KR910002428B1 - Aids를 유발시킬수 있는 신규 레트로비루스의 제조방법 - Google Patents
Aids를 유발시킬수 있는 신규 레트로비루스의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
내용 없음.
Description
본 발명에 인체내에서 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)으로도 진행될 수 있는 임파선증을 유발시킬수 있는 능력을 보유하고 있는 신종의 비루스에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이 신종 비루스에 의해 인체내에서 유도된 항체로 인지될 수 있는 항원에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이 비루스들에서 얻어진 항원에 의해 유도되는 항체에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 전술한 비루스의 게놈 RNA와 유사한 서열 또는 상보서열을 갖는 클론 DNA 서열에 관한 것이며, 또한 이 클론 DNA 서열을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 그 클론 DNA 서열에 의해 암호된 아미노산 서열을 가지는 폴리팹티드에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 어떤 형태의 AIDS 잠복기인 인체에 대하여 실험관내 진단시 상기 항원을 적용하는 방법 및, 이 항원들중 열부에 있어서는, 면역 조성물 및, 이 레트로비루스에 대한 왁찐 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 동일한 목적에 상기 항체를 응용하는 방법 및 그중 일부의 경우, 상기형태의 인체 AIDS에 대한 약의 활성 주성분을 생성하기 위해 적용하는 방법에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 클론 DNA 서열과 이 서열에서부터 얻어진 폴리팹티드의, 진단 키트중의 프로브로서의 응용법에 관한 것이다. LAV로 공지되고, AIDS의 전개시 그들의 관여성이 밝혀진 최초의 레트로비루스의 분리 및 특성 규명이 1983년 F. Barre-Sinoussi에 의한 논문에 이미 발표되었었다.(Science, vol,220, No 45-99,20, p.868-871) 이 비루스의 약간의 추출물, 보다 상세히 말한다면, 이것의 단백질 약간을 그 비루스에 대한 항체 존재에 대한 진단시에 응용하는 것은 유럽 특허출원 제138,677호에 보다 상세히 설명되어 있다. 그 이래로 LAV의 다른 유사한 균주 및 일부 변이주가 분리되었다. 상기할 수 있는 보기는 HTLV-III와 ARV의 이름으로 공지된 것들이다.
1986년 5월 Nature지에 발표된 명명의 새로운 규약을 적용하면, 인체에서 전술한 임파선증과 AIDS를 유발시킬 수 있는 레트로비루스는 "인체 면역결핍 비루스(Human Immunodeficiency Virus)"의 약자인 "HIV"로 통칭된다. LAV와 이것의 변이주에 의해 형성된 레트로비루스의 아종은 처음에는 "LAV 타입 I" 또는 "LAV-I"으로 명명되었었다. 후자의 아종은 이후 HIV-1로 명명될 것이다. LAV의 용어는 레트로비루스(특히 LAAV, IDAV-4와 IDAV-2) 균주중, 전술한 유럽 특허출원 제138,667호에서, 후술하는 바의 비교실시예에서 사용된 HIV-1 비루스종 즉 LAVBRU(1983년 7월15일에 프랑스, 앵스띠뛰 빠스뙤르의 the Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes(CNCM)(National Collection of Microorganism Cultures에 I-232호로 기탁됨)에 속하는 균주를 가리키기 위해 계속 사용될 것이다.
본 발명의 목적물을 형성하는 신종 레트로비루스와 그것에 관련되며 그것과 유사하게, 인체내에서 임파구를 증식시킬 수 있고 "LAV 타입 II" 또는 "LAV-II"도 공지된 비루스 균주는 "HIV-2"로 이후 공지되며, 후술되는 어떤 HIV-2 분리물의 명칭은 그것을 분리한 환자를 일컫는 세가지 약어로 이해될 것이다.
"HIV-2" 그룹은 실험관내에서 인체 T4 임파구에 대한 굴성을 가지며, 그들이 증식할때 이 임파구에 대해 세포병원성을 가지며, 일반0되고 지속적인 다발선병(polyadenopathies) 또는 AIDS의 한 형태를 유발시킨다. HIV-2 레트로비루스는 후술한 조건하에서 HIV-1 타입 비루스와는 다른 것으로 밝혀졌다. HIV-1 비루스와 마찬가지로, HIV-2는 이미 공지된(HTLV-1과 HTLV-II) 다른 인체 레트로비루스와는 다르다.
상기 비루스는 상당히 광범위한 유전적 변이체가 있지만, 미국, 유럽, 아이티와, 아프리카 환자에게서 분리한 다른 HIV-1 균주는 그들의 주 단백질, 즉 코어 단백질 p25, 피낭 당단백질 gp110과 전이막 단백질 gp41-43에 공통적으로 보유되는 항원성 부위를 가진다. 이 관계에 의해서, 예컨대, 원형 LAV 균주가 그것의 출처와는 관계없이 그들을 가지는 모든 사람에 있어서 모든 HIV-1종의 비루스에 대하여 항체를 검출하는 항원의 균주로서 사용될 수 있도록 하는 것이다. 따라서 이 균주는 특히 면역형광법 및 ELISA, "웨스턴 블롯"(또는 면역-임프린팅) 및 "RIPA"(방사면역침전분석: Radioimmunoprecipitation Assay의 약어)에 의해 혈액 공여자 및 환자에서 항-HIV-1 항체를 검출하기 위해 현재 사용되고 있다. 그러나, 서아프리카 출신의 환자에게서 얻은 HIV-1 용해물로 시행한 혈청학적 연구에서, 그들중 일부가 음성형청반응이나 또는 매우 약한 양성 반응을 나타내는 반면, 그들은 AIDS에 대한 임상적 및 면역학적 징후를 나타냄이 관찰되었다.
이 환자들중 한사람의 배양 임파구에서 첫번째 HIV-2 레트로비루스가 분리되었는데 전자 현미경하의 그 구조와 SDS 겔 전기 영동에서 나타난 단백질 프로필이 HIV-1의 그것들과 유사성을 나타냈다. 그러나, 이 신규의 레트로비루스 HIV-2는 그 단백질의 항원 상동성과 유전적 물질의 상동성면에서 볼때 HIV-1과 약간의 관련성만을 갖는다.
따라서, 신규한 레트로비루스 또는 동등한 항원성 및 면역학적 특성을 갖는 레트로비루스(들)은 아프리카환자들 또는 아프리카에 체류했던 사람들에게 있어서, 최초에 관찰되었었던 타입의 AIDS 형태를 유발하는 비루스 및 그 변이주에의 감염을 진단하는 항원으로 제공될 수 있다.
전형적으로, 이 비루스는 수혈받지도 않았고, 약품 중동자도 아닌 28세의 이성연애 환자로부터, 헤파린 존재하에, 혈액으로부터 분리되었다. 1983년 이래, 그 환자는 만성 설사 증상을 나타냈고, 간헐적인 고열과 함께 상당한 체중 감소(17kg)를 나타냈다. 최근에, 그는 AIDS의 전형적인 식도 캔디다증을 비롯하여 캔디다와 세라티아 감염을 나타내었다.
이 환자는 또한 빈혈, 피부 아네르기, 임파구감소증 및 0.15비율의 T4 임파구/T8 임파구를 가지며 1㎣의 혈청에서 100이하의 T4 임파구 수준을 나타내었다. 배양중의 그 환자의 임파구는 식물성 혈구응집소 및 콘카나발 A의 자극시 반응하지 않았다. 이 환자는 또한 에스.엔테리디티스(S. enteriditis)에 의한 재발성 균혈증 음와스포리듐증(cryptosporidioses), 이소스포라벨리(Isospora belli)에 의한 감염과 뇌 톡소 플라스마병을 함께 지니는 것으로 진단되었다.
이 여러가지가 결합된 증상은 HIV-1 비루스에 의해 유발되는 형태의 "AIDS" 또는 "ARC"("AIDS-Related Complex"의 약어)과 결합된 복합 증후근의 증거이다. 이 여러가지 관찰은 또한 미국의 아트란타의 질병 구제 센터(CDC ; the Center of Disease Control)에 의해 마련된 기준과 일치하였다.
이 환자의 임파구 배양과 레트로비루스의 분리는 BARRE-SINOUSSI등의 논문과 유럽 특허출원 제84/401.834-0.138.667에서 HIV-1의 분리에 대하여 이미 설명된 기술에 의하여 실행되었다. 그들은 하기에서 간단히 회술된다. 식물성 혈구 응집소(PHA)로 3일간 자극된 임파구를 10%의 태아 송아지 혈청과10-5M의 β-메르캅토에탄올과, 인터루킨-2와 항-(인체 인터페론 α)혈청을 가한 RPMI 1640 배양 배지중에서 배양한다.
비루스의 생산이 이 역전사효소 활성에 의해 일어난다. 배양 상청액에서, 비루스의 활성피크가 14일 내지22일이내에 나타났다가 감소된다. 세포 배양의 감소와 사멸이 수단된다. HIV-1와 마찬가지로, HIV-2로 감염된 임파구의 분비는 전자 현미경하에서 성숙에 달한 비리온과 감염된 세포 표면에 접합된 비루스입자를 나타낸다. 이 분리된 비루스의 배양체를 생산하기 위해 사용된 세포주는 경우에 따라서, HUT, CEM 또는 MOLT 종류의 세포주(cell line) 또는 T4 수용체를 갖는 불멸의 임파구 주일수 있다
비루스를 혈액 공여자의 임파구 배양체에서 번식시키고, HUT 78과 같은 백혈병 원의 연속 주중에서 번식시킨다. 이것은 HIV-1과는 거의 다른 그것의 항원 및 핵산에 의해 특징화된다. 비루스를 전술한 논문에서 서술된 바와 같이 정제한다. 이 비루스의 일차 분리물은 1985년 12월 19일 CNCM에 제I-502호로 기탁되었다. 이것은 LAV-II MIR명으로 계속 명명되었다. 이차 분리물이 1986년 2월 21일 CNCM에 제I-352호로 기탁되었다. 이 이차 분리물은 LAV-II ROD로 명명한다. 이 분리물은 때때로 MIR 또는 ROD와 같이 간단히 하기에서 언급될 것이다.
일반적으로, 본 발명은 상기 비루스의 변이주들과 또는 CNCM에 제I-502호 또는 제I-532호로 기탁된 HIV-2 비루스와 똑같은 면역화적 특성을 가지는 구조 단백질을 함유한 종가의 비루스들(예컨대, 1986년12월 19일 CNCM에 제I-642호와 제I-643호로 기탁된 HIV-2-IRMO와 HIV-2-EHO동)에 관한 것이다. 듬가 기준의 정의는 후술될 것이다.
본 발명은 또한 T4 임파구 또는 T4 표현형을 갖는 임파구로부터 유래된 영구 세포주에서 HIV-2 비루스 또는 그 변이주룰 생산하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 HIV-2 비루스로 이미 감염된 이 라인을 배양하고, 특히 역전사효소 활성의 수준이 특정한 계기점에 달했을때, 배양 배지에 분비된 비루스를 회수하는 것으로 구성된다.
HIV-2를 배양하는 것에 바람직한 영구세포주는 예컨대 HUT 78 세포 종류이다, HIV-2로 감염된 HUT 78주는 CNCM에 1986년 2월 6일 제I-519호로 기탁되었다. 배양은 예를 들면 하기와 같이 실시된다 : HUT 78 세포(106/ml)를 감염된 보통의 인체 임파구(106/ml)과 함께 배양한다. 배양 배지는 10% 태아 송아지 혈청이 부가된 RPMT 1640이다. 15내지 21일후, 세포병원성 작용이 HUT 78 세포에서 관찰된다. 역전사효소는 이 관찰 1주일후 배양 상청액에서 분석된다. 이때, 이 상청액으로부터 비루스를 회수하기시작하는 것이 가능하다.
배양을 위한 다른 바람직한 주는 CEM 명명으로 공지된 주에 속하는 것이다.
감염 및 그후 그 감염된 CEM 세포위 배양은 특히, 하기와 같이 실행될 수 있다.
HIV-2로 미리 감염된 T4 임파구와 CEM 주의 비감염 세포를 CEM 감염에 필요한 시간동안 공배양한다. 배양 조건은 적합한 배지중에서, 예컨대 후술하는 배지중에서 지속시키며 감염세포의 역전사효소 활성이 충분한 수준에 달했을때, 생산된 비루스를 배양 배지로부터 회수한다.
특히, 후술하는 조건하에서, "ROD"로 명명되고, 또한 CEM으로도 명명된, 한 환자에게서 유출한 HIV-2 비루스 균주와 함께 5일전에 감염된 인체 T4 임파구를 배양한다.
식물성 혈구응집소로 미리 활성화된, 감열된 T4 임파구는 감염 3일후에 5,000cpm/106일반 T 임파구의 역전사효소 활성을 갖는 것으로 판명되었다. 측정된 역전사효소 활성이 상청액에서 100,000cpm에 달할때까지 배양을 지속시킨다. 이 T4 임파구를 CEM 세포(3×106감염된 일반 T 임파구)와 접촉시키고 하기 배양 배지중에서 다시 항온 보존시킨다 : 2.92mg/m1의 L-글루타민, 10% 탈보충된 태아 송아지 혈청, 2μg/ml의 폴리브렌, 0.05%의 항-인터페론-알파혈청, 100,000μg/ml의 페니실린, 10μg/ml의 스트렙토마이신과 10,000μg/ml의 네오마이신이 함유된 RPMI 1640.
배양 배지는 일주일에 2회씨 갈아준다. 상청액에서 측정된 역전사효소 활성은 하기와 같이 측정된다 :
0일째 : 1,000 (기준)
15일째 : 20,000
21일째 : 200,000
35일째 : 1,000,000
HIV-2 비루스로 감염된 CEM 배양체는 1986년 3월 24일 엥스뛰띠 파스떼르의 the Collection Nationale de Cultures de Micro-Organismes(CNCM) 에 I-537호로 기탁되었다.
HIV-2 구조와 관련된 항원 및 핵산의 몇가지 특징은 후술되는 조건하에 실시된 실험으로부터 밝혀졌다. 많은 경우에, 그들은 레트로비루스의 다른 종류, 특히 HIV-1과 SIV에 관한 똑같은 종류의 특징과 비교함으로써 보다 잘 평가될 것이다.
하기 설명에서는 도면에 대하여 언급되는바, 제1a, 1b와 1c도는 각각 HIV-1과 HIV-2로 감염된 환자의 혈청과 STLV-III으로 감염된 리서스(rhesus) 원숭이 혈청과 한편으로는 HIV-1의 비루스 추출물로 감염된 리서스 원숭이 혈청간의 교차 면역침전 실험에 관한 것이다.
제2a도와 2b도는 SDS-폴리아크릴아미드겔중에서 HIV-1, HIV-2와 STLV-III의 단백질의 전자 현미경적 유동성에 대한 비교 결과를 나타낸다.
제3도는 HIV-1, HIV-2와 STLV-III의 게놈 서열과 다른 또한 HIV-1 비루스의 다른 서브 게놈 서열간에 교차된 하이브리드화의 결과를 나타낸다.
제 4도는 HIV-2 ROD의 RNA에서 유래된 cDNA의 제한지도이다.
제5도는 HIV-2에서 유래된 cDNA의 E2 단편물의 제한지도이며, 이 단편물은 HIV-2의 3' LTR 지역에 해당하는 부위를 함유한다.
제6도는 E2 부위의 뉴클레오티드 서열이며, 이 서열은 HIV-2의 U3/R 지역에 해당한다.
제7A도는 HIV-1 3' LTR이 함유된 부위와 나란히 배열된 HIV-1의 구조적 요소들은 도식적으로 나타낸 것이며, 그 서열은 HIV-2 cDNA의 E2 부위로부터 유래된 것이다.
