ES2821654T3 - Factor XIII humano como control de normalización para inmunoensayos - Google Patents

Abstract

Un kit para corregir las variaciones en el procesamiento de muestras y/o efectos de la matriz biológica cuando se realizan ensayos biológicos, comprendiendo dicho kit un factor de normalización que no se une a un analito de la muestra biológica a ensayar y que se acopla a un soporte sólido, en el que el factor de normalización es hFXIII, y una pluralidad de soportes sólidos que tienen miembros de unión inmovilizados sobre ellos que se unen a uno o más analitos en la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN

Factor XIII humano como control de normalización para inmunoensayos

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de los inmunodiagnósticos.

Antecedentes de la invención

Los inmunoensayos que detectan los antígenos del VIH y los anticuerpos dirigidos contra los antígenos del VIH en muestras biológicas son útiles para determinar si un individuo está infectado o ha estado expuesto al VIH. Los ensayos actuales detectan los antígenos del VIH y los anticuerpos contra el VIH-1, que incluyen los grupos O y M, y los anticuerpos contra el VIH-2. Sin embargo, los ensayos que detectan la cantidad de analitos en una muestra biológica están sujetos a errores que pueden producir resultados falsos. Existen numerosos factores que pueden producir errores. Estos factores incluyen variaciones en la concentración del reactivo (por ejemplo, debido a la estabilidad del reactivo o a errores del pipeteo del instrumento), etapas del procedimiento del instrumento (por ejemplo, volúmenes de dispensación del reactivo, aspiración incompleta después de las etapas de lavado que dan como resultado la dilución del reactivo, tiempo de incubación), condiciones del instrumento (temperatura del detector) y efectos de la matriz de la muestra (por ejemplo, suero versus al plasma).

Un procedimiento para verificar la cantidad o el volumen de una muestra que se analiza en un ensayo se describe en la patente de los EE. UU. núm. 7.141.362. El procedimiento detecta la cantidad de las subunidades a y b del factor XIII (hFXIII) de la coagulación de la sangre humana en una muestra para determinar el volumen de una muestra, y puede usarse además para distinguir el plasma y el suero de otros tipos de muestras biológicas. La cantidad de hFXIII en una muestra se detecta en un inmunoensayo mediante el uso de los anticuerpos contra las subunidades de hFXIII inmovilizadas sobre soportes sólidos. La patente de los EE. UU. núm. 6,916,621 divulga los sistemas informáticos, los productos de los programas informáticos y los procedimientos para los procedimientos basados en matrices en sílico para determinar la cantidad relativa de las moléculas biológicas (por ejemplo, las secuencias del ácido nucleico) en dos o más muestras. La invención proporciona además las matrices novedosas que comprenden las moléculas de calibración inmovilizadas (por ejemplo, los ácidos nucleicos) para normalizar los resultados de los ensayos de unión en base a las matrices (por ejemplo, las reacciones de hibridación).

La patente de los EE. UU. núm. 7,608,465 divulga los ensayos inmunológicos para varios marcadores biológicos de trastornos de la tiroides en una muestra biológica que se realizan en una sola prueba con una combinación de ensayos serológicos, competitivos secuenciales y tipo sándwich mediante el uso de partículas clasificadas en grupos que pueden distinguirse por citometría de flujo, un grupo para el ensayo de cada marcador. Cada grupo de partículas se recubre con un miembro de unión inmunológico diferente, y se usan densidades de recubrimiento, materiales de co-recubrimiento y soluciones tampón especiales para ajustar las diferencias en las sensibilidades y los intervalos dinámicos de cada uno de los marcadores en la muestra típica.

La patente de los EE. UU. núm. 8,137,987 divulga el análisis de los fluidos corporales para detectar la presencia de los fármacos de un panel seleccionado de los fármacos en un ensayo simultáneo en el que la muestra del fluido se incuba con cantidades las adicionales de todos los fármacos del panel, los anticuerpos específicos para cada uno de los fármacos del panel, y las micropartículas, dividiéndose las micropartículas en subconjuntos, una vez el subconjunto para cada fármaco en el panel y cada subconjunto distinguible de los demás. La incubación se realiza en un medio líquido en el que se produce la unión competitiva, compitiendo los fármacos de la muestra con los añadidos al medio de ensayo por la unión a los anticuerpos.

La publicación de la solicitud de la patente de los EE. UU. núm 2003/0186250 divulga los sistemas informáticos, los productos de los programas informáticos y los procedimientos para los procedimientos en base a las matrices en sílico para determinar la cantidad relativa de las moléculas biológicas (por ejemplo, las secuencias del ácido nucleico) en dos o más muestras. La invención proporciona además las matrices novedosas que comprenden las moléculas de calibración inmovilizadas (por ejemplo, los ácidos nucleicos) para normalizar los resultados de los ensayos de unión en base a las matrices (por ejemplo, las reacciones de hibridación). La Publicación de la solicitud de la patente de los EE. UU. núm. 2005/0239108 divulga los procedimientos y los kits para detectar y/o monitorizar las moléculas biológicas en una muestra de prueba. Por ejemplo, la invención se refiere a los procedimientos y los kits para detectar y/o monitorear el antígeno p24 del VIH en los fluidos corporales humanos, toxinas biológicas como la ricina o el botulismo en una muestra ambiental o biológica, y las proteínas previas de los humanos, ciervos o bovinos, como PrPSC, en una muestra biológica. La señal de detección del antígeno se potencia mediante la amplificación de un polinucleótido unido a una molécula detectora mediante el uso de los procedimientos para la tecnología de la amplificación de los ácidos nucleicos. El documento EP-A-1424086 divulga que el factor XIII está inmovilizado sobre las membranas de colágeno.

BG Blanchy y otros, J. Biomed. Mat. Res. 20(4):469-479 (1986) describe la existencia de factor XIII inmovilizado sobre el sustrato de la celulosa oxidada.

H. Hormann y otros, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368:669-674 (1987) revela un kit que comprende una transglutaminasa de forma abierta como el factor XIII. Dicho factor XIII está presente preferentemente en forma inmovilizada cuando se usa en la detección diagnóstica.

El documento EP-A-2322926 muestra un factor XIII solidificado inmovilizado en la superficie de la pared de un órgano artificial tubular.

El documento JP_H04250167 divulga el factor XIII inmovilizado sobre las perlas de poliestireno.

Además, el análisis repetido de las muestras como calibradores, controles o muestras de pacientes (suero o plasma) puede producir resultados inconsistentes que conducen a los altos coeficientes de variación (porcentaje de desviación estándar relativa). En algunos casos, la variación puede llegar al 50 % o más y puede ser suficiente para producir una respuesta clasificada como positiva para algunas repeticiones pero negativa para otras. Esta variabilidad es inaceptable para los ensayos críticos como la detección del VIH. La presente invención aborda los errores en el análisis que conducen a los altos coeficientes de variación.

Sumario de la divulgación

La presente divulgación describe un factor de normalización que puede usarse como estándar de normalización y/o control interno en un ensayo biológico. El estándar de normalización se adjunta a un soporte sólido que se incluye en el ensayo. En un procedimiento para normalizar los resultados de un inmunoensayo para la detección de los analitos en una muestra biológica, los analitos se detectan uniéndose a los miembros de unión que se unen específicamente a un analito individual. Al incluir un factor de normalización en el ensayo, pueden corregirse los errores introducidos por las variaciones en el procesamiento de la muestra o los efectos de la matriz biológica asociados con los varios tipos de muestras. Particularmente, el factor de normalización no se une específicamente a un analito en la muestra.

La muestra biológica se incuba con uno o más miembros de unión que se unen a uno o más de los analitos en la muestra, y se detecta si alguno de los analitos se une a los miembros de unión. Por ejemplo, si el analito es un antígeno, el miembro de unión correspondiente puede ser un anticuerpo que se une específicamente al antígeno. Del mismo modo, si el analito es un anticuerpo, el miembro de unión correspondiente puede ser un antígeno que se une específicamente al anticuerpo. De este modo, un analito diana individual se une específicamente a un miembro de unión correspondiente, y un panel de analitos puede unirse a un panel correspondiente de miembros de unión. Después se identifican los analitos que se unen a un miembro de unión dado. Un medio de tal identificación es usar miembros de unión que están inmovilizados sobre un soporte sólido, con un soporte sólido diferente para cada miembro de unión. Por ejemplo, las moléculas de un solo miembro de unión se inmovilizan en un soporte sólido individual, y los soportes sólidos para los diferentes miembros de unión pueden distinguirse entre sí por medios distintos de los propios miembros de unión. Los soportes sólidos pueden distinguirse entre sí mediante el uso de los parámetros de diferenciación asociados con los soportes sólidos, siendo todos los soportes que llevan cualquier miembro de unión diferenciables de todos los soportes que llevan cualquiera de los otros miembros de unión por los parámetros de diferenciación. De este modo, los parámetros de diferenciación pueden usarse para dividir los soportes sólidos en subpoblaciones diferenciables entre sí.

La detección de la unión inmunológica entre los analitos de la muestra y los miembros de unión puede lograrse mediante el uso de los agentes de unión. Por ejemplo, los agentes de unión que tienen afinidad de unión por el factor de normalización y los agentes de unión que tienen afinidad de unión por cada uno de los analitos de la muestra pueden usarse para detectar la unión. En determinadas realizaciones, los agentes de unión se incuban con los soportes sólidos que tienen miembros de unión inmovilizados sobre ellos en condiciones que promueven la unión de los agentes de unión al factor de normalización y los analitos. En algunas realizaciones, el agente aglutinante se conjuga con un marcador. En algunas realizaciones, el marcador es la biotina. En algunas realizaciones, el marcador es un marcador detectable, tal como una porción fluorescente.

Después de la incubación de los agentes aglutinantes con los soportes sólidos, los soportes sólidos se recuperan para separar los soportes que tienen los analitos y/o el factor de normalización unidos a los mismos de los agentes aglutinantes no unidos. En las realizaciones donde el agente de unión se conjuga con la biotina, los soportes sólidos pueden incubarse con la estreptavidina que se acopla a un marcador detectable. En algunas realizaciones, el marcador detectable es un marcador fluorescente, como la ficoeritrina (PE). Después, se detecta la cantidad del marcador unido a los soportes sólidos. Por ejemplo, el marcador puede detectarse mediante cualquier procedimiento capaz de medir la cantidad de la señal fluorescente emitida por el marcador.

La cantidad de marcador detectado puede correlacionarse con los parámetros de diferenciación para obtener valores que sean representativos del nivel o la cantidad de cada analito individual en la muestra, así como valores que sean representativos del nivel o la cantidad del factor de normalización que se une al soporte sólido. Esto permite normalizar los valores representativos de los niveles de cada analito individual en la muestra al valor representativo del nivel del factor de normalización. La normalización permite corregir las variaciones en el procesamiento de la muestra, mejorando de ese modo, el rendimiento del ensayo. La normalización permite corregir además las variaciones en la intensidad de la señal, por ejemplo, del marcador detectable, donde la variación en la intensidad de la señal se debe a la fuente de la muestra (es decir, los efectos de la matriz biológica).

