DE60222121T2

DE60222121T2 - Diagnose von metall-allergien durch zytokin-freigabe von t-zellen in vitro

Info

Publication number: DE60222121T2
Application number: DE60222121T
Authority: DE
Inventors: Eva Jakobson
Original assignee: Mabtech AB
Current assignee: Mabtech AB
Priority date: 2001-03-12
Filing date: 2002-03-12
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2022-03-13
Also published as: US8278054B2; CA2440733A1; WO2002073195A3; JP2004528546A; CA2440733C; EP1393070A2; DE60222121D1; US20040115744A1; AU2002302416B8; JP4272431B2; WO2002073195A2; EP1241476A1; AU2002302416B2; ATE371866T1; EP1393070B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Allergie, insbesondere einer Nickelallergie. Sie betrifft auch einen Kit, der zur Durchführung des Verfahrens zum Diagnostizieren verwendet werden kann.
Hintergrund der Erfindung
Eine Nickelallergie ist eine der häufigsten Arten von Kontaktallergien. In Europa leiden etwa 10 % aller Frauen an dieser Art von Allergie, während sie in der männlichen Bevölkerung weniger häufig ist. Es ist eine bedeutende Berufskrankheit, jedoch ist sie aufgrund der verbreiteten Verwendung von Nickel-enthaltenden Produkten ein signifikantes Problem beim Menschen im Allgemeinen. Der Unterschied zwischen den Geschlechtern wird teilweise durch die gebräuchlichere Verwendung von Schmuck bei Frauen erklärt und ziemlich häufig scheint das Durchstechen eines Ohrs das Ereignis zu sein, das die Krankheit induziert. Eine Nickelallergie dauert üblicherweise ein Leben lang an und neben der Vermeidung der Exponierung gibt es gegenwärtig keine wirksame Behandlung.
Anders als viele andere Allergien (z.B. gegen Tiere, Pollen, Pflanzen, usw.) sind Kontaktallergien üblicherweise nicht mit einem Anstieg an allergenspezifischen IgE-Antikörpern verbunden. Da die in vitro-Diagnose einer Allergie normalerweise auf dem Nachweis eines spezifischen IgE im Serum beruht, gibt es gegenwärtig einen Mangel an serologischen Tests für eine Nickelallergie. Das am gebräuchlichsten verwendete Verfahren zur Feststellung einer Nickelallergie basiert auf dem sogenannten Pflastertest, bei dem Nickel in die Haut des Patienten eingeführt wird und abhängig von der Gegenwart oder dem Fehlen einer lokalen Entzündung bei dem Patienten die Diagnose durchgeführt wird, ob er allergisch oder nicht-allergisch ist. Die gemessene Größe der Entzündungsstelle kann auch als Indikator für die Schwere der Allergie dienen. Ein Hauptnachteil des Pflastertests ist neben den Unannehmlichkeiten, die er bei einer Person bewirken kann, das Risiko, dass das Aussetzen bezüglich Nickel während des Tests selbst die Erkrankung induzieren oder verstärken kann. Der Test kann auch falsche positive oder negative Reaktionen ergeben und das Vermögen für eine Reaktion kann durch den hormonellen Status der Person sowie durch bestimmte Arzneistoffe und durch UV-Licht beeinflusst werden.
