CN1147586C - Hiv-1 o组(或亚组)逆转录病毒抗原的核苷酸序列 - Google Patents
Hiv-1 o组(或亚组)逆转录病毒抗原的核苷酸序列Info
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Abstract
一种HIV-1 O型(或亚型)逆转录病毒蛋白质,或者至少包含一部分所述蛋白质的天然或合成多肽或肽。其能够被从血清分离的起因于HIV-1 O型VAU毒株或者HIV-1 O型(或亚型)DUR毒株感染的抗体识别。
Description
本发明涉及通过表达核苷酸序列或通过化学合成(例如采用AppliedBiosystems牌合成仪)获得的存在于HIV-1 O组(或亚组)变体中的抗原,更具体地说是相应于可以从病毒颗粒分离的抗原的那些抗原。
本发明也涉及由这些抗原诱导的单克隆或多克隆抗体。
本发明也涉及具有类似于或互补于以上提及的病毒基因组RNA之序列的克隆DNA序列。本发明也涉及制备这些克隆DNA序列的方法。本发明还涉及包含由所述克隆DNA序列编码的氨基酸序列的多肽。
此外,本发明涉及以上提到的抗原在某种形式的艾滋病高危个体中体外检测上的应用,这些抗原中的某些在产生针对这种逆转录病毒的致免疫组合物和免疫接种组合物上的应用。类似地,本发明涉及以上提到的抗体在相同目的上的应用,这些抗体中的某些在产生用于抗这一人类艾滋病之医药产品的活性物质上的应用。
本发明也涉及克隆DNA序列和从这些序列获得的多肽在诊断试剂盒中作为探针和基因扩增引物上的应用。
本发明也涉及抗原组合物,该组合物可以由化学合成或重组细胞宿主表达获得,其使得可以诊断由HIV-1或HIV-2亚型不依赖性HIV型人逆转录病毒引起的感染。这种组合物包含至少一种选自与HIV-1、HIV-2、HIV-1(DUR)和HIV-1(VAU)病毒相同的抗原肽或者具有类似致免疫特征的所述抗原肽的变体。
本发明也涉及这样一种组合物,其使得可以特异性地诊断由HIV-1型(更具体地说是HIV-1M组)、HIV-2或HIV-1 O组(或亚组)逆转录病毒引起的感染,它包含至少一种对HIV-1病毒特异性的抗原肽、对HIV-2病毒特异性的抗原肽和对HIV-1 O组(或亚组)病毒特异性的抗原肽或者具有类似致免疫特征的这些抗原肽的变体。更具体地说,所述的抗原肽来源于HIV-1 M组和HIV-2和HIV-1 O组(或亚组)病毒的包膜蛋白。
此外,本发明涉及这样一种肽,基于(特别是基于)发现新HIV-1毒株:HIV-1 DUR,这种肽使得可以检测抗-HIV抗体,现有技术的肽总是不使检测所述的肽成为可能。针对它的抗血清与现今使用的共有HIV肽总是不具有反应性。术语“共有HIV”指分离物之间保守的区,其阐明对设计诊断试剂或疫苗是必需的,并且其突变赋予对抗病毒医药产品的抗性。本发明中使用的术语“肽”定义为寡肽和多肽两者。
现有技术状态
在LAS或AIDS发展中起作用的两种类型的人类免疫缺陷病毒(HIV)已被分离并确定特征。被称为LAV-1或HIV-1的第一种病毒已被分离,并且在英国专利申请8324,800和欧洲专利申请84401,834(14/09/1984)中有描述,该病毒也由F.Barrie-Sinoussi等在科学(1983),220,868-871中描述。
2型HIV逆转录病毒属于不同的类别,与1型HIV逆转录病毒仅有有限的免疫学关系。HIV-2逆转录病毒在欧洲专利申请87,400,151,4(公开号239,425)中已有描述。
HIV-1逆转录病毒是最普遍的,其存在在世界上几个地区占优势。就HIV-2而言,最多的是在西非发现,尽管Grez等((1994)病毒学杂志,68,2161-2168)最近报道了其在这一地区之外传播。
灵长类免疫缺陷慢病毒属(包括1型和2型人免疫缺陷病毒以及几种类型的非人灵长类病毒)的总数数量上和复杂性上逐渐增加。这些病毒的最普遍的HIV-1当前以在世界范围内流行的方式传播,产生最大的公共卫生问题。在这种病毒的鉴别和分子特征确定之后不久,其被认识到是高度可变的,目前包括若干亚型(Myers,1994,Louwagie等,1993,Louwagie等,1992,Myers,G.(1994)在人类逆转录病毒和爱滋病1994中的HIV-1亚型系统树;Myers,G.,Korber,B.,Wain-Hobson,S.,Smith,R.F.和Pavlakis,G.N.,Eds.Los Alamos国家实验室,LosAlamos,NM.III-2-III-9)。这种亚型的分型主要基于gag和env的差别。至少已鉴别出6种亚型,指定为A到F,但在基于HIV-1分离物的正在进行的广泛的世界范围的调查中很可能还出现几种亚型。业已发现这些各亚型在被成为星号(star)系统发育的系统发育轮廓上是相互等距离的。这表明各HIV-1亚型可能已进化并且同时区别于共同的祖先。
前不久,HIV-1病毒这一组的2种不同的病毒被分离并确定特征。这两种病毒是从生活在非洲中西部的喀麦隆的病人中获得的(Gurtler等,1994,Vanden Heasevelde等1994)。它们的序列,更具体地说是它们的env(包膜)基因的序列,清楚地显示这些病毒属于HIV-1相关病毒的一个不同的类别。称为HIV-1 O组(Nkengasong等,1993)。
然而,这一HIV-1相关病毒组内的分离物的差别是未知的,其在非洲之外的扩散未见报道。
开发HIV血清学检验中的总的要点是避免假阳性或假阴性结果-同时保持或改善以前的试验所具有的血清反应阳性性检测的敏感性。
在发现HIV-1-O变体之前,基于采用共有肽(基本上得自“env”基因)的试验被认为是揭示假阴性结果之可能性的近乎理想的解决办法(基因组克隆和高趋异进化非洲人免疫缺陷病毒分离物的全序列分析,病毒学杂志,1994;68:1586-96;来源于喀麦隆的人免疫缺陷病毒1型的新亚型(MPV-5180),病毒学杂志,1994;68:1581-85)。
某些用“env”肽抗原的试验的非反应性(然而在病人中表现出(有时在它们之前)某种艾滋病临床综合病症特征或淋巴结病综合病症)有时归因于HIV-1-O组感染(在HIV-1 O亚型感染病人中的HIV-1/HIV-2血清学反应阴性性,Lancet,1994;343:1393-94;瑞士的新HIV-1亚型,Lancet1994;344:270-71)。
发明描述
本发明的目的是为诊断实验室提供一种手段,具体说来是一种特异性肽,其使得可以检测迄今不能检测的抗HIV抗体。本发明也涉及从HIV-1 DUR获得的肽混合物和从其它HIV获得的相应的肽的混合物,以避免潜在的"假阴性"结果。
此外,本发明涉及在生物样品中检测和辨别HIV-1-M型逆转录病毒特征性抗体和HIV-1 O组(或亚组)逆转录病毒特征性抗体的方法。
本发明基于在一个血清学反应阳性女性(曾在喀麦隆逗留,表现出非典型的血清学反应性)上在几个筛选HIV感染的试验(这些技术已被"Western印迹"技术证实)中的观察结果。
考虑到这一非典型的血清学反应性,特别是即使修饰O型也缺乏对某些第三-产生试验的反应性,本发明的发明人认为进行这一HIV-1 DUR毒株基因组某些部分(更具体地说是GAG和ENV基因)测序是有益的。
然而,利用从M组获得的引物和从O组获得的已知引物经PCR成功地进行了gp120的V3环的编码部分和gp41的优势免疫区的基因扩增。仅GAG区可以用现有技术已知的引物(Loussert-AjakaI,Lancet1994;343:1393)扩增。因此,本发明的另一个目的是确定能够解决这一问题的引物。
测定了糖蛋白gp41和gp120的部分序列,也测定了来源于淋巴细胞DNA以及病毒的培养物的衣壳蛋白质(GAG基因),结果表明这一HIV-1 DUR毒株部分属于HIV-1-O组,其与M组(更具体地说是与gp41和gp120)有很大的不同。
这样,有可能说明(更具体地说是说明HIV-1(DUR)GAG序列)在几个区O组共有序列的存在,其不同于相同区的M组共有序列。
在包含有PST1位点的Bluescript质粒中进行GAG、gp41和gp120片段的编码序列。按照采用T3和T7通用引物的标准技术或者经采用先前扩增的引物直接测序来克隆扩增产物。然后,所述序列用应用生物系统373A自动测序仪(ESGS Montigny le Bretonneux,法国)测定。
