先立つ（preceding）増幅のプライマを利用して直接的に配列を決定した。次いで配列を、アプライド・バイオシステムズの373A自動配列決定機（EDGD Montigny le Bretonneux,France）を利用して決定した。
ヨ−ロッパ以外を旅行したことがなく、1992年にAIDSで死亡したフランス人患者より得られた、Oグル−プ単離体であるHIV-1(VAU)のenv遺伝子を、発明者らは本発明の面において単離して、配列を決定した。そのエンベロ−プ配列によると、HIV-1(VAU)は、最近特徴付けられた二つのカメル−ンウイルスである、HIV-1ANT、及びHIV-1MVP5180に関連している。env配列の系統樹的分析により、３つのウイルスが、以後本願ではHIV-1のOグル−プと呼ぶ、一つの独立したグル−プを構成していることが明らかになった。この患者からHIV-1(VAU)を単離したことはまた、アフリカ以外でHIV-1のOグル−プの、ある程度の広がりが起きていることを示している。
HIV-1(VAU)ウイルスの単離
HIV-1(VAU)は、1992年に４１歳のフランス人のAIDS患者より単離された。この患者は、1986年に、子宮頚部の癌に関連した重度のロイコ好中球減少症（leuconeutropenia）を発症している。しかしながらこの患者は次第に、日和見感染の症状を示し、循環しているCD4+のＴ細胞の数が減少して、1992年にAIDSで死亡した。抗−HIV-1抗体は、ELISA（Elavia,Sanofi Diagnositics Pasteur and Abbott test）により、1990年に最初に検出された。
ヨ−ロッパ以外を旅行したことのない該患者は、静脈性の医薬を使用したことがなく、また如何なる輸血もされていなかった。アフリカ系の性交パ−トナ−は、全く同定されていない。この患者は、1971年に健常な子供を出産しているが、1980年に出生した男子は、新生児性のAIDSを強く示唆する、症状を発症した後に、１歳で死亡した。該患者の三番目の子供は、1983年に出生しており、患者の配偶者（男）は現在も健常であって、感染していない。
このウイルスの単離は、次のようにして行った。患者のPBMC（末梢血リンパ球）に存在するCD8+細胞をIOT8抗体（Immunotech）でコ−ティングされたビ−ズを使用して除去する。残りのPBMCをPHAで刺激し、次いで健常なドナ−より得て、PHAで刺激済みのCD8枯渇済みPBMCと共培養した。共培養中のウイルス増殖を、上清中の逆転写（RT）活性をアッセイすることと、HIV-1のp24のELISA試験（Dupont de Nemoursにより販売の、診断キット）によりモニタ−した。初期の共培養より得られたウイルスを、CD8-枯渇済み、及びPHA刺激済みのPBMC培養で、継代を数回行った。MT4細胞（Harada,et al.,1985）、及びCEM細胞（Rey et al.,1989）はもちろん、Hela-CD4-LTRLacZ細胞株P4-2（Clavel and Charneau 1994）が含まれる形質転換細胞株の、HIV-1(VAU)による感染を幾度か試みた。
HIV-1(VAU)の生物学的特徴付け
患者のCD8-枯渇済み、PHA刺激済みPBMCと、健常なドナ−からの同様の細胞との共培養後２週間で、培養上清中のRT活性のピ−クを示して、ウイルス産生が検出された。次いでこのウイルスをCD8-枯渇済み、PHA刺激済みPBMCを使用して、連続した継代を行うことができた。図１においてプレ−トAは、HIV-1(VAU)の、感染済みPBMC培養上清中での産生を表し、これはRTアッセイ（黒丸）と、HIV-1p24捕獲ELISA（中抜きの丸）とで確認した。HIV-1のp24の濃度は、ng/mlで表され、RT活性はcpm/μlで表されている。プレ−トBでは、同じ実験を、AIDS患者からの標準的なHIV-1初代分離体で行った。
HIV-1(VAU)の増殖は、RTアッセイにより容易に検出できるが、HIV-1p24 ELISAによる、培養上清中のウイルス検出は、実質的に感度がよくない。図１は、RT、またはp24でアッセイしたときの、HIV-1(VAU)、またはAIDS患者からの初代HIV-1単離体での、PBMCの増殖性感染の特徴の比較を示している。アッセイ上清中のRT活性のアッセイで決定した、等量の粒子に対しては、他のHIV-1単離体の場合に比べてHIV-1(VAU)の場合に、約２５分の１のp24が検出された。この差異は、ELISAプレ−トのコ−ティングに使用される、HIV-1p24に特異的なモノクロ−ナル抗体には、HIV-1(VAU)のgag産物に対する弱い親和性しかないという事実による可能性がある。
HIV-1に感受性である、形質転換済みのヒトＴ細胞株で、HIV-1(VAU)を繁殖させる試みが幾つか行なわれたが、成功しなかった。特に、MT4細胞、またはCEM細胞の何れかと、HIV-1(VAU)感染済みPBMCとの間の共培養を行っても、ウイルスは繁殖しなかった。さらにこのウイルスは、tat遺伝子で誘導可能なlacZ遺伝子を有する、CD4+HeLa細胞（P4-2）を感染することができないことも判明した（Clavel and Charneu 1994）。同様に、HIV-1(VAU)の複製も、複数のチンパンジ−から由来の、活性化した末梢血リンパ球で検出することができなかった。
以下に詳細に記載する、HIV-1(VAU)のエンベロ−プ配列の分析、及び最近記載された２つのカメル−ン単離体との比較により、３つのウイルス全てはHIV-1関連ウイルスの同じグル−プに属することが示されている。更に、この比較により、該ウイルスの３つの変異体はそれぞれ、系統樹でほぼ等しく離れていることが示されている。結果的に、３つのウイルス変異体のそれぞれは、それ自身で、現在、Oグル−プと呼ばれているグル−プの内の、異なるサブタイプを構成している。このグル−プは、現在までに同定されていて、発明者らがMグル−プと本願で呼んでいる、そのほかのHIV-1単離体のグル−プとは異なっている。
この新規のグル−プの出現は、その起源に関しての疑問を投げかけている：Oグル−プはMグル−プウイルスより発生したのか、（またはこれとは逆か？）、あるいはそれぞれのグル−プは異なる歴史を有するのか？。Mグル−プとOグル−プの両方に関しては、同様の内部分岐の特徴を有しており、それぞれは、ヒトの異なるポピュレ−ションで、分岐した異なるウイルス祖先に相当していると、発明者らは考えている。現時点で入手可能な系統学的、及びウイルス学的デ−タによって、上記の２つのグル−プのそれぞれが、自然にヒトに影響したのか、それとも他の種よりヒトに導入されたのかどうかを調べることはできない。ヒト以外の霊長類に存在する、HIV-1と同様の唯一のウイルスは、明らかに自然的に感染したチンパンジ−より単離した、SIVCPZGAB単離体（Huet et al.,1990）であるが、これは明らかにMグル−プ、及びOグル−プからも異なっていて、これに相当するものはヒトでは発見されていない。HIV-1(VAU)のチンパンジ−リンパ球での複製が成功していない限り、Oグル−プのウイルスが最近になってチンパンジ−のウイルスより進化したとは考えにくい。
Mグル−プよりも１５から２０年後になって、現在のみに、Oグル−プの流行が現れたのであろうか？３つの可能な説明がある。第一には、Oグル−プウイルスの祖先の、ヒトへの導入は、Mグル−プのものよりもより最近であると考えられる。第二には、それぞれの起源の地域では社会的条件が異なっていたので、Mグル−プはOグル−プよりも速く伝播することができた。そして第三には、Oグル−プウイルスは、Mグル−プに比べてその伝播能力が低かった。このような性質は、感染患者でのより少ないウイルス負荷が低減した伝播性と関連しているHIV-2の全世界的伝播が顕著に起きていないことを説明すると、提案されている（De Cock et al.,1993）。この点に関して、HIV-1のOグル−プに感染した患者でのウイルス負荷に関するデ−タは入手できないが、これらのウイルスの病原性は、HIV-1のものとは異なっているとはいえないようである。HIV-1(VAU)が単離された患者は、HIV-1MVP5180Oグル−プ単離体が得られた患者のようにして、死亡した。
しかしながら、HIV-1(VAU)患者の自然な感染歴はいまだ不明であるが、AIDSに似た症候群の第二子の死亡日から示唆されるように、この患者は1980以前に感染したという幾つかの兆候がある。
本発明は、図６に記載の配列で、配列認識番号５にも記載の、「vau」とよばれる配列を具備したenv遺伝子によりコ−ドされる構造タンパク質と同等の免疫学的特徴を有する構造タンパク質を有する、HIV-1(VAU)ウイルスの核酸配列の如何なる変異体、またはOグル−プの同等の、如何なるウイルスに関する。
本発明は更に、本発明による抗原、あるいは本発明による抗原を、一方において、一つ以上のHIV-1のOグル−プウイルス若しくはそのほかの変異体ウイルスと、また他方において、一つ以上の、HIV-2、及び／またはHIV-1、に由来する抽出物と組み合わした混合物の何れかを含む組成物であって、該組成物が、適宜標識されている、組成物に関する。如何なるタイプの適切な標識（酵素性、蛍光性、放射性等）も使用することが可能である。
核酸
本発明は、ＤＮＡ、またはＤＮＡ断片に関し、特にはPCRやそのほかの遺伝子増幅法に使用可能な、ＲＮＡ、cDNA、またはプライマ由来の、クロ−ン化したＤＮＡとＤＮＡ断片で、HIV-1(VAU)レトロウイルスのＲＮＡ、またはＤＮＡ由来のものに関する。本発明は、より特異的には、等価なＤＮＡ全てに関し、特にはHIV-1(VAU)ＤＮＡ、特には図６に記載され、「vau」と呼ばれている配列に相当する配列を具備したHIV-1(VAU)株のenv領域をコ−ドする配列と、相同な配列を有するＤＮＡに関する。HIV-1のMグル−プとの相同性は少なくとも５０％、好ましくは７０％、更に有益には９０％である。慨して本発明は、HIV-1のOグル−プのレトロウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズすることができる、等価なＤＮＡ（またはＲＮＡ）に関する。