El factor de normalización puede ser el Factor XIII humano (hFXIII). El procedimiento puede usar el Factor XIII humano acoplado a un soporte sólido como factor de normalización y/o control interno en un ensayo biológico. Una subpoblación de soportes sólidos tiene hFXIII inmovilizado sobre ellos. El soporte sólido puede ser una perla o una perla magnética. El hFXIII puede inmovilizarse en una perla o puede inmovilizarse en una perla magnética. Particularmente, el hFXIII puede inmovilizarse en una perla o perla magnética se denomina como Perla de Normalización de la Señal (SNB). El hFXIII unido al soporte sólido puede detectarse mediante el uso de un anticuerpo anti-hFXIII. El anticuerpo anti-hFXIII típicamente no está presente en la muestra biológica aislada del individuo, pero se agrega con otros agentes aglutinantes específicos para los analitos durante el procesamiento de la muestra para proporcionar un medio para detectar el hFXIII inmovilizado sobre el soporte sólido, como se describe en la presente memoria.

En algunas realizaciones, una subpoblación de soportes sólidos tiene los anticuerpos contra el hFXIII inmovilizados sobre ella, que se usan para detectar la unión del hFXIII (es decir, subunidades a y/o b) presente en la muestra biológica, como se describe en Patente de los EE. UU. núm. 7,141,362. De este modo, en algunas realizaciones, los anticuerpos anti-hFXIII se inmovilizan sobre un soporte sólido que comprende una perla o una perla magnética. En una realización, la perla o perla magnética que tiene los anticuerpos anti-hFXIII inmovilizados sobre ella se denomina Perla de Verificación de Suero (SVB). La SVB permite confirmar la presencia de una muestra de suero en el ensayo.

En un primer aspecto, se proporciona un kit para corregir variaciones en el procesamiento de la muestra y/o los efectos de la matriz biológica al realizar los ensayos biológicos, dicho kit comprende un factor de normalización que no une un analito de la muestra biológica a ensayar y que está acoplado a un soporte sólido, en el que el factor de normalización es el hFXIII, y

una pluralidad de soportes sólidos que tienen miembros de unión inmovilizados sobre estos que se unen a uno o más analitos en la muestra.

En un segundo aspecto, se proporciona una composición para corregir las variaciones en el procesamiento de la muestra y/o los efectos de la matriz biológica al realizar los ensayos biológicos, dicha composición comprende una normalización que no une un analito de la muestra biológica a ensayar y que se acopla a un soporte sólido, en el que el factor de normalización es el hFXIII, y

una pluralidad de soportes sólidos que tienen los miembros de unión inmovilizados sobre estos que se unen a uno o más analitos en la muestra.

El kit o la composición puede incluir un soporte sólido que tenga un anticuerpo contra el Factor XIII humano inmovilizado sobre este. Como se describió anteriormente, el anticuerpo del Factor XIII humano se une al hFXIII presente en la muestra biológica y, de este modo, sirve como un ensayo para verificar que la muestra contenía suero o plasma, lo que ayuda a evitar los resultados falsos negativos. De este modo, en una realización, el miembro de unión es un anticuerpo contra el Factor XIII humano.

En algunas realizaciones, el soporte sólido es una perla o una perla magnética.

En algunas realizaciones, el soporte sólido se acopla a la tetrametilcadaverina rodamina (TMRC).

Definiciones

Un "agente de unión" es un compuesto que tiene afinidad de unión por otro compuesto. Por ejemplo, el agente de unión puede unirse con alta afinidad al factor de normalización que está inmovilizado sobre un soporte sólido. El agente de unión puede unirse además a un analito en la muestra biológica. El agente de unión puede ser inmunorreactivo con el factor de normalización o un analito objetivo. Por ejemplo, el agente de unión puede ser un anticuerpo que se une específicamente al factor de normalización o un antígeno en la muestra biológica, o el agente de unión puede ser un antígeno que se une específicamente a un anticuerpo en la muestra biológica. El agente de unión puede conjugarse con un marcador que permite que se detecte el agente de unión. En algunas realizaciones, el agente de unión no está inmovilizado sobre un soporte sólido.

El término "miembro de unión" se usa en la presente memoria para indicar una molécula o agente que se une específicamente a un analito objetivo. El miembro de unión puede ser inmunorreactivo con un analito objetivo. Por ejemplo, el miembro de unión puede ser un antígeno que se une específicamente a un anticuerpo en la muestra biológica, o el miembro de unión puede ser un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno en la muestra biológica. El miembro de unión puede inmovilizarse sobre un soporte sólido, que incluye, pero no se limita a, una perla o una perla magnética.

Un "factor de normalización" es una molécula que puede usarse para normalizar el resultado de un ensayo. El factor de normalización normalmente no reacciona ni se une con alta afinidad a un analito de interés en la muestra.

El término "marcador" o "porción detectable" se usa en la presente memoria para indicar una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, químicos u otros medios físicos. Ejemplos de marcadores son 32P, colorantes fluorescentes, reactivos densos en electrones, enzimas (por ejemplo, como se usa comúnmente en un ELISA), biotina, digoxigenina y haptenos y proteínas u otras entidades que pueden hacerse detectables, por ejemplo, incorporando un radiomarcador en el péptido o usándolo para detectar los anticuerpos específicamente reactivos con el péptido. Los marcadores pueden incorporarse, por ejemplo, en anticuerpos y/u otras proteínas en cualquier posición. Puede emplearse cualquier procedimiento conocido en la técnica para conjugar el anticuerpo o la proteína (péptido) con el marcador, por ejemplo, mediante el uso de los procedimientos descritos en Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego. Alternativamente, los procedimientos que usan interacciones de alta afinidad pueden lograr los mismos resultados cuando uno de un par de socios de unión se une al otro por ejemplo, la biotina y la estreptavidina. Las proteínas de la invención, como se describe en la presente memoria, pueden marcarse directamente con isótopos, cromóforos, lumíforos, cromógenos, o marcarse indirectamente, como con la biotina, a la cual se le puede dar la estreptavidina en un complejo con una porción fluorescente, radiactiva u otra que pueda detectarse directamente después que puede unirse. De este modo, un anticuerpo biotinilado se considera un "anticuerpo marcado" como se usa en la presente memoria.

El término "anticuerpo" como se usa en la presente memoria se refiere a un polipéptido codificado por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de estos, que se unen específicamente y reconocen a un analito (antígeno). Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina reconocida se clasifican ya sea como kappa o lambda. Las cadenas pesadas de la inmunoglobulina se clasifican como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, las que a su vez definen las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, respectivamente.

Un ejemplo de una unidad estructural de la inmunoglobulina G (anticuerpo IgG) es un tetrámero. Cada tetrámero de este tipo está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (25 kD) y una cadena "pesada" (50-70 kD). El extremo N-terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 aminoácidos o más, responsables principalmente del reconocimiento antigénico. Los términos "cadena ligera variable" (VL) y "cadena pesada variable" (VH) se refieren a estas cadenas ligeras y pesadas, respectivamente.

Los anticuerpos existen como inmunoglobulinas intactas o como fragmentos bien caracterizados producidos por digestión de inmunoglobulinas intactas con diversas peptidasas. De este modo, por ejemplo, la pepsina digiere un anticuerpo cerca de los enlaces disulfuro en la región bisagra para producir F(ab')2, un dímero de Fab que en sí mismo es una cadena ligera unida a VH-CH1 mediante un enlace disulfuro. El dímero F(ab')2 puede reducirse en condiciones suaves para romper el enlace disulfuro en la región bisagra, convirtiendo de este modo, el dímero F(ab')2 en dos monómeros Fab'. El monómero Fab' es esencialmente un Fab con parte de la región de bisagra (ver, Paul (Ed.) Fundamental Immunology, Tercera edición, Raven Press, NY (1993)). Aunque varios fragmentos de anticuerpos se definen en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto apreciará que tales fragmentos pueden sintetizarse de nuevo ya sea químicamente o utilizando la metodología del ADN recombinante. De este modo, el término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, incluye además los fragmentos de anticuerpos producidos ya sea mediante la modificación de los anticuerpos completos o mediante síntesis de Novo mediante el uso de las metodologías del ADN recombinante tales como Fv de cadena sencilla.

La expresión "específicamente (o selectivamente)" en referencia a la unión a un anticuerpo, o "específicamente (o selectivamente) inmunorreactiva con" o "que tiene especificidad de unión para", cuando se refiere a una proteína, péptido o antígeno, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la proteína, péptido o antígeno en presencia de una población heterogénea de las proteínas y otras biologías. De este modo, en condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteína particular y no se unen en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. La unión específica a una proteína bajo tales condiciones puede requerir un anticuerpo que se selecciona por su especificidad por una proteína particular. Por ejemplo, los anticuerpos producidos contra una proteína pueden seleccionarse para obtener anticuerpos específicamente inmunorreactivos con esa proteína y no con otras proteínas. Una variedad de formatos de inmunoensayos pueden ser apropiados para seleccionar los anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA en fase sólida, transferencia de tipo western, o la inmunohistoquímica, se usan rutinariamente para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con una proteína. Ver Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, NY (1988), para una descripción de los formatos de inmunoensayo y las condiciones que pueden usarse para determinar la inmunoreactividad específica. Típicamente, una reacción específica o selectiva será al menos el doble de la señal o ruido de los valores iniciales, y más típicamente más de 10 a 100 veces los valores iniciales.

Los anticuerpos para su uso en ciertas realizaciones de la presente invención son anticuerpos antihumanos, particularmente aquellos anticuerpos antihumanos que están marcados. Entre estos anticuerpos antihumanos, se prefieren los que son anticuerpos de IgG humana, los que son anticuerpos de IgM humana y los que son anticuerpos de IgA humana.

El término "muestra biológica" abarca una variedad de tipos de muestras obtenidas de un organismo. El término abarca fluidos corporales como la sangre, saliva, suero, plasma, orina y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido, como una muestra de biopsia o cultivos de tejidos o células derivadas de ahí y la progenie de estos. Como se describe en la presente memoria, típicamente, la muestra biológica será un fluido corporal o tejido que contiene cantidades detectables de un analito de interés, por ejemplo, un antígeno, anticuerpo, proteína, péptido, ácido nucleico o molécula pequeña. El término abarca muestras que han sido manipuladas de alguna manera después de su obtención, como por tratamiento con los reactivos, solubilización, sedimentación o enriquecimiento de ciertos componentes. El término abarca una muestra clínica e incluye además las células en cultivo celular, sobrenadantes celulares, lisados celulares, suero, plasma, otros fluidos biológicos y muestras de tejido. Las muestras biológicas preferidas son las muestras de sangre, muestras de plasma y muestras de suero.