7B도는 많은 삭제 및 삽입에 의해 배치된, HIV-2의 E2 지역에서 유래된 서열과 HIV-1의 해당서열에 각각 존재하는 공통의 뉴클레오티드를 나타낸다.
제8도는 HIV-2로부터 유래된 cDNA를 몇가지 삽입체로 변형시킨 파아지의 몇가지 클론(클론 ROD1, ROD27, ROD35)의 구조를 도식적으로 나타낸다. 차례로, 플라스미드 pUC18에서 서브클론된 ROD4, ROD27과 ROD35에서 유래된 서열들이 이 도면에서 또한 도식적으로 나타내어지며, 후자의 서열들은 그들의 각각 기원된 ROD4, ROD27과 ROD35의 부위와 부합되도록 놓여진다.
제9도는 하기 a)와b)사이의 하이브리드 강도를 나타낸다.
(a) 완전한 HIV-1 게놈(이 단편물은 도면의 하단부에 도식적으로 나타냄)과 또한 ROD4에 존재하는 HIV-2 cDNA의 다른 지역에서 제거된 11개의 단편물.
(b) 동일한 cDNA를 갖는 HIV-2로부터 유래된 단펀물.
일반적으로, 후술된 비교시험에 사용되는 HIV-2 항원은 CNCM에 제I-502로 기탁된 HIV-2 MIR 균주에서부터 유출되며 HIV-2의 게놈 DNA에서 유래된 DNA 서열은 CNCM에 제I-352호로 기탁된 HIV-2 ROD에서부터 유출된다.
I-항원, 특히 단백질 및 당단백질
HUT 78에서 최초로 배양된 비루스를 [35S] 시스테인과 [35S] 메티오닌으로 대사과정중 라벨하며, [35S] 시스테인으로 라벨하는 것에 관해서는 명세서 끝부분에 제시된 참고 문헌(21)의 방법에 따라서 실시하며, 그 감염된 세포를 14 내지 16시간동안 해당되는 라벨되지 않은 아미노산이 없는 배양 배지중 이 방사성 아미노산 존재하에 항온 배양시킨다. 그 상청액이 투명해지면 비루스를 20% 슈크로즈의 큐숀상에서 100,000g하에 1시간동안 초원심분리시킨다. 그 비루스의 주요 항원은 변성 조건(SDS)하에 폴리아크릴아미드 겔(12.5%)중 전기 영동으로 또는 폴리-아크릴아미드(10%) + 비스아크릴아미드(0.13%)로 구성된 겔중에서 SDS(0.1% 최종농도)로써 분리된다.
하기 착색 마커들은 분자량 기준으로서 사용된다:
미 오 신 : 200kd
포스포릴라제 : 97.4kd
BSA : 68kd
오브알부민 : 43kd
-키모트립신 : 25.7kd
-락토글루부린 : 18.4kd
리소자임 : 14.3kd
다른 분자량 마커들이 다른 실험들에서 사용되었다. 이것은 특히 다른 공지된 분자량 마커를 언급하고 있는(이 도면에서 문자밑에서) 제1a, 1b, 1c도에 해당된다. 항원은 그 환자 혈청에 존재하는 항체를 사용하여 면역-침전(RIPA)후 또는 면역 임프린팅(웨스턴 블롯)에 의해 보다 쉽게 구별된다. 그들의 외형 이동에 의해 측정된 외형 분자량은 HIV-1 항원과 매우 유사하다.
후술되는 본문에서, "p" 및 또는 "gp" 명명을 따르는 숫자들은 해당 단백질 및 또는 당단백질의 1,000으로 나눈 근사한 분자량에 해당한다. 예컨대 p36은 36,000정도의 분자량을 갖는다. 그러나, 분자량치는 5%, 10% 정도의 범위내에서 이 분자량 측정에 사용되는 기술에 따라 분자량이 변화될 수 있다.
실험의 반복은 HIV-2 항원의 분자량을 보다 정확하게 측정할 수 있게 한다. 따라서, 세개 코어 단백질의 외형 분자량은 각각 13,000, 18,000, 25,000 정도의 분자량으로 처음에 정하여졌는데, 실제로, 각각 12,000, 16,000, 26,000에 보다 근사한 외형 분자량을 갖는 것으로 나타났다. 이 단백질들은 이후 p12, p16과 p26으로 약칭된다.
똑같은 방식이 그 외형 분자량이 32,000 내지 42,000-45,000의 값으로 측정된 단백질 또는 당단백질 밴드의 존재시 적용된다. 반복 측정하여 36,000의 외형 분자량에 해당하는 밴드를 보다 정확하게 측정할 수 있게 한다. 하기 본문에서, 이 밴드는 p36의 약어로 호칭된다. 42,000-45,000(p42)에서 다른 밴드가 또한 일관적으로 관찰되었다. 하나 또는 다른 p36 또는 p42은 그 비루스의 전이막 당단백질을 구성하는 것으로 추정된다.
130-140kd 정도의 분자량을 갖는 주요 피낭 당단백질이 지속적으로 관찰된다 : 이 당단백질은 이후 gp140으로 명명된다.
일단적으로 +5%의 정확도로 분자량이 측정되며, 이 정확도는 gp140에 대하여 밝혀진 바와 같이(140±10%의 분자량) 고분자량의 항원에 대하여 약간 감소될 수 있다. 이 그룹의 항원들(그들이 [35S] 시스테인으로 라벨될때)은 일명 "ELAVIA"의 DIAGNOSTICS PASTEUR에 의해 시판되는 것과 같은 HIV-1 용해물을 사용하는 테스트에 의해 또는 실험에서 사용되는 검출 시스템에서 항-HIV-1 항체를 갖는 환자의 항체에 의해 희미하게만 인식된다. p26 단백질만이 그 혈청에 의해 약하게 면역침전되었다. 피낭 단백질은 침전되지 않았다. 신규의 비루스(HIV-2)로 감염된 환자의 혈청은 HIV-1의 p34 단백질을 희미하게 인식한다. 사용되는 검출 시스템에서, 다른 HIV-1 단백질은 인식되지 않았다.
반대로, HIV-2는 포획된 리서스종의 짧은 꼬리 원숭이(macague)에서 최근 분리한 레트로비루스로부터 유사한 조건하에서 분리된 구조 단백질 또는 당단백질의 비교시 면역학적 관계를 다소 나타내는 몇몇 단백질이 있지만 위의 면역학적 관련성은 다른 단백질 또는 당단백질에서는 나타나지 않는다. 이 후자의 레트로비루스들은 원숭이에 있어서의 병원학적 인자인 것으로 추정되며, 이를 분리해낸 연구자들에 의해(하기의 참고목록(16-18) "STLV-IIImac"로 명명되었다. 편리를 위해, 이것은 하기에서 "STLV-III"(또는 SIV : 시미안 면역결핍 비루스(simian Immunodeficiency Virus)의 약어)로 간단히 언급된다.
"STLV-IIlAGM")=(또는 SIVAGM)으로 명명되는 다른 레트로비루스는 야생 녹색 원숭이에서 분리되어 왔다. 그러나, 리서스 원숭이에 존재하는 비루스와 달리, "STLV-IIIAGM"의 존재는 아프리카 녹색 원숭이에서 AlDS-종류의 질병을 유도하지 않는 것으로 나타난다.
그럼에도 불구하고, HIV-2의 구조 단백질과 당단백질의 면역학적 관계와 또한 STLV-IIImac와 STLV-IIIAGM레트로비루스와의 면역학적 관계 및 그 결과 그들의 핵산 서열의 관계가 제한되어 있다. 실험에 의해 인체 또는 원숭이를 감염시키는 레트로비루스들간의 첫번째 차이점이 입증되었다. 그 내용은 다음과 같다.
HIV-2 비루스는 N. L. Letvin등의 Science(1985), 230, 71-75에 의해 설명된 바와 같이 STLV-IIImac비루스의 진행을 가능케하는 실시조건하에, 및 생체내에 주사되었을때 리서스 원숭이의 임파구에서 만성적으로 중식되지 않는다.
자연 조건하에 원숭이에서 전개되지 못하는 HIV-2의 이 명백한 무능력은 HIV-2 비루스와 또는 STLV-III 비루스 분리물을 생물학적으로 구별할 수 있게 한다.
상기에서 언급된 것과 같은 기술을 사용하여 STLV-III에서부터 하기 단백질을 얻을 수 있음이 밝혀졌다 :
-27킬로달톤 정도의 분자량을 갖는 성분 p27 코어단백질,
-주요 피낭 당단백질, gp 140,
-그 비루스가 [35S] 시스테인으로 미리 라벨되었을때 SRIPA에서 관찰되지 않지만, 넓은 밴드 형태에서 면역-임프린팅 실험(웨스턴 블롯)으로 관찰될 수 있는, 아마도 전이막인 p32 단백질.
HIV-2의 주요 피낭 당단백질은 HIV-1의 주요 피낭 당단백질 보다는 STLV-III의 주요 피낭 당단백질과 면역학적으로 유사한 것으로 밝혀졌다.
이 발견은 HIV-1의 주요 피낭 당단백질에 대한 약 110과 비교되는 HIV-2와 STLV-III의 주요 당단백질에 대한 130-140킬로달톤의 분자량에 대해서 뿐아니라, 면역학적 특성에 대해서도 적용되는데, HIV-2로 감염된 환자의 혈청과 특히 HIV-2에 대하여 형성된 항체는 STLV-III gp140을 인식하지만, 비교실험에서는 똑같은 혈청과 HIV-2에 대한 똑같은 항체는 HIV-1 gp110을 인지하지 않기 때문이다. 그러나, 항-HIV-2는 HIV-1 gp110을 인지하지 않는다. 그러나, HIV-2 gp140과 반응하지 않는 항-HIV-1 혈청은 HIV-2의 추출물에 존재하는 [35S] 시스테인-라벨된 26kd 단백질을 침전시킨다.
HIV-2의 주요 코어 단백질은 HIV-1 p25와 STLV-III의 p27의 분자량 사이의 평균 분자량(약 26,000)을 갖는다.
이 관찰은 전술한 환자중 한사람에게서 분리해낸 HIV-2에서 수득한 비루스 추출물로 실험이 행해졌다. 유사한 결과가 두번째 환자로부터 분리된 HIV-2의 비루스 추출물로써 얻어졌다.
각각 HIV-1, HIV-2와 STLV-III와 감염된 세포를 [35S] 시스테인만이 200μci/ml가 존재하는 배치중에서 16시간 동안 항온 보존시킨다. 맑은 상청액을 90분간 60,000g로 원심분리시킨다. 펠렛을 RIPA 완충액(1)에서 용해시키고 다른 혈청들로 면역침전시킨후 소듐 도데실 설페이트로 채워진 폴리아크릴아미드 겔(SDS-PAGE)상에서 전기 영동시킨다.
그 결과를 제1a, 1b와 1c에 나타내었다.
제1a도는 CEM C1.13 세포주로부터 얻어진 HIV-7의 비루스 추출물과 각각 하기 혈청들 사이의 면역침전 결과를 나타낸다 :
-항-HIV-1-양성 혈청(밴드 1)
-상술한 첫번째 환자의 혈청(밴드 2)
-항-HIV-1 항체를 갖는 건강한 아프리카인 보균자의 혈청(밴드 3)
-STLV-III으로 감염된 짧은 꼬리 원숭이의 혈청(밴드 4)
-상술한 두번째 환자의 혈청(밴드 5)
제1b도에서는 HUT-78 세포와 배양후 첫번째 환자로부터 얻어진 HIV-2 항원과 다른 혈청들 사이의 면역침전 반응을 나타내며, 더 구체척으로 전술한 첫번째 환자의 혈청(밴드 1), 항-HIV-1-양성 혈청(밴드 2), STLV-III으로 감염된 짧은 꼬리 원숭이 혈청(밴드 3)과 전술한 이차 환자의 혈청(밴드 4)사이의 면역침전의 관찰 결과가 나타나 있다.
마지막으로, 1c도는 시미안 AIDS를 갖는 짧은 꼬리 원숭이에서 얻어진 STLV-III 분리물의 항원들 사이의 면역침전 결과를 나타낸다. 밴드 1 내지 5로 언급된, 사용 혈청들은 제1a도에 관해 상술된 바와 같다.
M은 마커 미오신(200kd), 갈락토시다제(130kd), 송아지 혈청 알부민(BSA)(69kd), 포스포릴라제 B(93kd), 오브알부민(46kd)와 탄산탈수효소(30kd) 를 언급한다.
제2a도와 제2b도는 HIV-1, HIV-2와 STLV-III의 단백질의 전기 영동 이동의 결과를 나타낸다.
제2a도는 SDS-PAGE상의 면역침전후 [35S]되 시스테인으로 라벨된 비루스의 추출물로 실시된 실험에 관한 것이다. 다른 밴드들은 하기 비루스 추출물에 관한 것이다 : 환자 1에서 수득되며 동일 환자로부터 수득한 혈청에 의해 면역침전된 비루스(밴드 1), 항-HIV-1 또는 항-HIV-2 항체를 갖지 않는 사람의 음성대조 혈청으로 면역침전된 똑같은 비루스의 추출물(밴드 2), STLV-III으로 감염된 짧은 꼬리 원숭이에서 얻어진 혈청으로 면역침전된 STLV-III 비루스의 추출물(밴드 3), 같은 비루스의 추출물과 음성 대조 혈청 사이에서 관찰된 면역침전(밴드 4), AIDS로 감염된 유럽인 환자의 혈청으로 면역침전된 HIV-1의 추출물.
제1b도는 웨스턴 블롯(면역-임프린팅) 실험에서 얻은 결과를 보여준다. 비감염 또는 감염된 HUT-78세포로부터 얻어진 세포 용해물을 SDS-PAGE상에서 전기 영동하고 전기 영동으로 니트로셀룰로오스 필터에 이동시켜 상술한 첫번째 환자의 혈청(1/100로 희석된 혈청)과 반응시킨다. 니트로셀룰로오스 필터를 세척하고 결합된 항체를 검출키 위해125I-라벨된 염소의 항-인체로 가시화하며 관찰한다.
밴드 1,2,3에서 관찰된 점은 각각 전술한 항체와 비감염 HUT-78 세포의 추출물(밴드 1), HIV-2 비루스로 감염된 HUT-78 세포의 추출물(밴드 2)와 STLV-III로 감염된 HUT-78 세포의 추출물(밴드 3)사이의 응집 실험에 관한 것이다. 각 밴드의 옆에 표시된 수치들은 가장 대표적인 비루스 단백질의 대략적인 분자량이다(분자량은 킬로달톤으로 나타냄).
II - 핵산
1) HIV-2 레트로비루스의 RNAs
"스포트 블롯(spot blot)"법에 의해 필터에 부착된 비루스의 RNA는 제한조건 (Stringent condition)하에 HIV-1의 DNA와 하이브리드되지 않는다. "제한조건"이란 HIV-2의 RNA와32P로 방사능 라벨된(또는 다른 방법으로 라벨된) 선택 프로오브 사이의 하이브리드화 반응(그후 프로오브를 세척함)이 일어나는 조건이다. 막상에서, 하이브리드화는 18시간 동안 0.1%의 SDS/5×SSC중 50%의 포름아미드(부피/부피)의 수용성용액 존재하에 42℃에서 실시된다. 하이브리드화 반응이 실시된 막은 65℃에서 0.15% SDS와 0.1×SSC를 함유한 완충액중에서 세척한다.