本発明は更に上記したＤＮＡ配列に相当する、ＲＮＡ配列に関する。
本発明は更に、配列認識番号７に記載の配列か、配列認識番号７の配列にハイブリダイズする配列を具備した、HIV-1(VAU)ウイルスのインテグラ−ゼ遺伝子に関する。本発明はまた、上記のＤＮＡに相当するＲＮＡに関する。
本発明の主題はまた、上記したＤＮＡ、またはＤＮＡ断片にコ−ドされるペプチド、またはポリペプチドである。
VAU配列あるいはHIV-1(VAU)ウイルスのインテグラ−ゼ遺伝子、特には少なくとも９つのヌクレオチドを具備したオリゴヌクレオチドに由来するオリゴヌクレオチドは、PCR技術やそのほかの遺伝子増幅技術により、生物学的試料中、培養細胞中、または細胞抽出物中の、HIV-1のOグル−プウイルスＤＮＡまたはＲＮＡの検出に使用することが可能である。これらの配列は遺伝子増幅用のプライマとして、または遺伝子増幅産物の特異的な検出用のプロ−ブの何れかに使用することが可能である。さらにハイブリダイゼーションプロ−ブとして利用されることが可能なものには、増幅産物、またはそれに相当する、化学合成（Applied Biosystems）により得られる合成配列がある。
本発明はまた、ハイブリダイゼーション反応にプロ−ブとして使用可能で、高厳密度条件下でのHIV-1(VAU)変異体のゲノムの一部との反応を許容する、少なくとも１００ヌクレオチドの、如何なる断片をも含んでいる。
HIV-1(VAU)env遺伝子のクロ−ニングと配列決定
HIV-1(VAU)ＤＮＡに関する、初回のPCR増幅に対しては、全ＤＮＡをHIV-1(VAU)感染PBMCより抽出し、以下の縮重したプライマを利用して、po1遺伝子のセグメント（インテグラ−ゼ領域）を増幅した：
得られた増幅産物をpBluescriptベクタにクロ−ニングして、ph4クロ−ンを作成し、1994年10月20日にCNCMへ、番号I-1486の下に寄託し、次いでこれをプロ−ブとして使用して、HIV-1(VAU)感染細胞より得られ、またEcoRIで消化済みの、低分子量ＤＮＡのラムダライブラリ−のスクリ−ニングを行った。簡潔にいうと、HIV-1(VAU)感染済みPBMCを、PHAで刺激済み且つ、CD8+枯渇済みの細胞と２４時間共培養し、その後で高い細胞病変効果（CPE）が見られた。次いで低分子量ＤＮＡをハ−トの方法（Hirt,1967）により抽出して、酵素EcoRIで消化した。このＤＮＡに対して行った、以前のサザンブロット分析では実際に、HIV-1(VAU)ゲノムにはただ一つのEcoRI部位があることが示されており、全ウイルスゲノムを表す、非インテグレ−ト型の環状ＤＮＡ種のクロ−ニングが可能である。得られる消化産物をアガロ−スゲル電気泳動にかけて、約８−１２kbのサイズのＤＮＡのポピュレ−ションを精製して、EcoRIで消化済みのラムダZap ＤＮＡ（Stratagene）に連結した。カプシド形成後、プレ−ティングと、32Pで標識したph4 ＤＮＡでのハイブリダイゼーションによるスクリ−ニングで、クロ−ン、λH34が陽性として同定されて、増幅にかけられた。EcoRI挿入物を精製して、超音波処理し、「ショットガン」技術により、酵素SmaでI消化済みの、リン酸塩処理済みベクタM13mp18内でクロ−ニングした。得られた１５０クロ−ンを373A ＤＮＡ配列決定機（Applied Biosystems）で配列決定し、得られた配列をウィスコンシンGCG ＤＮＡ分析パッケ−ジを使用して単一の配列に組み立てた。
この配列を分析して、多くのナンセンスコドンを、全てのタンパク質読み取り枠内に見出したが、これは過度に変異したゲノムを強く示唆している（Vartanian,et al.,1991）。この配列は不安定であるため、結果的にはHIV-1(VAU)感染済みPBMC由来の全ＤＮＡと、λH３４配列より由来した以下のオリゴヌクレオチドプライマを使用して、PCRにより、HIV-1(VAU)のenv遺伝子を増幅させた：
プロ−ブとしての核酸の利用
本発明はまた当然のこととして、HIV-1(VAU)ウイルスのキャリア−であることが疑われている患者に由来する、血清試料、その他の生物学的液体、または組織中に、HIV-1(VAU)ウイルスが存在すること、あるいはその逆を検出するために、ＤＮＡ、cDNA、若しくはその断片、または組み換えプラスミド、若しくはその断片を含んだ、他の等価なベクタのいずれかをプロ−ブとして利用することにも関している。これらのプロ−ブは、適宜標識されている（放射性、酵素性、または蛍光性のような標識）。HIV-1(VAU)ウイルス、またはHIV-1(VAU)の変異体を検出するための方法を実行するために極めて有益であるプロ−ブは、HIV-1(VAU)ウイルスゲノムに相補的なＤＮＡ全体、またはその一部、あるいは特には種々のクロ−ンに含まれる断片を具備することを特徴としていてもよい。env領域の全て、または一部を含む、HIV-1(VAU)のcDNA断片について、より特異的に言及する。
HIV-1(VAU)ウイルスの検出のためのこの方法、または診断キットにおいて使用されるプロ−ブは、すでに記載されているプロ−ブのみには決して限定されない。該プロ−ブは、HIV-1(VAU)ウイルス、HIV-1(VAU)の変異体、または構造的に同等のウイルス、の何れかのゲノム由来のヌクレオチド配列を具備しているが、ただしAIDSの可能性のある人に由来する生物学的液体を使用して、HIV-1(VAU)のＤＮＡ、またはＲＮＡとのハイブリダイゼーションにより、HIV-1のOグル−プウイルス、特にはHIV-1(VAU)を検出することが可能なものでなくてはならない。
特に有益なのは、HIV-1とハイブリダイズしたときに、Oグル−プに属するHIV-1と強く反応し、Mグル−プに属するHIV-1と弱く反応するプロ−ブである。限定するためのものではない例を挙げると、HIV-1(VAU)ウイルスのインテグラ−ゼ遺伝子配列（配列認識番号７）より構築されたプロ−ブは、特許EP 178 978等に記載されているハイブリダイゼーション条件下でHIV-1とハイブリダイズすると、Oグル−プのHIVとは強く反応し、Mグル−プのHIVとは弱く反応する。
検出はすでに知られている方法自体で行えるが、特には次のようである：
まずプロ−ブを、生物学的液体（例えば髄液、唾液等）に含まれる細胞より由来した核酸、または上記の液体自体と接触させることにより行う。ただし、後者の場合には、当該核酸は、上記プロ−ブとのハイブリダイゼーションを許容する条件下で、上記プロ−ブとハイブリダイゼーションするようにされている。そして、産生するかもしれないハイブリダイゼーションを検出する。
ハイブリダイゼーション反応が関わる、上記の診断はまた、それぞれHIV-1(VAU)、HIV-1、及びHIV-2より由来したプロ−ブの混合物を使用して行うことができる。ただし、望むHIVウイルスのタイプを区別する必要は、必ずしもない。
本発明の主題はまた、HIV-1のエンベロ−プタンパク質をコ−ドした配列、またはインテグラ−ゼをコ−ドした配列を含む、発現ベクタでもある。
本発明はHIV-1(VAU)ウイルスの存在、またはその逆を、HIV-1(VAU)ウイルスのキャリア−であることが疑われている患者より由来した血清試料中、またはそのほかの生物学的液体や組織中に検出するための組成物を具備している。これらの組成物は、HIV-1(VAU)ウイルスゲノム、特にはHIV-1(VAU)ウイルス、若しくはHIV-1(VAU)の変異体のenvタンパク質をコ−ドする領域、若しくはその一部を含んだＤＮＡ断片より得られるか、または誘導されるヌクレオチド配列に由来したプロ−ブを、少なくとも一つ具備することを特徴とする。
有益には、上記した組成物はまた、HIV-1、またはHIV-2に由来する配列から得られるプロ−ブを具備している。
そのほかの診断組成物は、Oサブグル−プのレトロウイルス、またはこのレトロウイルスの変異体を遺伝子増幅する際に使用することが可能な、本発明のプライマを具備する。
抗原、特にはタンパク質及び糖タンパク質
本発明は、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）のレトロウイルス性タンパク質、または該タンパク質の少なくとも一部を具備した天然若しくは合成の、ペプチド、若しくはポリペプチドであって、HIV-1のOグル−プのVAU株、またはHIV-1のOグル−プのDUR株での感染後に得られる血清より単離することが可能な抗体によって認識されうるものに関する。
本発明は、HIV-1(VAU)レトロウイルスの外部エンベロ−プタンパク質で、配列認識番号５に相当する配列を具備した遺伝子でコ−ドされているものに関する。本発明の好ましい態様では、このタンパク質は更に、配列認識番号６に相当し、図３に記載され、アミノ酸残基の１から５２６を具備したアミノ酸配列を具備することで特徴付けられる。本発明の主題はまた、如何なるポリペプチド、または該配列より由来の変異体であって、HIV-1(VAU)ウイルスにより誘導される抗体により認識されうるエピト−プを有するものでもある。
上記のタンパク質は糖付加型、または非糖付加型の形態で得られる。
本発明の主題はまた、配列認識番号８に相当し、図３に記載され、アミノ酸残基５２７から８７７の間のアミノ酸を具備した、エンベロ−プ膜貫通型タンパク質でもある。この膜貫通型タンパク質は、本発明の範囲内においては、糖付加型、または非糖付加型である。
本発明は、HIV-1(VAU)ゲノムのコ−ド配列の発現により得られ、HIV-1(VAU)のものと同等の免疫学的特徴を有する、全ての抗原、特にはタンパク質、糖タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに関する。該抗原は、本発明の範囲内においては、同等であるといわれる。ただしこれらは、同じ抗体、特にはHIV-1(VAU)に感染した患者より得られた血清より単離されうる抗体により認識されうるものであること。
