DE2632478A1

DE2632478A1 - Verfahren zur erfassung und trennung von antigenen und antikoerperchen im blut und in anderen proben

Info

Publication number: DE2632478A1
Application number: DE19762632478
Authority: DE
Inventors: Mack J Fulwyler
Original assignee: Coulter Electronics Inc
Current assignee: Coulter Electronics Inc
Priority date: 1975-07-23
Filing date: 1976-07-19
Publication date: 1977-02-24
Also published as: JPS5215815A; NL7608052A; GB1561042A; FR2319131A1; SE7608307L; FR2319131B3

Description

Patentanwälte

DIpI.-Ing. E. Eder Dipl.-lng. K. Schieschke

8 München 40, Elisabethstraße34

Coulter Electronics, Inc., Hialeah, llorida/USA

Verfahren zur Erfassung und Trennung von Antigenen und Antikörperchen im Blut und in anderen

Proben

Das erfindungsgemäße Verfahren "bezieht sich auf die Ermittlung von Antigenen und Antikörperchen, die Krankheiten zuzuordnen sind und die im Blut und in anderen Proben ermittelt werden können.

Als Ursache oder im Gefolge verschiedener Krankheiten gelangen organische Antigene in den Körper und in den Blutkreislauf. Ein Antigen ist eine Protein- oder Kohlenhydrat sub stanz , die Teil eines Organismus sein kann, etwa eines Parasiten, eines Bakteriums oder eines Virusteilchens oder auch einer Droge oder eines anderen, nicht

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biologischen Stoffes, der, wenn er in den Körper gelangt, die Produktion von für diese Antigene spezifischen Antikörperchen anregt· Ein Antikörperchen ist ein Globulin, das sich besonders mit dem spezifischen Antigen kombiniert und zu dessen Neutralisation beiträgt. Das Globulin ist als Protein nicht in Wasser, wohl aber in Salzlösungen löslich.

Zur Erkennung verschiedener Krankheiten wird dem Patienten eine Probe einer Körperflüssigkeit entnommen, beispielsweise Blut, Riickenmarksflüssigkeit oder Gewebeproben. Die Probe wird auf das Vorhandensein von Antigenen oder Antikörperchen untersucht, von denen man weiß, daß sie nur bei bestimmten Krankheiten auftreten. Mit der Erfassung der Antigene oder Antikörperchen ist der Nachweis für eine akute oder erst überstandene Krankheit gegeben. Ferner kann eine quantitative Abschätzung der Antikörperchen oder Antigene erfolgen. Erfolgt diese Quantifizierung über mehrere Tage, so kann man erkennen, ob die Produktion der Antikörperchen oder Antigene konstant ist, was auf eine frühere Infektion oder einen stationären Zustand hindeutet. Nimmt die Produktion zu, so weist dies auf eine zunehmende Infektion hin oder darauf, daß eine begonnene Behandlung unwirksam ist. Geht die Produktion zurück, so ist dies ein Hinweis für die ebenfalls zurückgehende Infektion bzw. für die Wirksamkeit der Behandlung.

Zur Ermittlung von in Proben, beispielsweise in Blut enthaltenen Antigenen oder Antikörperchen wurden verschiedene Methoden entwickelt. Bei einer Methode nach der US-Patentschrift 3 088 875 vom 7. Mai 1963 werden kleine Plastikteilchen, sogenannte Mikrokügelchen, mit dem einer bestimmten Krankheit zuzuordnenden Antigen beschichtet. Diesen Mikrokügelchen wird die zu untersuchende Probe hinzugefügt. Wenn die Probe der speziellen Krankheit zugeordnete

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Antikörperchen enthält, so werden die Antikörperchen angezogen und haften an den mit dem Antigen beschichteten Mikrokügelchen. Dadurch haften auch die Mikrokügelchen aneinander, so daß eine sichtbare Aggregation der Teilchen entsteht. Durch diese Aggregation der Teilchen wird das Vorliegen dieser bestimmten Krankheit nachgewiesen·