Es wurden Versuche gemacht, die spezifische Aktivierung von Zellen nach der in vitro-Exponierung mit Nickel zu messen. Dies wurde durch Messen der Zellproliferation oder der Freisetzung von Cytokinen durch die stimulierten Zellen durchgeführt. Bei der gegebenen geringen Häufigkeit von Nickel-spezifischen Zellen in dem peripheren Blut hat sich die Zellproliferation häufig als zu unempfindlich und unzuverlässig erwiesen und der Nachweis einer Nickel-induzierten Cytokinerzeugung durch ELISA erfordert üblicherweise die Vermehrung und in vitro-Kultivierung von Zellen, um zuerst die Population von reagierenden Zellen zu vermehren. Ferner ist die Cytokinerzeugung heterogen und es konnte bei keinem einzigen Cytokin gezeigt werden, dass es durch die reagierenden Zellen beständig erzeugt wird, wie es durch eine Analyse von Nickel-spezifischen T-Zell-Klonen gezeigt worden ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben erstmals die Möglichkeit des Nachweises von Nickelspezifischen T-Zellen auf einem Einzelzellniveau durch Nachweisen der Erzeugung von Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5) und/oder Interleukin 13 (IL-13) als Reaktion auf eine Nickelexponierung gezeigt. Entsprechende Ergebnisse wurden auch mit anderen Kontaktallergenen, d.h. nicht-Nickel- und nicht-Metall-Allergenen, erreicht. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein in vitro-Verfahren zum Diagnostizieren einer Kontaktallergie in einem Lebewesen bereit, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Bereitstellen (a) eines Kontaktallergens, (b) von T-Zellen von dem Lebewesen, und (c) einer Oberfläche, an der ein erstes spezifisch bindendes Mittel, das spezifisch an ein Cytokin binden kann, das von einer T-Zelle als Reaktion auf das Allergen freigesetzt worden ist, immobilisiert ist,
(ii) Inkontaktbringen der T-Zellen mit dem Allergen und der Oberfläche unter Bedingungen, die geeignet sind für (a) eine Freisetzung des Cytokins durch T-Zellen, die in vivo bezüglich des Allergens vorsensibilisiert worden sind, und (b) das Binden des Cytokins an das erste spezifisch bindende Mittel, und
(iii) Nachweisen des Bindens des Cytokins an das erste spezifisch bindende Mittel, wodurch Allergen-spezifische T-Zellen auf einem Einzelzellniveau nachgewiesen werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 zeigt die Freisetzung von Cytokinen aus T-Zellen von Personen mit einer Nickelallergie oder einer fehlenden Nickelallergie als Reaktion auf NiCl₂. PBMC von allergischen (n = 8) oder nicht-allergischen Personen (n = 7) wurden mit 50 μm NiCl₂ stimuliert und die Anzahl von Zellen, die IL-4, IL-5 oder IL-13 erzeugen, wurde mittels ELISpot bestimmt. Die Balken über der Achse zeigen die durchschnittlichen Reaktionen auf NiCl₂ in allergischen Personen und Kontrollen nach der Subtraktion von Flecken, die spontan erzeugt worden sind. Die Balken unter der Achse zeigen die spontane Anzahl von Flecken, die subtrahiert worden ist, und diese ist unter Verwendung einer invertierten Skala gezeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren zum Diagnostizieren einer Kontaktallergie durch Nachweisen von Kontaktallergen-empfindlichen T-Zellen bereit. Solche Zellen werden unter Verwendung eines Tests nachgewiesen, mit dem die Freisetzung von einem oder mehreren Cytokinen von einer oder mehreren T-Zelle(n) als Reaktion auf das Allergen nachgewiesen werden kann. Das Verfahren zum Nachweisen von Kontaktallergenempfindlichen T-Zellen besteht im Wesentlichen aus den folgenden Schritten:

(i) Bereitstellen (a) eines Kontaktallergens, (b) von T-Zellen von dem Lebewesen, und (c) einer Oberfläche, an der ein erstes spezifisch bindendes Mittel, das spezifisch an ein Cytokin binden kann, das von einer T-Zelle als Reaktion auf das Allergen freigesetzt worden ist, immobilisiert ist,
(ii) Inkontaktbringen der Probe mit dem Allergen und der Oberfläche unter Bedingungen, die geeignet sind für (a) eine Freisetzung des Cytokins durch T-Zellen, die in vivo bezüglich des Allergens vorsensibilisiert worden sind, und (b) das Binden des Cytokins an das erste spezifisch bindende Mittel, und
(iii) Nachweisen des Bindens des Cytokins an das erste spezifisch bindende Mittel.