在本发明中,发明人已从O组分离物HIV-1(VAU)分离env基因并测序,所说分离物是从从未离开过欧洲的并于1992年死于艾滋病的法国病人获得的。按照其包膜序列,HIV-1(VAU)与两种最近确定特征的喀麦隆病毒HIVANT70和HIVMVP5180相关。env基因的系统发育分析揭示三种病毒看来似乎构成一个单独的组,本文称为HIV-1 O组。HIV-1(VAU)从这一病人分离也表明HIV-1(VAU)O组的传播范围已在非洲之外发生。
HIV-1(VAU)病毒的分离
HIV-1(VAU)病毒是1992年从41岁患爱滋病的法国病人中分离到的。这一病人在1986年表现出严重的与子宫颈癌相关的无色中性白细胞减少(leuconeutropenia)。然而她逐渐表现出机会感染的症状,循环CD4+数量较低,其1992年死于艾滋病。1990年首次用ELISA(Elavia,SanofiDiagnostics Pasteur和Abbott试验)检测抗HIV-1抗体。
该病人从未离开过欧洲,没有静脉内使用过医药产品,也没有接受过任何已知的血液输注。没有已辨明的非洲来源的性伙伴。她于1971年生下一个健康的孩子,但1980年生下的一个儿子在很能说明新生期艾滋病的疾病临床发作后在1岁时死亡。其1983年出生的第三个孩子和其丈夫目前健康状况良好,未被感染。
按以下方式进行病毒的分离:用涂上一层IOT8抗体(Immunotech)的小珠除去在病人PBMCs(外周血淋巴细胞)中存在的CD8+细胞。用植物血细胞凝集素刺激这些余下的PBMCs,然后,与从健康供体获得的CD8+-缺失PBMCs一起共培养,并用植物血细胞凝集素刺激。通过测定上清液的逆转录酶(RT)活性和经HIV-1p24的ELISA试验(由DuPont推向市场的诊断试剂盒)监测共培养中的病毒生长。从初级共培养获得的病毒进行CD8-缺失和植物血细胞凝集素-刺激PBMC培养物中的几次继代移植。进行了用HIV-1(VAU)感染各种转化的细胞系的几种尝试,所说细胞系包括MT4细胞(Harada等,1985)和CEM细胞(Rey等,1989)以及Hela-CD4-LTRLacZ细胞系P4-2,(Clavel和Charneau1994)。
HIV-1(VAU)的生物学特征
在与健康供体的类似细胞一起共培养病人的CD8-缺失,植物血细胞凝集素-刺激PBMCs两周后,以RT活性高峰的形式在培养物上清液中检测病毒的产生。然后可以将这一病毒在CD8-缺失,PHA-刺激的正常的PBMCs上进行系列继代移植。在图1中,图1A代表在感染PBMC培养物上清液中HIV-1(VAU)的产生,其由RT试验(实心圆圈)和HIV-1 p24抗原俘获ELISA(空心圆圈)检测。HIV-1p24的浓度以毫微克/毫升表示,RT活性以cpm/μl表示。在图1B中,用从艾滋病患者获得的初级HIV-1分离物进行相同的实验。
尽管HIV-1(VAU)的生长可容易地被RT试验检测,但经HIV-1p24ELISA(DuPont)在培养上清液中检测病毒实质上具有较低的灵敏度。图1显示了用HIV-1(VAU)和来源于艾滋病患者的初级HIV-1分离物的PBMCs的有效感染的轮廓之间的比较结果。就等量的颗粒而言,在所试验的上清液中用RT活性试验检测时,在HIV-1(VAU)的情况下与在其它HIV-1分离物的情况下比较,约少25倍的p24被检测到。这种不同可能是由于单克隆抗体对HIV-1p24是特异性的,该抗体用于涂覆在ELISA平板上,对HIV-1(VAU)gag产物仅具有弱的亲和性。
进行了在对HIV-1敏感的转化的人类T细胞系上繁殖HIV-1(VAU)的几种阴性尝试。具体地说,由HIV-1(VAU)感染的PBMCs和MT4细胞或CEM细胞的共培养物不导致病毒的繁殖。也发现这一病毒不能感染携带有lacZ基因(可由tat基因诱导)的CD4+HeLa细胞(P4-2)(Clavel和Charneau1994)。同样地,在来源于几种黑猩猩的活化的外周血淋巴细胞中不能检测到HIV-1(VAU)的复制。
HIV-1(VAU)包膜序列的分析(稍后将详尽地描述)和与前不久所描述的两种喀麦隆分离物的序列的比较表明,所有三种病毒都属于HIV-1相关病毒的相同的组。此外,这一比较表明,这三种病毒变体相互大约是系统发育等距离的。因而,三种病毒变体其自身各自构成它们的组的不同亚型,现在被称为HIV-1 O组。这一组不同于迄今所鉴别的其它HIV-1分离物的组(发明人在此称为HIV-1 M组)。
这一新组的出现产生了它的起源问题:O组是从M组病毒进化的吗(或相反)或者各组具有不同的历史吗?发明人认为,迄今M组和O组具有类似的趋异轮廓,很可能它们各自相应于不同人群中的不同病毒祖先的趋异进化。从目前可获得的系统发育和病毒学数据不可能估计两组的祖先是天然地影响人的还是从其它物种引入到人类的。仅类似于存在在非人灵长类中的HIV-1的病毒是SIVCPZGAB分离物(Huet等,1990),其是从明显天然感染的黑猩猩分离的,明显不同于M组和O组两者,没有其人类等同物被发现。O组病毒不可能是最近从黑猩猩病毒进化来的,因为HIV-1(VAU)在黑猩猩淋巴细胞中的复制没有取得成功。
为什么O组的流行仅出现在M组之后15至20年?有三种可能的解释:首先,O组病毒的祖先进入人类被认为比M组更近期地出现;其次,由于在其来源区域的社会条件不同,与O组比较,可能M组可以更早地扩散;第三,与M组病毒比较,O组病毒可能具有较低的传播能力。业已提出这种性质解释了HIV-2不出现明显世界范围的传播,感染宿主中HIV-2较小的病毒荷载与降低的传播性相关联(DeCock等,1993)。在这一点上,虽然在由HIV-1 O组感染患者中有关病毒荷载没有可供使用的数据,但是这些病毒的致病性没有显示出与HIV-1的不同。与从其中获得HIVMVP5180 O组分离物的病人一样,从其中分离HIV-1(VAU)的病人死于艾滋病。
然而,HIV-1(VAU)病人感染的历史仍然不清楚,但是,如她的第二个孩子患有类似于艾滋病的综合病症所提示的,有若干线索说明这一病人在1980年之前被感染。
本发明涉及HIV-1(VAU)病毒或任何O组等价病毒的核酸序列的任何变体,包括具有与被env基因编码的结构蛋白质相同的免疫学性质的结构蛋白质,所说基因具有图6所描述的序列,被称为"vau",也被指定为Seq IDNo.5。
本发明也涉及一种组合物,该组合物包含按照本发明任何抗原或按照本发明的抗原的混合物以及得自一种或多种HIV-1 O组病毒或得自其它变体病毒的提取物,和另一方面得自一种或多种HIV-2和/或HIV-1病毒的提取物,另一方面这些组合物可以是可以不是标记的。采用任何类型的合适的标记(酶,荧光,放射性等)是可能的。
核酸
本发明涉及DNA或者DNA片段,更具体地说涉及可以从RNA,cDNA或可以用于PCR或其它基因扩增方法的引物获得的克隆DNA和DNA片段,来源于HIV-1(VAU)逆转录病毒RNA或DNA的克隆DNA和DNA片段。本发明更具体地说涉及所有等同DNA,特别是涉及具有同源于HIV-1(VAU)DNA的序列,特别是具有编码HIV-1(VAU)毒株env区之序列(包括相应于称为"vau"的以图6代表的Seq ID No.5的序列)的任何DNA。与HIV-1 M组的同源性至少等于50%,优选的等于70%,更优选的等于约90%。总的来说,本发明涉及能够与O组HIV-1逆转录病毒DNA或RNA杂交的等价DNA(或RNA)。
本发明也涉及相应于以上所限定的DNA序列的RNA序列。
本发明也涉及HIV-1(VAU)病毒整合酶基因,其包括由名称Seq ID No.7所限定的序列或与Seq ID No.7杂交的序列。本发明也涉及相应于以上所述DNA的RNA。
本发明的主题也是一种组合物,其包含被以上提到的DNA或DNA片段所编码的肽或多肽。
衍生自VAU序列或者是衍生自HIV-1(VAU)病毒整合酶基因的寡核苷酸,特别是包含至少9个核苷酸的寡核苷酸,可以用于在生物样品,细胞培养物或者细胞抽提物中用PCR技术或任何其它基因扩增技术检测O组HIV-1病毒DNA或者RNA序列。这些序列可以用作基因扩增引物或用作特异性检测基因扩增产物的探针。也可以用作杂交探针的是扩增产物或者它们相应的从化学合成(应用生物系统)获得的合成序列。
本发明也包括可以在杂交反应中用作探针和可以在高度严格杂交条件下与HIV-1(VAU)变体的部分基因组反应的至少100个核苷酸的任何片段。
HIV-1(VAU)env基因的克隆和测序