El término "soporte sólido" se usa en la presente memoria para indicar una superficie o cuerpo sólido inerte al que se puede inmovilizar un agente, tal como un anticuerpo o un antígeno, que es reactivo en cualquiera de las reacciones de unión descritas en la presente memoria. El término "inmovilizado", como se usa en la presente memoria, indica un acoplamiento de base molecular que no se desplaza ni desacopla bajo ninguna de las condiciones impuestas durante cualquiera de las etapas de los ensayos descritos en la presente memoria. Tal inmovilización puede lograrse mediante un enlace covalente, un enlace iónico, un enlace de tipo afinidad o cualquier otro enlace químico.

El término "partículas" se usa en la presente memoria para indicar los cuerpos sólidos, a menudo con dimensiones lineales en la escala de micras (es decir, menos de 100 micrones), de cualquier forma o textura superficial. El término "perlas" se usa en la presente memoria para indicar las partículas que son de forma esférica o casi esférica, a menudo de composición polimérica.

Los ensayos "en formato múltiple" son análisis que miden simultáneamente los niveles de más de un analito en una sola muestra.

El término "analito" o "analito objetivo" se usa en la presente memoria para indicar una molécula que está presente en una muestra biológica y es indicativo de la presencia o ausencia de una condición biológica en un individuo, tal como un individuo humano. El término afección biológica se usa sin limitación y puede incluir afecciones tanto normales como anormales. Por ejemplo, la afección biológica puede ser una afección patológica como una enfermedad, infección, cáncer o trastorno autoinmunitario. El analito puede indicar además el estado o la progresión de una enfermedad o infección, como durante el tratamiento de la enfermedad o durante las diferentes etapas de una infección. El analito puede indicar además un diagnóstico o pronóstico de una afección biológica.

El término "porción de unión marcada" se refiere a una molécula o reactivo que está conjugado o acoplado a un marcador. El marcador puede ser un marcador detectable, como un fluoróforo, o puede marcarse indirectamente como con la biotina o la estreptavidina, o con una enzima que sea útil para producir una señal detectable, como la fosfatasa alcalina (AP) o la peroxidasa de rábano picante (HRP). La porción de unión marcado puede unirse a un agente de unión o, cuando el marcador es avidina, estreptavidina o un equivalente, a un conjugado biotinilado.

El término "parámetro de diferenciación" se usa en la presente memoria para indicar una característica del soporte sólido que es independiente del miembro de unión que está unido o inmovilizado al soporte sólido. De este modo, un parámetro de diferenciación permite que los soportes sólidos con diferentes miembros de unión inmovilizados sobre ellos se distingan entre sí por medios distintos de los propios miembros de unión.

El término "matriz biológica" se refiere a la fuente de la muestra que contiene los analitos de interés. Por ejemplo, la matriz biológica puede ser un fluido biológico tal como, pero sin limitarse al, suero, plasma, sangre completa, orina, saliva, linfa o fluido cefalorraquídeo. El término "efecto de la matriz biológica" se refiere a la variación en la señal de ensayo cuando la muestra se deriva de diferentes matrices biológicas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 ilustra el uso de una perla recubierta de Factor XIII humano como control y para producir una señal normalizada en un ensayo de VIH representativo que detecta el antígeno p24 de VIH. Se realizaron doce (12) réplicas, y los datos se normalizaron como se describe en el Ejemplo 1.

La Figura 2 ilustra el uso de una perla recubierta de Factor XIII humano como control y para producir una señal normalizada en un ensayo de control de VIH múltiple representativo que detecta los anticuerpos policlonales humanos contra VIH-1. Se realizaron cinco (5) réplicas, y los datos se normalizaron como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 3 ilustra el uso de una perla recubierta de Factor XIII humano como control y para producir una señal normalizada en un ensayo de control de VIH en formato múltiple representativo que detecta los anticuerpos policlonales humanos contra VIH-2. Se realizaron cinco (5) réplicas, y los datos se normalizaron como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 4 ilustra el uso de una perla recubierta de Factor XIII humano como control y para producir una señal normalizada en un ensayo de control de VIH en formato múltiple representativo que detecta los anticuerpos monoclonales de conejo contra VIH-O. Se realizaron cinco (5) réplicas, y los datos se normalizaron como se describe en el Ejemplo 2.

La Figura 5 ilustra que la señal del ensayo se reduce por diversas cantidades del conjugado de biotina restante en el recipiente de reacción en un experimento representativo que detecta los anticuerpos contra VIH-O, como se describe en el Ejemplo 5.

La Figura 6 ilustra un gráfico de la respuesta relativa de la señal del antígeno p24 del VIH y la señal del Factor XIII humano detectadas en las muestras de suero y plasma del mismo donante en diversas matrices biológicas suplementadas con concentraciones idénticas del antígeno p24 del VIH.

La Figura 7 ilustra un gráfico de la señal normalizada del mismo experimento que en la Figura 6, mostrando una variación menor para todas las muestras en diferentes matrices biológicas.

Descripciones de las realizaciones seleccionadas

La presente divulgación proporciona las composiciones y los kits para corregir las variaciones en el procesamiento de la muestra y/o los efectos de la matriz biológica cuando se realizan los ensayos biológicos. La composición del kit comprende un factor de normalización acoplado a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el factor de normalización puede ser cualquier molécula adecuada que sea capaz de unirse a un soporte sólido y que no se una específicamente a un analito objetivo en la muestra biológica. El factor de normalización puede unirse covalentemente o no covalentemente al soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido es una perla o una perla magnética. De este modo, en algunas realizaciones, el factor de normalización se acopla a una perla, y la perla de normalización interactúa con los reactivos usados durante las etapas de detección posteriores del ensayo de la misma manera que las perlas que se unen específicamente a los analitos de la muestra. El soporte sólido acoplado a un factor de normalización puede usarse para verificar el procesamiento correcto de la muestra y para la normalización de la señal del ensayo. La normalización de la señal proporciona una precisión del ensayo mejorada para las muestras biológicas, controles y calibradores, y mejora la estabilidad de la señal durante la vida útil de los reactivos usados en el ensayo. En una realización el factor de normalización es el Factor XIII humano (hFXIII). En una realización, el procedimiento usa el Factor XIII humano acoplado a un soporte sólido como factor de normalización y/o control interno en un ensayo biológico. En un aspecto, se proporciona un soporte sólido acoplado al hFXIII para su uso como estándar de normalización y/o control interno.

De este modo, en algunas realizaciones, el soporte sólido acoplado al hFXIII puede usarse en los inmunoensayos para corregir las variaciones en el procesamiento de la muestra. En una realización, el soporte sólido acoplado al hFXIII permite normalizar la cantidad de la señal detectada para mejorar la precisión del ensayo. La señal puede producirse, por ejemplo, mediante un marcador. En una realización, el soporte sólido acoplado al hFXIII permite normalizar la cantidad del marcador detectado para corregir la pérdida de la cantidad del marcador detectable durante el almacenamiento de los reactivos usados en el procedimiento.

En algunas realizaciones, el soporte sólido acoplado al hFXIII permite detectar un ensayo no válido, por ejemplo, detectando cuando la señal del ensayo cae por debajo de un límite preestablecido. Por ejemplo, la señal para cada muestra puede normalizarse mediante el uso del hFXIII, y la señal normalizada puede compararse con los valores de control esperados. Si la señal de la muestra normalizada es demasiado baja, los resultados del ensayo pueden verse comprometidos debido a los efectos de la matriz u otros errores de procesamiento, y los resultados pueden marcarse como no válidos.

El factor de normalización acoplado a un soporte sólido puede usarse en un procedimiento para analizar una muestra biológica en busca de la presencia de uno o más analitos cuyos niveles son indicativos de un estado de enfermedad en un individuo. En algunas realizaciones, el uno o más analitos comprenden un panel de analitos. Los analitos de la presente divulgación incluyen los antígenos y los anticuerpos que están presentes en una muestra biológica de un individuo, que incluye un sujeto humano. En algunas realizaciones, la presencia, ausencia o el nivel de un analito en una muestra indica que el individuo padece o está en riesgo de desarrollar una enfermedad u otra afección patológica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los analitos indican que el individuo está infectado con un virus, como un retrovirus. De este modo, en algunas realizaciones, los analitos indican que el individuo está infectado con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la hepatitis C (VHC) o el virus del herpes simple (VHS). En una realización, los analitos indican que el individuo está infectado con el VIH. Los analitos que son indicativos de la infección por VIH de un individuo humano incluyen los antígenos del VIH como el antígeno p24, anticuerpos del VIH-1 (grupos M, O, N y P) y los anticuerpos del VIH-2 (que incluyen numerosos subtipos).

En algunas realizaciones del procedimiento, se incuba una muestra biológica con una pluralidad de soportes sólidos que tienen miembros de unión inmovilizados sobre estos para cada analito en el panel. Los miembros de unión de la presente divulgación incluyen los antígenos y los anticuerpos que son capaces de unirse específicamente a un analito en la muestra biológica. Por ejemplo, los miembros de unión que son capaces de unirse específicamente a los analitos indicativos de la infección por VIH de un individuo humano incluyen los anticuerpos anti-p24, la proteína gp160 para la detección del VIH-1, 39 p Fn para la detección del VIH-1/M, AFR para detección del VIH-1/O, SPOH para la detección del VIH-2, péptido gp36 para la detección del VIH-2, y SV2V para la detección del VIH-2. 39 P^fN y AFR son los péptidos que imitan las regiones inmunodominantes de los grupos M y O del VIH-1, respectivamente. SPOh y SV2V son los péptidos que imitan las regiones inmunodominantes del VIH-2. Las secuencias de los péptidos se proporcionan en la siguiente tabla (Tabla 1).

En algunas realizaciones, el miembro de unión se conjuga con otra proteína, como BSA, que está unida a un soporte sólido. En una realización, el miembro de unión es un anticuerpo anti-hFXIII. De este modo, en una realización, la muestra biológica se incuba con una pluralidad de soportes sólidos que tienen un anticuerpo anti-hFXIII inmovilizado sobre estos. La incubación se realiza en condiciones que promueven la unión de cada analito, si está presente en la muestra, a los miembros de unión inmovilizados sobre los soportes sólidos. Las condiciones que promueven la unión de los analitos a los miembros de unión en el soporte sólido incluyen la incubación de la muestra con los soportes sólidos en una solución tamponada como tampón fosfato a un pH de 7,0 a 7,4, a una temperatura de 25-37 °C durante 10 a 60 minutos. En algunas realizaciones, la unión constituye una unión inmunológica.