Allergie
Unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine Allergie gegen jedwedes Allergen, das eine Überempfindlichkeitsreaktion des verzögerten Typs induziert, diagnostiziert werden. Bevorzugte Allergene sind nicht-Protein- oder nicht-Peptid-Allergene. Eine Allergie, die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden kann, ist typischerweise eine Kontaktallergie. In einer Ausführungsform ist die Kontaktallergie eine Me tallallergie. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Metall um ein Metall, das gebräuchlich in Schmuck oder anderen Metallgegenständen verwendet wird, welche die Haut kontaktieren, wie z.B. Kleidungsverschlüsse. Mehr bevorzugt ist das Metall Chrom, Mangan, Eisen, Cobalt, Kupfer oder Zink. Insbesondere ist das Allergen Nickel. In einer alternativen Ausführungsform ist die Kontaktallergie eine nicht-Metall-Allergie. Vorzugsweise ist das nicht-Metall ein nicht-Metall, das gebräuchlich in Gesundheitsprodukten, Klebstoffen, Anstrichmitteln, Kautschukprodukten oder Arzneistoffen verwendet wird. Mehr bevorzugt ist das nicht-Metall Lanolin, Methylchlorisothiazolin, Methylisothiazolinon (Kathon CG), Perubalsam, Epoxyharz, Latex oder Neomycin.
Lebewesen
Das Lebewesen ist im Allgemeinen ein Mensch, kann jedoch ein Haustier bzw. Vieh sein. Typischerweise ist das Tier ein nicht-menschlicher Säuger, wie z.B. eine Katze, ein Hund, ein Hase, eine Kuh oder ein Pferd. Von dem Lebewesen ist im Allgemeinen bekannt, dass es dem Kontaktallergen ausgesetzt wurde. Das Lebewesen kann eine genetische oder erworbene Disposition für eine Allergie aufweisen.
T-Zellen
Im Allgemeinen werden die T-Zellen, die zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren bereitgestellt werden, von dem Lebewesen in einer Blutprobe entnommen, obwohl andere Arten von Proben, die T-Zellen enthalten, verwendet werden können. Die Probe kann dem Test direkt zugesetzt oder zuerst verarbeitet werden. Typischerweise kann die Verarbeitung das Verdünnen der Probe z.B. mit Wasser oder einem Puffer umfassen. Typischerweise wird die Probe von 1,5- bis 100-fach, wie z.B. 2- bis 50- oder 5- bis 10-fach, verdünnt.
Die Verarbeitung kann typischerweise die Abtrennung von Komponenten einer Blutprobe oder einer anderen Probe umfassen. Typischerweise werden Proben von einkernigen Zellen (MC's) oder von einkernigen Zellen von peripherem Blut (PBMC's) hergestellt. Die MC's werden die T-Zellen und die Antigen-präsentierenden Zellen (APC's) umfassen. Folglich können in dem Verfahren die APC's, die in den abgetrennten MC's vorliegen, ein Peptid präsentieren, das durch das Kontaktallergen zu den T-Zellen modifiziert worden ist. In einer anderen Ausführungsform werden nur T-Zellen, wie z.B. nur CD4- oder nur CD8 T-Zellen, von der Probe gereinigt. PBMC's, MC's und T-Zellen können von der Probe unter Verwendung bekannter Techniken abgetrennt werden, wie z.B. denjenigen, die in Lalvani et al. (1997), J. Exp. Med. 186, Seiten 859-865 beschrieben sind.
Vorzugsweise liegen die T-Zellen, die in dem Test verwendet werden, in der Form von unverarbeiteten oder verdünnten Proben vor oder es handelt sich um frisch isolierte T-Zellen (wie z.B. in der Form von frisch isolierten MC's oder PBMC's), die direkt ex vivo verwendet werden, d.h. sie werden vor der Verwendung in dem Verfahren nicht kultiviert. Typischerweise werden jedem Test 10⁵ bis 10, vorzugsweise 5 × 10⁵ bis 5 × 10⁶, mehr bevorzugt 2 × 10⁵ bis 2 × 10⁶ PBMC's zugesetzt.