"비-제한 조건"은 하이브리드화 반응후 세척이 실시되는 조건을 뜻한다. 하이브리드화는 30% 포름아미드가 함유된 5×SSC 완충액, 0.1% SDS 중에서,32P로 라벨된(또는 그외에 라벨된) 선택 프로오브와, 18시간 동안 접촉시킴으로써 실시한다. 막의 세척은 0.1 SDS와 2×SSC가 함유된 완충액으로 50℃에서 실시된다. 하이브리드화 실험을 벡터 pUC18중에서 λJ19(Cell 1985, vol.40, p.9)으로부터의 HIV-1의 DNA를 클로닝함으로써 얻은 제조합 플라즈미드 pBT1으로 이루어진 하이브리드화 프로오브로써 실시한다. 비제한 조건하에, 매우 약한 하이브리드화가 HIV-2의 RNA와 HIV-1에서 유래된 클론된 DNA 사이에서 관찰된다.
HIV-1의 클론된 서열이 함유된 다른 프로오브가 사용된다.
a) HIV-1 게놈의 서브클론으로부터 생산되고 파아지 M13에 삽입된 HIV-1의 서브 게놈 DNA의 일본쇄 프로오브, 클론 부위는 프로테아제 유전자 또는 엔도뉴클레아제 유전자와 관계된다.
HIV-1의 엔도뉴클레아제 부위의 하나의 프로오브(염기 3760과 4130사이의 뉴클레오티드 서열)만이 비-제한 조건하에 HIV-2와 약하게 하이브리드한다. "프로테아제" 프로오브(염기 1680과 1804사이의 HIV-1 뉴클레오티드 서열)은 비-제한 조건하에 HIV-2와 하이브리드하지 않는다.
b) HIV-1의 "피낭"부위를 코오드하는 서열로 이루어진 프로오브 pRS3 (pUC18중에서 서보클로닝됨)은 비-제한 조건하에 HIV-2와 하이브리드화 하지 않는다.
"스포트 블롯"법은 또한 "도트 블룻"(스포트에 의한 전이)으로서 공지되어 있다.
HIV-1, HIV-2와 STLV-III의 게놈 RNA 사이 및 HIV-1 비루스의 다른 서브 게놈 서열이 함유된 프로오브사이의 하이브리드화 결과가 제3도에 표시되어 있다.
다른 배양 배지의 상청액(각 스포트 1ml당 0.5의 비율)을 5분간 45,000rpm으로 원심분리시킨다 : 펠렛을 0.1% SDS가 함유된 NTE 완충제에 재현탁시키고 니트로셀룰로우즈 필터상에 부착시킨다. 그것을 2×SSC 배지(0.3M NaCl, 0.03M의 소듐시트레이트)중에서 예비-침지시킨다. 2시간 동안 80℃에서 가온한 후, 필터를 비제한 조건하에(30% 포름아미드, 5×SSC, 40℃) HIV-1의 게놈 서브-단편물을 함유한 여러가지 프로오브와 하이브리드화시키고 50℃에서 0.1% SDS가 함유된 2×SSC용액으로 세척하고 -70℃에서 48시간 동안 스크린을 진폭시킴으로써 자동 방사능 사진법으로 관찰한다.
프로오브 1-4는 (25)에서 설명되는 바의 "프라임 커트[prime cut)"법으로 얻어진 일본쇄 프로오브이다. 간단히, M13 비루스에서 기원되고, 서브 게놈 HIV-1 삽입체들(30)을 함유하는 일본쇄 분체들을 M13(BIOLABS)으로부터 수득한 올리고머 단편물(17 뉴쿨레오티드)에 결합시킨다. 상보성 쇄를 알파위치에서32P로 라벨된 dATP, dGTP, dTTP와 dCTP(Amersham, 3000Ci/mmol)의 존재하에 TM 완충액(10mM 트리스, pH 7.5, 10mM MgClz)중에서 클레노우 효소로 합성시킨다. DNA를 적합한 제한 효소로 절단하고 열로 변성시키며 변성된 폴리아크릴아미드 겔(TDE 완충액중 6% 아크릴아미드, 8M 우레아 함유)상에서 전기 영동시킨다. 그 겔을 5분간 자동 방사능으로 촬영한다. 프로오브를 이 일본쇄 프로오브의 특이활성(SA)은 분/마이크로그람당 5×108-109붕괴(dpm/μg)로 측정되었다.
다른 프로오브에 존재하는 특징적인 서열들은 하기와 같다 :
프로오브 1 : 뉴클레오티드 970-1070,
프로오브 2 : 뉴클레오티드 980-1260,
프로오브 3 : 뉴클레오티드 2170-2240,
프로오브 4 : 뉴클레오티드 3370-3640.
상기 뉴클레오티드의 숫자들은 참고목록(30)의 논문에서 밝혀진 것들이다.
마지막으로, 프로오브 5는 λJ19(31)중에서 HIV 클론의 EcoR1-Sac1 단편물을 함유한 플라즈미드 pUC18로 이루어지며, 이것은 약 108dpm/μg의 SA를 얻기 위해 니크 번역된다.
전체 HIV-1 게놈에 대한 프보오브에 존재하는 서브 게놈 단편물의 상대적 배열이 제3도에 도식적으로 표시되어 있다. 다른 스포트들은 각각 하기와 같다.
스포트 A : HIV-1으로 감염된 CEM C1.13 세포 배양체에서 얻어진 비루스,
스포트 B : STLV-III으로 감염된 HUT-78 세포에서 얻어진 비루스,
스포트 C와 D : 전술한 두 아프리카 환자의 비루스로부터 각각 얻어진 분리물들,
스포트 E : 비감염 HUT-78 세포에서 얻은 음성 대조 세포 추출물,
스포트 F : AIDS를 앓고 있는 자이레 환자에서 얻은 비루스, 이것은 TCGF 존재하에 일반 T임파구중에서 배양된 것임.
스포드 C는 15,000dpm 이지만 상기 모든 스포트는 25,000dpm의 역전사효소 활성에 해당하는 비루스의 양으로써 얻어진다.
하기 관찰이 행해졌다.
비루스 입자가 분리되고, 높은 역전사효소 활성이 입증된 고감염 세포의 배양 상청액으로부터 정제되지만 정제된 비루스 입자에서 얻은 두개 HIV-2 분리물의 게놈 RNA는 상술한 제한 조건하에 어떤 프로오브와도 하이브리드 하지 않는다.
전술한 비-제한 조건하에서, 하기 관찰들이 이루어졌다 : 모든 프로오브들이 대조 HIV-1 제조물로부터 얻어진 게놈 RNA와, AIDS를 앓고 있는 자이레 환자에서 얻은 다른 분리물의 게놈 RNA와 강력하게 하이브리드 된다.
수득한 두개의 프로오브(뉴클레오티드 990-1070과 990-1260, HIV-1의개그(gag) 지역으로부터 유래된 것들)는 HIV-2 레트로비루스의 추출물로부터의 스포트들과 약하게 하이브리드된다. 이 두개 프로오브중 하나만이(뉴클레오티드 990-1260) STLV-III 스포트와 약하게 하이브리드된다(제3도). pol 부위의 단편물이 함유된 프로오브(뉴클레오티드 2170-2240)에 대해서는 STLV-IIl와, 그리고 훨씬 약하기는 하지만 HIV-2의 RNA와 하이브리드됨이 관찰된다. pol 부위의 다른 프로오브(뉴클레오티드 3370-3640)는 HIV-2와 STLV-III 스포트의 어느 것과도 하이브리드 되지 않는다.
마지막으로, 니크 번역으도 변형되었으며, HIV-2의 전체 env 유전자와 LTR(뉴클레오티드 5290-9130)을 함유한 프로오브는 STLV-III의 RNA 또는 HIV-2의 RNA와 반응하지 않는다.
HIV-1의 pol 해독 프레임(프로테아제 부위에 해당)의 5' 말단을 함유하는 다른 프로오브가 HIV-2의 RNA 또는 STLA-III의 RNA와 하이브리드되지 않음이 또한 주시된다.
위의 결과에서 HIV-2 비루스는, 구조적 면에서 볼때, STLV-III 보다는 HIV-1 비루스와 거리가 먼것으로 나타난다. 그러나 HIV-2는 STLV-III과 크게 다른데, HIV-2 비루스는 실제로 원숭이에서는 감염성이 없고, STLV-III 비루스는 똑같은 종류의 원숭이에서 확실한 감염성이 있는 것으로 비교, 관찰된다.
HIV-2의 제한 지도와 게놈 RNA 서열 또는 이 게놈 RNA로부터 얻어진 cDNA의 서열이 기술상 공지된 바와 같이 입수될 수 있는데, CNCM에 기탁된 HIV-2의 균주는, 적당히 증식시킨 후 제한지도와 뉴클레오티드 서열을 결정하기 위해 필요한 유전적 장비들과 함께 이용될 수 있기 때문이다. 본 발명의 HIV-2-분리물중 하나의 게놈의 제한지도가 설정되는 조건과 이 게놈으로부터 유래된 cDNA의 어떤 부분이 서열화되는 조건이 후술되어 있다.
HIV-2 레트로비루스로 대표적인 비루스의 게놈 유전자 지도를 제4도에 나타내었다. 이 cDNA 단편물 제한지도는 제5도에 나타내었다. 마지막으로, 이 후자의 단편물의 부분이 서열화 되었다.
이 서열과, 이것이 함유하고 있는 제한 부위의 번호가 제6도에 나타나 있다. 클론된 전체 cDNA- 또는 이 cDNA의 클론된 단편물-는 특정한 하이브리드화 프로오브로서 사용될 수 있다.
2) HIV-2의 RNA로부터의 유도된 cDNA와 이 cDNA의 단편물 전술한 cDNA가 얻어지는 조건이 후술된다.
이 cDNA를 만들기 위한 첫번째 단계는 프라이머(주형)으로서 올리고(dT)와 개시제 cDNA 쇄를 제조하기 위해 세정제에 의해 활성화된 내인성 반응을, 감염된 CEM 세포의 상청액에서 얻어진 정제된 비리온상의 HIV-2의 역전사효소를 사용하여 실시하는 겻으로 이루어진다. CEM 세포주는 G. E. Foley등에 의해 저술된 Cancer 18:522-529(1965)에서 설명된 바의 립포 블라스토이드 CD4+세포주이다. 사용되는 이CEM 세포를 다량의 HIV-2를 계속 생산하는 것으로 입증된 ROD 분리물로 감염시킨다.
이차 쇄의 합성후(뉴클레오티드와 박테리아 DNA 폴리머라제 즌재하에서), 이 본쇄 cDNA를 박테리아 파아지 벡터 M13 TG130에 삽입한다. 104제조합 M13 파아지의 파아지 라이브러리를 얻고 원 위치에서 HIV-1 프로오브로써 스크리닝한다. 후자는 LAV 분리물의 RNA에서 유래된 cDNA의 3'-말단으로부터 기원되는 1.5kb 단편물을 포함한다(제7A도에 나타냄). 약 50개 양성 플라크를 검출, 정제후, 그 삽입체의 교차 하이브리드화와 말단의 서열화에 의해 특징을 규명한다.
이 과정은 LTR(S. Wain Hobson등에 의해 저술된 Cell 40:9-17(1985)에 설명된, HIV-1의 "긴 말단반복체 ; long termianl repeat"의 약어) 부분의 폴리아데닐화된 RNA의 3'말단에 거의 상보적 서열들을 함유하는 다른 클론들이 분리될 수 있게 한다.
HIV-1의 3'LTR 부분과 하이브리드되는 문제의 M13 클론 그룹의 삽입체중 가장 큰 것은 E2로 명명되는 약 2kb 클론이다. HIV-1의 3'LTR 부분과 같이, 클론 E2는 폴리(A) 말단부분으로부터 약 20개 뉴클레오티드 상부에 위치한 AATAAA 시그널을 포함하며, 3'LTR 부분은 HIV-2의 부분에 해당한다. 부분적으로 서열화한후, HIV-2의 3'LTR 부분은 HIV-1의 상동한 부위와는 유사성이 먼것으로 판명되었다.
제5도는 이것을 함유하는 플라스미드 pSPE2중에 결합된 E2(연장된 직사각형 영역) 단편물의 제한 지도이다. 이것은 HIV-2의 R 부분과 U3 부분을 함유한다. 이 도면은 p과 U3 부분의 경계를 나타내지 않는다.
E2 부분의 서열은 제6도에 나타낸다. 특정 제한 부위의 위치가 표시되어 있다. HIV-1과 HIV-2의 3'LTR 부분사이의 작은 정도의 관련성을 제7도에 나타낸다. 실제로, 두개 LTR 서열의 약 50% 뉴클레오티드만이 일부 삽입 또는 삭제를 감수한 채로 배열될 수 있다(약 50% 서열 상동성). 비교적 HIV-1의 다른 변이주인 아프리카 및 아메리카인 분리물의 서열 상동성은 95%이상이며 삽입 또는 삭제가 없다.
클론 E2는 HIV-2로부터 얻어지며 다른 클론에 존재하는 서열의 하이브리드화 필더상에 HIV-2에 대한 특정 프로오브로 사용하여 확인한다.
이 프로오브는 또한 제한 조건하에 HIV-2의 게놈 RNA를 검출한다. 이것은 ROD 분리물 또는 다른 HIV-2 분리물로 감염된 CEM 또는 그 유사 세포의 DNA에 대한 "써든 블롯"법에 의해서도 검출될 수 있다.
HIV-1 감염 세포 또는 비감염 세포의 cDNA와 프로오브와의 하이브리드화 시험에서는 똑같은 제한 조건하에 아무런 시그널이 검출되지 않는다. 이 결과는 HIV-1에 대한 HIV-2의 외인성 특성을 확증시키는 것이다. 약 10kb 종류(비-결합 비루스 DNA에 해당할 것임)가 HIV-2으로 감염된 세포의 비분해 DNA중의 주요성분으로 검출된다. 비루스 DNA의 환상 형태에 해당될 것으로 추측되는 6kb의 외관 크기를 갖는 다른 DNA도 또한 검출되었다.
HIV-2 게놈의 다른 부분들도 또한 확인되었다. 이를 위해, 게놈 라이브러리를 파아지 람다 L47중에서 조립한다. 파아지 람다 L47.1은 W. A.M. Loenen등의 gene10,249-259(1980)에 설명되어 있다.
효소 Sau 3AI로 분해후 HIV-2 ROD로 감염된 CEM 세포주로부터 유래된 DNA를 분해시킴으로써 얻어진 단편물로써 게놈 라이브러리를 조립한다.
약 2×106재조합 플라크가 HIV-2 cDNA의 라벨된 E2 삽입체가 포함된 클론으로써 원 위치에서 스크린된다. 10개 재조합 플라크를 플라크상에서 검출하고 정제한다. 이 세개 파아지의 제한 지도는 비-제한조건하에 HIV-1의 서브 게놈 프로오브뿐 아니라 긴급 E2 삽입체와의 "써든 블롯" 하이브리드화에 대한 능력으로써 특징지워진다.
전체 환상 비루스 DNA로부터 유래된 9.5kb 삽입체를 가지며, 완전한 HIV-2 게놈을 함유하는 클론을 확인한다. 이것은 "람다 ROD 4"로 명명한다. 결합된 프로비루스에서 유래된 다른 두개 클론, 람다 ROD27과 람다 ROD35는 비루스 암호 서열의 LTR 서열 및 인접한 세포 DNA 서열을 함유한다. 이 다른 서열들이 제8도에 표시되어 있다.
람다 클론의 단편물을 플라즈미드 벡터 pUC18에서 서브 클론한다. 각각 전술한 플라즈미드 벡터에서 서브 클론된 λROD4,λROD 27과 λROD 35에서 유래된 단편물을 제8도에 또한 나타내었다. 하기 서브 클론들이 얻어졌다 :
-람다 ROD 27에서 유래된 pROD 27-5는 HIV-2 게놈의 5.2kb 부분과 인접한 세포 서열(EcoRI 부위 주변의 5'LTR과 5' 암호 비루스 서열)을 함유한다 ;
-람다 ROD 4에서 유래된 pROD 4.8은 약 5kb Hind III 단편물을 함유한다. 이 분체는 HIV-2 게놈의 중앙부분에 해당한다.