特には、本発明の主題は、化学的に合成されるペプチド、またはポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が、図３に表示の配列であるか、または同等のペプチド若しくはポリペプチドである、HIV-1(VAU)エンベロ−プタンパク質のものに含まれるものである。
前記の同等なペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または糖タンパク質の中には、由来する元の抗原との免疫学的交差反応性があるかぎり、化学的合成、または遺伝子工学的に調製される上記の抗原の断片、またはペプチドが含まれるべきである。言い換えると、本発明は、上記した抗原のエピト−プに相当するか同等であるエピト−プを有し、また同じ抗体により認識されうる、どのようなペプチド、またはポリペプチドにも関する。上記したポリペプチド、または抗原をコ−ドするＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ配列の発現産物は、前記の後者のタイプのポリペプチドの一部を形成している。
より特には、HIV-1(VAU)ウイルスに由来するか、または遺伝子工学的、若しくは通常の化学合成により産生され、本発明の前後関係において非常に興味がもたれる上記抗原は、本発明のHIV-1(VAU)ウイルスと、HIV-1及びHIV-2のグル−プのウイルスとを明確に区別することを可能にする、抗原である。この点に関して、HIV-1(VAU)ウイルスのエンベロ−プタンパク質レベルにおいてはもちろん、PMタンパク質の外部の免疫優性エピト−プのレベルにおいても、かなりの差異が見られている。gag及びpolタンパク質は、エンベロ−プタンパク質よりも、HIV-1とのより高い類似度を示しているようである。
本発明は更に、HIV-1(VAU)のエンベロ−プの膜貫通型の糖タンパク質に免疫優性領域と同一であるペプチド、またはポリペプチドに関する。この領域は図３に表示されている。
この領域の好ましいポリペプチドは例えば、配列CKNRLICを含むか、またはこの配列に相当したものを含むものである。これらは配列
RLLALETFIQNWWLLNLWGCKNRLICに相当しているか、この配列を具備したペプチド、またはポリペプチドであってもよい。
以下で「vau」という名前で呼ばれる、別の好ましいペプチドは以下の配列に相当するか、またはこの配列、若しくはこの配列の一部であって、HIV-1(VAU)レトロウイルスのRARLLALETFIQNQQLLNLWGCKNRLICYTSVKWNKTに対する抗体により認識されうるものを具備している。
この配列のポリペプチド変異体は例えば、HIV-1(MVP5180)、及びHIV-1(ANT70)単離体のポリペプチドに対して図４に表示されているものである。これらのポリペプチドはまた、例えばアミノ酸残基による保存性の置換のような、挿入、及び／または欠失、及び／または置換による、先行物に由来するものであってもよい。
本発明は、照会番号I-1542の下、1995年2月23日にCNCMに寄託されたHIV-1-O DURウイルス由来のペプチド、あるいは、アミノ酸の置換、欠失、または付加により、配列が上記のものとは異なっているペプチドであるが、上記のものの抗原性の特徴を保持しているペプチドに関する。
本発明の範囲に含まれるその他のペプチドを、以下に定義している。
故に、本発明の好ましいペプチドは、図８に表示のGAG配列中か、またはGAG配列と免疫学的に同等な配列でHIV-1-O DURウイルスの変異体由来のものの中に含まれる、少なくとも４つの連続したアミノ酸を有するペプチドであって、該免疫学的に同等な配列が、図８のGAG配列に含まれる配列、AHPQQA,LWTTRAGNPのうち少なくとも一つをも特異的に認識する抗体により認識されるものである、ペプチドである。
好ましくは、このペプチドは、アミノ酸配列が以下の配列、
SPRTLNAWVKAVEEKAFNPEIIPMFMALSEGA（１）、
MLNAIGGHQGALQVLKEVIN（２）、
GPLPPGQIREPTGSDIAGTTSTQQEQI（３）、
IPVGDIYRKWIVLGLNKMVKMYSPVSILDI（４）、
QGPKEPFRDYVDRFYKTKLAE（５）、
AHPQQA（５ａ）、
LWTTRAGNP（５ｂ）、
のうちの一つか、
相当する免疫学的に同等の配列
の何れかの中に含まれるペプチドであって、このペプチドは、上記配列のうちの一つの、少なくとも４つの連続したアミノ酸配列を含んでいる、ペプチドからなっている。
また好ましくは、このペプチドは、アミノ酸配列が以下の配列、
SPRTLNAWVK（６）、
GSDIAGTTST（7）、
QGPKEPFRDYVDRF（8）、
のうち一つか、または
相当する免疫学的に同等の配列
の何れかに含まれるペプチドであって、このペプチドは、上記配列のうちの一つの、少なくとも４つの連続したアミノ酸配列を含んでいる、ペプチドからなっている。
本発明において特に好ましいペプチドは、
アミノ酸配列NPEI（9）、または
アミノ酸配列AVEEKAFNPEIIPMFM（10）を含むペプチドであって、より特には、アミノ酸配列が、
IGGHQGALQ（23）、
REPTGSDI（24）のうちの一つ、または
相当する免疫学的に同等の配列
のなかに含まれる、ペプチドであって、このペプチドは、上記配列のうちの一つの、少なくとも４つの連続したアミノ酸配列を含んでいる、ペプチドはもちろん、アミノ酸配列が以下の配列、
INDEAADWD（２５）、
または相当する免疫学的に同等の配列
の何れかの中に含まれるペプチドであって、このペプチドは、上記配列の少なくとも４つの連続するアミノ酸を含んでいる、ペプチドである
本発明は、ペプチド（２３）、（２４）、及び（２５）はもちろん、免疫学的に同等の配列をコ−ドする核酸配列だけでなく、これらの核酸配列の少なくとも一つを具備した組成物にも関する。
本発明は更に、HIV-1のMグル−プ株とHIV-1のOグル−プ株とに関する検出と区別のための、少なくとも一つの上記核酸の使用に関する。
上に定義した、HIV-1-O DURウイルス由来のペプチドはまた、本発明の範囲に含まれるが、該ペプチドは、HIV-1-O DURウイルスに由来する、図９に表示のgp120のVP3ル−プ、または相当する免疫学的に同等な配列の、少なくとも４つの連続するアミノ酸を含んでいるが、該免疫学的に同等な配列は、以下の配列、
KEIKI（12）、
EREGKGAN（13）、
CVRPGNNSVKEIKI（14）、
QIEREGKGANSR（15）、
のうち少なくとも一つをも特異的に認識する抗体により認識される。
このペプチドは好ましくは、
（a）配列CVRPGNNSVKEIKIGPMAWYSMQIEREGKGANSRTAFC（１１）、またはこの配列の一部であって少なくとも４つのアミノ酸を含むもの、の何れか、または、
（b）１以上のアミノ酸が１以上のアミノ酸で置換されていて、（a）の配列とは別個である、アミノ酸配列（ただし、当該ペプチドには、上記ペプチドに対する血清との反応性が保持されていること）；または、
（c）１以上のアミノ酸が欠失、または付加されていて、（a）または（b）とは別個である、アミノ酸配列（ただし当該ペプチドには、（a）のペプチドに対する血清との反応性が保持されていること）；または、
（d）相当する、免疫学的に同等な配列、若しくはその一部；
のうち何れかを含んでいる。
また好ましくは、このペプチドは、
配列KEIKI（１２）、または配列EREGKGAN（１３）、または配列GPMAWYSM（１６）の何れかを含んでいる。
特に好ましい方法においては、上に定義されるペプチドには、アミノ酸配列CVRPGNNSVKEIKI（14）、またはQIEREGKGANSR（15）の何れか一つが含まれる。
上に定義した、HIV-1-O DURウイルスより由来するペプチドはまた、本発明の範囲に含まれるが、該ペプチドは、その全アミノ酸配列が、HIV-1-O DURウイルスの変異体より由来する、図９に表示のgp41の免疫優性領域内の配列、または相当する免疫学的に同等の配列内に含まれる、少なくとも４つの連続するアミノ酸を含むが、該免疫学的に相同な配列は、以下の配列、
RLLALETLMQNQQL（17）、
LNLWGCRGKAICYTSVQWNETWG（18）、
CRGKAI（19）、
SVQWN（20）、
RLLALETLMONQQLLNLWGCRGKAICYTS（21）、
QNQQLLNLWGCRGKAICYTSVQWN（22）、
の少なくとも何れか一つをも特異的に認識する抗体により認識される。
このペプチドは好ましくは、配列RLLALETLMQNQQL（17）、配列LNLWGCRGKAICYTSVQWNETWG（18）、またはこのペプチド（18）の一部で以下を含むもの、を含んでいるペプチドである：
（a）配列CRGKAI（19）、またはQが、適切な場合には、K以外の異なるアミノ酸で置換された配列SVQWN（20）、あるいはこの二つの配列両方、
（b）１以上のアミノ酸が２つのアミノ酸で置換されていて、（a）の配列とは異なるアミノ酸配列（ただし当該ペプチドは、（a）のペプチドに対する血清との反応性を保持していること）、
（c）１以上のアミノ酸が欠失、または付加されていて、（a）または（b）とは異なるアミノ酸配列（ただし当該ペプチドは、（a）のペプチドに対する血清との反応性を保持していること）、または、
（d）相当する免疫学的に同等な配列、若しくはその一部。
また好ましくは、このペプチドは、以下の特徴のうち一方、または他方を有している：
・少なくとも８つのアミノ酸配列を含む、そのN末端配列は、HIV-1-LAI株のgp41の免疫優性領域内に含まれるRILAVERY配列に対して形成された抗体により免疫学的に認識されない；