La determinación de que se ha producido la unión inmunológica constituye una o más etapas en determinadas realizaciones de la presente invención, y esto puede implicar la separación o recuperación de los complejos antígenoanticuerpo del antígeno o el anticuerpo no unido. Un medio de lograr dicha separación o recuperación es mediante el uso de los soportes sólidos. De este modo, la presente divulgación proporciona además una pluralidad de soportes sólidos que tienen miembros de unión inmovilizados sobre estos para cada analito del panel de analitos. En algunas realizaciones, la pluralidad de los soportes sólidos se divide en subpoblaciones caracterizadas porque cada subpoblación comprende un miembro de unión que se une a un solo analito del panel de analitos. En algunas realizaciones, cada subpoblación de soportes sólidos es diferenciable de las otras subpoblaciones de soportes sólidos mediante un parámetro de diferenciación, como se describe en la presente memoria.

En determinadas realizaciones, se proporciona una subpoblación de soportes sólidos que tienen el Factor XIII humano inmovilizado sobre estos. En algunas realizaciones, el hFXIII está inmovilizado en una perla o perla magnética. En una realización, el hFXIII inmovilizado en una perla o perla magnética se denomina Perla de Normalización de la Señal (SNB).

En determinadas realizaciones, una subpoblación de soportes sólidos tiene un anticuerpo que se une al hFXIII inmovilizado en estos. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-hFXIII se inmoviliza en una perla o perla magnética. En una realización, la perla o perla magnética que tiene los anticuerpos anti-hFXIII inmovilizados se denomina Perla de Verificación del Suero (SVB). Como se describe en la presente memoria, el SVB puede usarse para verificar la cantidad de la muestra biológica añadida al ensayo y si la muestra era de suero, plasma o alguna otra muestra biológica.

I. Soportes sólidos

En la invención puede usarse cualquier tipo de soporte sólido. El soporte sólido puede comprender cualquier superficie capaz de unirse a una proteína, exponerse a una muestra y separarse en poblaciones discretas. El soporte sólido puede ser la pared o el suelo de un recipiente de ensayo, o una varilla de nivel u otro instrumento para insertar en un recipiente de ensayo, o las partículas colocadas dentro o suspendidas en un recipiente de ensayo. Las partículas, y especialmente las perlas, son particularmente útiles en muchas realizaciones, que incluyen las perlas que son de tamaño microscópico (es decir, micropartículas) y están formadas por un material polimérico. Los polímeros útiles como micropartículas son aquellos que son químicamente inertes con respecto a los componentes de la muestra biológica y a los reactivos del ensayo distintos de los miembros de unión que están inmovilizados en la superficie de la micropartícula. Los materiales de micropartículas preferidos, particularmente cuando se usan marcadores fluorescentes en el ensayo, son aquellos con autofluorescencia mínima y que son sólidos e insolubles en la muestra y en cualquier tampón, solvente, portador, diluyente o agente de suspensión usado en el ensayo, en además de permitir la inmovilización del reactivo del ensayo. Ejemplos de polímeros adecuados son poliestirenos, poliésteres, poliéteres, poliolefinas, óxidos de polialquileno, poliamidas, poliuretanos, polisacáridos, celulosas, y poliisoprenos. La reticulación es útil en muchos polímeros para impartir integridad estructural y rigidez a la micropartícula. El intervalo de tamaño de las micropartículas puede variar. En algunas realizaciones, las micropartículas varían en diámetro de 0,3 pm a 100 pm, y en otras realizaciones, de 0,5 pm a 40 pm, y en otras realizaciones aún, de 2 pm a 10 pm.

En realizaciones donde el soporte sólido es una perla, la muestra biológica puede incubarse con de 0,1 pg a 2,0 pg (microgramo) de perlas por muestra en un recipiente de reacción. Por ejemplo, la muestra puede incubarse con 0,1 a 2,0 pg, 0,3 a 1,7 pg, 0,5 a 1,5 pg, 0,7 a 1,2 pg o 0,8 a 1,0 pg de perlas. En algunas realizaciones, la cantidad de perlas incubadas con la muestra es suficiente para producir una concentración de 0,002 pg/pl a 0,04 pg/pl en un volumen de reacción de 50 pl. Por ejemplo, la concentración puede variar de 0,002 a 0,040 pg/pL, 0,004 a 0,035 pg/pL, 0,008 a 0,030 pg/pL, 0,010 a 0,025 pg/pL, 0,010 a 0,020 pg/pL o 0,012 a 0,018 pg/pL. Las concentraciones de las perlas más altas reducen el tiempo para contar el número mínimo de perlas (por ejemplo, 50-100 eventos de perlas) requerido para determinar la señal mediana para un recipiente de reacción dado. En algunas realizaciones, se cuentan 200 eventos de perlas por muestra de reacción.

En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además recuperar los soportes sólidos de la muestra incubada descrita anteriormente. La recuperación y el lavado de las partículas pueden facilitarse mediante el uso de las partículas que están formadas o contienen un material magnéticamente sensible, es decir, cualquier material que responda a un campo magnético. La separación de las fases sólida y líquida, ya sea después de la incubación o después de una etapa de lavado, se logra mediante la imposición de un campo magnético en el recipiente de reacción en el que se incuban las partículas y la muestra, haciendo que las partículas se adhieran a la pared del recipiente y permitiendo de este modo, que el líquido se elimine por decantación o aspiración. Los materiales magnéticamente sensibles de interés en la presente invención incluyen los materiales paramagnéticos, materiales ferromagnéticos, materiales ferrimagnéticos y los materiales metamagnéticos. Ejemplos incluyen, por ejemplo, hierro, níquel y cobalto, así como los óxidos metálicos como Fe³O⁴, BaFe-^O-ig, CoO, NiO, Mn²O³, Cr²O³, y CoMnP.

Los expertos en la técnica conocen los procedimientos y la instrumentación para aplicar y eliminar un campo magnético como parte de un ensayo y se describen en la bibliografía. Ejemplos de informes de literatura son Forrest y otros., Patente de los EE. UU. núm. 4,141,687 (Technicon Instruments Corporation, 27 de febrero de 1979); Ithakissios, Patente de los EE. UU. núm. 4,115,534 (Minnesota Mining and Manufacturing Company, 19 de septiembre de 1978); Vlieger, AM y otros, Analytical Biochemistry 205: 1-7 (1992); Dudley, Journal of Clinical Immunoassay 14: 77-82 (1991); y Smart, Journal of Clinical Immunoassay 15:246-251 (1992).

El material magnéticamente sensible puede dispersarse por todo el polímero, aplicarse como un revestimiento sobre la superficie del polímero o como uno de dos o más revestimientos sobre la superficie, o incorporarse o fijarse de cualquier otra manera que asegure el material a la partícula. La cantidad del material magnéticamente sensible en la partícula no es crítica y puede variar en un amplio intervalo. Sin embargo, la cantidad puede afectar la densidad de la micropartícula, y tanto la cantidad como el tamaño de la partícula pueden afectar la facilidad de mantener la micropartícula en suspensión con el fin de lograr un contacto máximo entre la fase líquida y sólida y para facilitar la citometría de flujo. Una cantidad excesiva de material magnéticamente sensible en las micropartículas puede producir autofluorescencia a un nivel lo suficientemente alto como para interferir con los resultados del ensayo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la concentración del material que responde magnéticamente es lo suficientemente baja como para minimizar cualquier autofluorescencia que emana del material. Con estas consideraciones en mente, el material magnéticamente sensible en una partícula de acuerdo con la presente invención es, por ejemplo, de 0,05 % a 75 % en peso de la partícula en su conjunto. En algunas realizaciones, el intervalo de porcentaje en peso es del 1 % al 50 %, por ejemplo, del 2 % al 25 %, por ejemplo, del 2 % al 8 %.

En algunas realizaciones, los miembros de unión se acoplan covalentemente al soporte sólido. En algunas realizaciones, el miembro de unión es un anticuerpo contra el hFXIII, que está unido covalentemente al soporte sólido. En algunas realizaciones, los miembros de unión son proteínas acopladas covalentemente al soporte sólido mediante el uso de la química de acoplamiento mediada por la carbodiimida. Otros procedimientos de acoplamiento covalente de proteínas a un soporte sólido son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las proteínas pueden acoplarse a un grupo carboxi reactivo en perlas de poliestireno. La perla de carboxi inicial puede convertirse químicamente en grupos dobles amino o carbono-carbono activado. Los soportes sólidos pueden contener además los grupos cloroalquilo reactivos o los agentes alquilantes similares que son capaces de reaccionar directamente con las porciones amino proteicos.

En otras realizaciones, los miembros de unión están acoplados de forma no covalente al soporte sólido. Por ejemplo, las proteínas pueden adsorberse en la superficie del soporte sólido mediante las interacciones electrostáticas. En algunas realizaciones, el soporte sólido puede recubrirse con la estreptavidina para capturar las proteínas, los antígenos y los anticuerpos biotinilados mediante el uso de la fuerte avidez de la estreptavidina por la biotina. La estreptavidina puede acoplarse covalentemente al soporte sólido mediante el uso de la química de activación de la carbodiimida convencional. Pueden usarse otras proteínas de unión, como la proteína G o A, para inmovilizar los anticuerpos en las perlas.

En algunas realizaciones, el factor de normalización se acopla covalentemente al soporte sólido. En algunas realizaciones, el factor de normalización es el hFXIII, que se une covalentemente a un soporte sólido. Por ejemplo, el hFXIII puede unirse covalentemente a una perla mediante el uso de la química de acoplamiento mediada por la carbodiimida. En una realización, el hFXIII está acoplado a una región de perlas única. En algunas realizaciones, el hFXIII está acoplado de forma no covalente al soporte sólido, por ejemplo, por adsorción. En algunas realizaciones, el hFXIII se acopla indirectamente al soporte sólido, por ejemplo, primero acoplando covalentemente un anticuerpo del hFXIII al soporte sólido y después incubando el soporte sólido con el hFXIII para producir un soporte sólido del hFXIII inmunoacoplado.

En algunas realizaciones, el ensayo incluye un soporte sólido acoplado a un anticuerpo anti-Factor XIII humano. En una realización, el anticuerpo anti-Factor XIII humano se acopla a una perla. En una realización, la perla se acopla a un anticuerpo monoclonal anti-FXIII humano de ratón. Esta realización se denomina Perla de Verificación de Suero (SVB). El SVB es útil para detectar el factor XIII humano nativo en la muestra para verificar la adición de la muestra. Ejemplos de perlas acopladas a los anticuerpos monoclonales anti-factor XIII humano se describen en la patente de los Ee . UU. núm. 7,141,362.