Mit dieser Technik kann zwar effektiv gearbeitet werden, doch muß der Zeitpunkt der Teilchenaggregation subjektiv durch Beobachtung ermittelt werden· Eine schwache Reaktion kann auf diese Weise übersehen werden. Für Jede interessierende Krankheit muß der Test getrennt durchgeführt werden, so daß man für eine vollständige Analyse sehr viel Zeit benötigt. Kosten und Zeit sowie die subjektive Ermittlung könnten nur durch ein automatisches Verfahren verringert bzw. beseitigt werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren dient ein Fluoreszenzelement als gegen den Henschen gerichteter Antikörper bzw. als Antihuman-Antikörper.

In der US-Patentschrift 3 790 492 vom 5. Februar 1974 ist ein Verfahren beschrieben zur Herstellung von Mikrokügelchen mit gleichem Durchmesser. Die Patentschrift gibt außerdem ein Verfahren zur Herstellung gleicher Mikrokügelchen mit einem Durchmesser im Bereich, von 2 bis 40 Mikrometern an. Derart gleichmäßig geformte Mikrokügelchen mit diesem kleinen Durchmesser konnte man vorher nicht herst eilen«, Wie noch, ausführlicher erläutert wird, sind diese Kügelchen für das Verfahren von größter Bedeutung.

Nach einer Ausführungsform des Verfahrens arbeitet man mit einer Anzahl von Gruppen von Mikrokügelchen, wobei jede Gruppe Mikrokügelchen einer bestimmten Größe enthält.

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Beispielsweise kann man mit drei Gruppen gleichförmiger Mikroku.gelch.en arbeiten, wobei die erste Gruppe etwa 10.000 Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 4- bis 5 Mikrometern enthält, die zweite Gruppe 10.000 Mikrokügelchen mit einem Durchmesser von 7 ois 8 Mikrometern und die dritte Gruppe ebenfalls 10.000 Mikrokügelchen, aber mit einem Durchmesser von 10 bis 11 Mikrometern.

Jede Gruppe der Mikrokügelchen wird mit einem bestimmten, einer Krankheit zugeordneten Antigen beschichtet, beispielsweise nach dem Verfahren nach der US-Patentschrift 3 088 875. Beim üblichen Beschichtungsverfahren werden die Mikrokügelchen in einer alkalischen Pufferlösung mit dem Testantigen in Suspension gebracht. Die Suspension wird gelagert und nach einer bestimmten Zeit gewaschen, so daß überschüssige Lösung beseitigt wird und lediglich die beschichteten Mikrokügelchen zurückbleiben. Die genannte Patentschrift beschreibt die Beschichtung mit Cohn¹ Fraktion zur Erkennung der Antikörperchen von rheumatoider Arthritis. Ebenso können die Mikrokügelchen beschichtet werden mit Antigen von Histoplasma capsulatum für Histoplasmose oder mit Antigen für Coccidioides für Coccidioidomycose (San Joaquin Valley Fever), wobei die tatsächlichen Bedingungen, pH, Puffer, usw. von dem jeweils untersuchten System abhängen. Eine Probe des Blutes, des Serums oder eines anderen Stoffes, der auf das Vorhandensein der drei Krankheiten zu untersuchen ist, denen die Antigene auf den Mikrokügelchen zugeordnet sind, wird dann einer Mischung von diesen drei Gruppen von Mikrokügelchen zugesetzt. Gewöhnlich genügt ein einziger Tropfen des Stoffes. Beim Vorhandensein einer der drei Krankheiten findet man Antikörperchen auf die oben beschriebene Weise. Die Antikörperchen haften an dem zugehörigen Antigen, mit dem die Mikrokügelchen beschichtet sind. Wenn beispielsweise