Die APC kann eine natürlich vorkommende APC oder eine künstliche APC sein. Die APC ist eine Zeile, die das Peptid einer T-Zelle präsentieren kann. Es ist typischerweise eine B-Zelle, eine dendritische Zelle oder eine Makrophage. Sie wird typischerweise von der gleichen Probe wie die T-Zelle abgetrennt und typischerweise zusammen mit der T-Zelle gereinigt. Folglich kann die APC in MC's oder PBMC's vorliegen. Die APC ist typischerweise eine frisch isolierte ex vivo-Zelle oder eine kultivierte Zelle. Sie kann in der Form einer Zelllinie, wie z.B. einer Kurzzeitzelllinie oder einer sich unbegrenzt vermehrenden Zelllinie, vorliegen. Die APC kann leere MHC Klasse II-Moleküle auf deren Oberfläche präsentieren.
Cytokine
Eine T-Zelle, die bezüglich des Allergens empfindlich ist, das für die diagnostizierte Allergie verantwortlich ist, setzt typischerweise ein oder mehrere Cytokin(e) frei, wenn die T-Zelle mit dem Allergen kontaktiert wird. Jedwedes durch die T-Zelle als Reaktion auf das Allergen freigesetzte Cytokin kann in einem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen werden. Vorzugsweise wird das Cytokin von einer Helfer (Th2)-T-Zelle freigesetzt. Mehr bevorzugt ist das Cytokin, das in einem erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesen wird, aus IL-2, IL-4, IL-5, IL-13 und IFN-γ ausgewählt. Ein Verfahren der Erfindung kann ein, zwei, drei oder mehr Cytokin(e) gleichzeitig oder aufeinander folgend nachweisen. Mehr als ein Test, der jeweils zum Nachweisen eines anderen Cytokins gestaltet ist, kann zum Diagnostizieren einer Allergie durchgeführt werden. Vorzugsweise werden die Cytokine dann, wenn der Nachweis von zwei oder mehr Cytokinen erforderlich ist, unter Verwendung eines einzelnen Tests nachgewiesen.
Antikörper
Jedwedes Mittel, das spezifisch an die Substanz binden kann, die von T-Zellen als Reaktion auf ein Allergen sekretiert wird, kann zum Nachweis der Freisetzung der Substanz von T-Zellen verwendet werden. Ein Mittel „bindet spezifisch" an eine Substanz, wenn es mit einer Präferenz oder einer hohen Affinität an die Substanz bindet, für die es spezifisch ist, jedoch nicht, im Wesentlichen nicht oder nur mit einer geringen Affinität an andere Substanzen bindet. Ein Mittel, das spezifisch an eine Substanz binden kann, ist typischerweise ein Antikörper, wie z.B. ein monoklonaler oder ein polyklonaler Antikörper. Monoklonale Antikörper sind zur Verwendung in einem Verfahren der Erfindung bevorzugt.
Ein Antikörper, der zur Verwendung in einem Verfahren der Erfindung geeignet ist, bindet typischerweise spezifisch an ein oder mehrere Cytokin(e), vorzugsweise an ein Cytokin. Vorzugsweise bindet der Antikörper spezifisch an IL-2, IL-4, IL-5, IL-13 oder IFN γ. Ein Verfahren der Erfindung kann einen oder mehrere, wie z.B. 2 oder 3, Antikörper nutzen, wobei jeder Antikörper spezifisch an ein anderes Cytokin bindet. Beispielsweise können Antikörper für IL-2 und IL-4, IL-2 und IL-5, IL-2 und IL-13, IL-2 und IFN γ, IL-4 und IL-5, IL-4 und IL-13, IL-4 und IFN γ, IL-5 und IL-13, IL-5 und IFN γ oder IL-13 und IFN γ verwendet werden. Antikörper für Cytokine sind käuflich oder können unter Verwendung von Standardtechniken hergestellt werden. Käufliche Antikörper umfassen die folgenden monoklonalen Antikörper von Mabtech AB, Stockholm, Schweden: IL2-I und IL2-II für IL-2, 82,4 und 12,1 für IL-4, TRFK5 und 5A10 für IL-5, IL13-I und IL13-II für IL-13 und 1-D1K und 7-B6-1 für IFN γ.