Después de que los soportes sólidos se recuperan de la muestra biológica, por ejemplo, mediante el uso de los procedimientos descritos anteriormente, los soportes sólidos se incuban con reactivos que tienen afinidad de unión por cada uno de los analitos y los reactivos que tienen afinidad de unión por el hFXIII. En algunas realizaciones, los reactivos son conjugados biotinilados. En algunas realizaciones, los conjugados biotinilados son proteínas, péptidos o anticuerpos biotinilados. Los ejemplos de conjugados biotinilados incluyen: 39-PFN-BgG-Biotina para la detección de los anticuerpos VIH-1/M; SV2V-biotina para la detección de los anticuerpos del VIH-2; AFR-biotina para la detección de los anticuerpos del VIH-1/O; y los anticuerpos anti-p24 biotinilados para la detección del antígeno p24. En algunas realizaciones, el conjugado biotinilado es un anticuerpo biotinilado que se une al FXIII humano.

Los procedimientos para biotinilar los péptidos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el procedimiento más común y versátil para la biotinilación es mediante la reacción de derivados de la biotina que poseen el grupo éster de N-hidroxisuccinimida. Esta funcionalidad química permite la formación de los enlaces amida covalentes estables entre la biotina y el grupo amino de la proteína en condiciones de reacción muy suaves (temperatura ambiente, pH neutro a alto) generalmente en un período corto de tiempo (1 hora) hasta su finalización. Los derivados de la biotina están disponibles comercialmente y la distancia y el tipo de enlace entre la biotina y la proteína pueden adaptarse a la necesidad del conjugado de la biotina objetivo específico. Pueden usarse además los derivados de la biotina que contienen grupos hidrazida activos para unir la biotina a porciones carbonilo de las proteínas disponibles. Estos compuestos se usan a menudo si existe la necesidad de marcar directamente la proteína cerca de sus dominios que contienen azúcar. Los derivados de la biotina que portan grupos N-etilmaleimida o enlaces carbono-carbono insaturados similares se usan para apuntar a tioles proteicos y proporcionan otro ejemplo para el marcaje específico del sitio de las proteínas. Otros derivados de la biotina más especializados llevan funcionalidades químicas como aril azidas que pueden activarse fotoquímicamente mediante el uso de la luz ultravioleta. Una vez activadas fotoquímicamente, estas especies de la biotina transitorias pueden reaccionar con varios tipos de residuos de las proteínas. Ver, por ejemplo, Richard P. Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Capítulo 4, Biotins and Haptens, páginas, 63-80, Sexta Edición, 1996.

Los conjugados biotinilados se incuban en las condiciones que promueven la unión de los conjugados biotinilados al hFXIII y los analitos. Las condiciones adecuadas incluyen al tampón fosfato con NaCl, estabilizadores de proteínas, bloqueadores y conservantes. El pH puede estar en el intervalo de 7,0-7,4.

En algunas realizaciones, después de incubar los soportes sólidos con los conjugados biotinilados, el exceso del conjugado se elimina mediante lavado y los soportes sólidos se incuban con una porción de unión marcada. En algunas realizaciones, la porción de unión marcada se selecciona de la estreptavidina y la avidina. En algunas realizaciones, los marcadores son fluoróforos, muchos de los cuales se describen en la bibliografía y, de este modo, son conocidos por los expertos en la técnica, y muchos de los cuales están fácilmente disponibles de los proveedores comerciales para la industria de la biotecnología. Las fuentes de literatura sobre fluoróforos incluyen Cardullo y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8790-8794 (1988);Dexter, D.L., J. of Chemical Physics 21: 836- 850 (1953);Hochstrasser y otros, Biophysical Chemistry 45: 133-141 (1992); Selvin, P., Methods in Enzymology 246: 300-334 (1995);Steinberg, I. Ann. Rev. Biochem., 40: 83- 114 (1971);Stryer, L. Ann. Rev. Biochem. 47: 819-846 (1978); Wang y otros, Tetrahedron Letters 31: 6493-6496 (1990); y Wang y otros, Anal. Chem. 67: 1197-1203 (1995).

Los siguientes son ejemplos de fluoróforos que pueden usarse como marcadores:

ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'disulfónico

acridina

isotiocianato de acridina

Ácido 5-(2'-ammoetil)amonaftaleno-1-sulfónico (EDANS)

4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato N-(4-anilino-1-naftil)maleimida

antranilamida

BODIPY

Amarillo Brillante

cumarina

7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120)

7-amino-4-trifluorometilcumarina (Cumarán 151)

colorantes de cianina

cianosina

4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI)

5', 5"-dibromopirogalol-sulfonaftaleína (Bromopirogalol Rojo)

7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina dietilentriamina pentaacetato

ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfónico

ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico

cloruro de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, dansilcloruro) ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL)

4- dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC)

eosina

isotiocianato de eosina

eritrosina B

isotiocianato de eritrosina

etidio

5- carboxifluoresceína (FAM)

5- (4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF)

2',7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE) fluoresceína

isotiocianato de fluoresceína

fluorescamina

IR144

IR1446

Verde malaquita isotiocianato

4-metilumbeliferona

orto cresolftaleína

nitro tirosina

pararrosanilina

Rojo de fenol

ficoeritrina (que incluye pero no se limita a los tipos B y R)

o-ftaldialdehído

pireno

butirato de pireno

butirato de succinimidil 1-pireno

puntos quántum

Rojo reactivo 4 (Cibacron □ Rojo brillante 3B-A)

6- carboxi-X-rodamina (ROX)

6-carboxirodamina (R6G)

cloruro de lisamina rodamina B sulfonilo rodamina

rodamina B

rodamina 123

isotiocianato de rodamina X

sulforrodamina B

sulforrodamina 101

derivado sulfonil cloruro de sulforrodamina 101 (Texas Rojo)

N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA)

tetrametil rodamina

isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC)

riboflavina

ácido rosólico

derivados de quelatos de lantánidos

Un grupo destacado de los fluoróforos para los inmunoensayos son la fluoresceína, el isotiocianato de fluoresceína, la ficoeritrina, la rodamina B y el rojo Texas (derivado de cloruro de sulfonilo de la sulforrodamina 101). La ficoeritrina es particularmente prominente. De este modo, en una realización, la porción de unión marcada es la estreptavidina conjugada con la ficoeritrina (PE). Cualquiera de los fluoróforos de la lista que precede a este párrafo puede unirse a los miembros de unión mediante el enlace covalente convencional, mediante el uso de los grupos funcionales apropiados en los fluoróforos y en las porciones de unión. El reconocimiento de tales grupos y las reacciones para formar los enlaces serán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica.

Otros marcadores que pueden usarse en lugar de los fluoróforos son los marcadores radiactivos y los marcadores enzimáticos. Estos del mismo modo se conocen en la técnica.

Después de que los soportes sólidos se incuban con el miembro de unión marcado, los soportes sólidos se recuperan mediante el uso de los procedimientos de recuperación descritos anteriormente y se detecta la cantidad del marcador que está unido a los soportes. En algunas realizaciones, la etapa de detección se logra midiendo la cantidad de la señal de la fluorescencia producida por los marcadores fluorescentes descritos anteriormente.

En algunas realizaciones, la señal de la fluorescencia se detecta mediante citometría de flujo. La citometría de flujo se usa para la clasificación del tamaño de las perlas (dispersión frontal/lateral) con un sistema de láser dual para clasificar las regiones teñidas con las perlas y luego cuantificar la señal fluorescente de cada región. Los expertos en la técnica conocen otros procedimientos múltiples para la identificación de las poblaciones en la fase sólida y la señal de la población asociada. Los ejemplos incluyen la tecnología Luminex Magpix® que usa la inmovilización del flujo de las perlas seguida de la identificación y la cuantificación mediante el uso de las imágenes LED-CCD (ver en internet en www.luminexcorp.com/Products/Instruments/MAGPIX/). Otro ejemplo es la tecnología múltiple Ilumina Veracode™ que usa microperlas de vidrio cilíndricas que tienen códigos de alta densidad como la fase sólida y un procedimiento de detección de placa de ranura (ver en internet en www.illumina.com/systems/beadxpress/technology.ilmn). Otros ejemplos de tecnología múltiple incluyen los ensayos en base a chips como los ensayos Randox BioChip Array Technology (ver en internet en www.randox.com/Biochip%20Immunoassays.php).

En algunas realizaciones, la señal fluorescente se genera mediante el uso de los reactivos quelantes de lantánidos y se detecta mediante el uso de la fluorescencia resuelta en el tiempo. Los quelatos de lantánidos son únicos en el sentido de que sus desintegraciones de fluorescencia exhiben una vida útil más prolongada y mayores "cambios de Stoke". El uso de los quelatos de lantánidos permite una mayor sensibilidad para la detección de los analitos del inmunoensayo. Los quelatos pueden sintetizarse de forma personalizada y enlazarse con las proteínas y anticuerpos mediante las técnicas de conjugación química análogas para los fluoróforos convencionales como la fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y otros. El metal asociado con el quelato que se usa con mayor frecuencia es el europio. Un sistema comercial en base a esta tecnología es el DELFIA® (inmunoensayo fluorescente de lantánidos mejorados por disociación), el sistema de ensayo TRF (fluorescencia resuelta en el tiempo) (Perkin Elmer, Waltham. MA).

En algunas realizaciones, la cantidad del marcador detectado se correlaciona con los parámetros de diferenciación descritos en la presente memoria para obtener valores que son individualmente representativos de los niveles de los analitos en la muestra biológica. En algunas realizaciones, los valores representativos de los niveles de los analitos se normalizan a los valores representativos de los niveles del factor de normalización. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los valores se normalizan dividiendo el valor representativo del nivel del analito por el valor representativo del nivel del factor de normalización (por ejemplo, la relación de la señal del analito/señal del FXIII humano) y se multiplica el resultado por una constante para producir un valor normalizado. El valor normalizado (denominado además señal normalizada) puede usarse para corregir las variaciones en el procesamiento de la muestra y los efectos de la matriz biológica durante la ejecución del procedimiento. En algunas realizaciones, los valores normalizados reducen significativamente el coeficiente de variación (porcentaje de desviación estándar relativa) entre diferentes ensayos replicados mediante el uso de la misma muestra biológica.

La normalización de la señal proporciona una precisión del ensayo mejorada para las muestras, los controles y los calibradores usados en los procedimientos. La normalización de la señal proporciona además una estabilidad de la señal mejorada durante la vida útil de los reactivos usados en los procedimientos. Se entenderá que el factor de normalización puede usarse además para normalizar los valores en los ensayos para detectar otras afecciones biológicas en un individuo, como las infecciones virales además del VIH, y/u otras afecciones patológicas, como las enfermedades agudas o crónicas.

II. Grupos funcionales

El recubrimiento de la superficie de la partícula con el reactivo del ensayo apropiado puede lograrse mediante la atracción electrostática, interacción de afinidad específica, interacción hidrófoba o la unión covalente. El polímero puede derivatizarse con los grupos funcionales para la unión covalente de los reactivos del ensayo por medios convencionales, particularmente, mediante el uso de los monómeros que contienen los grupos funcionales, sirviendo tales monómeros como monómero único o como comonómero. Ejemplos de grupos funcionales adecuados son los grupos amina (-NH²), grupos amonio (-NH³+ o -NR³+), grupos hidroxilo (-OH), grupos ácido carboxílico (-COOH) y los grupos isocianato (-NCO). Los monómeros útiles para introducir los grupos de ácido carboxílico en poliolefinas, por ejemplo, son el ácido acrílico y el ácido metacrílico.

