ES2293643T5 - Secuencias nucleotídicas de antígenos retrovíricos vih-1 del grupo (o subgrupo) o. - Google Patents

Secuencias nucleotídicas de antígenos retrovíricos vih-1 del grupo (o subgrupo) o. Download PDF

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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA PROTEINA DE RETROVIRUS VIH-1 GRUPO (O SUBGRUPO) O, O POLIPEPTIDO O PEPTIDO NATURAL O SINTETICO QUE COMPRENDE AL MENOS UNA PARTE DE DICHA PROTEINA, SUSCEPTIBLE DE SER RECONOCIDA POR ANTICUERPOS SUSCEPTIBLE DE SER AISLADOS A PARTIR DE SUERO OBTENIDO TRAS UNA INFECCION POR UNA CEPA VIH-1 GRUPO O VAU, O UNA CEPA VIH-1 GRUPO (O SUBGRUPO O DUR.

Description

La invención se refiere a los antígenos obtenidos mediante la expresión de secuencias nucleotídicas o mediante la síntesis química, por ejemplo usando sintetizadores de la marca Applied-Biosystems presentes en las variantes de VIH-1 del grupo (o del subgrupo) O, y particularmente a los antígenos que corresponden a los que se pueden aislar de las partículas víricas. A título de ejemplo de virus VIH-1 del subgrupo O, se hará referencia al aislado VIH-1(VAU) así como al aislado VIH-1(DUR).
Se recuerda que la designación HIV usada en este texto corresponde a la designación VIH asimismo usado.
La invención se refiere asimismo a los anticuerpos, policlonales o monoclonales, inducidos por estos antígenos.
La invención se refiere asimismo a secuencias de ADN clonadas que presentan una analogía de secuencia, o bien que presentan una complementariedad con el ARN genómico del virus citado anteriormente. La invención se refiere asimismo a procedimientos de preparación de estas secuencias de ADN clonadas. La invención se refiere asimismo a los polipéptidos que contienen secuencias de aminoácidos codificados por las secuencias de ADN clonadas.
Además, la invención se refiere a aplicaciones de los antígenos mencionados anteriormente, para la detección in vitro en el ser humano de potencialidad de ciertas formas del SIDA y, en algunos de ellos, para la preparación de composiciones inmunógenas y composiciones vacunales contra este retrovirus. Asimismo, la invención se refiere a las aplicaciones para los mismos fines de dichos anticuerpos y, para algunos de ellos, a su aplicación para la producción de principios activos de medicamentos contra este sida humano.
La invención se refiere asimismo a la aplicación de las secuencias de ADN clonadas y de polipéptidos obtenidos a partir de estas secuencias como sondas o cebadores, para la amplificación génica, en kits de diagnóstico.
La invención se refiere asimismo a composiciones de antígenos, que se pueden obtener mediante síntesis química o mediante expresión en un hospedante celular recombinante y que permiten el diagnóstico de una infección debida a un retrovirus humano de tipo VIH independientemente del subtipo VIH-1 o VIH-2. Dichas composiciones comprenden al menos un péptido seleccionado de entre los péptidos antigénicos comunes a los virus VIH-1, VIH-2, VIH-1(DUR) y VIH-1(VAU), o variantes de estos péptidos antigénicos que poseen características inmunógenas parecidas.
La invención tiene asimismo por objeto composiciones que permiten el diagnóstico específico de una infección debida a un retrovirus humano de tipo VIH-1, más particularmente el VIH-1 del grupo M, el VIH-2 o el VIH-1 del grupo (o del subgrupo) O, y que comprende al menos un péptido antigénico específico del virus VIH-1, un péptido antigénico específico del virus VIH-1 y un péptido antigénico específico del virus del VIH-1 del grupo (o del subgrupo) O, o variantes de estos péptidos antigénicos que poseen características inmunógenas parecidas. Más particularmente, los péptidos antigénicos derivan de la proteína de cubierta de los virus VIH-1 del grupo M, VIH-2 y VIH-1 del grupo (o del subgrupo) O.
Por otra parte, la invención describe un péptido que permite una detección de anticuerpos anti-VIH que los péptidos de la técnica anterior no siempre permitían detectar basándose en particular en el descubrimiento de una nueva cepa de VIH-1: VIH-1 DUR. El antisuero dirigido contra ella no siempre presenta una reactividad con los péptidos del consenso VIH tal como se usa hoy en día. La expresión “consenso VIH” se refiere a las regiones conservadas entre aislados y cuya detección es esencial para la concepción de vacunas o de reactivos de diagnósticos, y cuya puesta en evidencia es esencial para la concepción de vacunas o de reactivos diagnósticos, y cuyas mutaciones confieren la resistencia a los medicamentos antivíricos. El término “péptido” usado en el presente texto, define tanto los oligopéptidos como los polipéptidos.
Estado de la técnica
Se han aislado y caracterizado dos tipos de virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que tienen una responsabilidad en el desarrollo de un SLA o del SIDA. Se ha aislado y descrito un primer virus denominado LAV-1 o VIH-1 en la solicitud de patente GB 8.324.800 y en la solicitud EP 84401.834 del 14/09/1984. Este virus también se ha descrito por F. Barré-Sinoussi et al., en Science (1983), 220. 868-871.
El retrovirus VIH de tipo 2 pertenece a una clase distinta y tiene sólo un parentesco inmunológico reducido con los retrovirus VIH de tipo 1. Se han descrito los retrovirus VIH-2 en la solicitud de patente europea nº 87.400.151.4 publicada con el número 239.425.
El retrovirus VIH-1 es el más habitual y su presencia es predominante en varias regiones del mundo. En cuanto al retrovirus VIH-1, se encuentra lo más frecuentemente en África occidental, aunque su propagación en el exterior de esta región ya se ha documentado recientemente por Grez et al., (1994) J. virol. 68, 2161-2168.
El conjunto de los lentivirus de la inmunodeficiencia de los primates, que comprende los virus de tipo 1 y de tipo 2 de la inmunodeficiencia humana, así como varios tipos de virus de primates no humanos, aumenta en tamaño y en complejidad. El más habitual de estos virus, el VIH-1, se extiende actualmente en forma de epidemia mundial, y es responsable de un problema de salud pública importante. Poco después de la identificación y la caracterización molecular de este virus, se ha reconocido como muy variable, y comprende actualmente varios subtipos (Myers, 1994, Louwagie, et al. 1993, Louwagie, et al. 1992, Myers, G. (1994) VIH-1 subtypes and phylogenetics trees. En: Human Retrovirus and AIDS 1994; Myers, G., Korber, B., Wain-Hobson, S., Smith, R.F. y Pavlakis, G.N., ed. Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM. III-2 -III-9.). Esta distinction de subtipos se basa esencialmente en la divergencia de los genes gag y env. Se han identificado al menos 6 subtipos, denominados A a F, pero algunos son todavía susceptibles de aparecer de la importante encuesta mundial en curso sobre los aislados del VIH-1. Se ha encontrado que estos diferentes subtipos son equidistantes unos de otros, en un perfil filogenético denominado filogenia en estrella, lo que sugiere que los diferentes subtipos del VIH-1 habrían evolucionado y divergido de manera simultánea a partir de un antepasado común.
Recientemente, se han aislado y caracterizado dos virus distintos de este grupo de virus VIH-1. Estos dos virus se obtuvieron de pacientes que viven en Camerún, en África del oeste central (Gürtler et al., 1994, Van den Heasevelde et al., 1994). Su secuencia, más particularmente la secuencia de su gen env (cubierta), muestra claramente que estos virus pertenecían a una categoría distinta del virus emparentado al VIH-1, denominado VIH-1 del grupo O (NKENGASONG et al., 1993).
Sin embargo, no se conoce la diversidad de los aislados dentro de este grupo de virus emparentados al VIH-1, y no se documentó su propagación fuera de África.
Una obligación general en la realización de ensayos serológicos VIH, es evitar tanto las reacciones falsamente positivas como falsamente negativas, conservando o mejorando la sensibilidad que permiten los ensayos anteriores en materia de detección de seropositividad.
Los ensayos basados en el uso de péptido(s) de consenso, esencialmente derivados del gen “env” se han considerado como una solución prácticamente ideal hasta que el descubrimiento de la variante VIH-1-O hizo entrever la posibilidad de resultados falsamente negativos (Genomic cloning and complete sequence analysis of a highly divergent African human immuno-deficiency virus isolate. J. Virol. 1994; 68: 1586-96; a new subtype of human immuno-deficiency virus type 1 (MPV-51 00) from Cameroon. J. Virol. 1994; 68:1581-85).
La no reactividad de ciertos ensayos con antígeno peptídico “env” en pacientes que presentan a pesar de todo ciertos síntomas clínicos característicos del SIDA o de los síndromes linfoadenopáticos que les preceden a veces, se imputa a veces hoy en día a una infección del grupo VIH-1-O (VIH-1/VIH-2 seronegativity in VIH-1 subtype O infected patients, Lancet 1994; 343:1393-94: New VIH-1 subtype in Switzerland. Lancet 1994; 344:270-71).
Descripción de la invención
La presente invención tiene por objetivo poner a disposición de los laboratorios de diagnóstico medios, en particular péptidos específicos que permiten una detección de anticuerpos anti-VIH que, hasta hoy en día, eran susceptibles de ser indetectables. La presente solicitud describe asimismo mezclas de péptidos que proceden de VIH-1 DUR y de péptidos que corresponden a otros VIH, a fin de evitar los resultados “falsos negativos” potenciales.
Por otra parte, la misma se refiere a un procedimiento de detección y de discriminación en una muestra biológica entre anticuerpos característicos de un retrovirus de tipo VIH-1-M y anticuerpos característicos de un retrovirus VIH-1 del grupo (o del subgrupo) O.
La invención se deriva de las observaciones realizadas en una mujer seropositiva, que había pasado una temporada en el Camerún y que había revelado una reactividad serológica atípica durante varios ensayos de detección de la infección del VIH, habiendo sido estos últimos confirmados mediante técnicas de “transferencia Western”.