-pROD 27-5'와 pROD 4.8은 서로 중복되는 HIV-2 삽입제를 함유한다.
-pROD 4.7은 람다 ROD 4의 1.8kb Hind III 단편물을 함유한다. 이 단편물은 pROD 4.8에서 서브 클론된 단편물에 대해 3방향에 위치하며 약 0.8kb의 암호 비루스 서열과, 파아지 람다(람다 L 47.1)의 왼쪽 아암(arm)의 BamHI와 Hind III 클로닝 부위 사이에 놓인 부분을 함유한다 ;
-pROD 35는 EcoRI 부위에 대해 3방항으로 모든 HIV-2 암호 서열과 세포원의 3'LTR과 약 4kb의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
-E. coli HB 101에 존재하는 pROD 27-5'와 pROD 35는 CNCM에 I-626과 I-633호로 1986년 11월21에 기탁되었다.
-E. coli TG 1에 존재하는 pROD 4.7과 pROD 8은 CNCM에 각각 I-627과 I-628호로 1986년 1l월21일에 기탁되었다.
제4도에서 보인 제한 지도를 갖는 완전한 HIV-2 ROD 게놈을 EcoRI와 pROD 27-5'로 사전에 선상화된 pROD 35로부터 재조립한다. pROD 27-5의 EcoRI 삽입체를 pROD 35의 EcoRI 부위에서 정확한 방향으로 결합시킨다.
HIV-2와 다른 인체 또는 시미안 레트로비루스 사이의 관련 정도를 상호 하이브리드화 실현에 의해 평가한다. HIV-1과 HIV-2 게놈의 다른 부분사이의 관련 상동성을 클론된 HIV-1 게놈으로 부터와, 방사 라벨된 람다 ROD 4로부터 각각 기원된 단편물의 하이브리드화 시험에 의해 측정한다. HIV-l 게놈에 대한 이 단편물(1에서 11까지 번호 붙음)의 상대적 위치를 제9도의 하단에 나타난다.
매우 낮은 제한 조건하에서도(Tm 42℃); HIV-1과 HIV-2 게놈은 그들의 각각 gag 유전자(스포트 1과 2), pol에서 역전사효소 부분(스포트 3), pol의 말단부분, Q(또는 sor) 유전자(스포트 5)와 F(또는 3' orf) 유전자와 3'LTR(스포트 11) 수준에서만 하이브리드된다. HIV-2의 첫번째 cDNA 클론을 검출하기위해 사용되는 HIV-1 분체는 스포트 11의 서브클론에 해당되며, 비-제한 조건하에 HIV-2와 비교적 잘 하이브리드된다. 피낭 유전자, tat 유전자 부분과 pol 부분은 크게 다른 것으로 나타난다. 이 데이타와 LTR로써 얻어진 서열(제3도)은 HIV-2가(아뭏든, 이것의 피낭(envelope)에 대해) HIV-1의 변이주가 아님을 증명한다.
HIV-2는 HIV-1 보다는 SIV [M. D. Daniel등의 Science 228:1201-1204(1985)에 설명됨]와 더욱 밀접하게 관련되는 것으로 관찰되었다.
피낭 단백질이 포함된 SIV의 모든 단백질들은 HIV-2로 감염된 환자 혈청으로 면역침전되지만 HIV-1과 HIV-2의 혈청학척 교차-반응성은 코어 단백질에만 제한된다. 그러나, SIV와 HIV-2는 그들의 단백질의 분자량에 관해 전술한 차이점으로 구분될 수 있다.
뉴클레오티드 서열에 관해, HIV-2가 SIV와 관련됨이 또한 주시된다.
또한, HIV-2을 특징 규명함으로써 표적 세포의 표면에 대한 비루스의 결합 및 그 비루스의 연속적 흡수에 결정적으로 관련되는 피낭 당단백질의 부분을 규명하는 것이 가능하다. 상호작용이 CD4 분자를 통해 일어나며 HIV-1과 HIV-2는 똑같은 수용제를 사용하는 것으로 나타난다. 따라서, HIV-1과 -2의 env 유전자 사이에 많은 차이가 있음에도 불구하고 두가지 HIV 피낭의 제한된 상동 부분은 T4 임파구의 공통수용체에 대한 결합 부분으로 간주될 수 있다. 이 부위들은 HIV 비루스에 대한 보호 면역 반응을 인체내에서 유도하기 위해 사용될 수 있는 펩티드의 면역원성을 갖는 에피토프를 형성하기 위해 모집된다.
비루스 또는 프로비루스를 보유하고 있는 환자의 유전 물질과의 하이브리드화 반응에서 프로오브를 만들기 위한 서열, 특히 그들의 임파구내에서 HIV-2 비루스 RNA 존재를 검출하기 의한 서열은 ROD 4의 E2 cDNA의 5kb Hind III 단편물의 조합으로부터 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 모든 방법, 특히 "노던 블롯", "써던 블롯"과 "도트 블롯"법에 의해 실험이 실시될 수 있다.
본 발명의 다른 특징들은 HIV-2의 레트로비루스 게놈에서 유래된 cDNA의 여러부분을 포함하는 많은 재조합 DNA 생산 및 레트로비루스 게놈의 어떤 부분을 확인하는 실시예에 대한 설명중에서도 나타난다.
[실시예 I]
HIV-2의 진단용 키트에 사용하기 위한 DNA 프로브(probe)
정제된 비루스 입자로부터 얻어진 RNA 게놈에 대해 상보적인 cDNA를 다음 방법으로 제조하였다 ; HIV-2에서 분리된 HIV-2 ROD를 감염시킨 CEM 세포를 48시간 배양한후 얻어진 상청액을 초고속으로 원심분리시켰다. 비루스입자를 포함하고 있는 원심본리된 결정 소구들을 슈크로즈 그레디언트상에서 다시 원심본리시켜 새롭게 원심분리된 펠렛을 얻었다. 본 슈크로즈 그레디언트 방법은 유럽 특허출원 84/401.234-0.138.667에서 이미 설명된 방법과 같은 방법이다.
정제된 HIV-2 제제를 사용하여 디터전트로 활성화시킨 내인성 반응성을 통해 cDNA를 합성했다.
간단히 설명하면, 50mM 트리스-염산, 5mM MgCl2, 10mM DTT, 트리톤[TRITON)이라는 제품명으로 시판되는 디터전트 0.025%, 그리고 4종류의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트를 각각 50μM, 그리고 올리고(dT) 개시 서열을 넣어 혼합한 반응 혼합물에 비루스 입자의 표본을 가해 주었다. 반응은 37℃에서 90분간 실행되었다.
첫번째 반응 배지내에 존재하는 단백질을 페놀로 추출한후, 두번째 c-DNA 사슬을 22℃에서 1시간 동안 그리고 15℃에서 1시간 동안 RNAse, E. coli DNA 폴리머라제 I과 4종류의 데옥시뉴클레오티드가 존재하는 상태에서 합성했다. 이 2본쇄 cDNA에 T4 DNA 폴리머라제를 작용시켜 블런트 말단(Blunt ends)를 만들어 내었다. 이 과정에 사용된 모든 시약은 상업적으로 시판되는 것(AMERSHAM cDNA 키트)으로 공급자가 추천한 것을 사용하였다.
(1) EcoRI 부위를 포함하고 있는 링커(linkers ; Pharmacia에 의해 시판됨)를 T4 DNA 리가제(ligase ; BIOLABS에 의해 시판됨) 존재하에서 cDNA의 블런트 말단과 연결(ligation)하고 (2) 제한 효소 EcoRI으로 이 링커를 절단하고 (3) AcA 34상에서(LKB-IBF) 겔 여과(ULTROGEL이라는 제품명으로 시판되는 겔 컬럼)시켜 링커 단편을 제거한 후, EcoRI으로 절단된 M13 TG130 벡터내로 이 cDNA를 도입시킨다. 총 cDNA의 라이브러리는 E. coli 균주 TG1을 형질 전환한후 산출되었다. 대략 104개의 재조합 M13 플라크들이 산출되었다.
cDNA의 라이브러리에서 HIV-2 cDNA를 포함하는 재조합 M13 클론을 선택하기 위해 플라크 하이브리드화기법(technique of plaque hybridization)을 사용했다. M13 플라크의 DNA를 니트로셀룰로오즈 필터로 옮기고, 유럽 특허출원에서 설명된 LAV(또는 HIV) 비루스의 "λJ19" 클론에서 유도된 아종 게놈의 HIV-1 프로브로 하이브리드를 형성했다. 이 프로브는 대략 HIV-1 DNA의 1,500염기쌍(base pairs) 길이 정도로 구성된 삽입부를 포함하고 있다. 이 삽입부는 각각 "env" 유전자의 개방해독 프레임 내부와, HIV-1의 3'LTR 말단의 R 분절(segment)내에 있는 2개의 Hind III 제한 위치에 의해 결합되어진다. 이 프로브는 env 유전자의 3'말단, 전체 F 유전자, 그리고 대략 1500염기쌍 정도의 길이를 갖고 있는 LTR의 R 분절 일부와 U3 분절을 포함하고 있다.
1.5kg의 Hind III 삽입부를 포함하고 있는 프로브는 개시 서열과 클레노우 DNA 폴리머라제 I(Klenow DNA polymerase I)의 존재하에서 4시간 동안 15℃에서, [32P]-dCTP 및 -dTTP(3000Ci×10-3몰)을 함께 배양시켜 라벨했다. 라이브러리내의 cDNA 클론의 하이브리드화 테스트는 5×SSC, 5×Denhart, 포름아미드 25%, 변성된 연어정자 DNA 100μg/ml와 라벨된 프로브(109cpm/μg의 특이성을 갖는 것을 2x107cpm)로 구성된 하이브리드 형성을 위한 배지용액내의 37℃에서 저제한 조건으로(low stringency condition) 실행했다. 필터를 다음과 같이 조성물로 구성된 세종류의 용액으로 3단계에 걸쳐 연속적으로 세척했다.
2회 세척 : 2×SSC, 0.1l% SDS, (42℃에서 30분간 2회)
3회 세척 : 0.1×SSC, 0.1% SDS, (65℃에서 30분간 2회)
매회 세척후 필터를 자동 방사선 사진법으로 조사했다.
여러개의 양성 클론들이 1회 세척후 감지되었고 2회 세척후에도 감지되었다. 그러나 3회 세척후 모든 시그널이 사라졌다. 이 사실은 양성의 클론들이 HIV-1 게놈과 단지 약한 정도로만 관계를 갖고 있을뿐이며, 상술한 선택을 실행하기에 매우 충분하다는 것을 나타내준다. 이러한 양성 클론들을 플라크상에서 다시 옮겨 계대 배양시키고 동일한 검출용 시료와 세척 1회에 상응하는 제한(stringent concition) 조건하에서 다시 하이브리드를 형성시켰다. 클론 대부분이 아직은 양성 상태이다.
클론들을 적절한 제한 조건하에서 인체의 전체 DNA 프로브를 사용하여 5×SSC, 5×Denhart 및 40% 포름아미드내에서 하이브리드를 형성하고, 50℃에서 1×SSC, 0.1% SDS로 세척하여 선택된다. 전술한 양성 클론은 감지되지 않으므로 이는 중복되는 특정 DNA에 해당하는 것이 아니며, 리보조옴성 RNA의 cDNA에 해당하는 것도 아님이 판명되었다.
양성인 M13 재조합 클론들은 액체 배지 중에서 배양되고, 다음과 같은 특성이 있다.
(1) 재조합 클론의 삽입체의 크기
M13 1본쇄형 DNA를 클론에서 수득하며 M13 17-mer 개시 서열 및 클레노우 효소 존재하에 2본쇄형으로 합성이 이루어졌다. 삽입부를 EcoRI(BOEHRINGER)을 사용하여 절단하고 아가로즈 젤 전기 영동법으로 분석했다. 대략 2kbp의 길이를 갖는 E2.1로 표시되는 클론을 제외하고 대부분의 삽입제는 200 내지 600및 200bp의 길이를 나타내었다.
(2) 뉴클레오티드 서열 분석
여러개의 클론들은 생거(Sanger)등의 디데옥시 방법을 사용하여 부분적으로 서열이 결정되었다(Sanger방법 : Proc. Nat1. Acad. Sci.74 : 5463-가1977)) 여러종류의 독립적인 클론들이 서로 길이가 다른 그들의 3'말단에 있는 poly(A) 사슬을 제외하고는 유사한 뉴클레오티드 서열을 갖고 있었다. 이러한 결과로부터 cDNA 클론들이 RNA 주형으로부터 유도된 것임을 입증해준다. HIV-2 게놈의 3'말단을 포함하는 이들 cDNA 클론들의 상세한 서열 분석 결과, HIV-1과 제한된 관계만을 나타내고 있었다.
(3) HIV-2의 게놈 RNA 및 DNA의 하이브리드화
(a) HIV-2의 게놈 RNA의 제조 ·
감염된 상청액을 원심분리 시켰다(500,000회전, 30분) 침전물의 펠렛을 pH 7.5의 트리스 10mM, EDTA 1mM SDS 0.1% 안에 재현탁시켰다. 삽입 클론중 하나(도면 1.1)를 라벨하여, 다른 종류의 비루스 분리물들에서 얻은 RNA 게놈과 도트-블롯(dot-blot) 기법에 의해 하이브리드를 형성시키기 위한 검출용 시료로 사용했다. "도트-블롯" 기법은 다음 단계에 의하여 행해졌다. (i) 20×SSC(3M NaCl, 0.3M 소듐 시트레이트)내에 미리 담구어둔 니트로셀룰로오즈 막상의 스폿내에 샘플(HIV-2 용해물)을 용착시키고 공기상에서 건조시킨후 (ii) 80℃에서 2시간 동안 막을 처리하고 (iii) 하이브리드화를 실행한다.
이 하이브리드화는 높은 제한 조건하에서 실행되었다(42℃에서 5×SSC, 5×Denhart, 50% 포름아미드). 그 다음 65℃에서 0.1×SSC, 0.1% SDS로 세척했다. 이러한 조건하에서, 프로브는 LAV-II ROD 및 그에서 유래된 클론 c-DNA를 포함하는 HIV-2의 두 종류의 독립적인 분리물의 스폿과 강하게 하이브리드된다. STLV-III mac[시미안 T-임파구추향성 비루스("SIV"로 공지됨), 유형 III 붉은원숭이]에 의해 생겨단 스폿에서는 약한 정도의 하이브리드 시그날을 나타내었으며 HIV-1 분리물과는 하이브리드화가 거의 검출되지 않았다.
32P로 라벨된 프로브로서 2kb 삽입부를 포함하는 E2.1 클론을 사용한 "써던 블롯"(Southern blot) 실험은, 미감염 세포의 DNA와는 전혀 하이브리드화가 나타나지 않았고 높은 제한 조건하에서 HIV-2로 감염된 세포에서 분리된 세포들 밴드가 검출되었다. HIV-2는 제한 효소 절단 지도상에서 다형성을 나타내는데, 이는 HIV-1의 제한 효소 절단 지도상에 나타나는 것과 동일하다. 감염된 세포의 완전한 세포 DNA에서 두가지 유형의 사그날이 "써던 블롯" 방법에 의해 검출된다 ; (1) 비루스가 병합된 경우 대략 분자량 20kb 이상을 갖는 DNA 단편물. (2) 게놈내로 병합되지 않은 비루스의 경우 저분자량(9, 10kb)의 단편물.
이러한 특징은 레트로비루스(retrovirus)에서는 상당히 특이하다.
감염된 세포로부터 STLV-III(SIV-3)를 가지고 행해진 몇가지 실험들에서 시미안 레트로비루스는 HIV-2와는 비교적 먼거리에 위치되었다(이 시그널은 저제한 조건하에서만 검출되었다). 이들 실험으로부터 상술한 프로브들이 HIV-2를 검출할 수 있음을 알았다.