Das spezifisch bindende Mittel wird auf einem festen Träger immobilisiert. Jedweder geeignete feste Träger kann verwendet werden, wie z.B. eine Polyvinylidendifluoridmembran. Der immobilisierte Träger kann eine Platte mit Vertiefungen sein, wie z.B. eine Mikrotiterplatte. Separate Tests können daher in separaten Vertiefungen in der Platte durchgeführt werden. Vorzugsweise ist die Oberfläche, an der das spezifisch bindende Mittel immobilisiert wird, die Basis einer Vertiefung. Ein Antikörper kann an den Träger durch Inkontaktbringen des Trägers und des Antikörpers unter Bedingungen, die dazu geeignet sind, dass der Antikörper an den Träger bindet, und Waschen zur Entfernung von ungebundenem Antikörper gebunden werden.
Die Form, in der das Allergen dem Test zugesetzt wird
Das Allergen kann in jedweder geeigneten Form bereitgestellt werden. Vorzugsweise liegt das Allergen in einer flüssigen Form, wie z.B. einer Lösung, vor. Jedwede geeignete Lösung eines Metallsalzes kann in einem erfindungsgemäßen Test verwendet werden. Typischerweise kann dann, wenn das Allergen Nickel ist, eine Lösung von NiCl₂ oder NiSO₄ verwendet werden. Jedwede geeignete Konzentration des Salzes kann verwendet werden. Typischerweise beträgt die Konzentration des Kationsalzes 1 μM bis 10 mM, wie z.B. 5 μM bis 1 mM, 10 μM bis 100 μM, 20 μM bis 90 μM, 30 μM bis 80 μM, 40 μM bis 60 μM, vorzugsweise 50 μM bis 100 μM.
Geeignetes Testformat
Die T-Zellen und das Allergen können unter jedweden Bedingungen in Kontakt gebracht werden, die zur Aktivierung der T-Zellen durch das Allergen geeignet sind. Eine T-Zelle wird durch ein Allergen aktiviert, wenn die Gegenwart des Allergens die T-Zelle zur Erzeugung eines Cytokins wie z.B. IL-4, IL-5 und/oder IL-13 stimuliert. Die Bedingungen können auch dazu geeignet sein, dass die Substanz direkt mit einem immobilisierten spezifisch bindenden Mittel reagiert. Im Allgemeinen werden die T-Zellen in einer flüssigen Probe vorliegen, die mit der Oberfläche in Kontakt steht, an der das bindende Mittel immobilisiert worden ist. Das Allergen kann der Probe von T-Zellen in Kontakt mit der Oberfläche zugesetzt werden. Alternativ kann das Allergen in einer Lösung vorliegen, die mit der Oberfläche in Kontakt steht, an der das bindende Mittel immobilisiert worden ist, und die T-Zellen können dem Allergen zugesetzt werden. Das Allergen kann an einer Oberfläche immobilisiert sein, wie z.B. der Oberfläche, an der das spezifisch bindende Mittel immobilisiert ist. Die Zellen können dann gleichzeitig mit dem Allergen und dem spezifisch bindenden Mittel in Kontakt gebracht werden.
Der Test kann in jedwedem geeigneten Volumen durchgeführt werden. Im Allgemeinen werden gleiche Volumina der T-Zellen-Probe und der Allergenlösung verwendet. Typische Volumina der T-Zellen-Probe liegen im Bereich von 10 μl bis 1 ml, vorzugsweise von 50 μl bis 500 μl, mehr bevorzugt von 100 μl bis 200 μl.
Typischerweise beträgt die Zeitdauer, für welche die T-Zellen mit dem Allergen und dem spezifisch bindenden Mittel in Kontakt gebracht werden, 4 bis 50 Stunden, wie z.B. 48 Stunden, 8 bis 45 Stunden, 12 bis 36 Stunden oder 16 bis 24 Stunden, vorzugsweise 6 bis 16 Stunden. Typischerweise werden die T-Zellen, das Antigen und das spezifisch bindende Mittel über Nacht inkubiert.