Debido a esta reactividad serológica atípica, en particular a la falta de reactividad en ciertos ensayos de tercera generación, incluso modificados para el tipo O, los inventores estimaron interesante emprender una secuenciación de ciertas partes del genoma de esta cepa VIH-1 DUR, más específicamente de los genes GAG y ENV.
Sin embargo, las amplificaciones génicas mediante PCR con la ayuda de cebadores que proceden del grupo M y de cebadores conocidos del grupo O, no han dado resultados para las partes que codifican el bucle V3 de gp120, y para la región inmunodominante de gp41. Sólo la región GAG era amplificable con la ayuda de cebadores conocidos en la técnica anterior (Loussert-Ajaka l, Lancet 1994; 343:1393). Otro objetivo de la presente invención es, por consiguiente, la determinación de cebadores susceptibles de paliar este problema. Estos cebadores se podrán denominar indiferentemente “primers” a continuación.
Se han determinado secuencias parciales de las glicoproteínas gp41 y gp120, así como de proteínas de cápsido (gen GAG) a partir de ADN linfocitario y de cultivos víricos, indicando que esta cepa VIH-1 DUR pertenece al grupo VIH-1-O, y que difiere de manera importante del grupo M, más particularmente para gp41 y gp120.
Así, se pudo demostrar, más particularmente a propósito de la secuencia GAG de VIH-1 (DUR), la existencia de secuencias de consenso en el grupo O, en varias zonas, distintas de las secuencias de consenso del grupo M en las mismas zonas.
La clonación de las secuencias que codifican los fragmentos de GAG, gp41 y gp120 de VIH-1 (DUR) se efectuó en un plásmido de Bluescript® que contiene un sitio PST1. Los productos de amplificación se clonaron según las técnicas habituales usando los cebadores universales T3 y T7, o bien se secuenciaron directamente mediante el uso de cebadores de la amplificación anterior. Las secuencias se determinaron a continuación mediante el dispositivo automático de secuenciación Applied Biosystems 373A (ESGS Montigny le Bretonneux, Francia).
En el contexto de la presente invención, se ha aislado y secuenciado el gen env de un aislado del grupo O, el VIH1(VAU), obtenido de una paciente francesa que nunca viajó fuera de Europa y que murió de SIDA en 1992. Según su secuencia de cubierta, el VIH-1(VAU) está emparentado con los dos virus cameruneses VIHANT70 y VIHMVP5180 recientemente caracterizados. El análisis filogenético de las secuencias env revela que los tres virus parecen constituir un grupo distinto, que se denominará aquí VIH-1 grupo O. El aislamiento del VIH-1(VAU) de esta paciente indica asimismo que una cierta propagación de los VIH-1 del grupo O ya se ha producido fuera de África.
Aislamiento del virus VIH-1(VAU)
VIH-1(VAU) se aisló en 1992 a partir de una paciente francesa de 41 años que padecía SIDA. Esta paciente presentaba en 1986 una leuconeutropenia grave asociada con un carcinoma del cuello uterino. Sin embargo, mostró progresivamente señales de infecciones oportunistas, con una disminución del número de células T CD4+ circulantes, y murió de SIDA en 1992. En primer lugar, se detectaron anticuerpos anti-VIH-1 mediante ELISA (Elavia, SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR, y ensayo ABBOTT) en 1990.
La paciente nunca había viajado fuera de Europa, no había utilizado ningún medicamento por vía intravenosa y no había sufrido ninguna transfusión sanguínea conocida. No se identificó ninguna pareja sexual de origen africano. Dio a luz a un niño con buena salud en 1971, pero un hijo, nacido en 1980, murió a la edad de un año tras un episodio clínico muy sugestivo de SIDA neo-natal. Su tercer hijo nacido en 1983 y su marido tienen actualmente una buena salud y no están infectados.
El asilamiento del virus se realizó de la siguiente manera: se eliminaron las células CD8+ presentes en los PBMC (linfocitos sanguíneos periféricos) de la paciente con la ayuda de perlas revestidas de anticuerpos IOT8 (Immunotech). Estos PBMC restantes se estimularon con PHA, y después se cocultivaron con PBMC agotados en CD8 que proceden de un donante sano y estimulados con PHA. El crecimiento vírico en el cocultivo se monitorizó mediante determinación de la actividad de transcriptasa inversa (RT) del sobrenadante y mediante un ensayo ELISA de la p24 del VIH-1 (kit de diagnóstico comercializado por DuPont de Nemours). El virus obtenido del cocultivo inicial se sometió a varios pasos en cultivos de PBMC agotados en CD8 y estimulados con PHA. Se realizaron varias tentativas para infectar mediante el VIH-1(VAU) varias líneas celulares transformadas, cuyas células MT4 (Harada, et al. 1989, así como la descendencia P4-2 de células Hela-CD4-LTRLacZ (Clavel y Chameau, 1994).
Caracterización biológica del VIH-1(VAU)
Dos semanas después del cocultivo de los PBMC de la paciente agotados en CD8, estimulados con PHA, con células similares de un donante sano, se detectó la producción de virus en forma de un pico de actividad de la RT en el sobrenadante de cultivo. Este virus se podía someter entonces a pasos en serie sobre PBMC normales, agotados en CD8 y estimulados con PHA. En la figura 1, el panel A representa la producción del VIH-1(VAU) en los sobrenadantes de cultivos de PBMC infectados, controlados mediante determinación RT (círculos llenos) y ELISA de captura de antígeno p24 VIH-1 (círculos vacíos). La concentración de p24 VIH-1 se expresa en ng/ml, y la actividad RT en cpm/µl. En el panel B, se efectuó el mismo experimento con un aislado primario estándar del VIH-1 de un paciente que padece SIDA.
Aunque el crecimiento del VIH-1(VAU) se detectó fácilmente con la ayuda de la determinación RT, la detección de virus en los sobrenadantes de cultivo con la ayuda de ELISA p24 VIH-1 (DuPont) fue claramente menos sensible. La figura 1 muestra la comparación entre los perfiles de infección productiva de los PBMC con el VIH-1(VAU) o bien con un aislado primario del VIH-1 de un paciente que padece SIDA, determinados en RT o p24. Para cantidades equivalentes de partículas, determinadas mediante determinación de la actividad RT en los sobrenadantes determinados, se detectó aproximadamente 25 veces menos de la p24 para el VIH-1(VAU) que para el otro aislado VIH-1. La diferencia pude ser consecutiva al hecho de que el anticuerpo monoclonal específico de p24 del VIH-1, que se usa para revestir las placas ELISA, únicamente presenta una baja afinidad para los productos gag del VIH1(VAU).
Se realizaron varias tentativas negativas para propagar el VIH-1(VAU) en líneas de células T humanas transformadas, sensibles al VIH-1. En particular, cocultivos entre PBMC infectados por el VIH-1(VAU) y bien células MT4 o bien células CEM, no han conducido a la propagación del virus. También se ha Descubierto que este virus no era capaz de infectar células HeLa CD4+ (P4-2) (Clavel y Chameau 1994) que portan un gen LacZ inducible por el gen tat. Asimismo, no se podía detectar ninguna replicación del VIH-1(VAU) en los linfocitos sanguíneos periféricos activados de varios chimpancés.
El análisis de la secuencia de cubierta VIH-1(VAU), que se describirá con mayor detalle a continuación, y su comparación con el de los dos aislados cameruneses recientemente descritos indican que los tres virus pertenecen al mismo grupo de virus emparentados con VIH-1. Además, esta comparación indica que estas tres variantes del virus son aproximadamente filogenéticamente equidistantes unas de otras. Por consiguiente, cada una de las tres variantes de virus constituye en sí misma un subtipo, distinto de su grupo, que se denomina ahora VIH-1 del grupo
O. Este grupo es distinto del grupo de los demás aislados VIH-1, identificados hasta ahora, y que los inventores denominan aquí VIH-1 del grupo M.
La aparición de este nuevo grupo plantea el problema de su origen: ¿evolucionó el grupo O a partir de los virus del grupo M (o inversamente) o cada grupo tiene un pasado distinto? Los inventores piensan que en la medida en la que al mismo tiempo el grupo M y el grupo O presentan un perfil de divergencia interna similar, es verosímil que correspondan cada uno a la diversificación de antepasados distintos de virus en poblaciones humanas distintas. No se puede apreciar a partir de los datos filogenéticos y virológicos actualmente disponibles si el antepasado de uno o de otro de los dos grupos afectaba los humanos de manera natural o fue introducido en los humanos a partir de otras especies. El único virus cercano del VIH-1 presente en un primate no humano es el aislado SNCPZGAB (Huet et al., 1990), aislado a partir de un chimpancé aparentemente infectado de manera natural, que es claramente distinto al mismo tiempo del grupo M; y del grupo O, y para el cual no se ha encontrado ningún equivalente humano. Es poco probable que los virus del grupo O hayan evolucionado recientemente a partir de un virus de chimpancé, en la medida en la que el VIH-1(VAU) no consiguió replicarse en linfocitos de chimpancés.
¿Por qué la epidemia del grupo O aparece sólo ahora, unos 15 a 20 años más tarde que el grupo M? Existen tres explicaciones posibles: en primer lugar, la introducción del antepasado de los virus del grupo O en los humanos se habría producido más recientemente que la del grupo M; en segundo lugar, podría ser que se haya permitido que el grupo M se propague más pronto que el grupo O debido a diferentes condiciones sociales en su región de origen; y en tercer lugar, los virus del grupo O tendrían una capacidad de transmisión más reducida, en comparación con la de los virus del grupo M. Se ha propuesto que dicha propiedad explique la ausencia de propagación mundial significativa del VIH-1, para el cual una carga vírica más débil en los sujetos infectados está relacionada con una transmisibilidad reducida (De Cock et al., 1993). En este aspecto, aunque no se tiene ningún dato sobre la carga vírica en los pacientes afectados por un VIH-1 del grupo O, el poder patógeno de estos virus no parece distinto del poder del VIH-1. La paciente en la que el VIH-1(VAU) se asiló murió de SIDA, tal como el paciente en el que se obtuvo el aislado VIHMVP5180 del grupo O.