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Mikrokügelchen der Größengruppe A mit Antigen A beschichtet sind, das der Krankheit A zugeordnet ist, so sind •Antikörperchen A im Blut vorhanden und haften an den Mikrokügelchen der Gruppe A, falls die Krankheit A vorliegt oder überstanden ist· Teilchen der Größengruppe B, beschichtet mit dem Antigen B, das der Krankheit B zugeordnet ist, haften an den Antikörperchen B, wenn diese im Blut vorhanden sind. Das gleiche gilt für Teilchen der Größengruppe C. Nachdem genügend Zeit verstrichen ist, damit die Antikörperchen der Probe sich an die Mikrokügelchen anlagern können, werden die Mikrokügelchen zur Beseitigung von überschüssiger Probe gewaschen. Dann wird zu den Mikrokügelchen eine Suspension von gegen den Menschen gerichteten Antikörperchen, beispielsweise Kaninchenantikörperchen, hinzugefügt. Die Suspension läßt sich gemäß der US-Patentschrift 3 088 875 präparieren. Die tatsächlichen Umstände, pH, Puffer, usw. hängen wieder von dem jeweils untersuchten System ab. Außerdem müssen die Kaninchenantikörper mit einem Farbstoff behandelt werden, beispielsweise mit ITuorescin Isothiocyanat gemäß M. Goldman in "Fluorescent Antibody Methods", Academic Press, 1968, wobei es beim Vorhandensein einer bestimmten Wellenlänge des Lichts zu Fluoreszenz kommt. Gegen den Menschen gerichtete Kaninchenantikörperchen besitzen Affinität zu sämtlichen menschlichen Antikörperchen und haften an jenen Mikrokügelchen, die menschliche Antikörperchen aus der Probe absorbiert haben.

Teilchenanalysegeräte mit mehreren Parametern sind beschrieben von Steinkamp u. a. in "Review of Scientific Instruments", Vol. 44, No. 9, Sept. 1973, Seiten 1301 bis 1310. In diesen Geräten fließen die Teilchen, beispielsweise die oben erwähnten Mikrokügelchen, in einer Suspension, beispielsweise einer Salzlösung, einzeln an mehreren

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elektrooptischen Sensoren vorbei_o Bestimmte Geräte lassen die Teilchen durch einen Teilchendetektor gemäß der US-Patentschrift 3 259 842 passieren. Bei diesem Teilchendetektor passieren die Teilchen eine mikroskopische Tastöffnung mit einem Durchmesser von ca, 100 Mikron. Jedes die Tastöffnung passierende Teilchen erzeugt ein Signal in Form eines Impulses, dessen Amplitude von der Größe oder dem Volumen des Teilchens abhängt. Die Teilchen passieren im Gerät nacheinander einen Laserstrahl, wobei an den Teilchen haftende Fluoreszenzfarbstoffe ein fluoreszierendes Licht abgeben_o Dieses fluoreszierende Licht wird von Photodetektoren erfaßt und als Signale einer Steuerschaltung zugeführt, die zur Identifizierung bei jedem Teilchen die Größe oder das Volumen, wie von der zugehörigen Impulsamplitude dargestellt, und das Fehlen oder Vorhandensein der Fluoreszenz zuordnet.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden nach geeigneter Inkubationszeit für die zugeführten, fluoreszierend markierten und gegen den Menschen gerichteten Antikörper die Mikrokügelchen in eine Suspension gebracht, beispielsweise eine Salzlösung, und durch das obengenannte Gerät geleitet. Das Gerät erfaßt Größe und Volumen jedes Mikrokügelchens beim Durchgang durch den Teilchendetektor. Falls das Teilchen fluoreszierende Antikörperchen absorbiert hat, fluoresziert es beim Durchgang durch den Laserstrahl. Die Fluoreszenz wird erfaßt und der Steuerschaltung zugeführt, wo das Fluoreszenzsignal mit der für dieses bestimmte Mikrokügelchen ermittelten Größe ins Verhältnis gesetzt wird. Beim Auftreten eines Fluoreszenzsignals wird die Steuerschaltung getriggert, wodurch das Vorhandensein dieser bestimmten Krankheit angezeigt wird, die den Antigenen und Antikörperchen zugeordnet ist, die an den Mikrokügelchen dieser bestimmten Größengruppe haften. Da gelegentlich