(4) 박테리아의 플라즈미드 벡터내에 HIV-의 cDNA를 클로닝
양성의 M13 클론인 E2.1이 선택되고 플라즈미드 벡터내로 클론화되었다. 재조합 M13(TG 130) 파아지 E2의 DNA가 HIV-2 게놈(HIV-2 ROD에서 산출)의 3'부분을 포함하는 2kb의 삽입부를 가지고 있는 1본쇄 DNA 상태로 정제되었다. 이 삽입부가 멜톤.디.데이(357 Nucleic Acid Res.12:035-7056(1984))에 의해 설명된 플라즈미드 pSP 65로 전이되었다.
두번째 사슬은 17-mer 개시 서열(AMERSHAM) 그리고 4종류의 뉴클레오티드 A,C,T,G 및 DNA 폴리머라제 I(클레노우)의 존재하에서 시험관적으로 합성되었다、EcoRI 삽입물은 EcoRI 분해에 의해 절단되고 아가로즈 겔에서 정제된 뒤 EcoRI으로 미리 분해된 pSP65에 결찰되었다. 결찰 혼합물은 Ecoli 균주에 옮기고, 재조합물들을 앰피실린에 대한 내성을 근거로 선택했다. 확인된 제조합물들은 50μg/ml의 앰피실린을 포함하고 있는 LB 배지(루리아 배지)에서 배양시켰다. 이 재조합 플라즈미드를 정제하고, 정확한 삽입단편물의 존제에 대해 조사했다.
산출된 클론중 참고번호 pSPE2는 1986닌 9월 5일 수탁번호 I-595에 의해 파리에 있는 CNCM에 기탁되었다.
HIV-2의 cDNA에서 유도되어 전술한 프로브로 삽입된 삽입물은 E2의 일부와 일치하는, 상기에서 밝힌 뉴클레오티드 서열을 포함하고 있었다.
[실시예 II]
HIV-2 비루스 입자의 RNA 게놈에 대한 상보 DNA에 상보 cDNA의 클로닝
ROD 분리물로 감염된 CEM 주에서 얻어진 배양액의 상청액 5
로부터 HIV-2 비루스입자를 정제해 내었다. 올리고(dT) 개시 서열의 존재하에서 디터전트로 활성화된 내인성 반응을 통해(Nature,312,757-760(1984)에 알리즌등에 의해 설명된 방법임) 정제된 비루스의 침전물과 접촉시켜 cDNA의 첫번째 사슬을 합성해 내었다. RNA/cDNA 하이브리드가 페놀/클로로포름 혼합물에 의한 추출법 및 에탄올에 의한 침전법으로 정제되었다. DNA 폴리머라제 I/RNAseH의 존재하에서 cDNA의 두번째 사슬이 제조되었다(Gubler 및 Hoffman에 의해 설명된 방법). 본 논문을 참고문헌으로 사용한다. AMERSHAM에 의해 시판되는 cDNA 합성 키트의 성분을 사용하고, DNA 폴리머라제 T4의 존재하에서 2본쇄 cDNA는 블런트 말단부를 갖게 된다.
PHARMACIA에 의해 시판되는 EcoRI 링커를 cDNA의 말단에 연결시켰다 ; 그렇게 변형된 cDNA를 EcoRI으로 분해시킨 후, AMERSHA에 의해 시판되며 EcoRI 미리 분해시켜 디포스포릴 레이션된 파아지 벡터 M13 tg130 대로 삽입시켰다. cDNA 밴드는 E.coli 균주 TG1의 형질전환 이후 산출되었다. 재조합 플라크는(104) 필터상에서 HIV-1으로부터 유래했고 상기에서 언급된 1.5kb의 Hind III 단편을 포함한 J19 클론과 하이브리드를 형성하여 복사가 허용된 상태로 필터상에서 조사되었다. 필터는 5×SSC, 5xDenhart 용액, 25% 포름알데히드 및 변성된 연어 정자 DNA(100μg/ml)를 포함하는 배지에서 4시간동안 37℃ 정도로 하이브리드하고, 동일한 완충 용액(Tm -42℃)내에서 부가적인 라벨된 프로오브(4×107cpm)을 넣고 16시간동안 하이브리드를 형성시킨 후, 다시 106cpm/ml를 포함하는 최종 하이브리드화용 완충 용액을 제공하여 하이브리드를 형성했다. 5×SSC, 0.1% SDS 용액으로 25℃에서 2시간 동안 세척을 실행했다(20×SSC는 3M NaCl과 0.3M 소듐 시트레이트 용액에 상응한다는 것은 공지된 사실임). 양성으로 반응한 플라크를 정제하고, M13의 1본쇄 DNA를 제조하고, 그들의 말단을 생거등의 방법에 의해 서열 결정했다.
HIV-1 및 HIV-2로 감염된 세포의 DNA 및 HIV-1, HIV-2의 RNA, 그리고 SIV 비루스입자 각각과 HIV-2의 클론화된 cDNA에서 유도된 검출용 시료와의 하이브리드화.
지속적으로 HIV-1 및 HlV-2를 생산하는 전염성 CEM 주들로부터 각각의 DNA를 추출했다.
PstI 20μg으로 분해되고 다른 경우에는 분해되지 않는 이들 두종류의 레트로비루스의 DNA 샘플들을 0.8% 아가로즈 겔상에서 전기 영동하고 "써던 방법"을 사용하여 나열론 막으로 전이시켰다. 감연된 상청액의 소량을 0.1% SDS 및 동일한 역전사 효소 활성을 갖는 NTE 완충용액내에 넣고, 이를 2×SSC 용액내에 담구어둔 니트로셀룰로오즈 막상에 옮겼다.
예비 하이브리드화는 50% 포름아미드, 5×SSC, 5×Denhart 및 변성된 연어 정자 DNA 100mg/ml를 포함하는 용액대에서, 42℃ 2시간 동안 실행되었다. 하이브리드화는 10% 덱스트란 설페이트와 106cpm/ml의 표지된 E2 삽입부(비활성 109cpm/μg)를 상기의 동일한 완충 용액에 첨가한 후 실행되었다. 0.1×SSC, 0.1% SDS 용액으로 매회 30분 동안 2차례에 걸쳐 세척을 행했다. 16시간 동안 강력한 스크린에 노출시킨후 써던스폿은 0.4N NaOH 내에서 하이브리드가 해체되며, 중화시키면 동일한 조건에서 109cpm/μg으로 표지된 HIV-1 검출용 시료와 다시 하이브리드된다.
[실시예 III]
HIV-2 프로비루스의 전체 DNA를 λ 파아지내로 클로닝
HIV-2 ROD로 감염된 CEM 세포의 DNA는(도면 2, 밴드 a 및 c) Sau3AI에 의해 부분적으로 분해된다. 9-15kb의 단편물이 5-40% 자당밀도구배상에서 선택되고, λL47.1 벡터의 BamHI 아암(arm)에 연결되었다, 시험관내 방법으로 팩케이징 및 E. coli 균주 LA101상에 이를 삽입하여 얻어진 플라크(2×106)을 E2 클론화된 cDNA의 삽입부와 하이브리드화를 시켜 원위치 상태로 관찰했다. 대략 10개의 양성 클론들이 플라크상에서 정제되고 E. coli C600 recBC 대에서 증식되었다. ROD4, ROD 27 및 ROD35 클론이 증식되고, 그들의 DNA를 제한 효소지도를 작성하고, 써던 방법으로 제한 조건하에서 HIV-2의 cDNA 클론 및 비제한 조건(Non-stringent condition)하에서 HIV-1의 gag-pol 프로브와 하이브리드하여 특징을 규명했다.
도면 8은 대략 ROD4, ROD27 및 ROR35 같은 산출된 3종류의 재조합 파아지들의 구조를 나타내고 있다.
이 도면에서 긴 직사각형 부분은 최초로 감염된 CEM 세포의 DNA에서 유래된 프로비루스의 서열에 상응하며, 밝은 부분은 레트로비루스의 서열, 어두운 부분은 세포의 DNA 부분이고, 검은 부분은 상기의 비루스 서열내에 있는 LTR에 상응하는 부위이다.
L 및 R도 표시된 가는 선은 클로닝을 위해 사용되는 L47.1 파아지 벡터에서 유래된 아암 부위이다.
또한 몇몇 제한 위치가 나타나 있다 ; B:BamHI : E:EcoRI ; H:Hind III; K:KpnI ; Ps:PstI ; Pv:PvuII : S:SacI ; X:XbaI.
비루스 서열은 E2 서열과 공통된 부분을 소유하고 있다. E2를 사용한 하이브리드화에 의해 이 상대적 위치가 결정되며, 도면에 그 위치를 나타내었다.
ROD4는 환형 비루스 DNA로부터 유도된다. ROD27과 ROD35는 세포의 DNA 구조내로 병합된 프로비루스들로부터 유도된다.
끝으로 상술한 조건하에 클론화된 삽입부 및 상응하는 ROD4, ROD27 및 ROD35 서열에 대한 상대적 위치가 본 도면에 나타나 있다.
이들은 특히 플라즈미드 pROD27-5', pROD35-3', pROD4.6, pROD4.8 및 pROD4.7 삽입부들이다.
도면 9는 전 LAV 게놈에서 유도된 핵산을 포함하는 M13 아클론으로부터 유래된 1본쇄 DNA의 서로 다른 부분으로 이루어져 있는 단편 1에서 11까지와, ROD-4간에 만들어진 하이브리드 스폿의 상대적 세기를 나타내고 있다. 전 LAV 게놈에 있어 이들 여러종류의 단편들의 상대적 위치를(서열결정에 의해 결정됨) 도면의 하부에 나타내었다. 12번점은 λ 파아지의 비교 DNA를 사용하여 형성된 비교 스폿이다.
도트-블롯에 의한 하이브리드화는 실시예 II에서 사용된 제한 조건하에서 HIV-2의 전 cDNA를 포함하고 있는 ROD4 재조합체를 프로브로 사용하여 실시했다. 세척은 순서대로 다음 조건하에 실행했다 : 2×SSC, 25℃에서 0.1% SDS(Tm -42℃), 1×SSC, 60℃에서 0.1% SDS(Tm -20℃) 및 0.1%×SSC, 60℃에서 0.1% SDS(Tm -3℃) 나타난 스폿은 방사선에 밤새 노출시킨후 산출된 것이다.
[실시예 IV]
생물학적 배지내에서 HIV-2 비루스의 존재를 시험관적으로 진단하는 방법.
재료 및 방법
환자
HIV-2에 감염된 환자군은 1986.9에서 1985.9사이에 자문 및 입원을 위해 리스본에 있는 에가스 모니즈 병원을 찾은 사람들중에서 선별하였다. 아프리카 종종이거나 아프리카에서 머문적이 있는 이들 선택군에 대해, HIV-1(면역형광-IFA 및/또는 ELISA)과 HIV-2(IFA) 모두에 대한 항체로 혈청 테스트를 실시했다.
혈청학적으로 HIV-2로 감염되었다고 판단된 몇명의 환자만을 본 연구에 포함시켰다.
비루스 분리
12명의 환자에게서 전술한 대로 HIV 분리가 시도되었다. 간단히 소개하면, 환자의 말초혈액 임파구(PBL)를 PHA로 자극하고, 정상인 사람의 PHA-자극 PBL과 함께 배양시킨 후 인터루킨-2 존재 상태에서 방치했다. 배양체는 세포병리학적 효과(CPE) 및 상청액의 역전사효소(RT) 활성에 대해 조사되었다.
면역 형광법에 의한 분석(IFA)
IFA 슬라이드가 다음에 의해 제조되었다 : HIV-2로 감염된 MOLT-4 세포를 PBS로 2회 세척하고 IFA 유리 슬라이드상에 층으로 편후(104세포/Wel1) 공기중에서 건조시키고 냉각 아세톤으로 고정시켰다. 이 세포들을 37℃에서 45분 동안 IFA에 대해 시험 혈청 1/10의 희석액과 반응시켰으며, 세척하고, 이를 건조시킨후, 형광 물질이 컨쥬케이트된 염소-항인체 IgG,A,M,(1/100로 희석시킨 것)과 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 세척후 세포들을 0.006% 에반스 블루로 대비염색시키고, 90% 글리세롤과 10% PBS로 고정시키고 형광 현미경하에서 관찰했다.
ELISA
몇몇 환자의 혈청이 상업제품 혈청 테스드 ELAVIA(파스퇴로 진단) 또는 ABBOTT를 사용하여 HIV-1에 대한 항체가 검사되었다.
방사선 면역 침전법(RIPA)
HIV-1 또는 HIV-2로 감염된 CEM 세포가 16시간 동안 35S 시스테인(200μci/ml)의 존재상에서 배양되었다. 상청액을 수거하고 비루스 입자들이 펠렛화되며 RIPA 완층 용액내에서 용해되었다(트리스-염산50mM, pH 7.5, NaCl 150mM, EDTA 1mM, 1% 트리톤×100, 소듐 데옥시 콜레이트 0.1%, SDS 0.1%)
매번 반응마다 105cpm에 상응하는 용해물의 회석체를 50μl 정도 취해 4℃에서 18시간 동안 시험 혈청 5μl와 반응시켰다. 면역 복합체가 세파로즈-단백질 A(PHARMACIA)에 결합되고, 세척후 2분간 가열시켜줌으로써 용출되었다. 용출된 항원은 SDS-폴리아크릴-아이드 겔 전기 영동법 및 자기 방사법에 의해 분석되었다.
도트-블롯 하이브리드화
환자의 PBL로부터 분리된 비루스가 펠렛화되고 트리스-염산 10mM, pH 7.5, NaCl 10mM, EDTA 1mM, SDS 0.5% 내에 용해되었다. RT 활성도가 50,000cpm에 상응하는 1μl의 각 용해물을 니트로-셀룰로오즈상에 옮겼다. 하이브리드화 및 세척이 높은 제한 조건하에 행해졌다 : 6×SSC, 5×Denhart, 50%포름아미드 내에서 18시간 동안 42℃ 조건으로 하이브리드화; 0.1×SSC, 0.1% SDS 내에서 65℃ 조건으로 세척. 비활성 108cpm/μg인32P로 표지된 HIV-1 및 HIV-2 프로브를 사용했다. HIV-1 프로브는 LAVBRU분리체의 전체 게놈에 상응하는 것이고 HIV-2 프로브는 LAV-2ROD분리제의 2kb에 해당하는 cDNA 클론에서 유도되었다.
결과
환자빈도
혈청학적 및/또는 비루스 학적인 근거로 HIV-2 감염을 나타낸 30명의 환자를 연구했다. 그들은 12명의 남성과 18명의 여성이었다. 11세에서 55세의 분포를 나타내었으며 평균 연령은 35세였다.
한명을 제외하고 모든 환자들이 서부 아프리카에서 여러해 동안 거주했던 경험이 있었다 ; 26명이 기니아-비소(Guinea-Bisau)에서 태어나 거주했고, 2명은 케이프 버드군도 출신이었다. 한명의 환자는 11세의 소년으로 알골라 출신이며 여러해 동안 케이프 버드군도에서 생활했다. 본 환자군중 유일한 유럽인은 40세의 포르투갈인으로 8년간 자이레에 거주했으며 서부 아프리카에 거주한 경험은 없다고 했다.