Sin embargo, la historia natural de la infección de la paciente VIH-1(VAU) todavía no es muy clara, pero existen varias indicaciones de que esta paciente fue infectada antes de 1980, tal como lo sugiere la muerte en esta fecha de su segundo hijo que padecía de un síndrome parecido al SIDA.
La presente invención se refiere asimismo a unas composiciones que contienen antígenos según la invención, o bien una mezcla de antígenos según la invención, asociados con extractos originarios de uno o varios VIH-1 del grupo O o de otros virus variantes, por una parte, y de uno o varios VIH-1 y/o VIH-2, por otra parte, siendo estas composiciones eventualmente marcadas. Se puede usar cualquier tipo de marcador apropiado: enzimáticos, fluorescentes, radioactivos, etc.
Ácidos nucleicos
La invención se refiere a los ADN o a los fragmentos de ADN, más particularmente ADN o fragmentos de ADN clonados obtenidos a partir del ARN, de ADNc o de cebadores que se pueden usar en PCR, u otros métodos de amplificación génica derivados del ARN o del ADN del retrovirus VIH-1(VAU). La solicitud describe asimismo ADN equivalentes, que presentan en particular homologías de secuencia con el ADN del VIH-1(VAU), en particular con la secuencia que codifica la región env de la cepa VIH-1(VAU) que comprende la secuencia representada en la figura 6 y denominada “vau”. La homología con el VIH-1 del grupo M es al menos igual a 50%, preferentemente a 70%, y más ventajosamente todavía a aproximadamente 90%. De manera general, la solicitud describe cualquier ADN (o ARN) equivalente capaz de hibridarse con el ADN o con el ARN de un retrovirus VIH-1 del grupo O.
La invención se refiere asimismo a las secuencias de ARN que corresponden a las secuencias de ADN definidas anteriormente.
La invención tiene asimismo por objeto unas composiciones que contienen los péptidos o polipéptidos codificados por dicho ADN o fragmentos de ADN.
Se pueden usar oligonucleótidos derivados de la secuencia VAU, particularmente oligonucleótidos que comprenden al menos 9 nucleótidos, para la detección de secuencias de ADN o de ARN del virus VIH-del grupo O en muestras biológicas, en cultivos celulares, o en extractos de células, mediante la técnica de la PCR o cualquier otra técnica de amplificación génica. Estas secuencias se podrían utilizar o bien como cebadores de amplificación génica o bien como sondas con vistas a la detección específica de los productos de amplificación génica. Los productos de amplificación o su secuencia correspondiente sintética, obtenidos mediante síntesis química (Applied Biosystems) se pueden usar asimismo como sonda de hibridación.
La invención muestra asimismo cualquier fragmento de al menos 100 nucleótidos que se puede usar como sonda en reacciones de hibridación y capaz de permitir una reacción con una parte del genoma de una variante VIH-1(VAU) en condiciones de hibridación de alta astringencia.
Clonación y secuenciación del gen env VIH-1(VAU)
Para la amplificación inicial mediante PCR del ADN del VIH-1(VAU), se extrajo el ADN total de PBMC infectados por el VIH-1(VAU), y se amplificó un segmento del gen pol (región integrasa) con la ayuda de cebadores degenerados:
cebador 4506: 5’AGTGGAT(A/T)(T/C)ATAGAAGCAGAAGT3’; SEC. ID N°1; cebador 5011: 5’ACTGC(C/T)CCTTC(A/C/T)CCTTTCCA3’; SEC. ID N°2;
El medio de reacción que incluye 50 mM de KCl, 10 mM de Tris-HCl (pH 8,9), 1,5 mM de MgCl2, 0,1 mg/ml de gelatina, 0,2 mM de dNTP, 1u DE Taq Polymerase (Amersham). Se realizó la PCR durante 43 ciclos a 92ºC durante 10 segundos, 50ºC durante 1 minuto, 72ºC durante 40 segundos.
El producto de amplificación resultante se clonó en un vector pBluescript, generando el clon ph4 depositado en la CNCM el 20 de octubre de 1994 con el nº I-1486, que se usó posteriormente como sonda para detectar automáticamente un banco lambda de ADN de bajo peso molecular, digerido por EcoRI, procedente de células infectadas por el VIH-1(VAU). Brevemente, las PBMC infectadas por el VIH-1(VAU) se cocultivaron durante 24 horas con PBMC nuevas estimuladas con PHA y agotadas en células CD8+, tras lo cual era visible un efecto citopatógeno marcado (ECP). Entonces, se extrajo el ADN de bajo peso molécula siguiendo el método de Hirt (Hirt 1967), y se digirió con la enzima EcoRI. Un análisis anterior con transferencia de Southern antes de este ADN mostró que el genoma VIH-1(VAU) contenía un único sitio EcoRI, que permite la clonación de especies de ADN circular no integrado que representa la totalidad del genoma vírico. El producto de digestión resultante se sometió a una electroforesis sobre gel de agarosa, y la población de fragmentos de ADN de un tamaño de 8 a 12 kb aproximadamente se purificó y se ligaturó al ADN lambda Zap digerido por EcoRI (Stratagene). Tras la encapsidación, la extensión y la detección sistemática por hibridación con ADN ph4 marcado con 32P, se identificó un clon, λ H34, como positivo y amplificado. El inserto EcoRI se purificó, se sonificó y se clonó mediante “Shotgun” en el vector M13mp18 tratado con la fosfatasa, digerido con la enzima SmaI. Ciento cincuenta de los clones obtenidos se secuenciaron en un secuenciador de ADN 373a (Applied Biosystems), y las secuencias resultantes se reunieron en una sola secuencia con la ayuda del paquete de programas de análisis de ADN GCG-Wisconsin.
El análisis de esta secuencia reveló numerosos codones anti-sentido en todos los cuadros de lectura, lo que sugiere un genoma hipermutado (Vartanian et al, 1991). Estando esta secuencia inutilizable, se decidió, por consiguiente, amplificar mediante PCR el gen env del VIH-1(VAU) con la ayuda del ADN total de PBMC infectadas mediante el VIH1(VAU), y cebadores oligonucleotídicos derivados de la secuencia λ H34:
cebador TH2 5’GCTCTAGATGGGGATCTCCCATGGCAGG3’ Seq. ID N°3; cebador UH2 5’GCTCTAGATCAGGGAAGAATCCCTGAGTGT3’. Seq. ID N°4.
La amplificación mediante PCR se efectuó durante 35 ciclos térmicos a 92ºC durante 15 segundos, 52ºC durante 1 minuto, 60ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos. El producto de amplificación resultante, de un tamaño de 3,5 kb, se clonó en el vector M13mp18, y se secuenció mediante reacciones sucesivas, usando en primer lugar el cebador universal de secuenciación M13, y después cebadores deducidos de las secuencias corriente arriba. El análisis de las secuencias nucleotídicas y peptídicas se efectuó con la ayuda del paquete de programas de análisis de ADN GCG-Wisconsin. El gen env VIH-1(VAU) codifica 877 aminoácidos en total, incluyendo el péptido señal. La secuencia nucleotídica del gen env VIH-1(VAU) corresponde a la SEC ID nº 5 (véase la figura 3).
Uso de ácidos nucleicos como sondas
La invención se refiere naturalmente también al uso de los ADN, ADNc o de sus fragmentos, o de plásmidos recombinantes u otros vectores equivalentes que contienen estos fragmentos, como sondas, para la detección de la presencia o no del virus VIH-1(VAU) en muestras de suero u otros líquidos o tejidos biológicos obtenidos a partir de pacientes de los que se sospecha ser portadores del virus VIH-1(VAU). Estas sondas se marcan eventualmente (marcadores radioactivos, enzimáticos, fluorescentes, etc.). Unas sondas particularmente interesantes para la realización del procedimiento de detección del virus VIH-1(VAU) o de una variante de VIH-1(VAU) se pueden caracterizar porque comprenden la totalidad o una fracción del ADN complementario del genoma del virus de VIH1(VAU) o también en particular los fragmentos contenidos en diversos clones. Unas sondas caracterizadas porque comprenden una fracción del ADNc del VIH-1(VAU) que contiene la totalidad o parte de la región env forman parte de la invención.
Las sondas usadas en este procedimiento de detección del virus VIH-1(VAU) o en kits de diagnóstico, no se limitan de ninguna manera a las sondas descritas anteriormente. Comprenden cualquier secuencia nucleotídica que procede del genoma del virus VIH-1(VAU), de una variante del VIH-1(VAU) o de un virus próximo por su estructura, en cuanto que permiten la detección, a partir de fluidos biológicos de personas susceptibles de presentar sida, de un virus VIH-1 del grupo O, en particular VIH-1(VAU) mediante hibridación con ADN o ARN del virus VIH-1(VAU).
Las sondas que, cuando la hibridación con VIH-1, proporcionan una reacción fuerte con los VIH que pertenecen al grupo O y una reacción baja con los VIH-1 que pertenecen al grupo M son particularmente ventajosas.
La detección se puede realizar de cualquier manera conocida en sí, en particular:
poniendo en contacto estas sondas con los ácidos nucleicos obtenidos a partir de células contenidas en fluidos biológicos (por ejemplo el líquido cefalorraquídeo, la saliva, etc.), o bien con estos fluidos en sí, por cuanto que sus ácidos nucleicos han sido accesibles para la hibridación con estas sondas, y ello en condiciones que permiten la hibridación entre estas sondas y estos ácidos nucleicos, y
mediante una detección de la hibridación eventualmente producida.
Dicho diagnóstico que usa reacciones de hibridación se puede realizar asimismo con la ayuda de mezclas de sondas derivadas respectivamente del VIH-1(VAU), del VIH-1 y del VIH-2, por cuanto que no es necesario hacer la distinción entre los tipos de virus VIH buscados.
La solicitud describe asimismo unos vectores de expresión que contienen la secuencia que codifica para las proteínas de cubierta de VIH-1.