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Widersprüche aufgezeichnet werden können, wird das Gerät so gewählt, daß das Vorhandensein der Antigene oder Antikörperchen einer bestimmten Krankheit nur dann registriert wird, wenn eine vorgegebene Anzahl von Mikrokügelchen eines bestimmten Größenbereiches fluoreszierten bzw. den Laserstrahl passierten und die erfaßte Fluoreszenz mit der geweiligen Teilchengröße verglichen wurde. Vom Steuergerät werden auch erfaßte Antikörperchen oder Antigene angezeigt, die Teilchengrößen dieser Gruppe zugeordnet sind, wenn beim Durchgang durch den Laserstrahl mehr als eine Teilchengröße fluoresziert.

Das oben erwähnte Analysegerät mit mehreren Parametern kann auch mit einem Teilchensepariergerat gemäß der US-Patentschrift 3 380 584 vom 30. April 1968 kombiniert werden. Bei Kombination mit einem solchen Teilchensepariergerat können die Teilchen je nach Größengruppe getrennt und gesammelt werden, so daß man die haftenden Antikörperchen getrennt untersuchen und analysieren kann.

In bestimmten Fällen kann man das oben beschriebene Verfahren abändern. Anstelle eines Antigens kann auch ein einer bestimmten Krankheit zugeordneter Antikörper auf die Mikrokügelchen einer bestimmten Größengruppe geschichtet werden. Die zu untersuchende Probe wird dann den Gruppen von Mikrokügelchen zugeführt. Falls die Probe den speziellen, getesteten Krankheiten zugeordnete Antigene aufweist, so haften diese Antigene der Probe an den Antikörperchen, mit denen die verschiedenen Mikrokügelchen beschichtet sind. Nach einer bestimmten Zeit, in der sich die in der Probe enthaltenen Antigene an die mit den Antikörper chen beschichteten Mikrokügelchen anlagern, wird die Mischung der Mikrokügelchen zur Beseitigung von überschüssiger Probe gewaschen. Anschließend wird den Mikrokügelchen eine

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auf Fluoreszenz behandelte Reagenslösung zugesetzt· Das Reagens besitzt Affinität zu einem oder mehreren der Antigene der Probe, die auf den Mikrokügelchen haften, so daß das Reagens ebenfalls auf diesem Mikrokügelchen haftete 'Nach einer ausreichenden Inkubationszeit werden die Mikrokügelchen durch das Teilchenanalysegerät mit mehreren Parametern geleitete Das Gerät erfaßt die Fluoreszenz von Mikrokügelchen einer bestimmten Größengruppe und gibt dadurch das Vorliegen der bestimmten Krankheit an, so daß der Arzt in der Behandlung der Krankheit unterstützt wird.

Im folgenden Beispiel wird die Erfassung dreier bestimmter Antikörperehen in einer Blutprobe erläutert:

I· Präparierung von Reagentien zur Bedeckung von Mikrokügelchen

a) Zur Erfassung von rheumatoider Arthritis:

Labortests für rheumatoide Arthritis sind serologische Tests zur Erkennung eines antikörperähnlichen Agglutinationsfaktors, gewöhnlich rheumatischer Faktor (RF) genannt. Tests auf das Vorliegen von RF basieren auf der Reaktion mit Cohn^r Fraktion II.

Zur Präparierung des Reagensmittels zum Bedecken der Mikrokügelchen wird die Cohn¹ Fraktion II gelöst in einer Kochsalzlösung (0,16 M), die als Schutz.0,1-%iges Natriumazid enthält, so daß eine 10%ige Lösung entsteht. Die Lösung wird durch Filtration über ein Bakterien ausschließendes Mittel sterilisiert.