・HIV-1-LAI株のSGKLICペプチドに対して形成された抗体により認識されない；
・以下の二つの配列の何れかを含んでいる：
RLLALETLMONQQLLNLWGCRGKAICYTS（21）、
QNQQLLNLWGCRGKAICYTSVQWN（22）。
VAUペプチドの合成
「連続フロ−（continuous flow）」Fmoc法を利用した、通常の固相ペプチド合成技術により、VAUペプチドを調製した。このペプチドは、Milligen9050 PEP合成機と、「Millipore」PEG PALレジンとを使用して、最初のC末端アミノ酸を置換して調製した。アミノ酸側鎖は、以下の基で保護した：アルギニンに対してはPmc；アスパラギン、グルタミン、及びシステインに対してはTrt；リジンに対してはBoc；グルタミン酸に対してはtBuエステル；セリン、スレオニン、及びチロシンに対してはtBuエ−テル。一過性のFmoc基は、DMF中の２０％ピペリジン溶液で除去した。それぞれのアミノ酸のカップリング反応は、６等量のDIPCDI及びHOBTで行った。残基の中には、特にアルギニン（１位及び２３位）、システイン（１９位及び２６位）、アスパラギン（１１位）、グルタミン（１０位、１２位、及び１３位）、アラニン（４位）、イソロイシン（９位）、及びロイシン（２位、３位、１４位、及び１５位）は、二重のカップリングが必要であった。
カップリング後、レジンを真空下で乾燥した。ペプチドを、室温で４時間K試薬による処理で支持体より開裂させた。粗ペプチドを沈殿させ、エチルエ−テルで洗浄した。産生物を高圧液体クロマトグラフィ−（HPLC:high pressure liquidchromatography）で精製した（WATERS LC PREP 4000装置、WATERS Delta Pak C18 40Ｘ100mmカ−トリッジ、流速30ml／分、アセトニトリル/0.1％TFAのグラジエント）。該ペプチドを含む画分を合わせて、ロ−タリ−エバポレ−タ−で濃縮後、凍結乾燥した。
環状化
ペプチド（0.025mM）を10mMの酢酸アンモニウム溶液に溶解した。１Ｍの水酸化アンモニウム溶液で、pHを8.5に調節した。pHは、３または４時間後に再び調節した。環状化は、HPLC（WATERS Delta Pak C18 5μカラム、アセトニトリル／0.1％TFAのグラジエント）で、２１４nm、及び２８０nmでモニタ−した。１５時間で環状化は完了した。９７−１００％の酢酸を使用して、pHを６にして、この溶液を凍結乾燥し、ついで粗ペプチドと同じ条件下で精製した。
このペプチドをHPLCと、エレクトロスプレ−技術（FISON VG Trio 2000分光器）を利用したマススペクトロスコピ−により検査した。
Fmoc:９−フルオロエニルメチルオキシカルボニル；
Pmc:８−メチルペンタン−６−スルフォニルクロマン；
Trt:トリトリル；
Boc:Tertブチルオキシカルボニル；
tBu:tertブチル；
DMF:ジメチルホルムアミド；
DIPCDI:ジイソプロピルカルボジイミド；
HOBT:１−ヒドロキシベンゾトリアゾ−ル；
TFA:トリフルオロ酢酸
試薬K:フェノ−ル／水／チオアニソ−ル／エタンジチオ−ル/TFA；２．５ml／２．５ml／２．５ml／１．５ml／４１ml。
HIV-1(VAU)エンベロ−プタンパク質のアミノ酸と、その他のHIVの相当する配列との比較
HIV-1(VAU)に感染した患者由来の、一連の血清試料の、ウェスタ−ン−ブロット分析を図２に示してある。HIV粒子（LAV,BLOT,SANOFI DIAGNOSITIC PASTEUR）由来のタンパク質で、電気泳動により分離されたものを有してる、ニトロセルロ−スのストライプを、同じ血清試料でインキュベ−ションし、その反応性を、製造業者推奨の方法により評価した。得られた結果は以下のようであった：
ステップ１：HIV-1(VAU)患者から、1992年2月に得た血清試料と反応させた、HIV-2特異的タンパク質；
ステップ２−７：HIV-1陽性血清；
２：HIV-1(VAU)患者より、1990年11月に得た血清；
３：HIV-1(VAU)患者より、1990年12月に得た血清；
４：HIV-1(VAU)患者より、1991年2月に得た血清；
５：HIV-1(VAU)患者より、1992年2月に得た血清；
６：陰性の対照；
７：陽性の対照（HIV-1に感染した人より得た血清）。
タンパク質の名前とサイズ（kD）を余白に示した。
図３はHIV-1(VAU)のエンベロ−プのアミノ酸配列を、HIV-1-LAI参照用単離体（Wain-Hobson,et al.,1985）の相当するものと整列させたものである。シグナルペプチド、VP3ル−プ、及びgp41免疫優性エピト−プを網掛けで示した。外部エンベロ−プ糖タンパク質gp120と、膜貫通型gp41との間の開裂部位を矢印で示した。アミノ酸の間の垂直な線は完全な一致を示し、コロン（：）は高い相同性を示し、また点（.）はそれぞれのアミノ酸間での限られた相同性を示す。ウィスコンシンのGCGパッケ−ジのGAPプログラムを使用して、整列を行った。
GAPとBESTFITプログラムの元のバ−ジョン（1.0）は、ニ−ドルマンとバンシュ（Needleman and Vunsch,J.Mol.biol.48,443-453（1970））と、スミスとウォ−タ−マン（Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2;482-489（1981））の詳細な研究報告に基づき、ポ−ル・ヒバ−リ（Paul Haeberli）が記載したものである。この限定整列はポ−ル・ヒバ−リにより開発されて、バ−ジョン3.0に組み込まれた。そしてこれはフィリプ・マルケス（Philip Marquess）による単一のプログラムに融合されて、バ−ジョン4.0になった。整列中のギャップ欠失のペナルティ−は、文献（Rechid,Vingron and Argos CABIOS 5:107-113（1989））で示唆されているようにして修飾した。
図３の整列は、２、３のドメインがあちらこちらで保持されている、より高い分岐度の、数多くの領域を示している。この保持領域は、通常のHIV-1単離体でも保持されている領域にほぼ対応する（Alizon et a1.,1986,Benn et al.,1985）。分岐したドメインの中では、中和決定基とも呼ばれる（Javaherian et al.,1990,Javaherian et al.,1989,Matsushita et al.,1988）VP3ル−プが、明らかに最も分岐している（ただし、ル−プを限定している二つのシステインは保持されている）。HIV-1-LAIではGPGRAFである、ル−プのキャップ配列は、HIV-1(VAU)ではGPMAWYである。キャップのこのユニットは、カメル−ンのOグル−プ単離体（HIV(ANT70)）のものに相当しているが（Van den Heasevelde et al.,1994）、該モチ−フがGPMRWRである、その他のOグル−プ単位体（HIVMVP5180）のものとは異なっている。
エンベロ−プ全体においては、全部で２９の、可能性のあるN-糖付加部位が同定され、このうちの１３が、その他のHIV-1エンベロ−プタンパク質と比較して、保持されている。全部で１９のシステインが見られ、該タンパク質の全体の折畳み構造が保持されていることを示しているが、５つの非保持システインが見られている。
図４は種々のHIV-1単離体における、膜貫通型エンベロ−プ糖タンパク質の外部領域中の免疫優性ペプチドの、マルチプル整列を示している。配列は全て、HIV-1-LAI参照用配列と比較してある。ハイフンはHIV-1-LAIとの相同性を示す。整列は、ウィスコンシンGCGパッケ−ジのPILEUPプログラムを使用して行った。
PILEVPプログラムでは、樹状図で表示される組み立て戦略をUPGMAとよんでいて、これは代数的平均を利用した、「非偏重（unweighted）」ペア−グル−プ法を意味している（Smith,P.H.A.Sokal,R.R.（1973）Numerical Taxonomy（pp.230-234）,W.H.Freeman and Company,San Francisco,California,USA）。PILEVPでのそれぞれのペア−の整列には、ニ−ドルマンとバンシュの方法を使用した（Needleman and Wunsch,Journal of Molecular Biology 48:443-453（1970））。
図４に示されるように、TMタンパク質の外部領域の免疫優性エピト−プのアミノ酸配列は、その他のHIV-1やHIV-2の単離体のものとは、実質的に異なっている。しかしながら、HIV-1とHIV-2ウイルスの間で保存されている多くのアミノ酸は保持されていた。
ある特定のアミノ酸が、Oグル−プ間のみで保存されていることが判明したが、２６アミノ酸のペプチド中の２１位のリジン、７位のスレオニン、及び１１位のアスパラギンがそうである。HIV-1(VAU)患者由来の血清の一つ、そしておそらくはその他のOグル−プウイルスに感染した患者由来の血清によっては、通常のHIV-1エンベロ−プ抗原の検出がされないことが、上記の差異により説明がつく。全体では、HIV-1-LAIと、HIV-1(VAU)のエンベロ−プ配列の比較では、５０％の相同性が示された。HIV-1(VAU)のエンベロ−プ配列はまた、その他の代表的なHIV（報告済みで配列が決定されている、HIV-1のOグル−プの２つのメンバ−である、HIV-1ANT70、及びHIV-1MVP5180）、並びに代表的なSIVとも比較した。この分析の結果を表１に示したが、これによりHIV-1(VAU)がOグル−プに属することが確立された。HIV-1(VAU)のエンベロ−プはHIV-1ANT70のエンベロ−プとは７０％相同で、HIV-1MVP5180とは７１％相同である。