Die T-Zellen können mit dem Allergen und dem spezifisch bindenden Mittel bei jedweder geeigneten Temperatur inkubiert werden. Eine geeignete Temperatur liegt in dem gleichen Bereich wie die normale Körpertemperatur des Menschen oder des Tiers, von dem die T-Zellen stammen. Typischerweise wird die Inkubation bei einer Temperatur zwischen 35°C und 39°C, vorzugsweise von 36°C bis 38°C, mehr bevorzugt bei 37°C durchgeführt.
Nachweis des Antikörper/Cytokin-Komplexes
Der zwischen dem immobilisierten spezifisch bindenden Mittel und dem von den T-Zellen als Reaktion auf das Allergen freigesetzten Cytokin gebildete Komplex kann mit jedwedem geeigneten Mittel nachgewiesen werden. Nach dem Binden des Mittels wird das Cytokin in der Nähe der T-Zelle, die es sekretiert hat, bleiben. Folglich werden auf dem Träger „Flecken" eines Cytokin/Mittel-Komplexes gebildet, wobei jeder Fleck eine T-Zelle repräsentiert, die das Cytokin sekretiert. Die Quantifizierung der Flecken und typischerweise das Vergleichen mit einer Kontrolle ermöglicht die Bestimmung der Erkennung des Allergens. Die Oberfläche, an der das spezifisch bindende Mittel immobilisiert ist, wird im Allgemeinen gewaschen, z.B. in PBS, um ungebundenes Cytokin zu entfernen.
Typischerweise kann der Mittel/Cytokin-Komplex, wie z.B. der Antikörper/Cytokin-Komplex, unter Verwendung eines zweiten bindenden Mittels, das den Komplex bindet, nachgewiesen werden. Das zweite bindende Mittel ist typischerweise ein Mittel, das von dem ersten spezifisch bindenden Mittel verschieden ist. Typischerweise bindet das zweite bindende Mittel das Cytokin an einer Stelle, die von der Stelle verschieden ist, an die das erste Mittel bindet. Das zweite Mittel kann an den Komplex binden, der zwischen dem Cytokin und dem ersten bindenden Mittel, das an dem festen Träger immobilisiert ist, gebildet worden ist. Vorzugsweise ist das zweite bindende Mittel ein Antikörper. Mehr bevorzugt ist das zweite bindende Mittel ein Antikörper, der spezifisch an das Cytokin bindet. Das zweite bindende Mittel kann typischerweise an das Cytokin binden, wenn das Cytokin an das erste bindende Mittel gebunden ist. Folglich binden das erste und das zweite bindende Mittel typischerweise an verschiedene Teile des Cytokinmoleküls.
Im Allgemeinen ist das zweite bindende Mittel mit einem Marker markiert, der entweder direkt oder indirekt nachgewiesen werden kann. Ein spezifisch bindendes Mittel, das einen direkt nachweisbaren Marker umfasst, kann einen Fluoreszenzmarker, wie z.B. Fluorescein, Texasrot, Rhodamin oder Oregongrün, umfassen. Das Binden des zweiten fluoreszierend markierten Mittels an die immobilisierten erstes Mittel/Substanz-Komplexe kann mittels Mikroskopie nachgewiesen werden, z.B. unter Verwendung eines Fluoreszenz- oder Konfokalmikroskops.
Ein zweites bindendes Mittel, das einen indirekt nachweisbaren Marker umfasst, kann mit einem dritten Mittel nachgewiesen werden, das direkt oder indirekt mit einem nachweisbaren Marker markiert ist. Das dritte Mittel wird typischerweise an den Marker an dem zweiten Mittel binden. Beispielsweise kann das zweite Mittel vorzugsweise einen Biotinrest umfassen, der den Nachweis durch ein drittes Mittel ermöglicht, das einen Streptavidinrest und typischerweise alkalische Phosphatase als nachweisbaren Marker umfasst.