임상적인 증상
30명의 환자중 17명이 CDC 표준에 의한 AIDS를 갖고 있었다. 이들 환자들에게 나타나는 주된 증세는 매해 10kg 이상의 체중 감소와 더불어 만성 설사를 나타내는 것이었다. 10명의 환자에게서 설사는 장의 기회 감염으로 인해 나타난 것으로 관찰되었다 ; 7명의 경우 병원체는 이소스포라벨리 단독이었고, 한명은 잠재성 스포리디움 단독에 의한 것이었으며, 2명은 두병원체 모두에 의한 것이었다. 3명에게는 기회성 장내병원체의 감염이 관찰되지 않았다. 17명의 AIDS 환자중 8명에게서 식도의 칸디다증이 나타났다. 6명의 AIDS 환자가 호흡장애를 나타냈다. 2명에게서 폐결핵증세가 나타났고, 한명에게는 미확인 미코박테리움이 관찰되었다. 2명의 환자가 폐의 아스페르 길루스병을 갖고 있었고, 연이어 한명이 결핵에 감염되었다. 2명의 다른 AIDS 환자가 뚜렷한 병원체를 가지고 있지 않은 상태의 재발성 폐렴 증세를 나타내었다. 한명의 환자는 사후 진단 결과 뉴모시스티스카리니(Pneumocystis carinii)에 의한 폐염이 관찰되었다.
17명의 AIDS 환자중 4명이 카포시 육종(Kaposi's sarcoma)를 갖고 있었다 ; 그중 3명이 피부에 국한되어 나타났고, 한명이 사후관찰 결과 내장으로 전염된 병변을 나타내었다. 중추신경계 장애가 2명의 AIDS환자에게 나타났다 : 한명은 뇌의 임파종을 나타내었고 다른 한명이 원인불명의 아급성 뇌염을 나타내었다. 4명의 환자가 AIDS와 언급된 합병증(ARC)를 나타내고 있었다 ; 2명의 환자가 만성 열병을 동반한 광범성임파선증을 나타내었고, 한명은 만성 설사와 체중 감소 그리고 한명이 재발성 기관지 폐염과 다발성 임파선증을 나타내었다. 남은 9명의 환자중 6명은 HIV 감염과 연관 된것으로 사료되는 어떠한 증세도 나타내지 않았고, 한명은 폐결핵만을 또 한명은 광범성 임파선증만을, 그리고 다른 한명은 신경매독을 나타내었다. 12개월의 연구 기간동안 AIDS 증세를 보인 7명의 환자가 사망했다.
혈청학적 연구
환자 개인별로 HIV-1 및 HIV-2 둘다에 대한 항체에 대하여 혈청 검사를 적어도 1회 시행했다. 모든 환자의 혈청은 HIV-2의 항체에 대해 IFA에 의해 시험되었고, 모두 양성을 나타내었다. 그들중 21명이 RIPA 법으로 HIV-2에 관련된 항체에 대해 시험되었다. 모두 gp140으로 명명된 고분자량을 갖는 비루스의 피낭 당단백질이 침전되고, 그들중 16명의 혈청이 코어 단백질 p26과 반응한 반면 단지 한명의 혈청이 p16으로 명명된 다른 비루스의 코어 단백질과 반응했다.
혈청은 다른 분석법을 사용하여 HIV-1에 대한 교차반응성 항체의 존재에 관해 평가되었다. 24개의 혈청에 IFA 시험법을 사용했다 ; 12개는 음성이었고, 10개는 약하게 반응했으며 2개는 양성이었다. 21개를 ELISA 시험법으로 시험했다 : 16개는 음성이었고 5개는 양성이었다. 마지막으로 11개의 혈청을 RIPA 방법으로 HIV-1 단백질에 대한 항체에 대해서 시험되었다. 3개는 어떠한 비루스 단백질과도 반응하지 않았고, 2개만이 pol 유전자 산물 p34를 침전시켰고 5개는 p25의 코어 단백질과 반응하였다. 2개의 혈청이 아주 약하게 HIV-1의 gp110인 당단백질외막과 반응했다. 이 2개의 혈청 및 HIV-1에 대한 항체에 대해 IFA 또는 ELISA 시험법에서 양성을 나타낸 모든 혈청은 RIPA 법에 의해 HIV-2의 gp140과 강한 반응성을 나타내며 이는 HIV-1보다 HIV-2로 감염됨을 나타내준다. 본 연구군에 포함시키지 않은 한명의 환자만이 혈청학적으로 HIV-2가 아닌-HIV-1에 의해 감염된 것이 밝혀졌다. 이 환자는 중앙 아프리카(사오톰 군도) 출신의 21세 여성으로 AIDS 환자였다.
비루스 분리
12명의 환자에게서 말초 혈액 임파구로부터 레트로비루스의 분리가 시로되었다. 세포병리학적 효과 및 배양체의 상청액내에서 역전사효소의 활성과 연관된 피크가 나타나는 11명으로부터 HIV가 분리되었다.
11개의 분리체 모두가 도트-블롯 하이브리드화를 실시한 결과 HIV-2로 확인되었다. 10개의 분리체로부터 얻어진 비루스의 도트는 하이브리드 형성 및 세척이 제한 조건에서 클론화된 HIV-2 cDNA로부터 유도된 HIV-2 프로브와 행해질때 강하게 하이브리드화하지만 동일 조건에서 HIV-1 프로브와 하이브리드 되지는 않았다.
1개의 분리체만이 HIV-2 프로브와 약하게 하이브리드를 형성하였으며, HIV-1 프로브와는 하이브리드를 형성하지 않았다.
면역학적인 평가
13명의 환자에 있어서 보조인자 T세포(CD44+)로 확인된 순환성 임파구의 수 및 보조인자 T세포 : 억제인자 T세포의 비율을 평가했다. 이들 환자중 11명이 AIDS 환자였다 : 그들의 평균절대 보조인자 T세포의 수는 243+300/μl였고 평균 보조인자 T세포 : 억제인자 T세포 비율을 0.25+0.15였다. 임상적으로 ARC를 나타낸 한명의 환자는 240/μl에 해당하는 다수의 보조인자 T임파구와 0.18의 비율을 갖고 있었다. 신경매독 및 HIV와 연관된 것이라는 증거가 없는 증세를 수반한 다른 환자는 690/μl의 보조인자 T임파구와 0.82의 비율을 나타내었다.
토론
본 연구에서 AIDS와 ARC 또는 HIV-관련된 증세를 보이지 않는 30명의 서부 아프리카인 환자에 있어서 HIV-2 감염을 입증했다. 그 결과 서부 아프리카 환자들에게 AIDS의 주된 병인학적 원인이 HIV-2라는 결론에 도달했다. 관찰된 혈청학적 및 비루스학적 자료들은 이 환자들에게서는 HIV-2 감염이 항시HIV-1 감염을 수반하는 것은 아님을 나타내준다. 항원 및 유전적인 중요한 차이에도 블구하고, HIV-1및 HIV-2는 CD4+T 임파구에 대해 유사한 굴성을 나타내며, 유사한 세포병균학적 효과, 유사한 형태를 나타내며, 그들의 몇몇 구성 단백질내에 공통적인 면역반응성 에피토프(epitope)를 공유하고 있다. 본 연구에서 HIV에 감염된 모든 서부 아프리카인 환자들이 HIV-1에 감염된 사람은 없고 모두 HIV-2에 감염된 것으로 밝혀졌기 때문에, 신종의 비루스인 HIV-2가 서부 아프리카에 발병하는 AIDS의 주원인이 되었다.
HIV-2에 관련된 AIDS의 증세는 중앙 아프리카에서 빈발하는 HIV-1에 관련된 AIDS 증세와 차이가 없다 ; 특히 공통된 증세는 거의 이소스포라베리 및/또는 잠재성 스포리디움에 기인한 심각한 체중감소를 동반한 만성 설사였다. 칸디다증, 미코박테리아증(M. 결핵균을 포함) 및 톡소플라스마병같은 여러 기회성 감염의 빈도가 HIV-1과 관련된 아프리카인의 AIDS에서 나타나는 빈도와 유사함이 알려졌다. 뉴모시스티스 카리니에 의한 폐렴이 미국 및 유럽의 AIDS에 가장 일반적인 합병증이라는 것이 본 연구에 의해 밝혀졌으며 크립토코커스에 의한 뇌막염은 나타나지 않았다.
더욱이 HlV-2가 감염된 AIDS 환자들에게서 나타나는 면역학적 이상은 HIV-1에 관련된 AIDS에서 설명된 것과 동일하다.
HIV-2 항원에 반응하는 혈청 항체를 소유한 30명의 환자중, 7명단이 IFA 또는 ELISA를 사용하여 검출할 수 있는 HIV-1에 톡이적인 항체를 소유하고 있었다. RIPA에서, 7명의 환자 모두는 강력한 면역반응성 에피토프를 공유하고 있는 다른 주요 코어 단백질 p25(HIV-1) 또는 p26(HIV-2)과 반응적인 항체를 가지고 있었다. 5명의 환자들은 그러한 항체가 부족했다 ; 5명 모두 음성 HIV-1 ELISA였다. 3명의환자는 IFA의 경계에 있었고 2명은 음성이었다. 그러나, 비록 그들중 몇몇이 완전히 평가되지는 않았더라도, 비루스의 코어 단백질인 HIV-2의 p26에 대한 혈청 항체를 보유한 9명의 환자들이, HIV-1에 특이적인 IFA 및/또는 ELISA에 매우 약하게 반응하거나 음성임을 발견했다. 이 사항들이 아프리카 및 다른 지역에서 실시되고 있는 HIV-혈청시험에서 HIV-2 항원을 포함시키는 중요한 점으로 주목되고 있다.
11명의 환자들의 말초 임파구로부터 레트로비루스가 분리되었다. 모든 경우에서 비루스의 생장이 2주내에 완성되었고 배양체 상청액내의 역전사 효소의 활성 및 세포병균학적 효과에 의해 특징화 되었다. 그러나 이러한 세포병균학적 효과는 한 종류의 분리체에서 다른 종류의 분리체에 이르기까지 상당히 다양성을 나타내었다 ; 몇몇 분리체들은 세포용해와 더불어 큰 크기의 다수합포세포를 제공하는 반면 다른 분리체들은 제한된 크기의 소수의 합포체만을 나타냈고, 배양체의 생존성에 거의 영향을 끼치지 못했다. 한 종류의 분리체를 제외한 모든 분리체에서 산출된 RNA는 높은 제한 조건에서 HIV-2 cDNA 클론에서 유도되어지고 그 게놈의 3'말단을 나타내는 프로브와 명백하게 하이브리드를 형성함이 밝혀졌다. 동일한 조건에서 HIV-1 프로브와는 아무것도 하이브리드를 형성하지 않았다. 이 사실은 이들 환자가 감염된 분리체는 모두 동일한 유형의 비루스임을 나타내준다. 단지 하나의 분리체만이 HIV-1과 아주 약하게 하이브리드를 형성했다. 그러나 이 비루스는 RIPA에서 HIV-2의 모든 항원과 반응하는 혈청항체를 보유한 환자로부터 분리된 것이었다.
일반적으로 본 발명은 HIV-2 비루스, 그것의 변이체 이외에 사람이 감염되며 HIV-2에 특이적인 면역학적 특성을 소유한 상응하는 비루스에 관한 것이다.
일반적으로 본 발명은 CNCM에 기탁된 HIV-2 비루스가 소유한 특성외에도 다음과 같은 특성을 소유하는 비루스에 관한 것이다.
HIV-2 레트로비루스의 바람직한 타겟은 인체의 Leu 3세포(또는 T4 임파구)와 T4 임파구로부터 유도된 불멸의 세포, -예를 들면 본 특허출원에서 취급된 HUT 781ine 같은 세포들-로 구성된다. 바꾸어 말하면, 이 세포들에 대해 특이적인 굴성을 갖는다고 한다. 그것은 HUT, CEM, MOLT 또는 유사한 유형의 T4 단백질을 발현시키는 모든 영구 주(line)내에서 배양될 수 있다. 이는 T8 임파구에는 감염되지 않으며 사람의 T4 임파구에 대해 세포독성을 갖는다. T4 임파구에 대한 HIV-2 비루스의 세포 병균학적 특성은 그 자체로, 특히 다핵 세포 출현에 의해 명백히 나타난다. 그것은 Mg2+의 존재가 요구되는 역전사효소를 갖고 있으며, 폴리아데닐레이트-올리고 데옥시티미딜레이트(poly(A)-올리고(dT) 12-18)에 대한 강한 친화력을 갖는다. 이는 슈크로즈 그레디언트내에서 대략 1.16 정도의 밀도를 나타낸다. 이는 140nm의 평균직경을 나타내며, 평균직경이 41nm인 코어를 소유한다.
이 비루스의 용해물은 HTLV-I 비루스 또는 HTLV-II 비루스의 p24 단백질과 교차면역반응을 하지않는 p26 단백질을 포함한다. 이 p26 단백질은 상응하는 HIV-1의 p25 단백질보다 약간 크고(대략 1000정도) 상응하는 SIV의 p27 단백질보다 약간 적은(대략 1000정도 적은) 분자량을 갖고 있다. HIV-2의 용해물은 RIPA 실험에 의해 면역학적으로 HTLV-I 또는 HTLV-II의 p19 단백질에 의해 면역학적으로 확인되지 않은 p16 단백질을 포함하고 있다. 그들은 또한 130,000-140,000정도의 분자량을 갖는 피낭 당단백질을 포함하며, 이 피낭은 HIV-1의 gp110과는 교차 면역 반응을 하지 않는 반면 STLV-III의 피낭 당단백질인 gp140과는 교차면역 반응을 한다. 이 용해물은 또한 (35S) 시스테인으로 표지된 분자량이 각각 36,000 그리고 42,000-45,000을 나타내는 단백질 또는 당단백질을 포함한다. HIV-의 RNA 게놈은 제한 조건하에서 HIV-1의 RNA 게놈과는 하이브리드를 형성하지 않는다.
비제한 조건하에서 HIV-2의 RNA 게놈은, HIV-1에서 유도되고 env 유전자 및 그것에 인접한 LTR을 포함하는 염기 서열과는 하이브리드를 형성하지 않는다. 특히 HIV-1의 5290-9130의 염기 서열을 갖는 것, HIV-1 게놈의 pol 지역의 염기 서열을 갖는 것, 특히 2170-2240까지의 염기 서열을 갖는 것 등과는 하이브리드를 형성하지 않는다. 비제한 조건하에서 HIV-1 지역의 염기 서열을 갖는 것, 특히 990-1070 및 990-1260의 염기 서열을 갖는 것과는 약하게 하이브리드를 형성한다.
사람에게 AIDS의 한유형을 유도하도록 감염될 수 있으며 상술한 필수 특징을 소유하며, 그들의 RNA 게놈이 CNCM에 기탁된 HIV-2 비루스의 균주와 제한 조건하에서 하이브리드를 형성할 수 있는 레트로비루스는 HIV-2와 동일한 것으로 간주함을 명백히 한다.
본 발명은 또한 각각의 항원 특히 정제된 상태의 단백질과 당단백질로, HIV-2에서 산출되는 것에 관한 것이다. 정제된 단백질 또는 당단백질이라는 의미는 상술한 실험 조건하에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시켰을 때 단지 한개의 밴드를 나타내는 단백질 또는 당단백질을 말한다. 이들의 각각을 산출하기 위해 적합한 분리 및/또는 정제 방법이 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 기법으로는 R.C. MONTELARO 등에 의해 J.of Virology, 6월, 1982, 페이지 1029-1038에 설명된 것이 언급될 것이다.
본 발명은 일반적으로 HIV-2에서 유래되고, HIV-2의 항원 화합물들의 면역학적 특징과 동일한 특징을 소유하고 있는 폴리펩티드 또는 당단백질, 단백질과 같은 모든 항원에 관한 것이다. 두종류의 항원은 그들이 HIV-2로 감염된 환자의 혈청에서 분리될 수 있는 동일한 항체에 의해 인지되거나, 하기할 "면역학적 동일성"을 위한 조건에 놓이기 때문에 동일하다고 언급된다.