La invención comprende unas composiciones para la detección de la presencia o no de virus VIH-1VAU en muestras de suero u otros líquidos o tejidos biológicos, obtenidos a partir de pacientes susceptibles de ser portadores del virus VIH-1VAU. Estas composiciones se caracterizan porque comprenden al menos una sonda obtenida a partir de una secuencia nucleotídica que procede o se deriva del genoma del virus VIH-1VAU, particularmente un fragmento de ADN VIH-1VAU que contiene la región o una parte de la región que codifica la proteína env del virus VIH-1VAU o de una variante de VIH-1VAU.
Ventajosamente, la composición descrita anteriormente comprende asimismo una sonda obtenida a partir de una secuencia nucleotídica que procede de VIH-1 o de VIH-2.
Otras composiciones de diagnóstico comprenden los cebadores de la invención que se pueden usar en la amplificación génica de retrovirus del subgrupo O o variantes de estos retrovirus.
Antígenos, en particular proteínas y glicoproteínas
La invención se refiere a una proteína del retrovirus VIH-1 del grupo (o del subgrupo) O, o polipéptido o péptido natural o sintético que comprende al menos una parte de dicha proteína, susceptibles de ser reconocidos por anticuerpos aislables a partir de suero obtenido después de una infección por una cepa de VIH-1 del grupo O VAU.
La invención se refiere a una proteína de cubierta externa del retrovirus VIH-1VAU codificado por el gen que comprende la secuencia representada en la figura 6. Según un modo de realización preferido de la invención, esta proteína se caracteriza además porque comprende la secuencia de aminoácidos representada en la figura 3, y que comprende los restos de aminoácidos 1 a 256. La invención tiene asimismo por objeto cualquier polipéptido o variante, derivado de dicha secuencia, que tiene un epítopo susceptible de ser reconocido por anticuerpos inducidos por el virus VIH-1VAU.
Dicha proteína se puede obtener en forma glucosilada o no glucosilada.
La invención tiene también por objeto una proteína transmembranaria de cubierta que comprende la cadena de aminoácidos representada en la figura 3, entre los restos de aminoácidos 527 y 877. Esta proteína transmembranaria está, en el marco de la invención, en forma glucosilada o no.
La invención se refiere a cualquier antígeno, en particular proteínas, glicoproteínas, polipéptidos o péptidos, obtenidos mediante la expresión de secuencias que codifican el genoma VIH-1(VAU) y que tienen propiedades inmunológicas equivalentes a las del VIH-1(VAU). Los antígenos se denominan equivalentes en el marco de la presente invención por cuanto que son reconocibles por los mismos anticuerpos, en particular anticuerpos aislables a partir de suero obtenido de un paciente que ha sido infectado por un VIH-1(VAU).
En particular, la invención tiene por objeto los péptidos o polipéptidos sintetizados químicamente y cuya secuencia de aminoácidos está contenida en la de las proteínas de cubierta de VIH-1(VAU), representada en la figura 3, o los péptidos o polipéptidos equivalentes.
También se debe incluir, entre los péptidos, polipéptidos, proteínas o glicoproteínas equivalentes, fragmentos de los antígenos que anteriores y los péptidos preparados mediante síntesis química o mediante ingeniería genética, por cuanto que dan lugar a reacciones inmunológicas cruzadas con los antígenos de los cuales derivan. En otros términos, la invención se refiere a cualquier péptido o polipéptido que tiene epítopos idénticos o parecidos a los epítopos de dichos antígenos, susceptibles de ser reconocidos por los mismos anticuerpos. Forman parte de este último tipo de polipéptidos, los productos de expresión de secuencias de ADN que corresponden a las secuencias de los ADN que codifican dichos polipéptidos o antígenos .
Más particularmente, los antígenos obtenidos a partir del virus VIH-1(VAU) o producidos mediante ingeniería genética
o síntesis química habitual y que presentan el máximo interés en el contexto de la presente invención son los antígenos que permiten establecer una distinción clara entre los virus VIH-1(VAU) de la invención y los virus de los grupos VIH-1 y VIH-2. En este aspecto, se han observado diferencias considerables a nivel de la proteína de cubierta del virus VIH-1(VAU), así como a nivel del epítopo inmunodominante de la porción externa de la proteína PM. Parece ser que las proteínas gag y pol presentan más similitud con el virus VIH-1 que la proteína de cubierta.
La invención se refiere asimismo a péptidos o polipéptidos idénticos a la región inmunodominante de la glicoproteína transmembranaria de cubierta del VIH-1(VAU). Esta región se representa en la figura 3.
Unos polipéptidos preferidos de esta región son, por ejemplo, los que contienen la secuencia CKNRLIC o que corresponden a esta secuencia. También puede tratarse de polipéptidos o péptidos que responden a la secuencia RLLALETFIQNWWLLNLWGCKNRLIC o que comprenden está secuencia.
Otro péptido preferido, identificado a continuación mediante la denominación “péptido VAU”, responde a la siguiente secuencia, o comprende esta secuencia o cualquier parte de esta secuencia susceptible de ser reconocida por anticuerpos dirigidos contra el retrovirus VIH-1(VAU), RARLLALETFIQNQQLLNLWGCKNRLICYTSVKWNKT.
Unos Polipéptidos variantes de esta secuencia son, por ejemplo, los polipéptidos representados en la figura 4 para los aislados VIH-1MVP5180 y VIH-1(AN170). Estos polipéptidos pueden también ser derivados de los anteriores mediante inserción y/o supresión y/o deleción, por ejemplo sustitución conservativa mediante restos de aminoácidos.
Síntesis de péptidos VAU
Se preparó un péptido VAU mediante la técnica habitual de síntesis peptídica en fase sólida, mediante el método Fmoc en “flujo continuo”. Se preparó el péptido con la ayuda de un sintetizador Milligen 9050 PEP usando la resina “Millipore” PEG PAL, sustituida por el primer resto de aminoácido C-terminal. Las cadenas laterales de los aminoácidos están protegidas por los siguientes grupos: Pmc por arginina; Trt por asparagina, glutamina y cisteína; Boc por lisina; tBu por ácido glutámico; éter tBu por serina, treonina y tirosina. Los grupos temporales Fmoc se eliminan mediante una disolución de piperidina al 20% en DMF. Las reacciones de enlace de cada aminoácido se realizan con 6 equivalentes de DIPCDI y HOBT. Ciertos restos necesitan un doble enlace, en particular las argininas 1 y 23, las cisteínas 19 y 26, la asparagina 11, las glutaminas 10, 12 y 13, la alanina 4, la isoleucina 9 y las leucinas 2, 3, 14 y 15.
Después del enlace, la resina se seca al vacío. El péptido se escinde del soporte mediante el agente reactivo K durante 4 horas a temperatura ambiente. El péptido en bruto se precipita y se lava con éter etílico. El producto se purifica mediante cromatografía líquida a alta presión (HPLC) en un aparato WATERS LC PREP 4000 con cartuchos WATER Delta Pak C18 40x100mm, caudal 30 ml/mn, gradiente acetonitrilo/TFA al 0,1%. Se reúnen las fracciones que contienen el péptido, se concentran con el evaporador rotativo y después se liofilizan.
Ciclización
El péptido (0,025 mM) se disuelve en una disolución de 10 mM de acetato de amonio. El pH se lleva a 8,5 con una disolución de 1M de amoniaco. Después de 3 ó 4 horas se reajusta el pH. La ciclización se monitoriza mediante HPLC a 214 nm y 280 nm, columna WATERS Delta Pak C18 5µ, gradiente acetonitrilo/TFA al 0,1%. La ciclización se termina después de 15 horas. El pH se lleva a 6 con la ayuda de ácido acético al 97-100%, la disolución se liofiliza y después se purifica en las mismas condiciones que para el péptido en bruto.
El péptido se monitoriza mediante HPLC y mediante espectometría de masas según la técnica de electropulverización (espectrofotómetro FISON VG Trio 2000).
Fmoc: Fluoroenil-9-metiloxicarbonilo Pmc: pentanometil-8-croman-sulfonilo-6 Trt: tritrilo Boc: tercbutiloxicarbonilo tBU: terc-butilo DMF: dimetilformamida DIPCDI: Diisopropilcarbodiimida HOBT: Hidroxi-1-benzotriazol TFA: ácido trifluoroacético Agente reactivo K: Fenol/agua/tioanisol/etanoditiol/TFA;,5 ml/2,5 ml/1,5 ml/41 ml
Comparación de la secuencia de aminoácidos de cubierta VIH-1(VAU) con la secuencia correspondiente de otros virus VIH.
El análisis de transferencia Western de una serie de muestras séricas que provienen de una paciente infectada por el VIH-1(VAU) se representa en la figura 2. Se incubaron bandas de nitrocelulosa que portan proteínas separadas mediante electroforesis y que provienen de partículas de VIH purificadas (LAV BLOT, SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR), con muestras de suero, y se evaluó su reactividad según los protocolos recomendados por el fabricante. Los resultados obtenidos son los siguientes: Banda 1: proteínas específicas de VIH-2, que se hicieron reaccionar con una muestra de suero de la paciente VIH-1(VAU) obtenida en febrero de 1992. Bandas 2 a 7: sueros VIH-1 positivos; sueros de la paciente VIH-1(VAU): 2: obtenido en noviembre de 1990; 3: obtenido en diciembre de 1990; 4: obtenido en febrero de 1991: 5: obtenido en febrero de 1992; 6: control negativo; 7: control positivo (suero de un individuo infectado por el VIH-1). Los nombres y los tamaños de las proteínas (en kD) se indican en el margen.
La figura 3 muestra una alineación de la secuencia de aminoácidos de la cubierta de VIH-1(VAU) con la secuencia correspondiente del aislado de referencia VIH-LAI (Wain-Hobson, et al. 1985). Los péptidos señal, el bucle V3 y el epítopo inmunodominante gp41 están resaltados mediante rectángulos rayados. El sitio de escisión entre la glucoproteína de cubierta externa gp120 y la gp41 transmembranaria se indica mediante flechas. Las líneas verticales entre las letras de aminoácidos indican una identidad completa, los dos puntos (:) indican una alta homología, y los puntos (.) indican una homología limitada entre aminoácidos individuales. La alineación se efectúo usando el programa GAP del paquete de programas GCG-Wisconsin.