Das zweite bindende Mittel kann ein Enzym umfassen, das auf ein ausfallendes nicht-fluoreszierendes Substrat einwirkt, das unter einem herkömmlichen Mikroskop mit geringer Vergrößerung, wie z.B. einer 10-fachen Vergrößerung, einer 20-fachen Vergrößerung oder einer 50-fachen Vergrößerung, wie z.B. einem Stereomikroskop, nachgewiesen werden kann. Vorzugsweise wird das ausfallende nicht-fluoreszierende Substrat unter Verwendung eines automatisierten ELISpot-Lesegeräts nachgewiesen. Ein automatisiertes ELISpot-Lesegerät basiert typischerweise auf einer Videokamera und einer Bildanalysesoftware, die zur Analyse von Flecken angepasst ist.
Das zweite spezifisch bindende Mittel kann ein Antikörper von einer anderen Art gegen sowohl den ersten Antikörper als auch das Lebewesen, von dem die T-Zellen entnommen werden, sein. Das dritte bindende Mittel kann dann ein Antikörper sein, der spezifisch Proteine von der Art erkennt, von welcher der zweite Antikörper stammt.
In allen Nachweisschritten ist es erwünscht, ein Mittel zur Minimierung des unspezifischen Bindens des zweiten Mittels und von weiteren Mitteln einzubeziehen. Beispielsweise können zur Blockierung eines unspezifischen Bindens Rinderserumalbumin (BSA) oder fetales Kälberserum (FCS) verwendet werden.
In einer Ausführungsform ist das Allergen Ni² ⁺, das T-Zellen von einem allergischen Lebewesen zur Erzeugung von Interleukin-4 (IL-4) stimuliert. IL-4, das von der T-Zelle sekretiert wird, wird durch einen ersten IL-4-Antikörper gebunden, der auf einem festen Träger immobilisiert ist. Das gebundene IL-4 wird dann unter Verwendung eines zweiten IL-4-Antikörpers nachgewiesen, der mit einem nachweisbaren Marker markiert ist. Der erste und der zweite IL-4-Antikörper binden an verschiedene Regionen des IL-4-Moleküls, so dass das Binden von IL-4 an den ersten Antikörper das Binden von IL-4 an den zweiten Antikörper nicht beeinträchtigt.
Das von T-Zellen als Reaktion auf das Allergen freigesetzte Cytokin kann auch bei einem Fehlen des Allergens spontan von T-Zellen freigesetzt werden. Daher kann es erforderlich sein, einen oder mehrere Negativkontrolltest(s) durchzuführen, um zu bestimmen, ob eine oder mehrere T-Zellen) das Cytokin als Reaktion auf das Allergen freisetzt bzw. freisetzen. Beispielsweise kann der Test in der Abwesenheit des Allergens durchgeführt werden und die Anzahl von „Flecken", die in der Abwesenheit des Allergens nachgewiesen werden, kann von der Anzahl der „Flecken" (positive T-Zellen), die in der Gegenwart des Allergens nachgewiesen werden, subtrahiert werden. Typischerweise können 0 bis 10 Zellen pro 2 × 10⁵ Zellen die Substanz in der Abwesenheit des Allergens freisetzen.
Allergisches Lebewesen
Bei einem Lebewesen kann diagnostiziert werden, dass es eine Allergie gegen ein spezifisches Allergen aufweist, wenn die Anzahl der positiven T-Zellen, die in der Gegenwart eines Allergens nachgewiesen werden, größer ist als die Anzahl von positiven T-Zellen, die in der Abwesenheit eines Allergens nachgewiesen werden. Typischerweise werden in der Gegenwart eines Allergens mindestens 5, vorzugsweise mindestens 7, mindestens 10, mindestens 15, mindestens 20, mindestens 30, mindestens 40, mindestens 50 oder mindestens 100 mehr Zellen pro 2 × 10⁵ Zellen das Cytokin verglichen mit Zellen von dem gleichen Lebewesen in der Abwesenheit des Allergens freisetzen.
Kits
Die Erfindung stellt auch einen Kit zur Durchführung des Verfahrens bereit, der ein Allergen, eine Oberfläche, die ein immobilisiertes Mittel umfasst, das an ein von T-Zellen als Reaktion auf das Allergen freigesetztes Cytokin spezifisch binden kann, und gegebenenfalls ein Mittel zum Nachweisen des Bindens des Mittels an das Cytokin umfasst.