Los grupos de enlace pueden usarse como un medio para aumentar la densidad de los grupos reactivos en la superficie de la partícula y además como un medio para disminuir el impedimento estérico. Los grupos de enlace pueden usarse además como un medio para asegurar los materiales de revestimiento a las superficies de las partículas. Ciertos grupos de enlace son los enlazadores monofuncionales que comprenden un grupo reactivo así como reticulantes multifuncionales que comprenden dos o más grupos reactivos capaces de formar un enlace con dos o más objetivos funcionales diferentes (por ejemplo, los péptidos, proteínas, macromoléculas, nanocristales semiconductores o el sustrato). En algunas realizaciones, los reticulantes multifuncionales son reticulantes heterobifuncionales que comprenden dos grupos de reactivos diferentes. Ejemplos de los grupos reactivos adecuados son el tiol (-SH), carboxilato (-COOR), carboxilo (-COOH), carbonilo (-C(^o )-), amina (NH²), hidroxilo (-OH), aldehído (-CHO), hidroxilo (­ OH), hidrógeno activo, éster, fosfato (-PO³) y las porciones fotorreactivas. Ejemplos de los grupos reactivos con la amina son los isotiocianatos, isocianatos, acilazidas, ésteres NHS, cloruros de sulfonilo, aldehídos y glioxales, epóxidos y oxiranos, carbonatos, agentes arilantes, imidoésteres, carbodiimidas y los anhídridos. Ejemplos de los grupos reactivos con el tiol son los derivados del haloacetilo y haluro de alquilo, maleimidas, aziridinas, derivados del acriloilo, agentes arilantes y los reactivos de intercambio del tiol-disulfuros. Ejemplos de los grupos reactivos del carboxilato son los diazoalcanos y compuestos de diazoacetilo, tales como los carbonildiimidazoles y las carbodiimidas. Ejemplos de los grupos reactivos con el hidroxilo son los epóxidos y los oxiranos, carbonildiimidazol, oxidación con el peryodato, carbonato de N, N'-disuccinimidilo o cloroformiato de N-hidroxilsuccimidilo, oxidación enzimática, halógenos de alquilo e isocianatos. Ejemplos de los grupos reactivos con los aldehídos y cetonas son los derivados de la hidrazina para la formación de bases de Schiff o la aminación por reducción. Ejemplos de los grupos reactivos con el hidrógeno activo son los derivados del diazonio para las reacciones de condensación y yodación de Mannich. Ejemplos de los grupos fotorreactivos son el aril azidas y aril azidas halogenadas, benzofenonas, compuestos diazo y derivados de la diazirina. Otros grupos reactivos y las clases de reacciones útiles en la práctica de la presente invención son generalmente aquellos bien conocidos en la técnica de la química de los bioconjugados. Actualmente las clases de reacciones favorecidas disponibles con los reactivos quelatos son aquellas que proceden bajo condiciones relativamente suaves. Estas incluyen las sustituciones nucleofílicas (por ejemplo, las reacciones de las aminas y los alcoholes con acil haluros, ésteres activos), las sustituciones electrofílicas (por ejemplo, las reacciones de la enamina) y las adiciones a los enlaces múltiples carbono-carbono y carbono-heteroátomo (por ejemplo, la reacción de Michael, la adición de Diels-Alder). Estas y otras reacciones útiles se discuten en, por ejemplo, March, Advanced Organic Chemistry, 3ra Ed., John Wiley & Sons, Nueva York, 1985; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; y Feeney y otros, Modification Of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982. En algunas realizaciones, el grupo funcional es un reticulante heterobifuncional que comprende dos grupos reactivos diferentes que contienen los anillos heterocíclicos que pueden interactuar con los péptidos y las proteínas. Por ejemplo, los reticulantes heterobifuncionales como el éster de N-[Y-maleimidobutiriloxi] succinimida (GMBS) o el 4-[N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato de succinimidilo (SMCC) comprenden un grupo reactivo con la amina y un grupo reactivo con el tiol que pueden interactuar con los grupos amino y tiol dentro de los péptidos o las proteínas. Las combinaciones adicionales de los grupos reactivos adecuados para los reticulantes heterobifuncionales incluyen, por ejemplo, los grupos reactivos carbonilo y sulfhídrilo; grupos amina y fotorreactivos; grupos sulfhídrilo y fotorreactivos; grupos carbonilo y fotorreactivos; grupos carboxilato y fotorreactivos; y arginina y grupos fotorreactivos. Ejemplos de grupos de enlace útiles adecuados son la polilisina, ácido poliaspártico, ácido poliglutámico y la poliarginina. Pueden usarse la N-hidroxisuccinimida (NHS), CMC 1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimida (CMC), N-hidroxibenzotriazol (HOBt) y/u otros agentes reticulantes.

Las partículas formadas por las técnicas de polimerización en emulsión convencionales a partir de una amplia variedad de monómeros de partida son favorables en muchos casos ya que exhiben como máximo un bajo nivel de autofluorescencia. Por el contrario, las partículas que se han modificado para aumentar su porosidad y, por tanto, su superficie, es decir, aquellas partículas a las que se hace referencia en la bibliografía como partículas "macroporosas", tienden a exhibir una alta autofluorescencia y, a menudo, son menos deseables. La autofluorescencia aumenta al aumentar el tamaño y las cantidades del monómero de divinilbenceno.

El análisis múltiple, es decir, la realización de los ensayos simultáneos para todos los analitos en un panel dado, puede realizarse con el uso de los soportes sólidos mediante la utilización de los parámetros de diferenciación, como se mencionó anteriormente y se describe a continuación.

MI. Parámetros de diferenciación

Un ejemplo de los parámetros de diferenciación es el diámetro de la partícula, donde los soportes sólidos son las partículas divididas en grupos con subintervalos de diámetro que no se superponen. Los anchos de los subintervalos de diámetro y el espaciado entre los diámetros medios de los subintervalos adyacentes en estas realizaciones se seleccionan para permitir la diferenciación de los subintervalos mediante la citometría de flujo, y tal selección será fácilmente evidente para los expertos en el uso y la instrumentación de la citometría de flujo. En esta memoria descriptiva, el término "diámetro medio" se refiere a un diámetro medio numérico. En algunas realizaciones, el ancho del subintervalo es ± 5 % CV o menos del diámetro medio, donde "CV" significa "coeficiente de variación" y se define como la desviación estándar del diámetro de la partícula dividida por el diámetro medio de la partícula, multiplicado por el 100 por ciento. El espacio mínimo entre los diámetros medios entre los diversos subintervalos puede variar en función de la distribución del tamaño de las micropartículas, la facilidad de segregar las micropartículas por tamaño con el propósito de unir diferentes reactivos de ensayo y el tipo y la sensibilidad del equipo de citometría de flujo. En algunas realizaciones, se obtendrán mejores resultados cuando los diámetros medios de los diferentes subintervalos estén separados por al menos un 6 % del diámetro medio de uno de los subintervalos, por ejemplo, al menos el 8 % del diámetro medio de uno de los subintervalos, por ejemplo, al menos el 10 % del diámetro medio de uno de los subintervalos. En algunas realizaciones, la desviación estándar de los diámetros de las partículas dentro de cada subintervalo es menos de un tercio de la separación de los diámetros medios de los subintervalos adyacentes.

Otro ejemplo de un parámetro de diferenciación que puede usarse para distinguir entre los diferentes grupos de las partículas es la fluorescencia. La diferenciación por fluorescencia se logra incorporando uno o más materiales fluorescentes en las partículas, teniendo los materiales fluorescentes diferentes espectros de emisión fluorescente y siendo distinguibles sobre esta base. La diferenciación puede lograrse mediante el uso de los materiales fluorescentes que tengan diferentes intensidades de fluorescencia o que emitan fluorescencia a diferentes longitudes de onda, o variando la cantidad del material fluorescente incorporado. La diferenciación por fluoróforos puede lograrse además mediante el uso de las combinaciones de los fluoróforos para cada subgrupo de partículas. Por ejemplo, puede hacerse que la partícula contenga un fluorocromo rojo como el Cy5 junto con un fluorocromo rojo lejano como Cy5.5, en diferentes cantidades relativas para los diferentes subgrupos. Pueden usarse fluorocromos adicionales para expandir aún más el sistema. De este modo, cada micropartícula puede contener una pluralidad de colorantes fluorescentes en longitudes de onda variables.

Mediante el uso de las emisiones de fluorescencia en diferentes longitudes de onda, la diferencia de la longitud de onda puede usarse para distinguir los grupos de las partículas entre sí, al mismo tiempo que se distinguen los marcadores en los anticuerpos antihumanos marcados de los marcadores que diferencian un grupo de partículas de otro. Un ejemplo de una sustancia fluorescente que puede usarse como medio para distinguir los grupos de las partículas es la fluoresceína y un ejemplo de una sustancia que puede usarse para la detección del ensayo es la ficoeritrina. En el uso de este ejemplo, pueden teñirse los diferentes grupos de partículas con diferentes concentraciones de fluoresceína para distinguirlos entre sí, mientras que se usa la ficoeritrina como marca en los diversos miembros de unión marcados usados en el ensayo.

Otro ejemplo de un parámetro de diferenciación que puede usarse para distinguir entre los diferentes grupos de las partículas es la dispersión de la luz. La dispersión de la luz del ángulo lateral varía con el tamaño de las partículas, la granularidad, la absorbancia y la rugosidad de la superficie, mientras que la dispersión de la luz del ángulo de avance se ve afectada principalmente por el tamaño y el índice de refracción. Variar cualquiera de estas cualidades puede resultar en diferencias de la dispersión de la luz que pueden servir como un medio para distinguir los diversos grupos.

Otro ejemplo más de un parámetro de diferenciación es la absorbancia. Cuando se aplica luz a las partículas, la absorbancia de la luz por las partículas se indica principalmente por un cambio en la intensidad de la luz dispersada lateralmente (ángulo lateral), mientras que la intensidad de la luz dispersada hacia adelante no se ve relativamente afectada. Por consiguiente, la diferencia de la absorbancia entre varios tintes de colores asociados con las partículas se determina observando las diferencias en la intensidad de la luz dispersada lateralmente.

Otro ejemplo adicional de un parámetro de diferenciación es el número de las partículas en cada grupo. Cuando el número de las partículas en cada grupo se varía de una manera conocida, el recuento de las partículas que tienen varias respuestas de ensayo puede asociarse con un ensayo particular por el número de las partículas que tienen cada respuesta.