一般的なHIV-1のサブタイプのほとんどでは、エンベロ−プのレベルでの相同性は、同等であり、７４％から８０％の範囲であった。
表１は、HIV-1に関連した、異なるウイルスのエンベロ−プ配列の比較である。番号は、GAPプラグラムを利用して計算した、エンベロ−プ配列間でのアミノ酸相同性の割合を示す：HIV-1 ANT70の場合には、外部エンベロ−プタンパク質のみを比較に使用した。
HIV-1(VAU)抗原を具備した組成物
慨して本発明は、生物学的試料、特にはHIV-1(VAU)、またはHIV-1(VAU)抗原の少なくとも一つに対する抗体と接触させられた人に由来する生物学的試料中での、存在をin vitroで検出するために使用可能な、如何なる組成物にも関する。この組成物は、特許出願EP 84401,834及びEP87400,1514に記載の診断技術を使用して、HIV-1のOグル−プによる感染の選択的診断に適用することが可能である。本発明の背景事情の範囲内で、HIV-1(VAU)に対して産生された抗体により認識されることが可能な抗原性決定基を具備した如何なる組成物（例えば組み換え抗原、ペプチド、またはHIV-1(VAU)のエンベロ−プの配列で定義される、化学的に合成されたペプチド）も使用可能である。この点に関して、本発明はより特には、少なくとも一つのHIV-1(VAU)エンベロ−プタンパク質を有する組成物に関する。例としては、HIV-1(VAU)のgp41タンパク質の５９０−６２０の全領域に対応する、エンベロ−プタンパク質に由来する、タンパク質、糖タンパク質、若しくはペプチド、あるいは上記領域の一部であって、ペプチド-TFIQN-または-WGCKNR-のようなHIV-1(VAU)特異的なものがあるであろう。
本発明は更に、
組み換え型、若しくは合成の、HIV-1(VAU)タンパク質、及び／または糖タンパク質、及び／またはペプチドと、
抽出、溶解、組み換え、または化学合成で得られる、HIV-1、及び／またはHIV-2、及び／または別の、HIV-1のOグル−プに由来した、タンパク質、及び／または糖タンパク質、及び／またはペプチド、及び／または
上記のタンパク質、または糖タンパク質由来であって、HIV-1、及び／またはHIV-2、及び／またはHIV-1のOグル−プにより誘導される抗体により認識されうるペプチド、とを組み合わせた組成物に関する。
診断用組成物であって、HIV-1(VAU)に対して向けられた抗体により認識されうる抗原決定基を有するもの、特にはペプチド組成物は、すでに入手可能である、HIV-1及び／またはHIV-2レトロウイルスによる感染検出用のキットまたは組成物中に含めるか、あるいはこれらと組み合わせて、キットの検出範囲をHIV-1のOグル−プにまで伸長することが可能である。
以下の例があるが、これらは限定するためのものではない：
コアタンパク質、特にはgag、pol、HIV-1及びHIV-2のタンパク質、若しくはそのペプチド、並びにHIV-1(VAU)のエンベロ−プタンパク質、若しくはそのペプチド、
HIV-1のエンベロ−プ糖タンパク質、HIV-2のエンベロ−プ糖タンパク質、及びHIV-1(VAU)のエンベロ−プ糖タンパク質、または
HIV-1タンパク質、及び／または糖タンパク質、HIV-2のタンパク質、及び／または糖タンパク質、並びにHIV-1(VAU)のエンベロ−プタンパク質、及び／または糖タンパク質、
の何れか。
HIV-1のOグル−プのウイルスに感染した患者から由来の抗体は、HIV-1のMグル−プのウイルス由来のgag、及びpol抗原と強く反応するが、Mグル−プのエンベロ−プ抗原との反応性は全くないことに注目するのは重要である。よって、本発明の組成物は、少なくとも一つの、HIV-1エンベロ−プタンパク質、若しくはペプチドを具備していて、このウイルスが確信をもって検出されるようになっていることが重要である。
このような組成物は、診断に用いると、結果的にAIDSの診断や、それに関連した症状の診断に役立ち、これはより広い病原体のスペクトラムにまで拡張される。HIV-1(VAU)エンベロ−プタンパク質、及び／または糖タンパク質のみを含む診断用組成物の使用は、それでもなお、該疾患を引き起こすかもしれないレトロウイルスの範疇の、より選択的な検出にとって有益であることはいうまでもない。
特にHIV-1(VAU)ウイルスにより引き起こされる感染の診断用の方法とキット
本発明は、AIDS、及び関連した症候群の病原体であるHIV-1ウイルスにより引き起こされる感染の、in vitroでの診断用の方法であって、診断する患者由来の血清、または生物学的液体を、HIV-1(VAU)由来のタンパク質、糖タンパク質、またはペプチドを少なくとも一つ含む組成物と接触させる工程と、可能な免疫学的反応を検出する工程とを具備した、方法に関する。このような組成物の例は上に記載してある。
好ましい方法には、例えば、免疫蛍光、またはELISA型の免疫酵素反応が関わる。検出は、直接、若しくは間接的な免疫蛍光の測定、または直接的、若しくは間接的な免疫酵素的アッセイにより影響されうる。
このような検出には、例えば、
マイクロプレ−トのウェルの中に、本発明に準じて、一定量の抽出物、または所望の抗原性組成物をいれる工程；
それぞれのウェルの中に、抗体を含むことが可能であってその存在をin vitroで検出する、希釈済み、または非希釈の血清を導入する工程；
該マイクロプレ−トをインキュベーションする工程；
適切な緩衝液でマイクロプレ−トを注意深く洗浄する工程；
該マイクロプレ−トのウェルの中に、ヒト免疫グロブリンに対する、特異的に標識した抗体を導入する工程であって、上記標識は、基質を加水分解し、後者の放射の吸収を、少なくとも決められた波長のバンドにおいて修飾することが可能なものより選択される酵素である、工程、そして、
好ましくは対照との比較において基質の加水分解の程度を測定して検出し、感染の危険性の目安、または実際の感染の事実とする、工程を具備する。
本発明はまた、以下を特に具備した、HIV-1(VAU)感染の検出用キット、またはボックス（boxes）に関する：
抽出物、より精製された画分、または上記したタイプのウイルスから派生した合成抗原（この抽出画分、または抗原は、例えば放射性、酵素性、蛍光性、若しくはその他の、標識がされている）；
ヒト免疫グロブリンに対する抗体、またはプロテインA（これは例えばアガロ−スビ−ズ、マイクロプレ−トなどのような、水に不溶の支持体に有益に固定される）；
適宜、陰性対照の検体より得た、同じ生物学的液体、若しくは細胞；
緩衝液、及び、適切であれば標識可視化基質。
本発明の主題はさらに、化学合成、または組み換えにより得られる抗原を認識する抗体の形成を誘導することが可能な、免疫原性組成物である。
血清学
HIV-1(VAU)に感染した患者由来の血清抗体が、HIV-1の抗原性調製物と反応する能力を、商業的に入手可能な種々のキット（Sanofi Diagnostic Pasteur,（Genelavai Mixt）Abbott,Wllcome,およびBehring）を利用して評価した。これらの抗体の、種々のHIV-1タンパク質との反応性を、サノフィ−診断パスツ−ル・ウェスタ−ン-ブロット・キットを製造業者推奨の方法で使用して調べた。
より正確には、患者の血清を、HIV-1特異的ELISAキットを使用して数回調べた。最初に試験されて1990年に陽性であると証明されたものは、（測定したODの、バックグラウンドODに対する比で）7.33（サノフィ−診断パスツ−ルキット使用時）、3.50（アボットキット使用時）、及び2.70（ウェルカムキット使用時）であった。HIV-1とHIV-2の両方に特異的な試薬の使用中には、1.42（ベ−リングキット使用時）、4.40（ウェルカムキット使用時）であった。
患者の血清の、異なる日における、異なるHIV-1構造タンパク質との反応性を、HIV-1 LAV BLOT免疫ブロットアッセイ（サノフィ−診断パスツ−ルで販売されている）を使用して調べた。図５に示されるように、調べた血清試料全てにおいて、envタンパク質gp160およびgp120との弱い反応性のみが見られた。しかしながら、該血清はHIV-1のgagタンパク質p55（gag前駆体）、及びp24（CA）、並びにpol産物p66（RT）、及びp34（IN）とは強く反応した。HIV-2免疫ブロッティングにより、非常に弱い反応性がgag p26に関して検出された。
これは、Oグル−プに特異的な抗体に関しての、商業的に入手可能な血清診断キットでの検出は、注意深く制御するべきであることを例示している。Oグル−プウイルスに感染した患者からの血清抗体は、Mグル−プのgag、及びpol抗原との強い交差性を示すが、それらはMグル−プのエンベロ−プ抗原とはほとんど反応しないか、全く反応しない。結果として、、Mグル−プに基づくキットの中には、上記患者のかなりの割合を検出しないものがあると推定できる。実際に、Oグル−プに感染した患者由来の、幾つかの血清を使った最近の予備的研究により、Oグル−プに特異的な抗体を検出する能力は、使用する検出キットにより、かなり異なっていることが明らかになった（Loussert-Ajaka,I.,Ly,T.D.,Chaix,M.L.,Ingrand,D.,Saragosti,S.,Courrouce,A.M.,Brun-Vezinet,F.,and Simon,F.,（1994）HIV-1／HIV-2seronegativity in HIV-1 subtype O infectedpatients）。これは、多くのOグル−プ血清の、市場で入手可能な診断キット全てとの反応性を、注意深く且つ徹底的に調べる必要があることを示唆している。
HIV-1(VAU)ウイルス由来で、組み換え、若しくは合成抗原より調製した、ポリクロ−ナル、若しくはモノクロ−ナル抗体を具備した組成物