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"b) Zur Erkennung von Syphilis:

Labortests für Syphilis enthalten Tests für Antikörperchen von Treponema Pallidum, der für Syphilis verantwortlichen Spirochäte. Im Handel erhältlich für serologische •Tests zur Erfassung von Treponema Pallidum Antikörperchen ist lyophilisiertes Treponema Pallidum, das in einer Salzlösung (0,16 M) gelöst wird, die 0,1-%iges Natriumazid als Schutz enthält, so daß eine 10%ige Lösung entsteht.

c) Zur Erfassung von Bruzellose:

Bruzelloseorganismen führen zu Wechselfieber beim Menschen und werden meist durch Personen übertragen, die mit Kühen, Hindern oder Ziegen zu tun haben. Die Labortests für Bruzellose sind serologische Tests zur Erkennung von Antikörperchen, die durch Infektionen mit einem der drei spezifischen Bruzellaorganismen entstehen, Brucella abortus, Bruceila suis, oder Brucella melitensis. Das Reagens für den Bruzellosetest ist eine durch Formalin oder Erwärmung abgetötete Suspension von Brucella abortus.

II. Beschichtung der Mikrokügelchen

Es werden $ Größengruppen von Mikrokügelchen verwendet _o Der Durchmesser der Mikrokügelchen einer Gruppe beträgt 5 bzw. 8 bzw. 11 Mikrometer. Die Mikrokügelchen werden der Vorratslösung entnommen und zweimal mit Glycin oder Borat-Salzlösungspuffer von pH 8,2 gewaschen. Jede Gruppe wird getrennt behandelt und die abschließende Konzentration je-

10 der Gruppe im Puffer wird auf die Größenordnung von 10 Mikrokügelchen/10 ml eingestellt.

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Eine Mikrokügelchensuspension von 10 ml wird mit einem gleichen Volumen der drei obengenannten Beschichtungsreagentien "behandelt· Die Suspension mit dem zugesetzten Beschichtungsreagens wird während einer Stunde (± 1/2 Stunde) bei einer Temperatur von 41⁰C (_+ 16⁰C) inkubiert· Während der Inkubation wird gerührt· Die Teilchen werden dann durch Zentrifugieren abgetrennt und wieder zweimal gewaschen, mit der obengenannten, gleichen Vorratspufferlösung, damit überschüssiges BeSchichtungsreagens, das nicht an den Teilchen haftet, beseitigt wird· Zur Verringerung unerwünschter lluoreszenzerscheinungen, die später auftreten können, wenn die Mikrokügelchen den Teilchenanalysator passieren, wird den Mikrokügelchen eine iO%ige Rinderserumalbuminlösung zugesetzt und die Suspension wie oben inkubiert. Durch den Zusatz der Lösung werden nicht bedeckte Stellen auf den Mikrokügelchen gesperrt und außerdem der weitere Zusatz von Serumproteinen auf den Mikrokügelchen verhindert. Nach der Inkubation wird die Konzen-

10 tration der Mikrokügelchensuspension wieder auf ca. 10 Mikrokügelchen/ml eingestellt·

III, Zusatz von Testserum

Einer Aliquote von 10 cc beschichteten Mikrokügelchen, die die gleiche Anzahl von jeder Gruppe von beschichteten Mikrokügelchen enthält, wird 1 Tropfen (ca, 0,05 cc) des zu untersuchenden Serums hinzugefügt. Die Aliquote wird während 1 Minute durchwirbelt und dann zur Trennung der Mikrokügelchen geschleudert. Mach der Trennung werden die Mikrokügelchen zweimal mit einem Borst-oder Glycinsalzlösungspuffer wie oben gewaschen, wodurch überschüssige Antikörperchen oder Antigene in der Lösung beseitigt werden. Die Suspension wird dann wieder auf eine Konzentration

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10
von 10 Kugelchen/10 ml eingestellt·

Zusatz von fluoreszierend markiertem Globulin

1 ml von Kaninchen-Antihuman-Globulin, das wie oben erwähnt fluoreszierend behandelt ist, wird den 10 ml Suspension der Mikrokügelcheh zugesetzt. Die Kombination wird während 10 Minuten ( _+ 5 Minuten) bei Zimmertemperatur inkubiert, wobei ein Arbeitstiter von ca_o 1:400 eingehalten wird. Die Suspension wird zur Abtrennung der markierten Mikrokügelchen zentrifugiert. Die abgetrennten Mikrokügelchen werden zur Beseitigung von überschüssigem Fluoreszenz-Antihuman-Globulin zweimal mit Boratoder Glycinsalzlösungpuffer gewaschen.