Se ha descrito la versión original (1.0) de los programas GAP y BESTFET por Paul Haeberli a partir de un estudio detallado de las publicaciones de Needleman y Vunsch (J. Mol. biol. 48, 443-453 (1970)) y de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math. 2; 482-489 (1981)). Las alineaciones limitadas se implementaron por Paul Heaberli, y se añadieron al paquete de programas para constituir la versión 3.0. Después, se fusionaron en un solo programa por Philip Marquess para constituir la versión 4.0. Se han modificado las penalidades de ausencia de separación entre la alineación de las proteínas tal como se sugirió por Rechid, Vingron y Argos (CABIOS 5; 107-113 (1989).
La alineación de la figura 3 revela numerosas zonas de alta divergencia, con algunos dominios conservados aquí y allá. Estas regiones conservadas corresponden más o menos a los dominios conservados asimismo en los aislados VIH-1 habituales (Alizon, et al. 1986, Benn, et al. 1985). Entre los dominios divergentes, el bucle V3, denominado asimismo determinante principal de neutralización (Javaherian, et al. 1990, Javaherian, et al. 1989, Matsushita, et al. 1988) es claramente uno de los más divergentes, aunque se conserven las dos cisternas que definen el bucle. La secuencia del epiplón del bucle GPGRAF para el VIH-1 LAI es GPMAWY en el VIH-1(VAU). Este motivo del epiplón es idéntico al del aislado del grupo O camerunés VIHANT70 (Van den Heasevelde, et al. 1994), pero es diferente del motivo del otro aislado del grupo O, VIHMVP5180 (Gürtler, et al. 1994), para el que el motivo es GPMRWR.
En la totalidad de la cubierta, se han identificado en total 29 sitios de N-glicosilación potenciales, de los cuales 13 se conservan en comparación con otras proteínas de cubierta del VIH-1. También se han encontrado en total 19 cisteínas conservadas, lo que indica que se conserva la arquitectura global de repliegue de la proteína, pero se han encontrado 5 cisteínas no conservadas.
La figura 4 muestra la alineación múltiple de los péptidos inmunodominantes en el segmento extracelular de la glicoproteína de cubierta transmembranaria de diferentes aislados de VIH-1. Todas las secuencias se comparan con la secuencia de referencia VIH-1 LAI. Los guiones indican una identidad con el VIH-1 LAI. La alineación se efectuó con la ayuda del programa PILEUP del paquete de programas GCG-Wisconsin.
En el programa PILEVP, la estrategia de unión representada por el dendogramo se denomina UPGMA, que significa “Unweighted pair-group method using arithmetic averages” (Smith, P.H.A Sokal, R.R. (1973) en Numerical Taxonomy (p. 230-234), W.H. Freeman and Company, San Francisco, California, USA). Cada alineación en par de PILEVP usa el método de Needleman y Wunsch (Journal of Molecular Biology 48; 443-453 (1970)).
Tal como lo muestra la figura 4, la secuencia de aminoácidos del epítopo inmunodominante de la porción externa de la proteína TM (Gnann, et al., 1987) es sustancialmente diferente de la de otros aislados de VIH-1 y VIH-2. Sin embargo, guardó la mayoría de los aminoácidos que se conservaron entre los virus VIH-1 y VIH-2.
Se ha encontrado que ciertos aminoácidos particulares estaban conservados solamente entre los virus del grupo O: tal como es el caso de la lisina en posición 21 en un péptido de 26 aminoácidos, de la treonina en posición 7 y de la
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
asparagina en posición 11. Estas diferencias podrían explicar la ausencia de detección de antígenos de cubierta VIH-1 habituales por uno de los sueros de la paciente VIH-1(VAU), y asimismo probablemente por el de pacientes infectados por otros virus de grupo O. Globalmente, la comparación entre las secuencias de cubierta VIH-1 LAI y VIH-1(VAU) mostró una identidad de 50%. La secuencia de cubierta VIH-1(VAU) también se comparó con la de otros representantes VIH de los cuales los dos miembros del grupo O del VIH-1 están descritos y secuenciados: VIH-ANT70 y VIHMVP5180, y SIV. Los resultados de este análisis, representados en la Tabla 1, establecen que VIH-1(VAU) pertenece al grupo O. La cubierta de VIH-1(VAU) es idéntica en 70% a la cubierta VIH-ANT70, e idéntica en 71% a VIHMVP5180. Entre los subtipos de VIH-1 más corrientes, la identidad a nivel de la cubierta es comparable, comprendida entre 74% y 80%.
VIH-1EU
77
VIH-1MAL
76 80
VIH-1U455
75 74 76
SIVCPZGAB
61 62 63 63
VIH-2ROD
38 39 39 40 39
SIVMAC251
37 37 38 38 38 74
SIVAGMTYO
37 36 37 38 40 46 47
VIHANT70
51 52 52 52 53 33 32 33
VIHMVP5180
51 52 54 51 52 36 33 34 70
VIHVAU
50 51 52 51 54 35 34 35 70 71
VIH-1
VIH-1
VIH-1
VIH-1
SIV VIH-2 SIV SIV VIH VIH
LAI
EU MAL U455 CPZQAB ROD MAC251 AGMTYO ANT70 MVP5180
Se analizó la relación entre el VIH-1(VAU), otros miembros de la filogenia de los VIH-1 y los dos virus recientemente descritos del grupo O, mediante construcción de un árbol filogenético de parcimonia no ponderada con la ayuda de la secuencia nucleotídica de la región transmembranaria env. El resultado de este análisis se representa en la fig. 5 en la que las cifras indican el número de cambios nucleotídicos. La figura 5 muestra que el VIH-1(VAU) es más o menos equidistante de los dos otros virus del grupo O, y que, globalmente, estos tres virus parecen ser aproximadamente equidistantes unos de otros. En efecto, el número de cambios nucleotídicos entre el VIH-1MVP5180 y el VIH-1(VAU) es de 218 en el segmento de genoma analizado, mientras que la distancia es de 183 entre el VIH1MVP5180 y el VIH-1ANT70, y de 213 entre el VIH-1ANT70 y el VIH-1(VAU). Este perfil de divergencia es muy similar a lo que se encuentra en el conjunto de los demás subtipos de VIH-1, en el que el número de cambios nucleotídicos únicos que se encuentran entre dos subgrupos distintos está comprendido entre 157 (subtipo E al subtipo F) y 219 (subtipo A al subtipo D).
La tabla 1 muestra la comparación de las secuencias de cubierta de diferentes virus emparentados al VIH-1. Las cifras indican el porcentaje de identidad en aminoácidos entre secuencias de cubierta, tal como se calcularon con la ayuda del programa GAP del paquete de programas GCG-Wisconsin. *: para el VIHANT70, se usó sólo la proteína de cubierta externa en la comparación.
Composiciones que comprenden antígenos VIH-1(VAU)
De manera general, la invención se refiere a cualquier composición que se puede usar para la detección in vitro de la presencia en un fluido biológico, en particular de personas que han estado en contacto con el VIH-1(VAU), o de anticuerpos contra al menos uno de los antígenos VIH-1(VAU). Esta composición se puede aplicar al diagnóstico selectivo de la infección mediante VIH-1 del grupo O, usando técnicas de diagnóstico tales como se describen en las solicitudes de patente EP 84401834 y EP 87400151.4. En el contexto de la presente invención, se usa cualquier constituyente que comprende determinantes antigénicos capaces de ser reconocidos por anticuerpos producidos contra el VIH-1(VAU), por ejemplo antígenos o péptidos recombinantes o péptidos sintetizados químicamente definidos a partir de la secuencia de la cubierta VIH-1(VAU). A este respecto, la invención se refiere más particularmente a unas composiciones que contienen al menos una de las proteínas de cubierta del virus VIH-1(VAU). Se mencionará, a título de ejemplos de composiciones, las que contienen proteínas, glucoproteínas o péptidos de la proteína de cubierta que corresponden a la totalidad de la región 590-620 de la proteína gp41 del VIH-1(VAU) o a la partes de esta región específicas del VIH-1(VAU) tales como los péptidos –TFIQN-o -WGCKNR-.
La invención se refiere asimismo a composiciones que asocian proteínas y/o glucoproteínas y/o péptidos VIH-1(VAU) recombinantes o sintéticos, con proteínas y/o glucoproteínas y/o péptidos VIH-1 y/o VIH-2 y/o de otro VIH-1 del grupo O obtenidos mediante extracción o en lisados o mediante recombinación o mediante síntesis química y/o de péptidos derivados de estas proteínas o glucoproteínas, y susceptibles de ser reconocidos por anticuerpos inducidos por el virus VIH-1 y/o VIH-2 y/o VIH-1 del grupo O.
Las composiciones de diagnóstico que contienen determinantes antigénicos capaces de ser reconocidos por anticuerpos dirigidos contra el VIH-1(VAU), en particular las composiciones peptídicas, se pueden incluir en o asociar con composiciones o kits ya disponibles para la detección de la infección de los retrovirus VIH-1 y/o VIH-2, a fin de extender el espectro de detección de los kits para la detección de los retrovirus VIH-1 del grupo O.
A título de ejemplos no limitativos:
-proteínas del núcleo (core), particularmente las proteínas gag, pol, VIH-1 y VIH-2, o péptidos de éstas, y proteínas o péptidos de cubierta VIH-1(VAU),
-o bien glucoproteínas de cubierta VIH-1, glucoproteínas de cubierta VIH-2 y glucoproteínas de cubierta VIH1(VAU),
-o bien mezclas de proteínas y/o de glucoproteínas VIH-1, de proteínas y/o de glucoproteínas VIH-2, y de proteínas y/o de glucoproteínas de cubierta VIH-1(VAU).