本発明は、HIV-1(VAU)、特にはHIV-1(VAU)の抗原性エピト−プ、より特にはHIV-1(VAU)のエンベロ−プタンパク質の抗原性エピト−プを動物に接種して、該動物内で産生されうる血清に関する。本発明はより特には、それぞれの抗原、特には該ウイルスのタンパク質、または糖タンパク質に向けられたポリクロ−ナル抗体に関する。更には、種々の技術により産生されるモノクロ−ナル抗体であって、それぞれ種々のHIV-1(VAU)タンパク質、特にはHIV-1(VAU)のエンベロ−プタンパク質に向けられている抗体、より特には該タンパク質に対する抗体に関する。
上記のポリクロ−ナル、またはモノクロ−ナル抗体を、種々の適用において使用することができる。本質的には、相当するタンパク質の中和のための使用であり、またはウイルス全体の感染性の阻害のための使用でもよいであろう。例えば、生物学的調製物中の、ウイルス抗原の検出、または相当するタンパク質、及び／または糖タンパク質の精製工程（例えばアフィニティ−クロマトグラフィ−カラムでの使用）を行うのに使用してもよい。
例を挙げると、抗エンベロ−プ抗体、または抗gag抗体は、診断に使用可能な試薬であり、特にはHIV-1のOグル−プを、抗原捕獲ELISAにより検出するための試薬である。
本発明は、１以上のHIV-1(VAU)のアミノ酸配列より産生される、HIV-1(VAU)のウイルス抗原に向けられる抗体に関する。本発明のHIV-1(VAU)ウイルスの抗原性エピト−プと同等の抗原性エピト−プから、抗体を得る技術は、すでに記載されている。
当業者は、アルマ−（Ulmer et al.,1993）らにより報告済みの抗体調整用技術を使用して、本発明の抗体を調製することができるが、本発明の抗原に適応させることが可能な修飾は、当業者の知識の一部を形成する。
vauペプチドの免疫反応性の調査
抗HIV抗体のスクリ−ニングに対して確立されている方法にそって、ELISAプレ−トを調製して、vauペプチドの免疫反応性が確認された。この試験は、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）であるVAU株のエンベロ−プ糖タンパク質の免疫優性エピト−プを模倣するペプチドで調製した固相の検出に基づいている。該試験の実行は、Genelavia（登録商標）Mixtキットで提案されている方法により、該キットでの試薬を使用してモデル化された。
図２１及び図２２の二つの表で照合される実験デ−タは以下のことを示している：
（a）HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）ウイルスで汚染されている患者からの４つの血清は、vauペプチドと強く反応する；
（b）Pasteur Institute of Yacoundeから送られてきた１９の血清のうち、HIV-1のO（グル−プ、またはサブグル−プ）ウイルスで汚染されている患者からと見られる１０の血清もまた、同じペプチドとの高い反応性を示す；
（c）HIV-1のBサブタイプウイルスで汚染された人（急性期）からの血清（４つの試料）は、vauペプチドとの反応性は示さない；
（d）無症候性の血液ドナ−より得られた血清（４８の試料を試験した）は、vauペプチドとの反応性は示さない；
これらの実験デ−タは、（HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）の抗体陽性試料が不足（paupicity）しているが）選択したペプチドの感受性と特異性とに関する証拠となる。
上記のテキストからは、本発明は更に、上記した抗体を、種々の段階を有する方法で使用することにより、HIV-1(VAU)ウイルス、または変異体を検出することに関していると分かるが、前記の段階は特にHIV-1(VAU)ウイルスの特徴的性質を明らかにすることを目的としている。
本発明はまた、分子ハイブリダイゼーションによる、HIV-1(VAU)ウイルスの検出に関する。
慨して、HIV-1(VAU)ウイルスのキャリア−であると思われる患者由来の、生物学的試料、またはその他の生物学的液体若しくは組織中に、HIV-1(VAU)ウイルス、または変異体を検出するこの方法は、以下の段階を具備している：
適宜標識された少なくとも一つのプロ−ブを製造する段階；
疑いのある患者の試料中の核酸を前記の標識プロ−ブと接触させて、適宜該複合体を適切な固相支持体上に固定化する段階；
適切であれば、該固相支持体を適切な洗浄溶液で洗浄する段階；
該複合体を検出し、よってHIV-1(VAU)の存在、または非存在を当業者に知られる適切な検出方法により検出する段階。
本発明のこの方法に関する、別の好ましい態様においては、上記したハイブリダイゼーションは、非厳密な条件下で行なわれ、且つ、膜はハイブリダイゼーション用に適応した条件下で洗浄される。
血清学、またはポリメラ−ゼ連鎖反応（PCR）のような遺伝子増幅技術を使用して、HIV-1のOグル−プの流行度が正確に評価される。カメル−ンの、５から１０％のHIV-1感染患者は実際にOグル−プのウイルスに感染していることが判明した。しかしながら、本願で記載したウイルス単離体とは別に、西中央アフリカの外での、Oグル−プの伝播は記録に残っていない。HIV-1(VAU)が単離された前記の患者は、フランスにずっと居住していてアフリカには一度も旅行したことがない。現在までには、該患者の感染源に関する正確な証拠は全くないが、このケ−スはOグル−プウイルスのある程度の伝播がヨ−ロッパですでに起きていることを示す。
本発明はまた、生物学的試料中の、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）レトロウイルスに特徴の抗体と、HIV-1-Mタイプのレトロウイルスに特徴の抗体とを、検出、及び区別するための方法であって、該生物学的試料を、HIV-1-Mタイプのレトロウイルスに特徴的である抗体とは反応しないペプチド、特には上記した、ペプチド（１）、（２）、（３）、（４）、（５a）、（５b）、（９）及び（１０）から選択した一つと、接触させることを特徴とする、方法に関する。
更に本発明は、生物学的試料中の、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）レトロウイルスに特徴の抗体と、HIV-1-Mタイプのレトロウイルスに特徴の抗体とを、検出、及び区別するための方法であって、図８及び９で考慮に入れたHIV-1のMウイルスの中の一つに由来し、尚且つペプチド（１）、（２）、（３）、（４）、（５a）、（５b）、（９）及び（１０）から選択したペプチドと相同性であるものと、上記生物学的試料を接触させることを特徴とし、またこの相同性ペプチドの配列は、図８または９に記載される、該配列自身がHIV-1のMウイルスの対応した適切なペプチド配列中に含まれる、独自の連続したアミノ酸の垂直整列より得られるものであり、図８または９からもまた、該ペプチドの連続したアミノ酸配列が選択される、上記の方法に関する。
本発明によると、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）レトロウイルスによる感染と、HIV-1のMサブグル−プレトロウイルスによる感染とを検出、及び区別する方法はAIDSの診断試験にかけられる患者に由来する血清を、特にペプチドRILAVERYと接触させることで特徴付けられる。
更に、HIV-1のOサブグル−プまたはHIV-1のMサブグル−プレトロウイルスによる感染の検出方法は、二つの範疇のペプチドの混合物、すなわちその一方の範疇が、ペプチド（１）、（２）、（３）、（４）、（５a）、（５b）、（９）、及び（１０）に相当するものを使用することにより特徴付けられる。
更に、HIV-1-O DURレトロウイルスによる感染と、HIV-1-Oの別のタイプのレトロウイルスによる感染とを区別する方法は、生物学的試験試料を、ペプチド（１１）から（１５）、またはペプチド（１７）から（２０）の何れかと接触させることにより特徴付けられる。
あるいは、本発明は、HIV-1のOグル−プ（又はサブグル−プ）のレトロウイルスによる感染と、HIV-1のMサブグル−プレトロウイルスによる感染とを区別する方法であって、開裂作用部位がSRジペプチドであるセリンペプチダ−ゼを使用することと、このレトロウイルスがHIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）のレトロウイルスであるか、HIV-1のMサブグル−プのレトロウイルスであるかに応じて、該レトロウイルスのgp120のVP3の開裂、または非開裂を検出することを具備している方法である。
本発明は更に、生物学的試料中の、HIV-1のMサブグル−プレトロウイルスによる感染と、HIV-1のOグル−プ（サブグル−プ）による感染とを検出、及び区別するための組成物であって、一方が特に、（１）、９２）、（３）、（４）、（５a）、（５b）、（９）、及び（１０）である、二つの範疇のペプチドの混合物を具備している、組成物に関する。
ペプチド（１）から（２０）のそれぞれに特異的なモノクロ−ナル抗体もまた、本発明の範囲に含まれる。
本発明は更に照会番号I-1548,I-1549,I-1550の下に、1995年2月24日にCNCMに寄託されたもののなかより選択したプラスミドにも関する。
本発明は更に、本発明で定義されるペプチド（１）から（２０）のそれぞれをコ−ドする配列を有する核酸に向けられている。
好ましい核酸配列の中では、図１０、１１、または１２に表示のものが選択されるであろう。
本発明は更に、上で定義した核酸を含むベクタにも関する。
本発明は更に、前記核酸、または前記ベクタの何れか一つを含むと考えられる細胞に向けられている。
本発明は更に、照会番号I-1542の下に1995年2月23日にCNCMに寄託されたもののようなウイルスに関する。
本発明の範囲にも含まれるウイルスは、上記と同じグル−プのウイルスであって、このウイルスのコンセンサスペプチドが、上記したペプチド、またはポリペプチドを特異的に認識する抗体により認識されることを特徴とするものである。