就HIV-1(VAU)DNA的初始的PCR扩增而言,从由HIV-1(VAU)感染的PBMCs提取总DNA,用以下简并引物扩增pol基因区段:引物4506:5 AGTGGAT(A/T) (T/C)ATAGAAGCAGAAGT 3;Seq ID No.1;引物5011:5 ACTGC(C/T)) CCTTC(A/C/T) CCTTTCCA 3;Seq ID No.2;
反应介质包含50mM KCl,10mM Tris-KCl(pH值8.9),1.5mM MgCl2,0.1毫克/毫升明胶,0.2mM dNTP,1U尾端聚合酶(Amersham)。PCR进行43个热循环,在92℃10秒钟,50℃1分钟,72℃40秒钟。
形成的扩增产物被克隆进pBluescript载体,产生克隆ph4,其特征在于1994年10月20日以保藏号I-1486保藏在CNCM,接着将其用作探针,筛选低分子量DNA的λ文库,其是用EcoRI消化并且是从由HIV-1(VAU)感染的细胞获得的。简言之,由HIV-1(VAU)感染的PBMCs与用植物血细胞凝集素刺激的新PBMCs一起并且在排除CD8+细胞下共培养24小时。此后可见高的细胞致病作用(CPE)。然后按照Hirt的方法(Hirt1967)提取低分子量DNA,以酶EcoRI消化。这一DNA的以前的Southern-印迹确实显示HIV-1(VAU)基因组仅包含EcoRI位点,允许克隆代表整个病毒基因组的非整合环状DNA物种。将所形成的消化产物进行凝胶电泳,将大小约8-12kb的DNA片段群纯化,并连接于EcoRI-消化的λZap DNA(Stratagene)。在衣壳化后,平板接种并经采用32P-标记的ph4 DNA的杂交筛选,克隆λH34被鉴别为阳性并扩增。纯化EcoRI插入物,超声处理,并经"shotgun"技术克隆进磷酸酶-处理的以酶SmaI消化的载体M13mp18。所获得的150个克隆在373A DNA测序仪(应用生物系统)中测序,采用威斯康星GCG DNA分析包将所形成的序列装配进单一序列。
这种序列分析揭示了在读框中的许多无意义的密码子,其很好地说明超变基因组(Vartanian等,1991)。这一序列是不稳定的,因而决定经PCR扩增HIV-1(VAU)env基因,扩增中采用由HIV-1(VAU)感染的PBMCs的总DNA和源于序列λH34的寡核苷酸引物:引物TH2 5 GCTCTAGATGGGGATCTCCCATGGCAGG 3 Seq ID No.3;引物UH2 5 GCTCTAGATCAGGGAAGAATCCCTGAGTGT 3 Seq ID No.4。
PCR扩增进行35个热循环,在92℃15秒钟,52℃1分钟,60℃2分钟,72℃2分钟。形成的大小3.5kb的扩增产物被克隆进M13mp18载体并经后续反应测序,首先采用M13通用测序引物,然后采用从上游序列推断的引物。用威斯康星GCG DNA分析包分析核苷酸和肽序列。HIV-1(VAU)env基因总共编码877个氨基酸,包括信号肽。HIV-1(VAU)env基因的核苷酸序列相应于Seq ID No.5(参见图3)。
核酸作为探针的用途
本发明也涉及DNA,cDNA或者其片段,以及包含这些片段的重组质粒或其它等同载体作为探针的用途,所说探针用于在从怀疑携带HIV-1(VAU)病毒的患者获得的血清样品或其它生物体液或组织中检测HIV-1(VAU)病毒的存在与否。这些探针可以是可以不是标记(放射性,酶或荧光标记等)的。在实施检测HIV-1(VAU)病毒或HIV-1(VAU)变体的方法上特别有价值的探针的特征可以是它们包含全部或部分DNA,所说DNA互补于HIV-1(VAU)病毒基因组或者包含在各种克隆中的特定的片段。包含所有或部分env区的HIV-1(VAU)cDNA片段将被特别提到。
用于这一检测HIV-1(VAU)病毒之方法中的或者诊断试剂盒中的探针不以任何方式限制在前面所描述的探针。它们包括从HIV-1(VAU)病毒或HIV-1(VAU)变体或者结构类似的病毒获得的所有核苷酸序列,其前提是它们使得可以采用来自很可能患有艾滋病的个体的生物体液经与HIV-1(VAU)病毒DNA或RNA杂交检测HIV-1 O组病毒,特别是HIV-1(VAU)。
特别有利的是这样一些探针,当与HIV-1杂交时,它们给出与属于O组的HIV的强的反应和与属于M组的HIV的弱的反应。非限制性的例子是,从HIV-1病毒整合酶基因序列(Seq ID No.7)构建的探针在杂交条件下(例如专利EP178978中所描述的那些)与HIV-1杂交时,给出与O组HIV强的反应和与M组HIV弱的反应。
所说的检测可以以任何已知的方式进行,所说方式尤其是:
通过把这些探针与从包含在生物体液(例如脊髓液,唾液等)中之细胞获得的核酸接触或者与这些体液本身(只要它们的核酸已经能用于与这些探针杂交)接触,这一接触是在允许这些探针和这些核酸之间杂交的条件之下进行的,
和通过检测可能产生的杂交。
以上提到的牵涉杂交的诊断也可以采用分别得自HIV-1(VAU)、HIV-1和HIV-2的探针混合物完成,只要不必区分所需HIV病毒型。
包含编码HIV-1包膜蛋白质之序列的表达载体和包含编码所述的整合酶的表达载体也是本发明的主题。
本发明包括用于在从很可能携带HIV-1(VAU)病毒的患者获得的血清样品或其它生物体液或组织中检测HIV-1(VAU)病毒的存在与否的组合物。这些组合物的特征是它们包含至少一种从得自或源于HIV-1(VAU)病毒基因组(特别是包含HIV-1(VAU)病毒或HIV-1(VAU)变体env蛋白质编码区或编码区部分的HIV-1(VAU)DNA片段)的核苷酸序列获得的探针。
有利地是,以上所描述的组合物也包含从源于HIV-1或HIV-2的核苷酸序列获得的探针。
其它诊断组合物包含本发明的引物,所述引物可以用于O亚组逆转录病毒或这些逆转录病毒变体的基因扩增。
抗原,尤其是蛋白质和糖蛋白
本发明涉及HIV-1 O组(或亚组)逆转录病毒蛋白质,或者包含至少一部分所述蛋白质的天然或合成肽或多肽,其能够被可以从血清分离的抗体识别,所述血清是在由HIV-1 O组VAU毒株或者HIV-1 O组DUR毒株感染后获得的。
本发明涉及由包含相应于Seq ID No.5的序列的基因编码的HIV-1(VAU)逆转录病毒的外包膜蛋白。按照本发明优选的实施方案,这一蛋白质的特征还有它包含相应于Seq ID No.6的图3所示的氨基酸序列并包含氨基酸残基1到526。得自所述序列具有可以被HIV-1(VAU)病毒诱导的抗体识别的表位的任何多肽或肽也是本发明的主题。
以上所提到的蛋白质可以以糖基化或者非糖基化的形式获得。
包含氨基酸残基527和877之间的图3所示的氨基酸序列Seq ID No.8的包膜跨膜蛋白质也是本发明的主题。在本发明范围内的这一跨膜蛋白质是糖基化或非糖基化形式的。
本发明也涉及通过表达HIV-1(VAU)基因组编码序列获得的并且具有等价于HIV-1(VAU)的生物学性质的所有的抗原,尤其是蛋白质,糖蛋白,多肽或肽。倘若它们被相同的抗体(尤其是可以从由已感染HIV-1(VAU)的病人获得的血清分离的抗体)识别,则这些抗原被说成是本发明范围内等价的。
具体地说,化学合成的其氨基酸序列包含在HIV-1(VAU)包膜蛋白质(其序列由图3代表)中的肽或多肽或者等价肽或多肽也是本发明的主题。
其中也应当包括的是等价肽、多肽、蛋白质或糖蛋白、以上抗原的片段和经化学合成或基因工程方法制备的肽,只要它们与其所源于的抗原发生免疫交叉反应。换句话说,本发明涉及具有相同于或类似于以上提到抗原的表位并且能够被相同的抗体识别之表位的任何肽或多肽。后面这一类型的多肽的形成部分是相应于编码以上提到的多肽或抗原之DNA序列的DNA序列的表达产物。
更具体地说,从HIV-1(VAU)病毒获得的或者经基因工程或常规化学合成产生的并且是本发明的最大的目标的抗原是这样一些抗原,它们使得获得本发明的HIV-1(VAU)病毒和HIV-1和HIV-2组病毒之间的明显区别成为可能。在这一点上,在HIV-1(VAU)病毒包膜蛋白水平上以及PM蛋白质外蛋白优势免疫表位水平上已观察到大量的区别。明显地是gag和pol蛋白质比包膜蛋白表现出与HIV-1病毒更大的相似性。
本发明也涉及相同于HIV-1(VAU)包膜跨膜糖蛋白优势免疫区的肽或多肽。所述区由图3所示。这个区的优选的多肽是,例如,包含序列CKNRLIC的那些或相应于这一序列的那些。它们也可以是相应于序列RLLALETFIQNWWLLNLWGCKNRLIC或包含这一序列的肽或者多肽。