Es importante observar que, aunque los anticuerpos de pacientes infectados por virus VIH-1 del grupo O reaccionan altamente con antígenos gag y pol de virus VIH-1 del grupo M, su reactividad es prácticamente nula con antígenos de cubierta de virus del grupo M. Por lo tanto, es importante que la composición de la presente invención comprenda al menos una proteína o un péptido de cubierta VIH-1(VAU) a fin de que este virus pueda ser detectado con certeza.
Por consiguiente, dichas composiciones, usadas en el diagnóstico, ayudan al diagnóstico del sida o de los síntomas asociados, que se extienden en un espectro más amplio de los agentes etiológicos responsables. Es inútil decir que el uso de composiciones de diagnóstico que contienen solamente proteínas y/o glucoproteínas de cubierta VIH-1(VAU) no es menos útil para la detección más selectiva de la categoría de retrovirus que puede ser responsable de la enfermedad.
Procedimiento y kits de diagnóstico de infecciones causadas en particular por el virus VIH-1(VAU)
La presente invención se refiere a un procedimiento de diagnóstico in vitro de la invención por los VIH, agentes etiológicos del SIDA y de síndromes emparentados, que comprende la puesta en contacto de un suero o de otro medio biológico, que procede de un paciente o sujeto que constituye el objeto del diagnóstico, con una composición que contiene al menos una proteína, una glucoproteína o un péptido VIH-1(VAU) según las reivindicaciones, y la detección de una eventual reacción inmunológica. Se han descrito anteriormente ejemplos de dichas composiciones.
Unos métodos preferidos usan, por ejemplo, reacciones inmunoenzimáticas de tipo ELISA o de inmunofluorescencia. Las detecciones se pueden realizar mediante inmunofluorescencia directa o indirecta, o mediante determinaciones inmunoenzimáticas directas o indirectas.
Dichas detecciones comprenden por ejemplo:
-depositar cantidades determinadas del extracto o de las composiciones antigénicas previstas de acuerdo con la presente invención en los pocillos de una microplaca;
-introducir en cada pocillo de un suero diluido o no, susceptible de contener anticuerpos cuya presencia se deba detectar in vitro;
-incubar la microplaca;
-lavar cuidadosamente la microplaca con un tampón apropiado;
-introducir en los pocillos de la microplaca anticuerpos marcados específicos anti-inmunoglobulina humana, realizándose la marcación mediante una enzima seleccionada de entre las capaces de hidrolizar un sustrato de tal manera que este último sufre entonces una modificación de su absorción de las radiaciones, al menos en una banda de longitud de onda determinada, y
-detectar, preferentemente de manera comparativa con relación a un control, de la importancia de la hidrólisis del sustrato como medida de riesgos potenciales, o de la presencia efectiva de la infección.
La presente invención se refiere asimismo a estuches o kits de diagnóstico de la infección mediante el virus VIH1(VAU), los cuales comprenden en particular:
-un extracto, una fracción más purificada o un antígeno sintético derivado de los tipos de virus indicados
anteriormente, siendo este extracto, esta fracción o este antígeno marcados, por ejemplo, de manera radioactiva,
enzimática, fluorescente u otro,
-unos anticuerpos antiinmunoglobulinas humanas, o una proteína A (fijados de manera ventajosa en un soporte insoluble en agua) tales como, por ejemplo, perlas de agarosa) o unos pocillos de microplacas, etc.),
-eventualmente una muestra de fluido biológico, o células obtenidos a partir de un sujeto de control negativo, -unos tampones y, cuando sea apropiado, unos sustratos para la visualización del marcado.
La invención tiene asimismo por objeto unas composiciones inmunógenas capaces de inducir la formación de anticuerpos que reconocen antígenos que se pueden obtener mediante síntesis química o mediante recombinación.
Serología
Se evaluó la capacidad de los anticuerpos séricos de la paciente infectada por el VIH-1(VAU) para reaccionar con preparaciones antigénicas VIH-1 con la ayuda de diversos kits disponibles en el comercio: SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR, (GENELAVIA MIXT) ABBOTT, WELLCOME, y BEHRING. Se examinó la reactividad de estos anticuerpos con diferentes proteínas VIH-1 con la ayuda del kit de transferencia de western de SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR, siguiendo los protocolos recomendados por el fabricante.
Más precisamente, el suero de la paciente se examinó varias veces con la ayuda de kits de ELISA específicos del VIH-1. En primer lugar se ensayó en 1990, y resultó positivo, y se anotó 7,33 (esta cifra corresponde a la relación de la DO medida sobre la DO del ruido de fondo) con el kit SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR, 3,50 con el kit ABBOTT y 2,70 con el kit WELLCOME. Durante el uso de los reactivos específicos al mismo tiempo del VIH-1 y del VIH-2, el suero se anotó 1,42 con el kit de Behring y 4,40 con el kit WELLCOME.
La capacidad del suero de la paciente para reaccionar en diferentes fechas con diferentes proteínas de estructura VIH-1 se estudió con la ayuda de la determinación mediante inmunomarcación LAV BLOT VIH-1, ensayo comercializado por SANOFI DIAGNOSTICS PASTEUR. Tal como lo muestra la figura 5, con todas las muestras de suero ensayadas, se observa sólo una muy baja reactividad del suero con las proteínas env VIH-1 gp160 y gp120. Sin embargo, el suero reaccionó altamente con las proteínas gag del VIH-1 p55 (precursor de gag) y p24 (CA), y con los productos pol p66 (RT) y p34 (IN). En la inmunomarcación de VIH-2, se observó sólo una reactividad muy baja con la p26 gag.
Esto ilustra que la detección de anticuerpos específicos del grupo O con kits de diagnóstico sérico disponibles en el comercio debe ser controlada cuidadosamente. Aunque anticuerpos séricos de pacientes infectados por virus del grupo O presenten fuertes reacciones cruzadas con los antígenos gag y pol del grupo M, éstos presentan poco o nada de reacción con los antígenos de cubierta del grupo M. Por lo tanto, se puede suponer que una proporción significativa de estos pacientes podría no ser detectada durante el uso de ciertos kits a base de agentes reactivos antigénicos de cubierta del grupo M. En efecto, en un primer estudio reciente de varios sueros de pacientes infectados por el grupo O, se encontró que la capacidad para detectar anticuerpos específicos del grupo O era muy diferente según el kit de detección usado (Loussert-Ajaka, I., Ly, T.D., Chaix, M.L., Ingrand, D., Saragosti, S., Courroucé, AM., Brun-Vézinet, F. y Simon, F. (1994). VIH-1/VIH-2 seronegativity in VIH-1 subtype O infected patients. Lancet. 343, 1393-1394.). Esto implica que es necesario un estudio cuidadoso y profundo de la reactividad de un gran número de sueros del grupo O con todos los kits de diagnóstico disponibles en el mercado.
Composiciones que comprenden anticuerpos policlonales o monoclonales preparadas a partir de antígenos recombinantes o sintéticos del virus VIH-1(VAU).
La invención se refiere a un suero susceptible de ser producido en el animal mediante inoculación del VIH-1(VAU), particularmente los epítopos antigénicos del VIH-1(VAU), y más particularmente los epítopos antigénicos de la proteína de cubierta del virus VIH-1(VAU). La invención se refiere más particularmente a los anticuerpos policlonales más específicamente orientados contra cada uno de los antígenos, en particular proteínas o glucoproteínas según las reivindicaciones. La invención se refiere asimismo a anticuerpos monoclonales producidos mediante diferentes técnicas, siendo estos anticuerpos monoclonales orientados respectivamente, de forma más específica, contra las proteínas de cubierta del VIH-1(VAU).
Estos anticuerpos policlonales o monoclonales se pueden usar en diferentes aplicaciones. Se mencionará esencialmente su uso para neutralizar las proteínas correspondientes, incluso inhibir la infecciosidad del virus entero. También se pueden usar, por ejemplo, para detectar los antígenos víricos en las preparaciones biológicas, o para realizar operaciones de purificación de las proteínas y/o de las glucoproteínas correspondientes, por ejemplo durante el uso en columnas de cromatografía de afinidad.
A título de ejemplo, anticuerpos anti-cubierta son agentes reactivos que se pueden usar en el diagnóstico, en particular para la detección de partículas VIH-1 del grupo O mediante ELISA de captura de antígeno.
La invención se refiere a anticuerpos dirigidos contra uno o varios antígenos del virus VIH-1(VAU) producidos a partir de secuencias de aminoácidos del VIH-1(VAU) según las reivindicaciones. Recientemente, se han descrito técnicas de obtención de anticuerpos a partir de epítopos antigénicos parecidos a los epítopos antigénicos del virus VIH-1(VAU) de la presente invención.
La técnica de preparación de anticuerpos descrita en la publicación de ULMER et al., 1993, puede ser usada por el experto en la materia para preparar anticuerpos de la presente invención, formando las modificaciones que permiten adaptar esta técnica a los antígenos de la presente invención parte de los conocimientos del experto en la técnica.
Estudio de la inmunoreactividad del péptido vau
Se ha verificado la inmunoreactividad del péptido vau, después de la preparación de las placas ELISA experimentales, según un protocolo establecido para un ensayo de detección sistemática de los anticuerpos anti-VIH. Este ensayo se basa en la detección de una fase sólida preparada con el péptido que imita el epítopo inmunodominante de la glucoproteína de cubierta del virus VIH-1 del grupo (o del subgrupo) O, aislado VAU. La realización del ensayo se calcó del protocolo propuesto por el estuche GENELAVIA® MIXT, con los reactivos de este estuche.
Los datos experimentales reunidos en las dos tablas de las figuras 21 y 22 demuestran que:
a) los cuatro sueros extraídos de pacientes contaminados por el virus VIH-1 del grupo (o del subgrupo) O son muy reactivos en el péptido vau;
b) los diez sueros considerados extraídos de pacientes contaminados por el virus VIH-1 (del grupo o del subgrupo)
O, entre los 19 sueros transmitidos por el Instituto Pasteur de Yacoundé, son asimismo altamente reactivos en
este mismo péptido;
c) los sueros (4 muestras) extraídos de sujetos contaminados por el virus VIH-1 del subtipo B (en fase aguda) no son reactivos en el péptido vau;
d) los sueros extraídos de donantes de sangre asintomáticos (48 muestras ensayadas) no son reactivos en el péptido vau; estos datos experimentales, aunque limitados (debido a la pobreza de las muestras positivas en anticuerpos VIH-1 del grupo (o del subgrupo) O)) atestan de la sensibilidad y especificidad del péptido seleccionado.