Como ilustran los ejemplos anteriores, puede usarse una amplia gama de parámetros o características como los parámetros de diferenciación para distinguir las partículas de un grupo de las de otro. Los parámetros de diferenciación pueden surgir del tamaño de la partícula, de la composición de las partículas, de las características físicas de las partículas que afectan la dispersión de la luz, de los colorantes fluorescentes excitables o tintes coloreados que imparten diferentes espectros de emisión y/o características de la dispersión a las partículas, o de diferentes concentraciones de uno o más colorantes fluorescentes. Cuando el parámetro de la partícula distinguible es un colorante o color fluorescente, puede recubrirse sobre la superficie de la partícula, incrustarse en la partícula o unirse a las moléculas del material de la partícula. De este modo, pueden fabricarse partículas fluorescentes combinando el material polimérico con el colorante fluorescente, o impregnando la partícula con el colorante. Las partículas con colorantes ya incorporados y de ese modo, adecuadas para su uso en la presente invención están disponibles comercialmente, de los proveedores tales como Spherotech, Inc. (Libertyville, Illinois, EE. UU.) y Molecular Probes, Inc. (Eugene, Oregon, EE. UU.).

Cuando se usan partículas, particularmente micropartículas, el uso de la citometría de flujo es una forma conveniente de clasificar las partículas por el parámetro de diferenciación, y en muchos casos además, de determinar si se ha adherido un marcador a la partícula a través de los componentes del ensayo como resultado de la reacción del ensayo.

Los procedimientos y la instrumentación para la citometría de flujo son conocidos en la técnica y pueden usarse en la práctica de la presente invención. La citometría de flujo en general reside en el paso de una suspensión de partículas (o células) como una corriente a través de un haz de luz y acoplada a sensores electro-ópticos, de tal manera que solo una partícula a la vez pasa por la región de los sensores. A medida que cada partícula pasa por esta región, el haz de luz se ve perturbado por la presencia de la partícula y se detecta la luz resultante dispersada y fluorescente. Las señales ópticas son usadas por la instrumentación para identificar el subgrupo al que pertenece cada partícula, junto con la presencia y cantidad de marcador, de modo que se obtengan los resultados del ensayo individuales. Las descripciones de la instrumentación y los procedimientos para la citometría de flujo se encuentran en la literatura. Ejemplos son "Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes," Methods in Cell Biology 42, Parte B (Academic Press, 1994); McHugh y otros, "Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays Using Flow Cytometry Instrumentaron," Clinical Flow Cytometry, Bauer, K.D., y otros, editores. (Baltimore, Maryland, EE. UU.: Williams y Williams, 1993), páginas. 535-544; Lindmo y otros, "Immunometric Assay Using Mixtures of Two Particle Types of Different Affinity," J. Immunol. Meth. 126: 183-189 (1990); McHugh, "Flow Cytometry and the Application of Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays," Immunochemica 5: 116 (1991); Horan y otros., "Fluid Phase Particle Fluorescence Analysis: Rheumatoid Factor Specificity Evaluated by Laser Flow Cytophotometry," Immunoassays in the Clinical Laboratory, 185-189 (Liss 1979); Wilson y otros, "A New Microsphere-Based Immunofluorescence Assay Using Flow Cytometry," J. Immunol. Meth. 107: 225-230 (1988); Fulwyler y otros, "Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes," Meth. Cell Biol. 33: 613-629 (1990); Coulter Electronics Inc., United Kingdom Patente núm. 1,561,042 (publicada el 13 de febrero, 1980); y Steinkamp y otros, Review of Scientific Instruments 44(9): 1301-1310 (1973).

Los procedimientos de la presente invención, y los kits de la presente invención que contienen los materiales para su uso en la práctica de los procedimientos, permiten la detección simultánea y opcionalmente la cuantificación de los diversos analitos en una muestra biológica. La presencia de estos analitos o panel de analitos puede ser una indicación de la presencia, ausencia o etapa de una condición biológica en el individuo del que se tomó la muestra. En algunas realizaciones, la detección y/o cuantificación de algunos o todos los diversos analitos en una muestra se usa para proporcionar un pronóstico o para evaluar la eficacia de un tratamiento farmacéutico (por ejemplo, un fármaco antiviral). El diagnóstico, el pronóstico o la evaluación de la eficacia farmacéutica pueden lograrse, por ejemplo, correlacionando las cantidades de ciertos analitos en la muestra con cantidades conocidas asociadas con los individuos sanos, enfermos o ambos. En algunas realizaciones, el diagnóstico o pronóstico puede usarse para recomendar un curso de tratamiento para el individuo.

En otra realización, el factor de normalización puede usarse para normalizar los valores de la señal a medida que los reactivos del ensayo se degradan con el tiempo. Por ejemplo, la señal SNB (como la señal del ensayo) es sensible a las concentraciones tanto del conjugado biotinilado como del reactivo estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE). A medida que estos reactivos se degradan durante el almacenamiento o bajo temperatura elevada asociada con el estrés del envío, típicamente se observa una pérdida de la señal tanto para el SNB como para la perla de ensayo. El uso de la normalización de la SNB mantiene la estabilidad de la respuesta del ensayo a pesar de la pérdida absoluta de la señal del ensayo. Esto tiene ventajas para la sensibilidad del ensayo relacionadas con la pendiente de la curva de calibración.

Ejemplos

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra que una perla del hFXIII incluida en un ensayo de detección del VIH puede usarse para detectar las variaciones inesperadas e inaceptables en la señal del ensayo.

Procedimientos:

Todas las incubaciones se realizan a 37 °C. Se incuban 25 pL de reactivo de perlas que contiene las perlas para la detección de los analitos del VIH, hFXIII, SVB e ISB, y 25 pL de la muestra durante 28,5 minutos, después se lavan. Se añaden 50 pL del reactivo conjugado 1 que contiene los conjugados biotinilados a las perlas, se incubaron durante 10 minutos, después se lavan. Se añaden 25 pL de conjugado 2 que contiene SA-PE concentrado y 25 pL del líquido de lavado a las perlas y se incubaron durante 10 minutos. Después del lavado, las perlas se resuspenden en 50 pL de líquido de lavado y se envían al detector. Las perlas se encuentran en un tampón que contiene trietanolamina y CHAPS (ácido 3[(3-cholamidopropil)dimetilamonio]-propanosulfónico), estabilizadores de proteínas, bloqueadores y conservantes. El conjugado 1 y el conjugado 2 están en tampón fosfato con NaCI, estabilizadores de proteínas, bloqueadores y conservantes. Todos los tampones tienen un pH de 7-7,4. La concentración inicial de la estreptavidina-PE fue de 4-8 pg/mL en el reactivo. Durante el procesamiento del recipiente de reacción, se mezclaron 25 pL del reactivo estreptavidina-PE con 25 pL del diluyente para una concentración de trabajo final de 2-4 pg/mL.

Se incubaron las muestras biológicas que contenían al antígeno del VIH (antígeno p24) con las perlas magnéticas acopladas covalentemente a los anticuerpos anti-p24 y con las perlas magnéticas acopladas covalentemente al hFXIII (a las que se hace referencia en la presente memoria como una perla del hFXIII o la perla de normalización de la señal (SNB)). Después de la etapa de incubación, las perlas se separaron de la muestra, se lavaron y se incubaron con los anticuerpos biotinilados que se unen específicamente al antígeno p24 y al hFXIII (anti-FXIII-biotina humana de ratón). La concentración del anticuerpo anti-p24 conjugado con la biotina fue de 5,0 pg/mL. La concentración del anticuerpo antip24 conjugado con biotina fue de 1,5 pg/mL. Se eliminó el exceso del conjugado mediante lavado y se añadió a las perlas el conjugado de estreptavidina-PE. Después de la incubación con la estreptavidina-PE, se lavaron las perlas y se detectó la cantidad de la señal fluorescente. Se realizaron doce (12) réplicas del ensayo.

Como se muestra en la Figura 1, la cantidad de la señal del antígeno del VIH y la cantidad de la señal del hFXIII se correlacionaron positivamente para cada réplica. Además, la señal normalizada (señal del antígeno/señal del hFXIII multiplicada por 150) mostró mucha menos variabilidad que la señal del antígeno entre las repeticiones. Como se muestra en la Tabla 2, el coeficiente de variación (porcentaje de desviación estándar relativa, % de CV) fue mucho menor mediante el uso de la señal normalizada que la señal del antígeno o la señal del hFXIII. Además, la señal del hFXIII puede usarse para detectar un resultado de ensayo no válido, como cuando la señal del hFXIII cae por debajo de un límite preestablecido (por ejemplo, una señal para el hFXIII por debajo de 250).

Tabla 2. Análisis de 12 réplicas de la muestra positiva del antígeno

Este ejemplo demuestra que el uso de una perla del hFXIII para normalizar los valores del analito produjo una precisión del ensayo mejorada. Este ejemplo demuestra además, que la perla de normalización de la señal del hFXIII puede usarse como una perla de control para detectar un ensayo no válido.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra que el uso de una perla del hFXIII mejora significativamente el CV de la señal normalizada cuando se realizan réplicas de una muestra de control múltiple.

Una muestra de control múltiple que contiene anticuerpos policlonales humanos para VIH-1 y VIH-2, así como los anticuerpos monoclonales de conejo que representan al VIH-O, se incubó con las perlas magnéticas acopladas covalentemente a los antígenos que se unen específicamente a los anticuerpos (perlas de analito objetivo). La perla de detección del VIH-1 se ligó al GP-160. La perla de detección del VIH-2 se ligó al SPOH. La perla de detección del VIH-O se ligó al AFR. La muestra del control se incubó además con las perlas del hFXIII. La muestra se procesó como se describe en el Ejemplo 1. Se realizaron cinco (5) réplicas del ensayo.

Como se muestra en la Figura 2, la señal del control del VIH-1 se correlacionó positivamente con la señal del hFXIII en cada réplica. La señal normalizada mostró mucha menos variación entre las réplicas. Como se muestra en la Tabla 3, el % de CV de la señal normalizada fue significativamente menor que el % de CV de la señal del VIH-1 o la señal del hFXIII.

Tabla 3. Análisis de cinco réplicas de la muestra del control positivo de los anticuerpos contra VIH-1.

Del mismo modo, la Figura 3 muestra que la señal del control del VIH-2 se correlacionó positivamente con la señal del hFXIII en cada réplica. La señal normalizada mostró mucha menos variación entre las réplicas. La Tabla 4 muestra que el % de CV de la señal normalizada fue significativamente menor que el % de CV de la señal del VIH-2 o la señal del hFXIII.

Tabla 4. Análisis de cinco réplicas de la muestra del control positivo de los anticuerpos contra VIH-2.