동일한 폴리펩티드, 단백질 또는 당단백질은 상기의 항원의 단편들(또는 화학적 합성에 의해 제조된 펩티드)을 포함해야만 하는데, 그 이유는 단편들을 유도하는 항원과 교차 면역 반응을 일으켜야 하기 때문이다. 바꾸어 말하면 본 발명은 상술한 항원과 마찬가지로 동일한 항체에 의해 감지될 수 있는 동일하거나 유사한 에피토프를 소유한 폴리펩티드에 관한 것이다. 후자의 유형인 폴리펩티드는 상응하는 폴리펩티드 서열을 코드하고 있는 상응하는 DNA 서열의 형질 발현 생성물이다.
HIV-2 비루스는 이 비루스와 접촉상태에 있는 모든 사람들에게 있어 항체를 검출하기 위한 항원의 재료로 사용할 수 있음이 입증되었다.
본 발명은 일반적으로 생물학적 유체인 혈청내에서 특히 HIV-2와 접촉한 사람의 혈청내에서 비루스 존재를 진단하고 최소한 일종 이상의 HIV-2의 항원에 대한 항체의 진단을 위해 사용될 수 있는 조성물에 관한 것이다.
본 조성물은 HIV-2의 정제된 항원 또는 용해물, εχτθαΨτδ가 HIV-1의 것 대신에 사용되는 것을 제외하고는 상기에서 인용한 유럽 특허출원에서 설명된 진단기법을 사용하여 상응하는 다양한 AIDS의 선택적 진단에 적용시킬 수 있다. 이것에 관련하여 본 발명은 특히 내부 단백질인 p12, p16, p26중 최소한 한가지, 또는 p36 또는 gp140을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
동시에 다음과 같은 조성물도 해당된다.
-p26과 gp36
-p26, p36과 gp140
-p12, p16과 p26
-p16, p26과 gp140 등
이 조성물들이 예에 불과하다는 것은 명백하다. 특히, 본 발명은 단백질 및/또는 당단백질을 포함하는 비루스 추출물 또는 용해물, 또는 상기의 당단백질을 미리 모든 단편물에서 분리해 놓은 것들에 관한 것이다.
본 발명은 또한 HIV-2의 단백질 및/또는 당단백질과 HIV-1의 단백질 및/또는 당단백질의 배합물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
예를들어 -HIV-1과 HIV-2의 코어 단백질, 특히 HIV-1의 p25와 HIV-2의 p26 또는 HIV-1의 p18과 HIV-2의 p16중에서 선택한 것의 배합물. ·
-또는 HIV-1의 피낭 당단백질과 HIV-2의 피낭 당단백질 특히 HIV-1의 gp110과 HIV-2의 gp140또는 HIV-1의 p42와 HIV-2의 p36 또는 p42-45중에 선택된 것.
-또는 물론 HIV-1의 단백질 및/또는 당단백질과 HIV-2의 단백질 및/또는 당단백질의 혼함물.
진단목적으로 사용되는 상기 조성물은 AIDS의 진단 또는 그와 관련된 증세 및 병인학적으로 원인이 되는 매개체의 광범위한 스펙트럼에 걸친 증세를 진단하는데 사용된다. HIV-2의 단백질 및 또는 당단백질만을 포함하는 조성물들을 진단과정에 사용함으로써, 그 질병을 초래할 수 있는 레트로비루스의 범위를 더 선택적으로 진단할 수 있는 유용성이 있음은 말할 필요도 없다.
본 발명은 또한 DNA 또는 DNA 단편, 특히 HIV-2 레트로비루스의 RNA에서 유도된 RNA와 cDNA로부터 산출된 클론화된 DNA와 DNA 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 모든 상응하는 DNA, 특히HIV-2의 DNA와 상응하는 서열을 포함하고 있는 DNA, 구체적으로 CNCM에 기탁된 HIV-2 균주의 env와 pol 지역을 코드하고 있는 서열을 최소 50% 정도 동일하게 바람직하게는 70% 정도 동일하게 더 바람직하게는 90% 정도 동일하게 포함하는 DNA에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기에서 정의한 비제한 조건하에서 "스폿 블롯" 기법으로 HIV-2의 RNA 또는 DNA와 하이브리드를 형성할 수 있는 상응하는 DNA(또는 RNA)에 관한 것이다.
본 발명은 HIV-2로 접종시킨 동물에서 생산될 수 있는 혈청에 관한 것이다. 또한 본 발명은 각각의 항체에 의해 유도된, 특히 비루스의 단백질 또는 당단백질에 의해 유도된 폴리크로날 항체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 통상적인 기법으로 제조되는 모노크로날 항체에 관한 것으로 이들 모노 크로날 항체들은 HIV-2의 여러 종류의 다른 단백질에 대해 더욱 특이적으로 유도된 것들이다.
폴리크로날 또는 모노크로날 항체들은 다른 목적에 사용될 수 있다. 상응하는 단백질을 중화시키는 용도, 또는 전비루스의 감염성을 억제하는 용도가 주로 거론될 것이다. 그들은 또한 예를 들면 생물학적 제제내의 비루스적 항원을 입증하기 위해 또는 상응하는 단백질 및/또는 당단백질을 친화 크로마토그래피컬럼을 사용하여 정제하는 과정을 실행할 때 사용될 수 있다.
HIV-1 및 HTLV-III로 표시되는 비루스들과 관련된 기법에 대한 유용한 문헌을(특히 참고문헌은 이러한 설명에 관점을 두고 있음) 본 참고문헌에 삽입시켰으며, 이는 이러한 문헌에 설명된 기법이 유사한 조건하에서 HIV-2 비루스의 분리 또는 상응하는 비루스의 분리는 물론 이들 비루스의 다른 조성분(특히 단백질, 당단백질, 폴리펩티드 및 핵산)을 이들 비루스로부터 제조하는데 적용되기 때문이다. AIDS 또는 LAS의 상응하는 형태를 진단하는 과정에 이들 다른 조성분을 적용시키는 것에 관련하여 이 기술상의 문헌들을 사용할 수 있다.
본 발명은 특히 HIV-2의 단백질 또는 당단백질중 최소한 한종류, 또는 비루스의 추출물 또는 용해물중 선택된 것을 포함하고 있는 조성물과 접촉시켜서 진단할 환자의 혈청 또는 다른 생물학적 배지를 준비하고, 면역학적 반응에 의해 검출하는 일련의 과정에 의한 시험관내의 AIDS 진단방법에 관한 것이다.
바람직한 방법은 예를 들면 ELISA 같은 면역효소학적 반응 또는, 면역형광법과 같은 것이다. 적정은 직접 또는 간접의 면역형과, 직접 또는 간접의 면역 효소학적 분석에 의해 측정될 수 있다.
본 발명은 또한 표지된 비루스의 추출물에 관한 것이다(일종 이상의 HIV-2 비루스 단독 추출물이거나 일종 이상의 HIV-2 비루스와 일종 이상의 HIV-1 비루스의 추출물들을 혼합한 혼합물). 사용할 수 있는 적절한 표지는 효소, 형광체, 방사능물질등이 있다.
적정은 예를 들면 다음과정에 따른다.
-본 발명에 의한 조성물 또는 추출물의 정확한 양을 미세 적정 플레이트상의 well에 넣는다.
-생체외에서 감지될 수 있는 항체를 포함하는 혈청의 희석체를 점점 늘여가면서 well내에 투입한다.
-이 미세 적정 플레이트를 배양한다.
-적절한 완충용액으로 미세 적정 플레이트를 세척한다.
-인체 면역 글로불린에 특이적으로 표지된 항체를 미세적정 플레이트의 well 내로 투입하며, 이때 표지(label)는 방사선, 특히 적어도 특정 파장을 흡수할 수 있도록 변형이 될 수 있는 기질을 가수분해하는 효소와 반응시킨다.
-바람직하게는, 조절에 관한 비교 유형 즉 기질의 가수분해정도, 질병을 일으키는 유효한 실체 또는 잠재적인 위험도 등을 측정함으로써 검출한다.
본 발명은 또한 상기의 진단을 실행하기 의해 사용되는 기구 또는 장비에 관한 것으로서 다음 내용을 포함한다 :
-상술한 유형의 비루스를 정제한 단편물 또는 추출물로 이들 추출물 또는 단편물은 방사능 또는 효소적 또는 면역형광적으로 표지된 것들이다.
-항-(인체 면역 글리불린) 또는 단백질 A(물에 불용성인 비드형태의 아가로즈같은 지지체에 결합된 것이 유용함).
-건강한 사람에게서 산출된 임파구의 추출물.
-표지를 육안 확인하기 위한 기질 또는 적절한 완충용액.
본 발명은 HIV-2 비루스 또는 그들의 변이체를 상술한 검출용 시료를 사용하여 하기에서 서술될 HIV-2의 특징적인 특성을 야기시키기 위해 준비된 여러단계에 걸친 방법에 의거하여 진단하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 또한 HIV-2 비루스의 보균자로 예측되는 환자에게서 얻어진 조직 또는 생물화적 체액 또는 혈청 시료에서 HIV-2 비루스의 존재여부를 진단할 목적으로 사용되는 프로브로서 cDNA 또는 cDNA의 단편물(또는 cDNA를 포함하는 재조합체)을 사용하는 것에 관한 것이다. 이들 프로브 또한 표지되는 것이 바람직하다(방사능 물질, 효소, 형광성 표지를 이용). 특히 HIV-2 비루스 또는 HIV-2의 변이체를 진단할 용도로 사용되는 프로브는, HIV-2 비루스의 게놈에 대해 상보적인 cDNA의 단편 또는 전체를 포함하거나 선택적으로 상기에서 분리된 이들 단편들이 존재하는 여러종류의 클론등이 바람직하다. 특히 클론 E2에 존재하는 HIV-2의 cDNA 분획분, 더욱 바람직하게는 상술한 클론 E2의 HIV 서열의 5'말단의 염기서열 및/또는 3'말단(LTR)의 서열 또는 선택적으로 HIV-2 비루스의 cDNA의 env 지역을 포함하고 있는cDNA이다.
HIV-2 비루스의 진단방법 및 진단용 기구로 사용되는 프로브는 상기에서 설명된 것에 한정되지 않는다. 이 프로브는 HIV-2 비루스의 게놈에서 유래된 누클레오티드 서열, 또는 HIV-2의 변이체에서 유래되거나, 구조적으로 연관된 비루스의 게놈에서 유래된 누클레오티드 서열 등을 포함하며, 이는 그들이 AIDS에 연관되게 진행될 가능성이 있는 사람의 체액내에서 HIV-2에 의해 제조된 항체를 검출할 수 있기 때문이다.
사람에게 최초로 감염된 HIV-2로부터 유래된 누클레오티드 서열을 사용하는 것이 바람직하다.
검출은 이들 프로브를 혈청 또는 뇌척수액, 타액등과 같은 생물학적 배지내에 존재하는 세포로부터 산출된 핵산과 접촉시키거나, 상기 프로브와 용이하게 하이브리드 될 수 있는 핵산이 충분한 배지중에서 접촉시키고, 그후 생성된 하이브리드를 검출하는 공지된 방법으로 실행된다. 상기에서 설명한 하이브리드화에 의한 진단방법은 HIV 비루스의 유형을 굳이 구분할 필요가 없는한에 있어서 HIV-1 및 HIV-2에서 각각 비롯된 프로브를 혼합하여 실행할 수 있다.
일반적으로 HIV-2 비루스의 보균자로 추측되는 환자의 조직 또는 체액 또는 혈청의 시료내에 HIV-2 비루스 또는 변이체의 존재여부를 진단하는 방법은 다음과 같은 단계로 구성된다 ;
1) 표지된 검출용 시료의 제조
2) 환자에게서 산출된 시료의 세포 DNA를 적절한 막상에서 상기의 표지된 프로브와 접촉시켜 제한 조건하에서 최소한 1단계의 하이브리드화를 실시.
3) 상기 막을 하이브리드화에 필요한 제한조건을 유지하기 위해 제공되는 용액으로 세척.
4) 면역학적 검출방법으로 HIV-2 비루스의 존재여부를 검출.
본 발명의 방법을 실행하는 바람직한 다른 경로는 상기의 하이브리드화가 비제한 조건하에서 실행되고 막의 세척을 하이브리드화에 요구되는 조건에서 실행하는 것이다.
본 발명은 특히 비루스의 RNA가 다음과 같은 각각의 염기서열을 포함하는 GAG와 ENV 유전자를 갖는 cDNA와 일치하는 특징을 갖는 HIV-2 비루스에 관한 것이다. 하기의 누클레오티드 서열은 HIV-2 Rod 게놈에 상응하는 cDNA의 지역을 서열 결정하여 표기했다. 그들은 그들이 코드한 아미노산과 관계가 있다.
이미 언급한바대로 본 발명은 그들의 RNA가 유사한 특성, 특히 HIV-2 Rod의 GAG 및 ENV 서열과 비교하여 최소한 50% 바람직하게는 70% 그리고 더욱 바람직하게는 90% 정도의 핵산서열이 동일성을 나타내는 배열을 포함하고 있는 RNA를 보유하는 모든 HIV-2 비루스에 관한 것이다.
본 발명은 C-DNA 단편에 관한 것이며, 이 단편들은 그 구조가 GAGRODN 내에 포함되어 있는 p16,p26,p12를 코드하고 있다. 특히 하기의 서열을 갖는 것들에 관한 것이다 ; -뉴클레오티드 1에서 뉴클레오티드 405(p16을 코드함) -뉴클레오티드 406에서 뉴클레오티드 1155(p26을 코드함), 및 -뉴클레오티드 1156에서 뉴클레오티드 1566(p12를 코드함).
또한 ENVR 내에 포함되어 있고 뉴클레오티드 1에서 뉴클레오티드 2574에 이르는 gp1400을 코드하고 있는 cDNA 단편에 관한 것이다.
본 발명은 또한 유전자코드의 축퇴(degeneracy)를 이용하여 뉴클레오티드 치환체로 치환한 결과 상기의 뉴클레오티드의 서열과 다르나, 이 치환체로 인해 상기의 뉴클레오티드 서열에 의해 코드된 아미노산 서열에는 전혀 변화가 없는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열에 관한 것이다.
또한 본 발명은 아미노산 서열이 전(前) 페이지에서 나타낸 것과 일치하는 당단백질 또는 단백질, 그리고 상응하는 펩티드들에 관한 것이며, 이 펩티드는 아미노산의 첨가, 치환, 희석에 의해 산출된 것들로 이러한 작용에 의해서도 상기 펩티드의 면역학적 특성 전반에 영향을 받지 않은 것을 특징으로 한다.
본 발명은 특히 ENVRN가 코드하고 있는 아미노산 서열을 나타내는 당단백질 외막에 관한 것이다.
본 발명은 또한 피낭항원, 특히 HIV-2 비루스의 gp140을 체중당 10 내지 500, 특히 50 내지 100mg/kg을 투여할 수 있을 정도의 투여 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역학적 조성물에 관한 것이다.
마지막으로 본 발명은 다음에 의해 상기에서 나타낸 단백질(p12, p16 또는 p26) 또는 gp140 구조를 갖는 단백질, 또는 상기 단백질의 특정부분을 제조하기 위한 방법에 관한 것이다 ; 그 방법은 상응하는 핵산서열을 적절하게 선택된 세포의 숙주를 형질전환시킬 수 있는 벡터내에 삽입하고, 이때 숙수는 상기 벡터에 포함된 삽입부를 발현시킬 수 있어야 하며, 상기의 핵산서열을 포함하는 상기 벡터에 의해 선택된 숙주는 형질전환되며, 상기의 변형된 벡터에 의해 형질전환된 세포의 숙조를 배양하며, 발현된 단백질을 회수하며 정제하는 일련의 과정에 의한 것이다.