Se desprende de lo que precede, que la solicitud describe asimismo la detección del virus VIH-1(VAU) o de una variante gracias al uso de los anticuerpos descritos anteriormente en un procedimiento que usa diferentes etapas, estando estas etapas específicamente previstas para mostrar las propiedades características del virus VIH-1(VAU).
La invención se refiere asimismo a la detección del virus VIH-1(VAU) mediante hibridación molecular.
De manera general, este procedimiento de detección del virus VIH-1(VAU) o de una variante en muestras de suero o de otros líquidos biológicos o de tejidos, obtenidos a partir de pacientes susceptibles de ser portadores del virus VIH1(VAU) comprende las siguientes etapas:
- fabricar al menos una sonda eventualmente marcada;
- al menos una etapa de hibridación realizada en condiciones que permiten la hibridación mediante la puesta en
contacto del ácido nucleico de la muestra sospechosa con dicha sonda marcada, y eventualmente inmovilización
del complejo formado sobre un soporte sólido apropiado;
- cuando sea apropiado, lavar dicho soporte sólido con una disolución de lavado adecuado;
-detectar dicho complejo, y por lo tanto detectar la presencia o no del virus VIH-1(VAU) mediante un método apropiado de detección conocido por el experto en la técnica.
En otro modo de realización preferido del procedimiento según la invención, la hibridación citada anteriormente se realiza en condiciones no astringentes, y el lavado del soporte (membrana) se realiza en condiciones adaptadas a las de la hibridación.
Usando una serología o una técnica de amplificación génica tal como la Polymerase Chain Reaction (PCR) específica, se evaluó de forma precisa la importancia de la epidemia del VIH-1 del grupo O. Se encontró que 5 a 10% de los pacientes infectados por un VIH-1 en el Camerún están realmente infectados por virus del grupo O. Sin embargo, salvo el aislado de virus descrito aquí, no se documentó la propagación de virus del grupo O fuera de África occidental central. La paciente en la que se aisló el VIH-1(VAU) siempre vivió en Francia y nunca viajó a África. Hasta hoy en día, no se tiene ninguna prueba precisa en cuanto al origen de su infección, pero este caso indica que ya se ha producido una cierta propagación de los virus del grupo O en Europa.
La muestra biológica puede estar constituida en particular por sangre, por plasma, por suero o por cualquier otro extracto biológico. Las composiciones anteriores son que se pueden usar para la detección de anticuerpos en una de dichas muestras biológicas.
La solicitud da a conocer asimismo un método de diagnóstico in vitro de una infección debida específicamente a un retrovirus de tipo VIH, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
-poner en contacto una muestra biológica susceptible de contener anticuerpos producidos a consecuencia de una infección mediante un retrovirus VIH-del grupo (o del subgrupo) O, con un péptido tal como el definido anteriormente, o con una composición peptídica tal como la definida anteriormente, en condiciones apropiadas que permiten la formación de un complejo inmunológico de tipo antígeno/anticuerpo,
-detectar la eventual presencia del complejo.
Por otra parte, se describe una composición inmunógena, caracterizada porque comprende al menos un péptido en asociación con un vehículo farmacéuticamente aceptable para la constitución de vacunas.
La invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de las proteínas de cápsido y de las glucoproteínas gp41 y gp120 de una cepa retrovírica según la invención, estando el procedimiento caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
-lisar las células infectadas por un retrovirus VIH-1 según la invención y separar el sobrenadante y las células infectadas, o lisar los residuos víricos preparados mediante centrifugación,
-depositar el extracto celular y/o el extracto vírico sobre un inmunoadsorbente que contiene anticuerpos purificados, obtenidos a partir de un suero de un sujeto infectado por un retrovirus según la invención, y fijados ventajosamente sobre un soporte adaptado, teniendo dicho suero del sujeto infectado la capacidad de reaccionar altamente con proteínas de cubierta del virus según la invención,
-incubar en presencia de un tampón y durante un tiempo suficientemente largo para obtener la formación de un complejo inmunológico antígeno/anticuerpo,
-lavar el inmunoadsorbente con un tampón para eliminar las moléculas no retenidas sobre el soporte,
-recuperar las proteínas antigénicas buscadas.
Según un primer modo de realización de este procedimiento de preparación, la separación y la recuperación de las proteínas de cápsido y de las glucoproteínas gp41 y gp120 de VIH-1 DUR se realizan mediante electroforesis y mediante electrorreducción de las proteínas.
Según otro modo de realización de este procedimiento de preparación, la recuperación de las proteínas se obtiene mediante:
-elución de las proteínas fijadas sobre el inmunoadsorbente anterior,
-purificación de los productos así eluidos sobre una columna de cromatografía que contiene, fijados sobre el soporte de separación, anticuerpos que reconocen las proteínas de cápsido y las glucoproteínas gp41 y gp120 del VIH-1 del grupo (o del subgrupo) O DUR.
Asimismo, está comprendido en el ámbito de la invención un procedimiento de producción de un polipéptido o de un péptido según la invención, siendo este polipéptido o este péptido obtenido
-mediante la expresión de un ácido nucleico de la invención, -o mediante síntesis química, por adición de aminoácidos hasta obtener este polipéptido o este péptido.
Se pueden usar los principios y los procedimientos habituales de la ingeniería genética (“Molecular cloning”), Sambrook, Fritsch, Maniatis, CSH 1989).
La solicitud describe un procedimiento de producción de un ácido nucleico definido anteriormente, que se puede producir mediante aislamiento de un virus de la invención, o mediante síntesis química, o usando técnicas de amplificación in vitro de ácidos nucleicos a partir de cebadores específicos.
Determinación de oligonucleótidos específicos del grupo O
Con la ayuda de la secuencia VAU y de su correlación con las secuencias MVP5180 y ANT70, se definieron cebadores oligonucleotídicos que se esfuerzan por ser específicos del subgrupo O en su totalidad para la región V3 y la región gp41. Éstas permitieron amplificar la cepa DUR y han constituido, por consiguiente, una solución al problema de amplificación encontrado. La posición así como la secuencia de estos cebadores VIH del subgrupo O se representan en la figura 13. Estos cebadores permiten la obtención de una banda de amplificación visible en coloración con bromuro de etidio con una sola etapa de 30 ciclos de PCR. Se obtuvieron secuencias parciales:
-GAG: 513 pares de bases (171 aminoácidos) = SEC ID nº 9 -Gp120 bucle V3: 525 pares de bases (175 aminoácidos) = SEC ID nº 10 -Gp41 región inmunodominante: 312 pares de bases (104 aminoácidos) = SEC ID nº 11.
Las comparaciones nucleotídicas (figura 15) y protídicas (figura 16) de las secuencias DUR con secuencias MVP5180, ANT y VAU para el subgrupo O, LAI para el VIH-1 de consenso, MAL secuencia africana VIH-1 representativa y CPZ para el CIV del chimpancé gabonés, muestran que DUR está tan distante de los demás VIH-1 del grupo (o del subgrupo) O publicados como éstos lo están entre sí.
Las diferencias son mínimas en la región GAG y máximas en la región del bucle V3 de gp120, en el que la comparación proteica alcanza 40% de diferencia (figura 16). Los árboles filogénicos confirman por una parte que la cepa DUR forma parte del subgrupo O, y, por otra parte la importancia de las diferencias entre las diversas cepas O descritas, sin que por ello se liberen claramente unas ramificaciones de subtipos (figura 17).
Comparación de las secuencias GAG:
Durante la comparación de la secuencia GAG obtenida en las otras dos cepas O denominadas ANT70 y MVP5180, así como la dos otras secuencias representativas del grupo M (figura 8), se pudo constatar que existe un consenso O en varias zonas, distintos del consenso M en las mismas zonas. También se pueden señalar dos zonas hipervariables, más variables para O que para M, y algunas diferencias puntuales para una u otra cepa. Sin embargo, las regiones SPRT... SEGA, MLNAI...KEVIN, GPLPP....CQEQI, VGD....SPV parecen discriminativas del consenso O frente al consenso M.
Las regiones QQA y LWTTRAGNP son regiones hipervariables. La cepa VIH-1 del grupo (o del subgrupo) O DUR se singulariza en tres posiciones frente al consenso M y O (L para 1 y 2 veces para E), y toma un aminoácido específico en tres posiciones hipervariables aisladas: V posición L9; A posición A77; L posición 110.
Además, es posible definir en la región GAG unos segmentos comunes al grupo O y al grupo M tales como SPRTLNAWVK, GSDIAGTTST y QGPKEPFRDYVDRF.
Comparación de las secuencias del bucle V3
Este estudio comparativo reveló diferencias considerables que alcanzan 56% de diferencias proteicas con el consenso VIH-1 del subgrupo M, y 35 a 42% con los demás VIH-1 del grupo (o del subgrupo) O.
Las alineaciones de secuencias peptídicas de las regiones del bucle V3 de gp120 y de la región inmunodominante de gp41 se indican en la figura 9. La secuencia del interior del bucle V3 de la cepa DUR difiere sustancialmente de la del consenso VIH-1 del subgrupo M. Comparte el motivo GPMAWYSM con las cepas VAU y ANT70, pero no con la cepa MVP que presenta dos sustituciones: R por A y R por Y.
Las partes izquierda y derecha del bucle V3 son claramente diferentes de cualquier otro VIH conocido, y no deja suponer otras reactividades cruzadas. Además, el bucle V3 de DUR es más largo de un aminoácido que las demás secuencias O, a su vez más largas de otro aminoácido que las secuencias del grupo VIH-1 M.