以下由名称"VAU肽"所限定的另一个更为优选的肽相应于以下序列或者包含这一序列或者包含这一序列的能够被针对HIV-1(VAU)逆转录病毒之抗体识别的任何部分:RARLLALETFIQNQQLLNLWGCKNRLICYTSVKWNKT。
这一序列的变体多肽是例如图4所示的HIV-1(MVP5180)和HIV-1(ant70)分离物的多肽。这些序列也可以经插入和/或缺失和/或取代(例如经氨基酸残基的保守取代)从上面的序列衍生。
本发明涉及从HIV-1-O DUR病毒(于1995年2月23日以保藏号I-1542保藏在CNCM)获得的肽或者这样一些肽,由于氨基酸的取代,缺失或者添加,其序列不同于以上那些,但其保持以上各种的抗原特征。
本发明的范围内的其它肽在下面限定。
这样,本发明优选的肽是从HIV-1-O DUR病毒获得的包含至少4个保守氨基酸的肽,所述的氨基酸包含在图8所示的GAG序列中或者免疫学上类似的GAG序列中,所述的免疫学上类似的序列被也特异性识别序列AHPQQA,LWTTRAGNP(包含在图8的GAG序列中)至少一个之抗体识别。
优选地,这一肽包括氨基酸序列包含在以下序列之一中或相应的免疫学上类似的序列中的肽:
SPRTLNAWVKAVEEKAFNPEIIPMFMALSEGA (1)
MLNAIGGHQGALQVLKEVIN (2)
GPLPPGQIREPTGSDIAGTTSTQQEQI (3)
IPVGDIYRKWIVLGLNKMVKMYSPVSILDI (4)
QGPKEPFRDYVDRFYKTKLAE (5)
AHPQQA (5a)
LWTTRAGNP (5b)
这一肽包含所述序列之一的至少4个连续的氨基酸。
优选地这一肽包括氨基酸序列包含在以下序列之一中或相应的免疫学上类似的序列中的肽:
SPRTLNAWVK (6)
GSDIAGTTST (7)
QGPKEPFRDYVDRF (8)
本发明特别优选的肽是包含氨基酸序列NPEI(9)或氨基酸序列AVEEKAFNPEIIPMFM(10)的肽,更具体地说是其氨基酸序列包含在以下序列之一中或相应的免疫学上类似的序列中的肽:
IGGHQGALQ (23)
REPTGSDI (24)
这一肽包含所述序列之一的至少4个连续的氨基酸,以及其氨基酸序列包含在以下序列之一中或相应的免疫学上类似的序列中的肽:
INDEAADWD (25)
这一肽包含所述序列之一的至少4个连续的氨基酸。
本发明涉及编码肽(23),(24)和(25)的核酸序列,和编码免疫学上类型序列的核酸序列,以及包含至少一种这些核酸的组合物。
本发明也涉及至少一种这样的核酸在检测和辨别HIV-1 M组和HIV-1 O组毒株上的用途。
一种得自以上所限定的HIV-1-O DUR病毒的肽也在本发明的范围内,所述肽包含图9所示的gp120的V3环区序列或者从HIV-1 O组(或亚组)DUR病毒变体获得的免疫学上类似的序列的至少4个连续的氨基酸,所说的免疫学上类似的序列被抗体识别,这些抗体也特异性地识别以下序列的至少一个:
KEIKI (12),
EREGKGAN (13),
CVRPGNNSVKEIKI (14),
QIEREGKGANSR (15)。
这一肽优选地包括:
a)序列CVRPGNNSVKEIKIGPMAWYSMQIEREGKGANSRTAFC (11)或这一序列的包含至少4个氨基酸的部分,
b)或者氨基酸序列,该序列不同于a)的序列之处在于,在所述肽保持其与抗以上所说肽之抗血清的反应性的前体下,其中的一个或多个氨基酸被两个氨基酸取代,
c)或者氨基酸序列,该序列不同于a)或b)的序列之处在于,在所述肽保持其与抗a)的肽之抗血清的反应性的前体下,其中的一个或多个氨基酸已被缺失或添加,
d)或者相应的免疫学上类似的序列或者序列的一部分。
这一肽包含以下序列也是优选的:
序列KEIKI (12),或
序列EREGKGAN (13),或
序列GPMAWYSM (16)。
特别优选地是,以上所限定的肽包含氨基酸序列CVRPGNNSVKEIKI (14)或序列QIEREGKGANSR (15)。
来自如上所限定的HIV-1-O DUR病毒的肽也在本发明的范围内,所述的肽包含至少4个连续的氨基酸,其整个序列包含在图9所示的gp41的优势免疫区序列中,或者包含在从HIV-1 O组(或亚组)DUR病毒变体获得的免疫学上类似的序列,所说的免疫学上类似的序列被抗体识别,这些抗体也特异性地识别以下序列的至少一个:
RLLALETLMQNQQL (17),
LNLWGCRGKAICYTSVQWNETWG (18),
CRGKAI(19),
SVQWN(20),
RLLALETLM O NQQLLNLWGCRGKAICYTS (21),
QNQQLLNLWGCRGKAICYTSVQWN (22)。
这样一种肽是优选的,其包括序列RLLALETLMQNQQL (17),或LNLWGCRGKAICYTSVQWNETWG (18)或该肽的部分,所述肽包含:
a)序列CRGKAI (19)或序列SVQWN (20)或者两者,其中Q合适地是被不同的氨基酸取代,然而其也不同于K,
b)或者氨基酸序列,该序列不同于a)的序列之处在于,在所述肽保持其与抗a)的肽之抗血清的反应性的前提下,其中的一个或多个氨基酸被两个氨基酸取代,
c)或者氨基酸序列,该序列不同于a)或b)的序列之处在于,在所述肽保持其与抗a)的肽之抗血清的反应性的前提下,其中的一个或多个氨基酸已被缺失或添加,
d)或者相应的免疫学上类似的序列或者序列的一部分。
这一肽具有下列特征之一也是优选的:
-包含至少8个氨基酸的其N-末端序列免疫学上不被抗序列RILAVERY所形成的抗体识别,所述序列包含在HIV-1-LAI毒株的gp41的优势免疫区中。
-其不被抗HIV-1-LAI毒株之肽SGKLIC所形成的抗体识别。
-其包含以下两个序列中的任何一个:
RLLALETLMONQQLLNLWGCRGKAICYTS (21),
QNQQLLNLWGCRGKAICYTSVQWN (22)。
VAU肽的合成
采用"继续流"Fmoc方法经常规固相肽合成技术制备VAU肽。采用Milligen 9050 PEP合成仪并采用"微孔"PEG PAL树脂制备所述的肽,取代第一个C-末端氨基酸残基。氨基酸侧链受到下列基团的保护:精氨酸为Pmc;天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸为Trt;赖氨酸为Boc;谷氨酸为tBu酯;丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸为tBu醚。临时的Fmoc基团用在DMF中的20%六氢吡啶溶液除去。用6当量的DIPCDI和H O BT完成偶联各氨基酸的反应。一些残基需要双偶联,尤其是精氨酸1和23,半胱氨酸19和26;天冬酰胺11;谷氨酰胺10、12和13;丙氨酸4;异亮氨酸9和亮氨酸2、3、14和15。
在连接之后,树脂在真空下干燥。经K试剂在室温下4小时使肽从支持物上裂解。用乙醚沉淀粗肽并洗涤。经高压液相色谱(HPLC)纯化,这一步骤中使用具有WATERS Delta Pak C18 40×100mm柱体的WATERS LC PREP4000仪器,流速30毫升/分钟,乙腈/0.1%TFA梯度。合并包含肽的组分,然后在旋转蒸发器上浓缩并冻干。
环化
将肽(0.025mM)在10mM乙酸铵溶液中溶解。pH值以1M氢氧化铵溶液调整至8.5。3或4小时之后再调整pH值。经HPLC(WATERS Delta PakC185μ柱,乙腈/0.1%TFA梯度)在214毫微米和280毫微米监测环化作用。环化在15小时之后完全。pH值用97-100%醋酸调节至6,冻干溶液,并在与粗肽相同的条件下纯化。
肽由HPLC和按照电喷射技术的质谱(FIS O N VG Trio2000分光光度计)检测。
Fmoc:9-芴基甲氧羰基
Pmc:8-甲基戊烷-6-磺酰苯并二氢吡喃
Trt:三苯甲基
Boc:叔丁氧羰基
tBU:叔丁基
DMF:二甲基甲酰胺
DIPCDI:二异丙基碳化二亚胺
HOBT:1-羟基苯并三唑
TFA:三氟乙酸
反应剂K:苯酚/水/苯硫基甲烷/乙二硫醇/TFA
2.5ml/2.5ml/2.5ml/1.5ml/41ml
HIV-1(VAU)包膜氨基酸序列与其它HIV病毒的相应序列的比较