V. Einführung in das Teilchenanalysegerät mit mehreren Parametern

Die durch den Verfahrensschritt IV gewonnene Mikrokügelchen- bzw. Teilchensuspension wird auf eine Konzentration von 5.1O⁶ Mikrol
gerät zugeführt,

von 5·10 Mikrokügelchen/5 ml eingestellt und dem Analyse-

Beim oben beschriebenen Verfahren ist es erforderlich, nach der Mikrokügelchengroße und der vorhandenen Fluoreszenz zu unterscheiden. Es kann jedoch auch eine Identifizierung der Teilchengröße erwünscht sein, ohne Fluoreszenz, wodurch das Fehlen einer Krankheit nachgewiesen wird. Bei einer Alternativmethode kann die Größe gleich sein und jede Teilchengruppe kann getrennt mit getrennten, im Analysegerät vorhandenen Photodetektoren gefärbt werden, zur Erfassung der Farbe der Mikrokügelchen. Nach

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einer weiteren Modifikation des Verfahrens werden die Mikrokiigelchen magnetisch codiert, wobei diese Codierung neben der Fluoreszenz erfaßt werden kann.

Patentanwälte Dipl.-ing. E. Eder Dipl.-Ing. K. Schisschke

8 Müncp.j.'. -.-, cüoa.-x, .iist;a6e34

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Claims

Patentanwälte DIpK-lng. E. E Dlpl.-lng. K. Schleechke - 13 - 2632478

Patentansprüche

Verfahren zur Untersuchung von Proben aus Blut oder Gewebe auf Krankheiten, wobei in der Probe von diesen Krankheiten abhängige Antikörperchen und Antigene vorhanden sind, dadurch gekennzeichnet,

a) daß jede Gruppe eine Anzahl unterscheidbarer Teilchengruppen mit verschiedenen, den jeweiligen Krankheiten entsprechenden Antigenen und Antikörpern beschichtet wird,

b) daß die zu untersuchende Probe diese?Anzahl von Gruppen beschichteter Teilchen zugeführt wird, wobei die Antikörper bzw. Antigene in der Probe an dem mit dem entsprechenden Antigen oder Antikörper beschichteten Teilchen haften,

c) daß die Teilchen mit einem Markierungselement versehen werden, das eine Affinität zu den haftenden Antigenen und Antikörpern besitzt, und

d) daß die Teilchen ein Erfassungsgerät passieren, in dem die Teilchen auf der Basis einer Kombination der Teilchengruppe und des Fehlens oder Vorhandenseins einer Markierung identifiziert werden.

Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jede Teilchengruppe eine andere Größe aufweist und daß die Identifizierung der Teilchen auf der Basis einer Kombination der Teilchengröße und des Fehlens oder Vorhandenseins einer Markierung erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn-

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zeichnet, daß als Markierelement ein Fluoreszenzelement vorgesehen ist, das mindestens eine Affinität zu den Antikörperchen oder den Antigenen besitzt, und daß die Identifizierung der Teilchen auf der Basis der Kombination der Teilchengruppe und des Fehlens oder Vorhandenseins einer Fluoreszenz erfolgt·

Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluoreszenzelement ein Antihuman-Antikörperchen ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluoreszenzelement ein Fluoreszenzreagens ist, das eine Affinität zu einem Antigen besitzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennung der Teilchen auf der Basis der Kombination der Teilchengruppe und des Fehlens oder Vorhandenseins einer Markierung erfolgt.

Patent

Dipl.-Ing. 8 München 40,

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