Se obtuvieron resultados similares con la muestra de control del VIH-O. La Figura 4 muestra que la señal del control del VIH-O se correlacionó positivamente con la señal del hFXIII en cada réplica. La señal normalizada mostró mucha menos variación entre las réplicas. La Tabla 5 muestra que el % de CV de la señal normalizada fue significativamente menor que el % de CV de la señal del VIH-O o la señal del hFXIII.

Tabla 5. Análisis de cinco réplicas de la muestra del control positivo de los anticuerpos del VIH-O.

Ejemplo 3

Este ejemplo describe los factores que influyen en la señal fluorescente final generada en las perlas.

Durante el desarrollo de los ensayos anteriores, se observó que el análisis repetido de las muestras tales como calibradores, controles o las muestras de los pacientes (suero o plasma) podría producir ocasionalmente señales fluorescentes variables en las perlas del ensayo dando como resultado altos coeficientes de variación. En algunos casos, la variación puede llegar al 50 % o más y fue suficiente para producir una respuesta clasificada como positiva para algunas repeticiones pero negativa para otras.

Numerosos factores asociados con la química del ensayo, así como el procesamiento manual o automatizado de la muestra, son responsables de la magnitud de la señal fluorescente final generada en las perlas. Algunas fuentes de fluctuación de la señal entre las réplicas pueden estar relacionadas con las variaciones del ensayo enumeradas en la Tabla 6.

Tabla 6. Factores que introducen fluctuaciones de la señal entre las réplicas.

Etapa 2 variaciones de conjugado-perlas

• Concentración del conjugado de biotina

• Volumen del conjugado de biotina

• tiempo de incubación del conjugado-perlas

• eficiencia de mezcla del conjugado-perlas

• temperatura de incubación del conjugado-perlas

• eficiencia de lavado del conjugado-perlas para eliminar el conjugado en exceso después de la unión del conjugado a las perlas

• Volumen del reactivo de lavado residual después de las etapas de lavado del conjugado-perlas

Etapa 3 variaciones de PE-perlas

• volumen del suministro de PE

• tiempo de incubación del PE-perlas

• eficiencia de la mezcla del PE-perlas

• temperatura de incubación del PE-perlas

• eficiencia del lavado del PE-perlas para eliminar el PE en exceso después de la unión del analito a las perlas y antes de la detección

• tiempo desde la unión de la perla-PE hasta la detección de la fluorescencia

• Respuesta del detector (deriva) debido a la temperatura o el voltaje a lo largo del tiempo

Dado que hFXIII está acoplado covalentemente a las perlas, no responde a las variaciones en las etapas de unión del analito-perla descritas en la etapa 1. Sin embargo, responde al proceso final que se muestra en la etapa 1 (volumen del reactivo de lavado residual después de los pasos de lavado de la muestra-perlas), ya que esto afecta la concentración final del reactivo de la biotina añadido en la etapa 2. La perlas responde a otros procesos enumerados en las etapas 2 y 3.

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra que la normalización de los valores de la señal mediante el uso de la perla de normalización de la señal del hFXIII reduce la variación entre las réplicas en comparación con una perla estándar interna recubierta con tetrametilcadaverina rodamina (TMRC).

Dado que la respuesta del detector de la fluorescencia puede variar con el tiempo, algunos ensayos manuales o automatizados incluyen típicamente una perla estándar interna (ISB) recubierta con una cantidad fija de TMRC, produciendo de este modo, una cantidad estándar de señal. Las señales de ensayo pueden normalizarse a la señal ISB para compensar la variación del detector. Sin embargo, dado que la ISB no participa en el inmunoensayo, no responde a las variaciones del proceso potenciales descritas en la Tabla 6 aparte de la deriva del detector. Para una serie de réplicas, no se observó ninguna mejora en la precisión del ensayo al normalizar las señales al ISB como se muestra a continuación en la Tabla 7 para los datos del VIH-1 descritos anteriormente en el Ejemplo 2.

Tabla 7. Comparación de la señal normalizada mediante el uso de una ISB y SNB de hFXIII.

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra que la variación de la señal se ve afectada por el conjugado de biotina residual en el recipiente de la reacción antes de la adición de la estreptavidina-PE.

Los inventores observaron que si el conjugado de biotina no se elimina eficazmente durante la fase de lavado de la etapa 2 en la Tabla 6 (por ejemplo, debido a los errores de lavado-aspiración del instrumento), la señal se reduce significativamente debido a la interacción del conjugado de biotina acuosa residual con el PE. El resultado es una reducción eficaz de la concentración del PE. Este tipo de error se modela a continuación para la detección de los anticuerpos del VIH-O en el calibrador de los anticuerpos:

Se crearon cuatro procedimientos de prueba (marcados como VIH, VIH2, VIH3, VIH4 en el eje X) en los que se dejaron deliberadamente varias cantidades del conjugado de la biotina en el recipiente de reacción (RV) antes de la adición del indicador fluorescente (PE). La Figura 5 muestra la respuesta de la señal para los procedimientos de prueba.

El VIH representa el procedimiento estándar con un protocolo de lavado de RV completo (se muestran 8 réplicas). El VIH-2 y el VIH-3 muestran la pérdida completa de la señal cuando se añaden intencionadamente al RV 10 uL o 5 uL, respectivamente, de conjugado de la biotina residual antes de la adición del reactivo PE. El VIH-4 muestra el efecto de un lavado incompleto deficiente del RV antes de la adición del reactivo PE. La señal ISB permaneció constante (datos no mostrados).

En los experimentos separados que exploraron el uso de una perla de patrón interno alternativo acoplada directamente con la biotina, se encontró que si la perla de la biotina se agregaba en la cantidad suficiente (es decir, la biotina en fase sólida), las señales del ensayo también disminuirían. El ISB no detecta esta caída en las señales del ensayo, pero como parece ser un efecto sobre la concentración de PE libre, el SNB sigue la señal del ensayo produciendo una buena precisión.

Del mismo modo, si el volumen de suministro del conjugado de la biotina es menor de lo esperado debido a un error de pipeteo del instrumento, o si el volumen de lavado residual es mayor de lo esperado debido a un error de aspirado del lavado del instrumento, la concentración final del conjugado en la mezcla de reacción se reduce, lo que resulta en una señal de ensayo más baja y la señal del hFXIII más baja mientras que la señal del ISB permanece constante.

En sumario, este ejemplo demuestra que el SNB del hFXIII puede usarse para normalizar la señal del ensayo cuando el conjugado de la biotina residual permanece en el recipiente de la reacción antes de la adición de la estreptavidina marcada.

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra que los efectos de la matriz biológica pueden producir una recuperación variable de la señal del antígeno p24, y que esta variabilidad se reduce significativamente cuando se usa la perla del hFXIII para la normalización.

Un donante humano proporcionó muestras de sangre extraídas en 9 tipos diferentes de tubos de recolección. Los tubos de recolección de vidrio o plástico contenían varios anticoagulantes para la producción del suero o el plasma. El suero se obtuvo de los tubos sin anticoagulante. Algunos tubos contienen barreras de separador del suero (SST) o separador del plasma (PST) para la separación de las células del suero o del plasma. Los tipos de tubos se describen a continuación:

Cada matriz de suero o plasma se complementó con una concentración idéntica del antígeno p24 del VIH y se analizó con 5 réplicas por condición de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1.

En este ejemplo, se esperaba que todas las réplicas y los tipos de matriz de la muestra produjeran la misma respuesta para el Ag RFI. Sin embargo, como se muestra en la Tabla 8 y la Figura 6, hubo una variación sustancial entre los diferentes tipos de matrices. El % de CV de la señal del antígeno p24 para todas las réplicas y tipos de muestras fue del 10,1 %. A diferencia, cuando los datos se normalizaron mediante el uso del hFXIII, la variabilidad se redujo significativamente. Como se muestra en la Tabla 8 y la Figura 7, el % de CV para la respuesta normalizada (señal p24/señal hFXIII) se mejoró a 4,6 %.

Este ejemplo muestra que el uso del hFXIII para normalizar la señal redujo significativamente la variabilidad asociada con los diferentes efectos de la matriz.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un kit para corregir las variaciones en el procesamiento de muestras y/o efectos de la matriz biológica cuando se realizan ensayos biológicos, comprendiendo dicho kit un factor de normalización que no se une a un analito de la muestra biológica a ensayar y que se acopla a un soporte sólido, en el que el factor de normalización es hFXIII, y una pluralidad de soportes sólidos que tienen miembros de unión inmovilizados sobre ellos que se unen a uno o más analitos en la muestra.

2. El kit de la reivindicación 1, que comprende además un anticuerpo contra el Factor XIII humano inmovilizado sobre un soporte sólido.

3. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende además el TMRC inmovilizado sobre un soporte sólido.

4. El kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los soportes sólidos son perlas o perlas magnéticas.

5. El kit de la reivindicación 1, en el que la pluralidad de soportes sólidos se divide en subpoblaciones de soportes que son diferenciables entre sí por un parámetro de diferenciación que comprende una característica que es independiente de los miembros de unión inmovilizados sobre los soportes sólidos, los miembros de unión inmovilizados en cada subpoblación son capaces de unirse a un solo analito en la muestra.

6. El kit de la reivindicación 1, en el que el soporte sólido acoplado al factor de normalización es diferenciable de los soportes sólidos que tienen los miembros de unión inmovilizados sobre el mismo.

7. Una composición para corregir las variaciones en el procesamiento de muestras y/o efectos de la matriz biológica al realizar los ensayos biológicos, comprendiendo dicha composición una normalización que no une a un analito de la muestra biológica a ensayar y que se acopla a un soporte sólido, en el que el factor de normalización es hFXIII, y una pluralidad de soportes sólidos que tienen los miembros de unión inmovilizados en ellos que se unen a uno o más analitos en la muestra.

8. La composición de la reivindicación 7, dicha composición se proporciona

(i) para verificar el procesamiento correcto de muestras y para la normalización de la señal del ensayo, y/o (ii) para mejorar la precisión del ensayo para muestras biológicas, controles y calibradores, y mejorar la estabilidad de la señal durante la vida útil de los reactivos usados en el ensayo.

9. La composición de la reivindicación 7, que comprende además un anticuerpo contra el Factor XIII humano inmovilizado sobre un soporte sólido.

10. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende además el TMRC inmovilizado sobre un soporte sólido.

11. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en la que los soportes sólidos son perlas o perlas magnéticas.

12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en la que la pluralidad de soportes sólidos se divide en subpoblaciones de soportes que son diferenciables entre sí por un parámetro de diferenciación que comprende una característica que es independiente de los miembros de unión inmovilizados sobre los soportes sólidos, los miembros de unión inmovilizados en cada subpoblación son capaces de unirse a un solo analito en la muestra.

13. La composición de la reivindicación 7, en la que el soporte sólido acoplado al factor de normalización es diferenciable de los soportes sólidos que tienen los miembros de unión inmovilizados en los mismos.