从HIV-1(VAU)感染病人获得的一系列血清样品的Western-印迹分析结果在图2中给出。将携带有经电泳分离的和从纯化的HI V颗粒(LAV BL O T SANO FI DIAGN O STIC SPASTEUR)获得的蛋白质的硝基纤维素条与血清样品一起温育,它们的反应性按照制造商推荐的方法估价。获得的结果如下:1道:对HIV-2特异性的蛋白质,其与1992年从HIV-1(VAU)病人获得的血清样品反应。2-7道:HIV-1阳性血清;得自HIV-1(VAU)病人的血清:2:1990年9月获得的;3:1990年12月获得的;4:1991年2月获得的;5:1992年2月获得的;6:阴性对照;7:阳性对照(从感染HIV-1个体获得的血清)。蛋白质的名称和大小在页边注明。
图3显示了HIV-1(VAU)包膜的氨基酸序列与HIV-1-LAI参照分离物(Wain-Hobson等,1985)的相应的序列的序列对比。信号肽、V3环以及gp41优势免疫表位由阴影矩形突出。外包膜糖蛋白gp120和跨膜gp41之间的裂解位点由箭头表明。氨基酸字母之间的垂直线表示完全等同,冒号(:)表示高的同源性,园点(.)表示单个氨基酸之间有限的同源性。采用威斯康星GCG包GAP程序进行序列对比。
GAP和BESTFIT程序原始版本(1.0)由Paul Haeberli从Needleman和Vunsch(分子生物学杂志,48,443-453(1970)以及Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.2;482-489(1981)出版物的详尽的研究编写。PaulHaeberli发展了有限的序列对比,并添加到程序包中构成3.0版本。然后它们由Philip Marquess融合成一个单一程序构成4.0版本。蛋白质序列对比的缺口缺乏障碍按照Rechid,Vingron和Argos(CABI O S5;107-113(1989))的建议被修饰。
图3的序列对比显示出许多高度差异的区,具有在这里或那里保持的很少的区。这些保持的区大致相应于在常规的HI V-1分离物中也保持的区(Alizon等,1986,Benn等,1985)。在差异的区域中,V3环,也称作主要的中和决定簇(Javaherian等,1990,Javaherian等,1989,Matsushita等,1988)明显地是最大差异的一个,尽管两个半胱氨酸限定的环被保持。环的帽序列(HIV-1-LAI的GPGRAF)在HIV-1(VAU)中是GPMAWY。这一帽单位与喀麦隆O组分离物HIV(ANT70)的(van den Heasevelde等,1994)相同,但是不同于另一O组分离物,基序为GPMRWR的HIVMVP5180(Gurtler等,1994)。
在整个包膜中,总共鉴别29个潜在的N-糖基化位点,与其它包膜蛋白质比较,其中13个被保持。总共也发现19个保持的半胱氨酸,这表明蛋白质的全部折叠体系结构被保持,但是发现5个未保持的半胱氨酸。
图4显示在各种HIV-1分离物的跨膜包膜糖蛋白的细胞外片段中的优势免疫肽多种序列对比。所有序列与参照序列HIV-1-LAI比较。短线表示与HIV-1-LAI相同。借助威斯康星GCG包的PILEUP程序进行序列对比。
在PILEVP程序中,由树状图阐述的装配策略称为UPGMA,其意指“采用数学平均值的非重量配对组方法(Smith,P.H.A.Sokal,R.R.(1973),数值分类学(pp.230-234),W.H.Freeman and Company,旧金山,加利福尼亚,美国)。PILEVP中的各对序列对比采用Needleman和Wunsch方法(分子生物学杂志,48;443-453(1970))。
如图4所示,TM蛋白质的外部部分的优势免疫表位的氨基酸序列(Gnann等1987)实质上不同于其它HIV-1和HIV-2分离物的。然而,它保持大多数发现在HIV-1和HIV-2病毒之间保守的氨基酸。
发现一些特异性氨基酸仅仅在O组病毒之间保守:这样的情况是在26个氨基酸的肽中21位的赖氨酸,7位的苏氨酸和11位的天冬酰胺。这些区别能解释常规HIV-1包膜抗原检测的缺乏,所述检测是经一种得自HIV-1(VAU)病人的血清进行的或者也很可能是经感染其它O组病毒的病人的血清进行的。总之,HIV-1-LAI和HIV-1(VAU)包膜序列之间的比较显示50%的等同性。HIV-1(VAU)包膜序列也分别与其它HIV代表(包括所描述的和测序的HIV-1O组的两个成员:HIV-1ANT70和HIV-1MVP5180)和SIV代表之序列比较。表1所示这一分析结果说明HIV-1(VAU)属于O组。HIV-1(VAU)包膜70%等同于HIV-1ANT70包膜和71%等同于HIV-1MVP5180包膜。
在最普通的HIV-1亚型中,包膜水平的等同性是可以比较的,范围从74%到80%。
通过采用env跨膜区的核苷酸序列经构建非重量节省(unweightedDarsimony)系统发育树分析HIV-1(VAU)、HIV-1病毒系统发育的其它成员和最近描述的两种O组病毒之间的相互关系。这一分析结果示于图5中,其中数字表示核苷酸变化的数量。图5显示HIV-1(VAU)大概与其它两个O组病毒等距离,总的来说,这三种病毒相互似乎大概是等距离的。事实上在所分析的基因组区段中,HIV-1MVP5180和HIV-1(VAU)之间的核苷酸变化的数量是218,而HIV-1MVP5180和HIV-1ANT70之间的距离是183,HIV-1ANT70和HIV-1(VAU)之间是213。这一差异轮廓非常类似于在所有其它HIV-1亚型中存在的,其中存在于两个不同亚型之间的单个核苷酸变化的数量在157(E亚型到F亚型)到219(A亚型到D亚型)范围内。
表1显示与HIV-1相关的不同病毒包膜序列的比较。数量表示包膜序列之间的氨基酸等同的百分比,其是采用威斯康星GCG包GAP程序计算的。*:在HIV-1ANT70的情况下,仅外包膜蛋白质用于比较。
包含HIV-1(VAU)抗原的组合物
总的来说,本发明涉及可以用于在生物体液中(特别是来源于已与HIV-1(VAU)接触或与抗至少一种HIV-1(VAU)抗原之抗体接触的个体的)体外检测HIV病毒存在的任何组合物。这一组合物可以用于经采用诊断技术(如在专利申请EP84401,834和EP87400,151,4中所描述的那些)选择性地诊断HIV-1 O组感染。在本发明的范围内,使用任何包含能够被抗HIV-1(VAU)所产生的抗体识别的抗原决定簇之组分例如,HIV-1(VAU)表位所限定的重组抗原或者肽或者化学合成肽。在这一点上,本发明更具体地说涉及包含至少一种HIV-1(VAU)病毒包膜蛋白质的组合物。作为举例说明组合物的方式可以提到的是包含来源于相应于全部HIV-1(VAU)gp41蛋白质590-620区或者对HIV-1(VAU)特异性的这一区的部分的包膜蛋白的蛋白质,糖蛋白或肽,例如肽-TFIQN-或者-WGCKNR-。
本发明也涉及重组或合成HIV-1(VAU)蛋白质和/或糖蛋白和/或肽与来源于HIV-1和/或H IV-2和/或来源于另一HIV-1 O组之蛋白质和/或糖蛋白和/或肽(其得自这些蛋白质或糖蛋白,并且其可以被HIV-1和/或HIV-2和/或HIV-1 O组病毒诱导的抗体识别)组合在一起的组合物。
所说的诊断组合物包含能够被针对HIV-1(VAU)的抗体识别的抗原决定簇,具体地说,是肽组合物,其可以包含在已经可以用于接触HIV-1和/或HIV-2逆转录病毒感染的组合物或试剂盒中或者与之组合,以扩大试剂盒接触HIV-1 O组逆转录病毒的接触范围。
非限制性的例子是:
-核心蛋白质,特别是gag,pol,HIV-1和HIV-2蛋白质或其肽,以及HIV-1(VAU)包膜蛋白质或肽,
-或者HIV-1包膜糖蛋白、HIV-2包膜糖蛋白和HIV-1(VAU)包膜糖蛋白,
-或者HIV-1蛋白质和/或糖蛋白,HIV-2蛋白质和/或糖蛋白和HIV-1(VAU)包膜蛋白和/或糖蛋白的混合物。
注意到以下一点是重要的,虽然来源于HIV-1 O组病毒感染病人的抗体与HIV-1 M组病毒的gag和pol抗原强烈反应,但其与M组包膜抗原的反应性实际上为零。因此,本发明的组合物包含至少一种HIV-1(VAU)包膜的蛋白质或者多肽以便这一病毒可被确切地检测是重要的。
因而,这样的组合物在用于诊断时有助于诊断爱滋病或者与之相关的病症,这扩展了对病原体较广泛的作用谱。不言而喻,使用仅包含HIV-1(VAU)包膜蛋白和/或糖蛋白的诊断组合物在更具选择性地检测在所述疾病中起作用的逆转录病毒类别上仍然是有用的。