Comparación de las alineaciones que se refieren a la región inmunodominante de la gp41
El “minibucle” de la cepa DUR, de secuencia CRGKAIC, resultó muy específico de esta cepa: constituiría un epítopo (véase la figura 9). Además, está secuencia sería susceptible de intervenir en la modificación de las condiciones de despliegue de la glucoproteína gp41 y, por consiguiente, en la infecciosidad de la cepa.
Una larga secuencia de 11 aminoácidos que flanquea a la izquierda este bucle es idéntica a la secuencia VAU. Se puede observar un polimorfismo de la cepa DUR para una posición S o T según los clones analizados.
Se representan asimismo en la figura 9 péptidos correspondientes que proceden de otras cepas retrovíricas conocidas.
La cepa DUR permite definir asimismo un consenso VIH del subgrupo O de la región gp41, del cual se podrían usar varias regiones homólogas suficientemente largas. Estas regiones homólogas son, entre otras: RL*ALET, QNQQ, LWGC, CYTV (representando * un aminoácido variable).
Correlaciones serológicas:
El antisuero anti-DUR no reacciona con los péptidos del bucle V3 del consenso VIH-1-M, VIH-1 MAL, VIH-1 CPZ o VIH-1 del grupo (o subgrupo) O MVP5180, pero reacciona sin embargo con el péptido del bucle V3 del VIH-1-O ANT70. En cuanto a la región inmunodominante gp41, éste no reacciona con el consenso VIH-1 del subgrupo M “habitual”, pero reacciona sin embargo, débilmente pero de manera sorprendente, con el consenso VIH-1 del subgrupo M extendido a la derecha.
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Claims (27)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Ácido nucleico que permite la detección del virus VIH-1VAU, que comprende la secuencia tal como la representada en la figura 6.
  2. 2.
    Ácido nucleico, que se puede usar como sonda, que consiste en un fragmento de al menos 100 pares de bases de la secuencia tal como la representada en la figura 6 de un ácido nucleico según la reivindicación 1.
  3. 3.
    Ácido nucleico, que se puede usar como sonda, caracterizado porque se trata de ADN y consiste en un fragmento de un ácido nucleico según la reivindicación 1, y que codifica para un polipéptido de la proteína de cubierta, seleccionado de entre el grupo constituido por secuencias que contienen o que corresponden a:
    (i)
    la secuencia CKNRLIC;
    (ii)
    la secuencia RLLALETFIQNQQLLNLWGCKNRLIC;
    (iii) la secuencia RARLLALETFIQNQQLLNLWGCKNRLICYTSVKWNKT;
    (iv)
    el bucle V3 de secuencia CERPGNQKfMAGPMAWYSMALSNTKGDTRAAYC;
    (v)
    la secuencia TFIQN;
    (vi)
    la secuencia WGCKNR;
    (vii) los aminoácidos 1 a 256 de la secuencia tal como la representada en la figura 3; y
    (viii) los aminoácidos 527 a 877 de la secuencia tal como la representada en la figura 3.
  4. 4.
    Ácido nucleico, que se puede usar como sonda, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se trata de ADN o de ADNc marcado, en particular por marcadores radioactivos, enzimáticos o fluorescentes.
  5. 5.
    Ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizado porque se trata de ARN.
  6. 6.
    Composición para la detección de la presencia o no de un retrovirus VIH-1VAU en muestras de suero o de otros líquidos o tejidos biológicos obtenidos a partir de pacientes susceptibles de ser portadores de un retrovirus VIH-1VAU, estando dicha composición caracterizada porque comprende al menos una sonda según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.
  7. 7.
    Péptido o polipéptido seleccionado de entre el grupo constituido por:
    -un polipéptido que consiste en la secuencia tal como la representada en la figura 3, y codificado por un ácido nucleico que consiste en la secuencia tal como la representada en la figura 6,
    -una parte de la proteína env de la secuencia tal como la representada en la figura 3 codificada por un ácido nucleico que consiste en un fragmento de al menos 100 pares de bases de la secuencia tal como la representada en la figura 6, y
    -un polipéptido (i) de secuencia CKNRLIC, (ii) de secuencia RLLALETFIQNQQLLNLWGCKNRLIC, (iii) de secuencia RARLLALETFI QNQQLLNLWGCKNRLICYTSVKWNKT, (iv) de secuencia CERPGNQKI MAGPMAWYSMALSNTKGOTRAAYC, (v) de secuencia TFIQN, (vi) de secuencia WGCKNR,(vii) que consiste en los aminoácidos 1 a 526 de la secuencia tal como la representada en la figura 3, o (viii) que consiste en los aminoácidos 527 a 877 de la secuencia tal como la representada en la figura 3.
  8. 8.
    Proteína de cubierta del retrovirus VIH-1VAU, caracterizada porque se puede obtener mediante la expresión en un hospedante celular de un ácido nucleico que corresponde a la secuencia tal como la representada en la figura 6, y porque dicha proteína comprende o bien la secuencia de aminoácidos comprendida entre los residuos 1 y 526 de la secuencia tal como la representada en la figura 3, o bien la secuencia de aminoácidos comprendida entre los restos 527 a 877 de la secuencia tal como la representada en la figura 3.
  9. 9.
    Polipéptido o péptido cuya secuencia está contenida en la de las proteínas de cubierta VIH-1VAU según la reivindicación 8, caracterizado porque comprende un epítopo susceptible de ser reconocido por anticuerpos inducidos por el virus VIH-1VAU.
  10. 10.
    Polipéptido o péptido según la reivindicación 9, caracterizado porque comprende una secuencia seleccionada de entre las siguientes secuencias:
    (i)
    la secuencia CKNRLIC ;
    (ii)
    la secuencia RLLALETFIQNQQLLNLWGCKNRLIC, o
    (iii) la secuencia RARLLALETFIQNQQLLNLWGCKNRUCYTSVKWNKT
  11. 11. Polipéptido derivado del polipéptido según la reivindicación 10 (ii) por sustitución conservativa de aminoácidos, por cuanto que dicho polipéptido conserva las mismas características antigénicas, seleccionado de entre el grupo constituido por:
    (iv)
    la secuencia RLLALETFIQNWWLLNLWGCKNRLIC; y
    (v)
    la secuencia RLLALETLLQNQQLLSLWGCKGKLVC.
  12. 12.
    Péptido o polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque se trata de un péptido sintético.
  13. 13.
    Composición apropiada para la detección in vitro de la presencia en una muestra biológica humana de anticuerpos anti-VIH-1VAU, comprendiendo dicha composición al menos un antígeno que comprende un polipéptido o un péptido de la proteína de cubierta de un retrovirus VIH-1VAU, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.
  14. 14.
    Composición según la reivindicación 13, caracterizada porque comprende además un antígeno tal como una proteína, una glucoproteína, un polipéptido o un péptido de un virus VIH-1 que no pertenece al grupo O y/o de un virus VIH-2 o un péptido derivado de un virus VIH-1 que no pertenece al grupo O y/o de un virus VIH-2 que tiene un epítopo susceptible de ser reconocido por los anticuerpos inducidos por el virus VIH-1 que no pertenece al grupo O y/o el virus VIH-2.
  15. 15.
    Composición según la reivindicación 14, caracterizada porque las proteínas y/o las glucoproteínas de VIH-1 que no pertenece al grupo O y/o de VIH-2 son proteínas GAG, POL o fragmentos de las proteínas GAG o POL.
  16. 16.
    Composición según la reivindicación 14, caracterizada porque las proteínas y/o las glucoproteínas de VIH-1 que no pertenece al grupo O y/o de VIH-2 son glucoproteínas de cubierta.
  17. 17.
    Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, apropiada para la detección in vitro de la presencia en una muestra biológica humana de anticuerpos anti-VIH-1VAU, caracterizada porque dicha composición comprende una secuencia peptídica que corresponde al conjunto de la región 590-620 de la proteína gp41 de VIH1VAU o a una parte de esta región.
  18. 18.
    Composición según la reivindicación 17, caracterizada porque dicha secuencia peptídica es la secuencia TFIQN, CKNRLIC o WGCKNR.
  19. 19.
    Anticuerpo susceptible de reconocer una proteína, un péptido o un polipéptido según una de las reivindicaciones 7 a 12.
  20. 20.
    Procedimiento de diagnóstico in vitro de una infección ocasionada por el virus VIH-1VAU, comprendiendo dicho procedimiento:
    -poner en contacto un suero u otro medio biológico que procede de un enfermo que constituye el objeto del diagnóstico con al menos una proteína, un péptido o un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18; y
    -detectar una reacción inmunológica.
  21. 21.
    Agente reactivo necesario para la reacción de la transferencia Western o de ELISA que comprende una proteína, un péptido o un polipéptido según una de las reivindicaciones 7 a 12, o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18.
  22. 22.
    Secuencia nucleotídica según la reivindicación 1, para el uso en la inducción in vivo de la síntesis de anticuerpos dirigidos contra el antígeno codificado por dicha secuencia.
  23. 23.
    Composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, capaz de inducir anticuerpos en el animal.
  24. 24.
    Estuche (kit) de detección in vitro en una muestra biológica de un retrovirus VIH-1VAU, caracterizado porque comprende como sonda eventualmente marcada, al menos una secuencia nucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
  25. 25.
    Estuche según la reivindicación 24, caracterizado porque comprende asimismo los agentes reactivos necesarios para la realización de una hibridación.
  26. 26.
    Procedimiento de detección de la presencia o no del virus VIH-1VAU en muestras de suero u otros líquidos o tejidos biológicos obtenidos a partir de pacientes que se sospecha podrían ser portadores del virus VIH-1VAU que comprende:
    -poner en contacto una sonda según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, o bien con los ácidos nucleicos obtenidos a partir de células contenidas en fluidos biológicos, o bien con estos mismos fluidos por cuanto que sus ácidos nucleicos se han hecho accesibles para la hibridación con esta sonda, y en condiciones que permiten la hibridación entre esta sonda y estos ácidos nucleicos, y
    -detectar la hibridación eventualmente producida.
  27. 27. Procedimiento de producción de un antígeno, de un polipéptido o de un péptido mediante la expresión de un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
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