このウイルスのゲノムＲＮＡもまた、本発明の範囲に入る。
更に本発明の範囲に入るものには、HIV-1タイプのヒトレトロウイルスに感染したと思われる患者からの血清、またはその他の生物学的試料中にある、抗体を検出するためのキット、またはボックスがあるが、これは以下を具備することを特徴としている：
配列が、特に上記した（１）から（２０）の配列の一つを有する、少なくとも一つのペプチド、またはポリペプチド；
上記のペプチド、または上記のポリペプチドと、試験する試料中に存在するかもしれない抗体との間の免疫複合体の形成反応を許容する手段（例えば、必要であるならば１以上のインキュベーション用緩衝液）；
陰性対照試料；
形成される、抗原／抗体複合体を可視化する手段。
更に本発明によると、このキットには、
HIV-1株より由来する少なくとも一つのコンセンサスペプチド若しくはポリペプチド、あるいは、
このポリペプチド若しくはペプチドの配列とは別個であり、その中の１以上のアミノ酸がその他のアミノ酸で置換されているアミノ酸配列（ただし、当該ペプチドには、コンセンサスペプチド若しくはポリペプチドに対する血清との反応性が保持されている）、または、
１以上のアミノ酸が欠失、付加されているアミノ酸配列（ただし、当該ペプチド、またはポリペプチドはには、コンセンサスペプチド若しくはポリペプチドに対する血清との反応性が保持されている）、
の何れかを具備したペプチド、若しくはポリペプチドに由来する少なくとも一つのコンセンサスペプチド若しくはポリペプチドを更に有している。
好ましくは本発明のキットは更に、別のHIV株、好ましくはHIV-1-LAI株に由来する、少なくとも一つのペプチド、またはペプチドを有する。
本発明は更に、本発明のレトロウイルスによる感染の、in vitroでの診断用の、ポリペプチド組成物、またはその変異体の一つに関するが、この診断は、上記の感染後に形成される抗体を含んでいると思われる生物学的試料に対して行なわれる。この組成物は、ペプチド（１）から（２０）のうち、少なくとも一つを具備していることを特徴とする。
生物学的試料は、特には血液、血漿、血清、またはその他の生物学的抽出物からなる。上記の組成物は、上記の生物学的試料のうちの一つの中の抗体を検出するのに使用することが可能である。
よって本発明は更に、特にHIVタイプのレトロウイルスによる感染の、in vitroでの診断方法であって、以下の工程で特徴付けられるものに向けられている：
HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）レトロウイルスに対する抗体を含むと思われる生物学的試料を、上に定義したペプチド、または上に定義したペプチド組成物と、抗原／抗体型の免疫複合体の形成を許容する適切な条件下で、接触させる工程；
存在する可能性のある上記の複合体を検出する工程。
本発明は更に、ワクチン作成に許容される薬学的媒介物（vehicle）と組み合わされた、少なくとも一つのペプチドを具備することを特徴とする、免疫学的組成物に関する。
本発明は更に、以下の工程を具備することを特徴とする、本発明のカプシドタンパク質、gp41、gp120の調製方法に関する：
本発明のHIV-1レトロウイルスに感染した細胞を溶解して、上清と感染細胞とを分離するか、または遠心により調製したウイルス沈殿物を溶解する工程；
細胞抽出物、及び／またはウイルス抽出物を、精製済み抗体を含む免疫吸着剤（immunoadsorbant）にかける工程（該抗体は、本発明のレトロウイルスに感染した人の血清より得られ、また有益には適切な支持体に固定されていて、感染者の該血清は、本発明のウイルスのエンベロ−プタンパク質と強く反応する能力がある）；
緩衝液の存在下で、抗原／抗体の免疫複合体の形成が起きるのに十分な時間だけ、インキュベーションする工程；
上記の免疫吸着剤を緩衝液で洗浄して、該支持体に保持されていない分子を除去する工程；
所望の抗原性タンパク質を回収する工程。
この調製方法の第一の態様によると、HIV-1 DURのカプシドタンパク質、並びに糖タンパク質gp41、及びgp120の分離と回収は、電気泳動法と、該タンパク質の電気的還元法により行える。
この調製方法の別の態様によると、該タンパク質は以下の工程により回収できる：
上記の免疫吸着剤に付着したタンパク質を溶出させる工程；
上記のように溶出された産物を、分離支持体に付着された抗体であって、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）DURのカプシドタンパク質、糖タンパク質gp41及びgp120を認識するものを有する、クロマトグラフィ−カラムにより精製する工程。
本発明の範囲に更に含まれるものには、本発明のペプチド、またはポリペプチドであって、以下のようにして産生される方法が含まれる：
本発明の核酸を発現する；または、
アミノ酸を付加して、該ペプチド、または該ポリペプチドが得られるまで化学合成する。
遺伝子工学の標準的な原理と方法を使用することが可能である（Molecular Cloning,Sambrook,Fritsch,Maniatis,CSH 1989）。
本発明の範囲に含まれるものにはまた、上記した核酸の産生方法があるが、これは本発明のウイルスより単離するか、化学合成か、または特異的プライマからの、核酸のin vitro増幅の技術により行なわれる。
本発明によるオリゴヌクレオチドプライマはまた、以下のヌクレオチド配列中の、少なくとも８つの連続するヌクレオチドを具備した配列を有する：
更に、本発明はPCRや上記した相当する技術にによる増幅を許容するキットに関する。
更に本発明の範囲には、本発明によるレトロウイルスを含んでいる、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）DURレトロウイルスに特徴的である核酸の、生物学的試料中での存在を検出する方法が含まれる。この方法は、上記の生物学的試料中に含まれるＲＮＡより形成したcDNAを、このcDNAとレトロウイルスゲノムとのハイブリダイゼーションを許容する条件下で接触させる工程と、このウイルス試料の遺伝子増幅を実行する工程とを具備している。
本発明はまた、本発明のウイルスで感染した細胞の溶解により得られるウイルス溶解物にも関する。
特に上記したペプチド、またはポリペプチドを含む、HIV-1(DUR)（またはHIV-1(VAU)）株もまた、本発明の範囲に含まれる。
本発明は、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）DURの構造、またはこのレトロウイルスの変異体より得られる、特異的ペプチドであって、以下を可能にするものに関する：
状況に応じて、
地球規模でOのカテゴリ−のHIV-1と、Mのカテゴリ−のHIV-1とを区別するか、または、
より特異的には、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）DURと、Oサブグル−プのその他のウイルスとを区別するか、あるいは、
一方で、全てではないにしろほとんどのレトロウイルスで、Oグル−プ（またはサブグル−プ）及びMサブグル−プの両方を認識する。
更に本発明の範囲に含まれるものには、HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）、またはHIV-1のMサブグル−プの、対応する構造タンパク質に由来の、相当するペプチドであって、特にはGAG、gp120、およびgp41より由来する構造タンパク質でその一部が図に示されているものがあるが、上記の相同的なペプチドは整列により得られ、更にまたHIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）DUR、より特異的には本願で同定したものに由来するペプチドの図からも得られるものである。
同様に、ある種の相同性ペプチドは上記した区別を可能にする試験で使用することが可能であり、この場合にはGAG、gp120、及びgp41の構造タンパク質由来の、対応するペプチドにかわって使用される。
Oグル−プ特異的なオリゴヌクレオチドの決定
VAU配列、並びにMVP5180、及びANT70配列との相関関係を使用して、全体がVP3領域及びgp41領域に対してOサブグル−プ特異的であるようにしたプライマを決めた。これらのプライマにより、DUR株を増幅することが可能になり、結果としてぶちあたっていた増幅の問題の一つの解決となった。これらのHIVのOサブグル−ププライマの配列と部位を、図１３に記載してある。これらのプライマにより、臭化エチジウム染色で可視化できる増幅バンドを、３０サイクルの単一ステップのPCRで得ることが可能になる、部分配列が得られた：
GAG:513塩基対（１７１アミノ酸）＝配列認識番号９；
gp120 VP3ル−プ:５２５塩基対（７５アミノ酸）＝配列認識番号１０；
gp41免疫優性領域：３１２塩基対（１０４アミノ酸）＝配列認識番号１１。
DUR配列に関して、ヌクレオチド（図１５）、及びタンパク質（図１６）の比較をOサブグル−プのMVP5180、ANT、及びVAU配列、HIV-1のコンセンサス配列、代表的なアフリカンHIV-1のMAL配列であるLAI、ガボンチンパンジ−のCIVのCPZで行うと、その他の報告済みのHIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）株同士が遠縁であるのと同じように、DURも、その他の報告済みのHIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）株から離れている。
差異はGAG領域でより少なく、またgp120のVP3領域で最大であり、このタンパク質の比較では差異が４０％にまで達する（図１６）。系統樹により、DUR株がOサブグル−プの一部を形成することが一方で確認され、また記載された種々のO株間での差異の受容性が他方では証明されたが、明らかなサブタイプの枝分かれは起きていなかった（図１７）。