用于诊断尤其是由HIV-1(VAU)病毒引起的感染的方法和试剂盒
本发明涉及体外诊断由HIV病毒(艾滋病病原体)引起的感染和相关病症的方法,该方法包括使从接受诊断的病人或受治疗者获得的血清或其它生物介质与包含至少一种HIV-1(VAU)蛋白质、糖蛋白或肽的组合物接触,检测可能的免疫学反应。以上描述了这种组合物的例子。
优选的方法包括,例如,免疫-荧光或ELISA型免疫酶促反应(immunoenzymicreaction)。测定可以受直接或间接的免疫荧光测定或直接或间接的免疫酶促测定影响。
这样的检测包括例如:
-将一定量的提取物或者按照本发明的所需抗原组合物置于微滴板的孔中;
-向孔中添加稀释的或未稀释的血清,其能够包含抗体,抗体的存在已在体外检测;
-培养微滴板;
-用适当的缓冲液细心地洗涤微滴板;
-向微滴板的孔中添加人类免疫球蛋白特异性抗体标记,所述标记是用选自能够杂交底物的酶完成的,以便以后进行其辐射吸收(至少在一定波长带中)修饰。
-检测(最好是以相对于对照的比较的方式)底物水解的程度,这一检测是潜在的风险或者实际存在感染的尺度。
本发明也涉及诊断HIV-1(VAU)病毒感染的试剂盒(kit或box),具体地说其包含:
-一种提取物,进一步纯化的组分,或者得自以上所述的病毒类型的合成抗原,这一提取物组分或者抗原是(例如经放射性、酶促、荧光或者其它)标记的,
-对人免疫球蛋白抗体或蛋白质A(有利地是其固定到不溶于水的支持物上,例如琼脂糖小珠或者微滴板孔等),
-可有可无的从阴性对照受试者获得的生物体液或者细胞样品,
-缓冲液和(合适时)显现标记的底物。
能够诱导识别抗原(其可以由化学合成获得或重组获得)的抗体形成的致免疫组合物也是本发明的主题。
血清学
采用各种市售的试剂盒:Sanofi Duagnostics Pasteur,(GenelaviaMixt)Abbott,Wellcome和Behring估价HIV-1(VAU)感染病人血清抗体与HIV-1抗原制剂反应的能力。按制造商推荐的方法用Sanofi DuagnosticsPasteurWestern-印迹试剂盒检查这些抗体与各种HIV-1蛋白质的反应性。
更具体地说,用HIV-1特异性ELISA试剂盒检查病人血清几次。其首次被试验并证明为阳性是在1990年,用Sanofi Duagnostics Pasteur试剂盒测定值(这一值相应于测得的OD对背景OD的比率)是7.33,用Abbott试剂盒的是3.50,用Wellcome试剂盒的是2.70。在使用对HIV-1和HIV-2两者特异性的试剂期间,用Behring试剂盒的测定值是1.42,用Wellcome试剂盒的是4.40。
采用HIV-1LAV印迹免疫印迹测定(Sanofi Duagnostics Pasteur推向市场的一种试验)研究病人血清在不同日期与不同HIV-1结构蛋白反应的能力。如图5所示,在所有被试血清样品中,仅血清与HIV-1 env蛋白质gp160和gp120很弱的反应性被观察到。然而,血清与HIV-1gag蛋白质p55(gag前体)和p24(CA),和与pol产物p66(RT)和p34(IN)强烈地反应。由HIV-2免疫印迹,仅有与gagp26的非常弱的反应性被检测到。
这说明用市售血清诊断试剂盒检测O组特异性抗体应当小心控制。尽管O组病毒感染病人之血清抗体表现出与M组gag和pol抗原强烈的交叉反应性,但其表现出与M组包膜抗原很低的或者没有反应性。因而,可以假定相当比例的这种患者不能用基于M组包膜抗原试剂的某些试剂盒检测。事实上,在最近从O组感染病人的几种血清的初步研究中,发现检测对O组特异性抗体的能力依据所采用的试剂盒非常不一样(Loussert-Ajaka,I.,LY,T.D.,Chaix,M.L.,Ingrand,D.,Saragosti,S.,Courrouce,A.M.,Brun-Vezinet,F.和Simon,F.(1994)。HIV-1 O亚型感染病人中HIV-1/HIV-2血清学阴性性,Lancet.343,1393-1394)。这意味着仔细和深入地研究大量O组血清与所有市售试剂盒的反应性是必要的。从HIV-1(VAU)病毒重组或合成抗原制备的包含多克隆或单克隆抗体的组合物
本发明涉及可以经接种HIV-1(VAU)在动物中产生的血清,具体地说是HIV-1(VAU)抗原表位,更具体地说是HIV-1(VAU)病毒包膜蛋白的抗原表位。更具体地说本发明涉及更特异性地针对各抗原的多克隆抗体,特别是病毒的蛋白或者糖蛋白。本发明也涉及经各种技术产生的单克隆抗体,这些单克隆抗体抗各种HIV-1(VAU)蛋白质(特别是包膜蛋白质)分别是更特异性的。
这些多克隆或单克隆抗体可以用于各种应用中。特别可以提到的是它们用于中和相应的蛋白质,或者甚至抑制全病毒的感染性。它们也可以用于例如在生物制剂中检测病毒抗原或者实施纯化相应蛋白质和/或糖蛋白的方法,例如将它们用于亲和色谱柱中。
举例来说,抗包膜抗体或抗gag抗体是可以用于诊断(特别是经抗原俘获ELISA检测HIV-1 O组颗粒)的试剂。
本发明涉及针对一种或多种HIV-1(VAU)病毒抗原之抗体,其是从HIV-1(VAU)氨基酸序列产生的,以前已描述了从类似于本发明的HIV-1(VAU)病毒抗原表位之抗原表位获得抗体的技术。
Ulmer等(1993)在出版物中描述的抗体的制备的技术可以由本领域技术人员用来制备本发明的抗体,使这一技术适应本发明的抗原的改进在本领域技术人员的知识范围内。
vau肽的免疫反应性的研究
vau肽的免疫反应性在制备实验ELISA平板后,按照为了用于抗HIV抗体的筛选试验而建立的方法确证。这一试验基于用模仿HIV-1 O组(或亚组)病毒VAU分离物包膜糖蛋白的优势免疫表位之肽制备的固相检测。按照GenelaviaMixt试剂盒提出的方法,用试剂盒中的试剂进行试验。
在图21和22两份表中对照的数据说明:
a)从HIV-1 O(组或亚组)病毒感染病人取得的四个血清样品与vau肽反应性很强;
b)在Yacounde的Pasteur研究所送出的19个血清中,十个假定从HIV-1O(组或亚组)病毒感染病人取得的血清与相同的肽反应性也很强;
c)从HIV-1B亚型病毒个体(急性期)取得的血清(4个样品)不与vau肽反应;
d)从无症状供血者取得的血清(48个样品)不与vau肽反应;这些实验数据(鉴于HIV-1组(或O亚组)抗体阳性样品的多样性,尽管有限)给出了所选择的肽的敏感性和特异性的证据。
从上述内容可见,本发明也涉及HIV-1(VAU)病毒或变体的检测,其是借助使用以上所述的抗体在牵涉各种阶段的方法中进行的,这些阶段特别地被预期揭示出HIV-1(VAU)病毒的特征性性质。
本发明也涉及经分子杂交检测HIV-1(VAU)病毒。
一般地,这一在从易于携带HIV-1(VAU)病毒的病人获得的血清样品或其它生物体液或者组织中检测HIV-1(VAU)病毒的方法包括下列步骤;
-制备至少一种可标记可不标记的探针;
-通过将可疑病人样品之核酸与所说的标记探针接触在允许杂交的条件下完成至少一个杂交步骤,并可有可无地将所形成的复合物固定在合适的固相支持物上;
-合适时,以一种适合的洗涤溶液洗涤所说的固体支持物;
-用一种本领域已知的方法检测所说的复合物,并由此检测HIV-1(VAU)病毒的存在或不存在。
在按照本发明的方法的另一个优选的实施方案中,以上所提到的杂交是在非严格条件下进行的,在使得适于杂交的条件下洗涤膜。
通过采用血清学或基因扩增技术,例如特异性的聚合酶链反应(PCR)精确地评价HIV-1 O组流行的程度。发现在喀麦隆5至10%感染HIV-1的病人事实上由HIV-1 O组病毒感染。然而,不同于这里所描述的分离物,已报道在非洲中西部之外O组病毒的传播。从其分离HIV-1(VAU)的病人一直生活在法国,从未旅行到非洲。直到现在,我们没有有关感染来源的准确的证据,但这一病例说明在欧洲已出现O组病毒的一定程度的传播。
本发明也涉及在生物样品中检测和辨别HIV-1 O组(或亚组)逆转录病毒特征抗体和HIV-1-M型逆转录病毒特征抗体的方法,其特征在于使所说生物样品与一种肽接触,所述肽不与HIV-1-M型逆转录病毒特征抗体反应,具体地说是以上描述的肽(1)、(2)、(3)、(4)、(5a)、(5b)、(9)和(10)。