1985년 10월 18일에 제출된 유럽특허출원 85 905513.9에 나타난 내용은, HIV-1의 게놈에서 유도된 핵산서열을 형질발현 생성물로 구성된 단백질 또는 펩티드의 제조에 관한 기법으로 HIV-2에서 유도된 상기의 단백질 또는 펩티드의 제조에도 적용될 수 있다. 이 유럽출원은 기법과 관련하여 본 참고문헌에 소개하였다.
하기에 HIV-2 단백질의 분자량(MP)은 HIV-1의 것과 비교치로 나타내었다.
HIV Mir 및 HIV-2 ROD는 살리스버리(영국)에 있는 "National Collection of Animal Cel1 Culture"에 1987.1.9자로 기탁번호 87 011001과 87 011002로 기탁되었다.
또한 플라스미드 pROD 35와 pROD 27.5는 애버딘(영국)에 있는 "National Collection of Industrial Bacteria"(NCIB)에 1987년 1월 9일자로 기탁번호 12398 및 12399로 기탁되었다.
본 출원에 언급한 모든 참고문헌은 다음에 수록한다.
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Claims (41)
- 역전사효소 활성이 규정수준에 도달했을때 HIV-2 비루스의 분리물로 감염된 인체의 T4 임파구 또는 상기 임파구로 부터 유래되어 T4 표현형을 갖는 영구 세포주를 배양하는 단계, 자당이나 메트리자미드의 그레디언트 차등 원심분리법에 의해 상기 임파구나 세포주의 배치중에 방출된 비루스를 회수하는 단계및 정제하는 단계로 구성되며, 상기의 회수된 레트로비루스는 인체 T4 임파구에 대한 감염 특성을 지니며, 인체에 AIDS 유발할 수 있는 HIV-2 레트로비루스로서 CNCM에 n°I-502, I-532, I-642 및 I-643으로 기탁된 레트로비루스중의 하나이거나 상기 레트로비루스중의 상기 레트로비루스중 어느 하나에 대응하는 항원에 대해 항체로서 인지될 수 있는 모든 항원을 포함하는 상기 레트로비루스중 하나의 변이주임을 특징으로 하는 HIV-2 레트로비루스의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 회수된 레트로비루스가 인체의 레트로비루스이며, 이의 게놈 RNA는 제한 조건하에서 CNCM에 n°I-502, I-532, I-642 및 I-643으로 기탁된 레트로비루스의 게놈 RNA로 부터 유도된 cDNA 또는 cDNA 단편물의 상보쇄에 하이브리드 될 수 있는 방법. '
- 제1항에 있어서, 회수된 레트로비루스는 분자량이 12000, 16000 및 26000 달톤인 코어 단백질, 분자량이 각기 36000 또는 42000-45000 달톤 정도인 단백질 또는 당단백질 및 분자량 130000 내지 140000 달톤인 주요 외막(envelope)당 단백질에 의해 생성된 일련의 항원으로 구성된 인체 레트로비루스인 방법.
- 제1항에 있어서, 회수된 레트로비루스는 인체의 정제된 레트로비루스로서, 인체에 법원성이 있으며, AIDS를 유발할 수 있고, -HIV-2 레트로비루스의 바람직한 표적은 인체 Leu 3 세포(또는 T4 임파구)와 그 T4 임파구에서 유래된 영구세포주로 이루어지며 ; -감염된 인체 T4 임파구에 대해 세포독성을 지닐 수 있으며 ; -Mg2+이온 존재를 필요로 하며 폴리아데닐레이트 올리고페옥시티미딜레이트(폴리(A)-올리(dT)12-18)에 대한 강한 친화력을 가지는 역 전사효소 활성을 지니고 ; -자당 그래디언트에서 1.16의 밀도를 지니며 ; -140nm의 평균지름을 가지고, 코어는 41nm의 평균지름을 지니며 ; - T4 단백질을 표현하는 영구 세포주에서 배양될 수 있고 ; - T8 임파구에서 감염성이 없고; -이 비우스의 용해물은 HTLA-1 비루스 또는 HTLB-2의 p24 단백질과 면역학적으로 교차반응하지 않은 p26 단백질을 함유하며 ; -상기 용해물은 또한 방사면역 침전 분석에서 HTLV-1 또는 HTLA-2의 p19 단백질에 의해 면역학적으로 인지되지 않는 p-16 단백질을 함유하고 ; -상기 용해물은 HTLV-1 레트로비루스의 gp110과 면역학적으로 교차반응하지 않은 130,000-140,000 달톤의 분자량을 갖는 외막 당단백질을 또한 함유하고 ; -상기 용해물은 36,000의 외관 분자량을 갖는35S-시스테인으로 라벨될 수 있는 분자를 함유하고 ; -HIV-2의 게놈 RNA는 제한 조건하에 HIV-1의 게놈 RNA와 또는 ENV 유전자 또는 LTR과 하이브리드되지 않고 ; -HIV-2의 게놈 RNA는 HIV-1 게놈의 GAG 부분의 한쪽 뉴클레오티드 990-1070과 다른 한쪽 뉴클레오티드 990-1260으로 구성된 뉴클레오티드 서열과 비-제한 조건하에 약하게 하이브리드 되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 회수된 레트로비루스는 STLVIIImac 비루스의 발생이 허용되는 실시조건으로 및 생체내에 주사한 경우 메카커스 레수스(macaques rhesus) 원숭이의 임파구에 만성적인 양상으로 복제되지 않는 레트로비루스인 방법.
- 제1항에 있어서, R 부분과 U3 부분의 서열을 함유하며, 이것의 게놈 RNA의 뉴클레오티드 서열이 하기 뉴클레오티드 서열과 일치하는 뉴클레오티드 서열을 또한 함유하는 레트로비루스의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 회수된 레트로비루스의 게놈 RNA가 하기 뉴클레오티드 서열과 열치하는 GAG 서열을 또한 함유하는 방법.
- 제1항에 있어서, 회수한 레트로비루스의 게놈 RNA가 하기 뉴클레오티드 서열과 일치하는 ENV서열을 함유하는 방법.
- 제1항에 있어서, 회수된 레트로비루스의 RNA가 HIV-1의 게놈 RNA와 제한조건하에서 하이브리드되지 않는 방법.
- 제9항에 있어서, 회수된 레트로비루스의 RNA가 env유전자와 그것에 인접한 LTR인 HIV-1의 뉴클레오티드서열 5290-9130 및 HIV-1게놈의 pol부분인 뉴클레오티드 서열 2170-2240과는 비제한조건하에서 하이브리드되지 않는방법.
- 시험관대에서 재조합하는 단계, 작용성 있는 세포숙주대에서 수득한 변형벡터를 클로닝하는 단계, 산출된 재조합를 회수함으로써 클로닝 벡터에 DNA서열을 삽입하는 단계로 구성된 HIV-2 레트로비루스 RNA를 검출하기 위한 하이브리드화 프로브의 제조방법.
- 제11항에 있어서, 상기 프로브가 상기 레트로비루스의 총추출물 또는 용해물로 이루어진 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 항원이 상기 비루스의 내부 코어단백질, 특히 각각12000, 16000과 26000의 외관분자량을 갖는 p12, p16과 p26중 하나로 이루어진 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 항원이 130000-140000의 외관 분자량을 갖는 gp140 당단백질을 함유하는 방법.
- 제11항에 있어서, 회수된 항원은 HIV-2 레트로비루스의 정제된 하나의 항원과 함께 HIV-2에 대한 항체의 보균자 혈청에 의해 인지되는 에피토프를 함유하는 폴리아크릴 아미드겔상의 전기영동에서 단일결합을 제공하는 항원인 방법.
- 숙주를 형질전환시킬 수 있는 벡터에 대응하는 핵산서열을 삽입하는 단계, 상기 벡터중에 함유된 삽입물을 형질발현시키는 단계, 상기 뉴클레오티드 서열을 함유한 벡터에 의해 상기 숙주를 형질전환시키는 단계, 형질전환된 세포주 숙주를 배양하며, 형질발현된 단백질을 정제하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하여 상기 정의한 단백질(p12, p16, p36 또는 p42) 또는 gp140의 구조나 상기 단백질의 규정부분을 갖는 단백질중 하나를 제조하는 방법.
- 제16항에 있어서, 회수된 항원이 항-p12항체에 의해 인지되는 하기 아미노산 서열 또는 그 서열의 일부분을 갖는 방법.
- 제16항에 있어서, 회수된 항원이 항-p12 항체에 의해 인지되는 하기 아미노산 서열 또는 그 서열의 일부분을 갖는 방법.
- 제16항에 있어서, 회수된 항원이 항-p12항체에 의해 인지된 하기 아미노산 서열 또는 그 서열의 일부분를 갖는 방법.
- 제16항에 있어서, 회수된 항원 항-p12항체에 의해 인지된 하기 아미노산 서열 또는 그 일부분을 갖는 방법.
- 피검체의 혈청 또는 다른 생물학적 매체를 제11항 내지 제14항의 어느 한항에 의한 프로브 또는 제15항 내지 제20항의 어느 한항에 의한 항원과 접촉시키는 단계 및 항-HIV-2 항체와 사용항원 또는 항원들 사이에서 형성되는 면역학적 콘쥬게이트를 검출하는 단계로 구성되어 혈청을 비롯한 생물학적 액체중에서의 항-HIV-2에 대한 항체인 HIV-2 레트로비루스에 의해 유발되는 잠재성 또는 실존성 LAS 또는 AIDS를 실험관내에서 검출하는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 면역학적 콘쥬게이트를 인체 항-면역글로부린-항체 또는 박테리아 A단백질에 의해 생성된 라벨시약과 반응시키고, 그 시약과 상기 면역화적 콘쥬게이트 사이에서 형성된 복합물을 검출하는 방법.
- HIV-2 레트로비루스의 gp140를 비롯한 비루스의 외막 당단백질 또는 상기 당단백질의 밑부분을 HIV-2에 대해 유효한 백신의 성분들에 적합한 약학적 허용 담체와 함께 혼합시키는 면역원 조성물의 제조방법.
- 제23항에 있어서, 상기 조성물은 하기 서열을 갖는 단백질 골격을 포함하는 면역원 당 단백질의 적어도 일부분을 함유하는 방법.
- 제23항 또는 제24항에 있어서, 상기 조성물을 체중 1kg당 10 내지 500μg의 투여-단위로 항원중에서 투여하는 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 조성물을 체중 1kg 당 5 내지 100μg의 투여-단위로 항원중에서 투여하는 방법.
- 제1항 내지 제10항중 어느 한항의 HIV-2 레트로비루스로 동물을 면역시키는 단계를 포함한 HIV-2 항원을 특이적으로 인지하는 항체의 수득 방법.
- 제1항 내지 제10항중 어느 한항의 HIV-2 레트로비루스 HIV-2로 부터 유도된 핵산 또는 핵산 단편물의 제조 방법은, a) 제1항 내지 제10항중 어느 한항의 HIV-2 레트로비루스 분리물로 감염시킨 세포배양물의 상층액을 초원심 분리하여 펠렛을 회수하는 단계, b) 디터전트로 활성화된 내생 반응에서 올리고(dT) 개시제의 존재하에 정제 및 침강된 비루스의 RNA와 접촉시켜서 개시제 cDNA 쇄를 합성하는 단계, c) DNA 폴리머라제 I, RNAseH 및 4개의 데옥시뉴클레오티드의 존재하에 2차 cDNA 쇄를 제조하는 단계, d) 산출된 핵산을 회수하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 a) 단계와 b) 단계사이에 회수된 펠렛을 자당 그레디언트법으로 원심 분리하고 게놈 RNA를 함유한 침강된 펠렛을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 b) 단계와 c) 단계사이에 페놀클로로포름으로 추출하고, 에탄올로 침전시킴으로써 RNA-cDNA 하이브리드를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, c) 단계와 d) 단계사이에 반응 혼합물중에 존재하는 단백질을 추출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제28항에 있어서, 제1항 내지 제10항중 어느 한항에서 정의된 HIV-2 레트로비루스 RNA의 적어도 일부에서 유도되어 라벨된 핵산이 회수되며, 이것은 HIV-1 게놈에서 유도된 DNA의 뉴클레오티드 990-1070, 990-1260, 2170-2240, 3370-3640를 각각 함유한 프로브 1 내지 4와 제한 조건하에서 하이브리드되지 않지만 상기 HIV-2 비루스의 RNA와는 상기 조건에서 하이브리드되는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 핵산은 제1항 내지 제10항중 어느 한항에서 정의된 HIV-2 레트로비루스의 전체 게놈 RND와는 하이브리드되지만 HIV-2 게놈에서 유도된 DNA의 뉴클레오티드 990-1070, 990-1260, 2170-2240, 3370-3640에 의해 분계된 단편물로 각각 HIV-1 게놈의 DNA 단편물이 구성된 프로브와는 하이브리드 되지 않는 cDNA 서열의 적어도 일부를 함유한 핵산이 회수되는 방법.
- 제32항에 있어서, 하기의 뉴클레오티드 서열을 함유한 핵산이 회수되는 방법.
- 상기 핵산은 하기의 아미노산 서열의 일부 또는 전체를 코오딩한 뉴클레오티드서열을 포함하며, 이 아미노산 서열 또는 그 일부는 HIV-2 레트로비루스로 감염된 환자의 혈청과 접촉시키는 경우 제1항 내지 제10항중 어느 한항에서 정의된 HIV-2 레트로비루스에 대한 항체와 특이적 면역 반응을 할수 있는 핵산이 회수되는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 핵산은 하기의 아미노산 서열의 일부를 코오딩한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이 아미노산 서열을 HIV-2 레트로비루스로 감염시킨 환자의 혈청과 접촉시키는 경우 제1항 내지 제10항중 어느 한항에서 정의된 HIV-2 레트로비루스에 대한 항체와 특히 면역반응을 제공할 수 있는 핵산이 회수되는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 핵산은 하기의 아미노산 서열의 전체 또는 일부를 코오딩한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이 아미노산 서열을 HIV-2 레트로비루스로 감염시킨 환자의 혈청과 접촉시키는 경우 제1항 내지 제10항중 어느 한항에서 정의된 HIV-2 레트로비루스에 대한 항체와 특이 면역반응을 제공할수 있는 핵산이 회수되는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 핵산은 하기의 아미노산 서열의 전체 또는 일부를 코오딩한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이 아미노산 서열을 HIV-2 레트로비루스로 특이적으로 감염된 환자의 혈청과 접촉시키는경우 제1항 내지 제10항중 어느 한항에서 정의된 HIV-2 레트로비루스에 대한 항체와 특히 면역반응을 제공할 수 있는 핵산이 회수되는 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 핵산은 하기의 아미노산 서열의 전체 또는 일부를 코오딩한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이 아미노산 서열을 HIV-2 레트로비루스로 감염시킨 환자의 혈청과 접촉시키는 경우 제1항 내지 제10항중 어느 한항에서 정의된 HIV-2 레트로비루스에 대한 항체와 특이 면역반응을 제공할수 있는 핵산이 회수되는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 핵산 또는 이의 단편을 제조하는 방법은, -이 본쇄 cDNA에 블런트 말단이 형성될때까지 T4 DNA 폴리머라제를 반응시키는 단계, -적응인자(adaptator)를 함유한 cDNA를 삽입하고 벡터의 핵산에서 적응효소로 절단하는 단계, -제28항 내지 제39항중 어느 한항에 의한 방법으로 수득된 cDNA 또는 그 일부, 상기 cDNA에 상응하는 RNA 또는 그 일부 또는 상기 cDNA 또는 그 일부와 상기 RNA 또는 그 일부의 혼합물을 함유한 재조합 DNA를 회수하고 상기 벡터에서 수득한 핵산에 삽입하는 단계들을 추가로 포함하는 방법.
- 제40항에 있어서, 회수된 재조합 핵산이 라벨된 방법.
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