GAG配列の比較
得られたGAG配列とその他の報告済みの２つのO株（ANT70、及びMVP5180）との比較はもちろん、Mグル−プの代表的な配列（図８）との比較により、Oのコンセンサス配列が複数の領域内に存在し、これが同じ領域のMのコンセンサス配列とは異なっていることが判明した。MよりもOに対しての方がより多様である、２つの超可変領域、及び一方または他方における、２、３の部位変異もまた判明した。しかしながら、SPRT・・・SEGA、MLNAI・・・KEVIN、GPLPP・・・QQEQI、及びVGD・・・SPVの領域は、Oのコンセンサス配列と、Mのコンセンサス配列との間では異なっているようである。
QQA及びLWTTRAGNPの領域は超可変領域である。HIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）DUR株は、M及びOのコンセンサス配列に対して、３つの部位で明らかに異なっていて（Iに対してL、Eに対して２回）、単離された３つの超可変部位に特異的なアミノ酸を有する（L9にV、A77にA、110にL）。
更に、GAG領域内に、例えばSPRTLNAWVK、GSDIAGTTST、及びQGPKEPFRDYVDRFのような、Oグル−プと、Mグル−プに共通な断片を決めることは可能である。
VP3ル−プ配列の比較
この比較実験では、HIV-1のMサブグル−プのコンセンサス配列とは、最高で５６％までのタンパク質の差異が見られ、、またHIV-1のOグル−プ（またはサブグル−プ）のコンセンサス配列とは、３５から４２％のタンパク質の差異が見られた。
gp120中のVP3ル−プ領域中、及びgp41中の免疫優性領域中のペプチド配列の整列を、図９に示してある。DUR株のVP3ル−プの内部の配列は、HIV-1のMサブグル−プのコンセンサス配列のものとはかなり異なっている。VAU及びANT70株とは、GPMAWYSMモチ−フを共有しているが、２つの置換（Aに対してR、及びYに対してR）があるMVP株とは共有していない。
VP3ル−プの残りの左右部分は、他の既知のHIV全てとはかなり異なっていて、他の交差性を有するとは想像できないほどであった。更にDURのVP3ル−プは他のOコンセンサス配列よりも１アミノ酸だけ長く、これはHIV-1のMグル−プの配列よりも１アミノ酸だけ長い。
gp41の免疫優性領域に関する、整列の比較
配列CRGKAICを有する、DUR株の「ミニル−プ」はこの株に非常に特異的であることが証明された：これはエピト−プを構成するかもしれない（図９を参照）。更に、この配列は、gp41糖タンパク質のアンフォ−ルディングの状態の修飾に関わる可能性があり、結果的には該株の感染に関わる。
このル−プを挟む１１アミノ酸長の長い配列は、VAU配列と同じである。DUR株の多型性は、分析したクロ−ンでは、SまたはTの部位で見ることが可能である。
他の既知のレトロウイルス株より得た、対応するペプチドもまた、図９に示してある。
DUR株は更に、HIVのOサブグル−プの、gp41領域に関するコンセンサス配列の決定を可能にし、その中の幾つかの充分に長い相同性領域を使用することができる。これらの相同性領域は、とりわけ、RL*ALET,QNQQ,LWGL,及び
CYTV（*は可変アミノ酸を意味する）である。
血清学的相関関係
抗DUR血清は、HIV-1-Mのコンセンサス配列、HIV-1 MAL、HIV-1 CPZ、またはHIV-1のOグル−プ（またサブグル−プ）のMVP5180、の中のVP3ル−プのペプチドとは反応しないが、しかし、HIV-1-O ANT70のVP3ル−プのペプチドとは反応する。gp41の免疫優性領域に関しては、これは「標準的な」HIV-1のMサブグル−プのコンセンサス配列とは反応しないが、しかしながら驚くことに弱いながらも、HIV-1のMサブグル−プの右に伸長しているコンセンサス配列とは反応する。
参考文献
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- 化学合成により得られる、請求項１または２に記載のプローブとして使用可能なポリヌクレオチド。
- 以下の（i）または（ii）のアミノ酸配列からなるエンベロープタンパク質のポリペプチドをコードする、プローブとして使用可能なポリヌクレオチド：
（i）RLLALETFIQNQQLLNLWGCKNRLICYTSVKWNKT；または
（ii）HIV-1VAUのエンベロープタンパク質のアミノ酸残基５２７〜８７７からなる以下の配列：
- 標識されていることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載のプローブとして使用可能なポリヌクレオチド。
- 放射性標識、酵素標識または蛍光標識で標識されていることを特徴とする、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
- HIV-1VAUレトロウイルスのキャリアであることが疑われている患者から得た、血清またはその他の生物学的流体もしくは組織の試料中に、HIV-1VAUレトロウイルスが存在するか否かを検出するための組成物であって、請求項１〜６の何れか１項に記載の少なくとも一つのポリヌクレオチドを含むことを特徴とする組成物。
- 請求項１〜４の何れか１項に記載のポリヌクレオチドによりコードされるペプチドまたはポリペプチド。
- HIV-1VAUレトロウイルスのエンベロープタンパク質であって、
配列番号５の配列（I）のポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させることにより得ることができることと、
該タンパク質が、HIV-1VAUのエンベロープタンパク質のアミノ酸残基５２７〜８７７の以下のアミノ酸配列：
を特徴とする、HIV-1VAUレトロウイルスのエンベロープタンパク質。 - ポリペプチドの配列が、以下のアミノ酸配列からなるポリペプチド：
- 合成ペプチドであることを特徴とする、請求項１０に記載のポリペプチドまたはペプチド。
- ヒト生物学的試料中に抗HIV-1VAU抗体が存在することをin vitroで検出するための組成物であって、請求項８〜１１の何れか１項で規定されるHIV-1VAUレトロウイルスのエンベロープタンパク質のポリペプチドまたはペプチドを含む少なくとも一の抗原を含む組成物。
- Ｏグループに属さないHIV-1ウイルスおよび/またはHIV-2ウイルスのペプチドを更に含むことを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
- Ｏグループに属さないHIV-1および/またはHIV-2のペプチドが、GAGまたはPOLタンパク質、またはその断片であることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
- Ｏグループに属さないHIV-1および/またはHIV-2のペプチドが、エンベロープ糖タンパク質であることを特徴とする、請求項１３に記載の組成物。
- 請求項８〜１１の何れか１項に記載のタンパク質、ペプチドまたはポリペプチドを認識することが可能な抗体。
- HIV-1VAUウイルスに対して特異的な抗体をin vitroで検出するための方法であって、
検出の対象となる被検体から得た血清または別の生物学的媒質を、
請求項８〜１１の何れか１項に記載のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの少なくとも一つ、または
請求項１２〜１５の何れか１項に記載の組成物
と接触させること、および
免疫学的反応を検出すること
を含む方法。 - ウェスタンブロット（免疫ブロッティング）またはELISA反応に必要な試薬であって、
請求項８〜１１の何れか１項に記載のタンパク質、ペプチドもしくはポリペプチド、または
請求項１２〜１５の何れか１項に記載の組成物
を含む試薬。 - 請求項１に記載のポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドによりコードされる抗原に対する抗体をin vivoで合成誘導する際に使用するためのポリヌクレオチド。
- 動物内で抗体を誘導することが可能である、請求項１２〜１５の何れか１項に記載の組成物。
- 生物学的試料について、HIV-1VAUレトロウイルスをin vitroで検出するためのキットであって、プローブとして、請求項１〜６の何れか１項に記載の少なくとも一つのポリヌクレオチド、または請求項7に記載の組成物を含むことを特徴とするキット。
- 請求項５に記載の別のプローブを更に含む、請求項２１に記載の検出キット。
- 前記プローブが固相支持体に固定化されていることを特徴とする、請求項２１または２２に記載の検出キット。
- ハイブリダイゼーションを行うために必要な試薬を更に含むことを特徴とする、請求項２１〜２３の何れか１項に記載のキット。
- HIV-1VAUのキャリアであることが疑われる患者から得た、血清試料またはその他の流体もしくは生物学的組織中に、HIV-1VAUウイルスが存在するか否かを検出するための方法であって、
請求項１〜６の何れか１項に記載のポリヌクレオチドを、生物学的流体中に含有される細胞から得た核酸またはこれら流体自体の何れかと、これら核酸がこれらプローブとのハイブリダイゼーションにアクセス可能にされている条件で、これらプローブとこれら核酸とのハイブリダイゼーションを許容する条件下で、接触させること、および
起こり得るハイブリダイゼーションを検出すること
を含む方法。 - 請求項１〜６の何れか１項に記載のポリヌクレオチドの発現により、抗原、ポリペプチドまたはペプチドを作成する方法。
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