本发明也涉及在生物样品中检测和辨别HIV-1 O组(或亚组)逆转录病毒特征抗体和HIV-1-M型逆转录病毒特征抗体的方法,其特征在于使所说生物样品与从图8和图9所示的HIV-1-M病毒获得的并与选自肽(1)、(2)、(3)、(4)、(5a)、(5b)、(9)和(10)的肽同源的肽接触,该序列起因于其自身连续氨基酸的垂直序列对比,其自身包含在相对HIV-1-M病毒和图8或9所代表的相关肽序列中,具有图8或9所示的选择的肽序列的连续氨基酸。
按照本发明,检测和辨别HIV-1 O组(或亚组)逆转录病毒和HIV-1 M亚组逆转录病毒感染的方法的特征是使从接受艾滋病诊断试验的个体获得的血清与(特别是)肽RILAVERY接触。
此外,检测由HIV-1 O亚组或HIV-1 M亚组逆转录病毒引起的感染的方法的特征是采用两类肽混合物,第一类的那些相应于肽(1)、(2)、(3)、(4)、(5a)、(5b)、(9)和(10)。
另外,辨别由HIV-1-O DUR逆转录病毒和由另一种HIV-1-O逆转录病毒引起的感染的方法的特征是使所说的生物样品与(11)到(15)或者(17)到(20)的任何肽接触。
另外,本发明也涉及辨别HIV-1 O组(或亚组)逆转录病毒和HIV-1 M亚组逆转录病毒感染的方法,该方法采用裂解作用发生在SR二肽上的丝氨酸蛋白酶,该方法包括根据这一逆转录病毒是HIV-1 O组(或亚组)逆转录病毒还是HIV-1 M亚组逆转录病毒,检测逆转录病毒gp120的V3环的裂解或非裂解。
本发明也涉及用于在生物样品中检测和辨别HIV-1 M亚组逆转录病毒和HIV-1 O组(或亚组)逆转录病毒的组合物,其包含两类肽的混合物,第一类特别是(1)、(2)、(3)、(4)、(5a)、(5b)、(9)和(10)所限定的那些。
对肽(1)到(20)各序列特异性的单克隆抗体也在本发明的范围内。
本发明也涉及选自1995年2月24日以保藏号I-1548,I-1549和I-1550保藏在CNCM的那些质粒。
本发明也涉及包含编码本发明所限定的肽(1)到(20)各种之序列的核酸。
在优选的核酸序列中,将选择图10、11或12代表的核苷酸序列。
本发明也涉及包含以上所限定的核酸的载体。
本发明也涉及容易包含任一所说的核酸或者所说的载体的细胞。
本发明也涉及一种病毒,如1995年2月23日以保藏号I-1542保藏在CNCM的病毒。
也在本发明的范围内的一种病毒是与以上病毒相同组的病毒,其特征是这一病毒的共有肽被特异性识别以上所限定的多肽或肽的抗体识别。
这种病毒的基因组RNA也在本发明的范围内。
也在本发明的范围内的是用于在来源于易被HIV型人逆转录病毒感染之病人的血清或其它生物样品中检测抗体的试剂盒,其特征在于该试剂盒包含:
-至少一种多肽或一种肽,其序列具有(尤其是)以上所描述的序列(1)到(20)之一,
-使得可以在所说多肽或肽与可能存在于被试生物样品中的抗体之间反应,形成免疫复合物的材料,例如,需要时一种或多种培养缓冲液,
-阴性对照样品,
-用于显示所形成的抗原/抗体复合物的材料。
按照本发明,这一试剂盒还可以包括至少一种来源于另一HIV毒株或者一种肽或多肽的共有肽或多肽,其包含:
不同于这一肽或多肽序列的氨基酸序列,在所述肽或多肽保持其与针对共有肽或多肽之抗血清的反应性的前提下,其中的一个或多个氨基酸被其它氨基酸取代,
或者在所述肽或多肽保持其与针对共有肽或多肽之抗血清的反应性的前提下,其中的一个或多个氨基酸已被缺失或添加的氨基酸序列。
优选地,按照本发明的试剂盒还包含来源于另一个HIV毒株(优选的是HIV-LAI毒株)的至少一种肽或多肽。
本发明也涉及用于体外诊断由按照本发明的逆转录病毒或者其变体引起的感染的多肽组合物,这一诊断是在可能含有感染后形成的抗体的生物样品中进行的。这一组合物的特征是其包含肽(1)到(20)的至少一种。
所说的生物样品具体地说可以包括血液,血浆,血清或任何其它生物提取物。上述组合物可以用于在以上提到的生物样品之一中检测抗体。
因此,本发明也涉及用于体外诊断特异性地由HIV型逆转录病毒感染的方法,其特征是该方法包括下列步骤:
-使生物样品与以上所限定的肽或者以上所限定的肽组合物在允许形成抗原/抗体型免疫复合物的合适的条件下接触,所说的生物样品可能含有HIV-1 O组(或亚组)逆转录病毒感染后产生的抗体,
-检测可能的存在的复合物。
此外,本发明涉及致免疫组合物,其特征在于该组合物包含至少一种肽以及制备疫苗可接受的药物载体。
本发明也涉及制备按照本发明的逆转录病毒毒株之衣壳蛋白质和gp41和gp120糖蛋白的方法,该方法的特征是包括以下步骤:
-裂解由按照本发明的HIV-1逆转录病毒感染之细胞,经离心分离上清液和感染细胞或所制备的病毒沉淀,
-将细胞抽提物和/或病毒提取物置于包含有纯化的抗体的免疫吸附剂上,所说抗体是从按照本发明的逆转录病毒感染之个体的血清获得的,并且有利地固定在固体支持物上,所说的感染个体的血清具有与按照本发明的病毒包膜蛋白强的反应能力,
-在缓冲液的存在下温育足够长的时间,以形成抗原/抗体免疫复合物,
-用缓冲液洗涤免疫吸附剂,以便除去未保持在固体支持物上的分子,
-回收所需抗原蛋白质。
按照这一制备方法的第一个实施方案,HIV-1 DUR之衣壳蛋白质和gp41和gp120糖蛋白的分离和回收是经电泳和经蛋白质的电还原(electroreduction)进行的。
按照这一制备方法的另一实施方案,蛋白质通过以下方式回收:
-洗脱固定到上述免疫吸附剂上的蛋白质,
-在色谱柱上纯化如此洗脱的产物,所述色谱柱包含固定到分离支持物上的抗体,这些抗体识别HIV-1 O组(或亚组)DUR的衣壳蛋白质和gp41和gp120糖蛋白。
也在本发明的范围内的是产生按照本发明的肽或多肽的方法,所述肽或多肽是用如下方式获得的:
-经表达本发明的核酸,
-或者经化学合成,通过增加氨基酸,直到获得所述肽或多肽。
这里可以使用遗传工程的标准原则和方法("分子扩增",Sambrook,Fritsch,Maniatis,1989 CSH)。
也在本发明的范围内的是产生以上限定的核酸的方法,其可以经从本发明的病毒分离或经化学合成或经使用特异性引物的核酸体外扩增产生。
也按照本发明的寡核苷酸引物具有包含以下核苷酸序列的至少8个连续的核苷酸的序列:
ATT CCA ATA CAC TAT TGT GCT CCA-3
AAA GAA TTC TCC ATG ACT GTT AAA-3
GGT ATA GTG CAA CAG CAG GAC AAC-3
AGA GGC CCA TTC ATC TAA CTC-3
通过例如编码本发明的肽的核苷酸序列的PCR或等价的技术,这些引物可以用于基因扩增方法中。用这些引物进行的试验给出结论性的结果。
本发明也涉及使得可以经以上描述的PCR或等价的技术扩增的试剂盒。
也在本发明的范围内的是在生物样品中检测HIV-1 O组(或亚组)DUR逆转录病毒(包括按照本发明的逆转录病毒)之核酸的方法。该方法包括将包含在该生物样品中的从RNA形成的cDNA在使这一cDNA杂交的条件下与逆转录病毒基因组接触,并在这一病毒样品上进行基因扩增。
本发明也涉及经按照本发明的病毒感染的细胞的裂解获得的病毒裂解物。
包含特别是以上所限定的肽或者多肽的HIV-1(DUR)(或者HIV-1(VAU))毒株的蛋白质提取物也在本发明的范围之内。
本发明涉及从HIV-1 O组(或亚组)DUR或者从这种HIV-1 O亚组逆转录病毒毒变体结构蛋白获得的特异性多肽,其使以下过程成为可能:
依据具体情况,普遍性地辨别属于O类的HIV-1和属于M类的HIV-1,
或者特异性地辨别属于HIV-1 O组(或亚组)DUR特征亚组之病毒和O亚组的其它病毒,
或者另一方面,识别大多数(如果不是全部的话)O组(或亚组)逆转录病毒和M亚组逆转录病毒两者。
也在本发明的范围内的是从其它HIV-1 O组(或亚组)或者HIV-1 M亚组病毒相应的结构蛋白获得的相应的肽,具体地说是来源于GAG,gp120和gp41结构蛋白(其部分在图表中示出)的那些,这些同源肽是将它们进行序列对比的结果,也起因于从HIV-1 O组(或亚组)DUR病毒获得的肽的图表,更具体地说是在本文中鉴定的。
同样地,某些同源肽可以用于这些试验中,其使得进行以上提到的辨别成为可能,在这种情况下应理解为它们用于替代来源于GAG,gp120和gp41结构蛋白的相应的肽。
O组特异性寡核苷酸的测定
采用VAU序列和其与MVP5180和ANT70序列的相关性,限定寡核苷酸引物,尽量使其V3区和gp41区整体对O亚组特异性。这些引物使扩增DUR毒株并由此构成所遇到的扩增问题的一种解决办法成为可能。这些HIV O亚组引物的位置和序列在图13中示出。这些引物使得由PCR30个循环的单一步骤获得用溴化乙锭染色可见的扩增带成为可能。获得了部分序列:
-GAG:513个碱基对(171个氨基酸)=Seq ID No.9
-gp120V3环:525个碱基对(75个氨基酸)=Seq ID No.10
-gp41优势免疫区:312个碱基对(104个氨基本酸)=Seq ID No.11。
DUR序列与MVP5180、ANT、O亚组VAU序列、HIV-1共有序列LAI、代表性的非洲HIV-1 MAL序列、加蓬黑猩猩CIV的CPZ的核苷酸(图15)和蛋白质(图16)比较显示,DUR与其它已知的HIV-1 O组(或亚组)毒株的距离和这些毒株相互之间的距离是相同的。
在GAG区的区别较小,最大的区别在gp120的V3环区,而蛋白质比较达到40%的不同(图16)。系统发育树证实,一方面DUR毒株形成O亚组的一部分,另一方面,形成所描述的各种O毒株之间的重要区别,然而,没有明显出现亚型分支(图17)。
GAG序列的比较:基于所获得的GAG序列与其它已知的两个O毒株ANT70和MVP5180以及M组的代表序列的比较(图8),可能观察到O共有序列存在于几个区,其不同于相同区的M共有序列。也可以发现两个超变区(对O比对M更加可变)和很少的一个或其它毒株的不同位点。然而,区SPRT....SEGA,MLNAI....KEVIN,GPLPP....QQEQI和VGD....SPV看来似乎区别O共有序列和M共有序列。
区QQA和LWTTRAGNP是超变区。就M和O共有序列而言,HIV-1 O组(或亚组)DUR毒株三个位置显著不同(L为I并两次为E)并在3个分离的超变位置采用一个特异性的氨基酸,V位置L9;A位置A77;L位置110。
此外,在GAG区限定与O组和M组相同的区段是可能的,如SPRTLNAWVK,GSDIAGTTST和QGPKEPFRDYVDRF。
V3环序列的比较
这一比较研究揭示出相当大的不同,HIV-1 M亚组共有序列蛋白质不同高达56%,其它HIV-1 O组(或亚组)共有序列达35到42%。
gp120V3环区与gp41的优势免疫区的肽序列对比示于图9中。DUR毒株的V3环的内部序列实质上不同于HIV-1 M亚组共有序列。其与VAU和ANT70毒株(但不与MVP毒株)共享基序GPMAWYSM,其具有两个取代,R替代A和R替代Y。
V3环离剩下的左和右部分明显不同于所有其它已知的HIV,并且确实不留下猜测其它交叉反应性的可能性。而且DUR的V3环比其它O序列长1个氨基酸,后者自身比HIV-1 M组序列另外长一个氨基酸。
有关qp41优势免疫区序列对比的比较
DUR毒株的“小环”具有序列CRGKAIC,被证明是对这种毒株非常特异性的:其可以构成表位(参见图9)。此外,这种序列很可能牵涉到gp41糖蛋白非折叠条件以及因此的该毒株的感染性的变化。
在左边侧翼于这一环的11个氨基酸长序列与VAU序列相同。按照所分析的克隆,DUR毒株的多态性对S或T位置可以是显著的。
得自其它已知逆转录病毒毒株的相应肽也示于图9。
DUR毒株也使限定gp41区的HIV O亚组共有序列成为可能,可以使用其若干足够长度的同源区。这些同源区特别是:RL*ALET,QNQQ,LWGC和CYTV(*代表可变氨基酸)。
血清学相互关系
抗DUR抗血清不与HIV-1-M共有序列的V3环肽、HIV-1 MAL肽、HIV-1CPZ肽或者HIV-1 O组(或亚组)MVP5180肽反应,但与HIV-1-0 ANT70的V3环肽反应。就gp41优势免疫区而言,其不与"标准"HIV-1 M亚组共有序列反应,但微弱地却令人惊奇地与HIV-1 M亚组右延伸共有序列反应。
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Claims (24)
1.一种用于特异性检测HIV-1VAU病毒的核酸,其选自:
i)含有相应于HIVVAU之env基因的SEQ ID NO:5的序列;
ii)具有至少100个核苷酸的核酸,其在高度严谨条件下可特异性地与SEQ ID NO:5杂交;
iii)含有SEQ ID NO:7的序列,或
iv)具有至少100个核苷酸的核酸,其在高度严谨条件下可特异性地与SEQ ID NO:7杂交。
2.用于在从怀疑携带HIV-1VAU逆转录病毒之病人获得的血清、其它生物体液或组织样品中检测HIV-1(VAU)逆转录病毒的组合物,该组合物的特征是其包含至少一种获自权利要求1的核酸之探针。
3.用于在生物样品中检测HIV-1(VAU)逆转录病毒的组合物,该组合物的特征是其包含至少两种按照权利要求1之核酸,所述核酸能用作扩增HIV-1(VAU)之DNA和/或RNA的引物。
4.权利要求1的核酸,其特征在于该序列是RNA序列。
5.HIV-1(VAU)逆转录病毒包膜蛋白,其特征在于它可以通过在宿主细胞中表达按照权利要求1的核酸获得,并且所述的蛋白质包括SEQ ID NO.6残基1和526之间的氨基酸序列,或SEQ ID NO.8残基527和877之间的氨基酸序列。
6.其序列包含于权利要求5之包膜蛋白序列的肽,其特征在于它具有可以被HIV-1(VAU)病毒所诱导的抗体识别的表位。
7.按照权利要求6的肽,其特征在于它含有选自如下的序列:CKNRLIC,序列RLLALETFIQNWWLLNLWGCKNRLIC,序列RLWALETLIQNQQRLNLWGCKGKLIC,序列RLLALETLLQNQQLLSLWGCKGKLVC,序列RARLLALETFIQNQQLLNLWGCKNRLICYTSVKWNKT,或这些序列由保守性氨基酸替换产生的变体,所述变体能被由HIVvau病毒诱导的抗体识别。
8.权利要求6和7任一项之肽,其特征在于其为合成肽。
9.用于在人类生物样品中体外检测抗HIV-1(VAU)抗体的组合物,该组合物包含至少一种抗原,该抗原包括权利要求5的包膜蛋白,或权利要求6的肽。
10.按照权利要求9的组合物,其特征在于它也包含这样的抗原,所述抗原为不属于O组的HIV-1病毒和/或HIV-2病毒的抗原,或者源于HIV-2病毒的具有被抗体识别的表位的抗原,所述抗体是由不属于O组的HIV-1病毒和/或HIV-2病毒诱导的。
11.按照权利要求10的组合物,其特征在于所述的不属于O组的HIV-1和/或HIV-2病毒的抗原是gag或pol蛋白质。
12.按照权利要求11的组合物,其特征在于所述的不属于O组的HIV-1病毒和/或HIV-2病毒的抗原是包膜糖蛋白。
13.按照权利要求9到12任一项之组合物,其特征在于所说的组合物包含相应于HIV-1(VAU)gp41蛋白质590-620整个区或者对HIV-1(VAU)特异性的这一区的部分的肽序列。
14.按照权利要求13的组合物,其特征在于所说的肽序列是序列TFIQN-、CKNRLIC或WGCKNR。
15.可以识别(i)按照权利要求5的HIV-1VAU之包膜蛋白质,或(ii)权利要求6的肽的抗体。
16.用于体外诊断由HIV-1(VAU)病毒引起的感染的方法,该方法包括:
-使形成诊断主体的来源于病人的血清或其它生物介质与以下物质接触:至少一种权利要求5的包膜蛋白,或者至少一种权利要求6的肽,或者按照权利要求9的组合物,和
-检测免疫学反应。
17.Western印迹或ELISA反应所需试剂,该试剂包含一种权利要求5的HIV-1(VAU)病毒的包膜蛋白,或者按照权利要求6的肽,或者按照权利要求9的组合物。
18.按照权利要求1的核苷酸序列用于制备用于诱导针对由所述序列编码之抗原的抗体体内合成之组合物的用途。
19.一种能够在动物中诱导抗体的按照权利要求9之组合物。
20.用于在生物样品上体外检测HIV-1(VAU)逆转录病毒的试剂盒,其特征在于该试剂盒包含:至少一种按照权利要求1的核酸之探针或者按照权利要求2或3之组合物。
21.按照权利要求20的试剂盒,其特征在于所述探针是经标记的。
22.按照权利要求20的试剂盒,其特征在于其含有根据权利要求2或3的组合物之另一种核酸探针。
23.按照权利要求20的试剂盒,其特征在于所述核酸探针被固定在固体支持物上。
24.按照权利要求20的试剂盒,其特征在于其也包含进行杂交所需的试剂。
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