Der Kit kann ein Mittel zum Inkontaktbringen des Allergens und der Oberfläche mit einer T-Zellen-Probe umfassen. Ein solches Mittel kann jedweder geeignete Behälter sein, wie z.B. eine einzelne Vertiefung oder eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte.
Der Kit kann auch ein Mittel zum Nachweisen des Cytokin/Mittel-Komplexes umfassen. Eine nachweisbare Veränderung kann nach dem Binden des Cytokins in dem Mittel selbst stattfinden, wie z.B. eine Farbänderung. Alternativ kann ermöglicht werden, dass ein zweites Mittel, das direkt oder indirekt für den Nachweis markiert ist, an den Cytokin/Mittel-Komplex bindet, so dass die Bestimmung der Flecken ermöglicht wird. Wie es vorstehend diskutiert worden ist, kann das zweite Mittel für das Cytokin spezifisch sein, bindet jedoch an eine andere Stelle an der Substanz als das erste Mittel.
Die Oberfläche, an der das spezifisch bindende Mittel gebunden ist, kann eine Oberfläche einer Vertiefung, vorzugsweise die Basis der Vertiefung, sein. Typischerweise liegt die Ver tiefung in einer Platte mit Vertiefungen, wie z.B. einer Mikrotiterplatte, vor. Jeder Test kann daher in einer separaten Vertiefung in der Platte durchgeführt werden.
Der Kit kann zusätzlich ein Medium für die T-Zellen, Nachweismittel oder Waschpuffer, die in den Nachweisschritten verwendet werden, umfassen. Der Kit kann zusätzlich Reagenzien umfassen, die zur Abtrennung von der Probe geeignet sind, wie z.B. zur Abtrennung von PBMC's oder T-Zellen von der Probe. Der Kit kann so gestaltet sein, dass es den Nachweis der T-Zellen direkt in der Probe ohne das Erfordernis jedweder Abtrennung der Komponenten der Probe ermöglicht.
Der Kit kann auch Kontrollen, wie z.B. Positiv- oder Negativkontrollen, umfassen. Die Positivkontrolle kann den Test des Nachweissystems ermöglichen. Folglich ahmt die Positivkontrolle typischerweise die Erkennung des Allergens in jedwedem der vorstehend genannten Verfahren nach. Typischerweise ist die Positivkontrolle in den Kits, die zur Bestimmung der Erkennung in vitro gestaltet sind, ein Cytokin, wie z.B. IL-2, IL-4, IL-5, IL-13 oder IFN γ. Alternativ kann die Positivkontrolle ein Mittel zur Analyse polyklonal stimulierter T-Zellen umfassen. Beispielsweise kann ein solches Mittel Phytohämagglutinin (PHA) oder anti-CD3 zur Stimulation von T-Zellen umfassen.
Der Kit kann auch ein Mittel zum Entnehmen einer T-Zellen-enthaltenden Probe von dem Wirt, wie z.B. einer Blutprobe, umfassen. Der Kit kann ein Mittel zum Abtrennen einkerniger Zellen oder T-Zellen von einer Probe von dem Wirt umfassen.
Beispiele
Beispiel 1: Auswahl von Patienten und Kontrolllebewesen zum Testen bezüglich einer Nickelallergie
Alle Personen, die als Patienten mit einer Nickel-induzierten allergischen Kontaktdermatitis (ACD) definiert waren, wurden auf der Basis der vorhergehenden ACD-Historie ausgewählt (n = 11, Altersbereich 28 bis 52; alle weiblich). Kontrollpersonen wiesen kein bekanntes Problem mit ACD auf (n = 9, Altersbereich 40 bis 54; alle weiblich). Alle Personen nahmen an der Studie teil, nachdem eine Einverständniserklärung erhalten wurde, und das Projekt wurde von der örtlichen Ethikkommission geprüft und akzeptiert.

Um zu bestätigen, dass die Gruppe der nicht-allergischen Kontrollen keine potenziell allergischen Personen umfasste und dass die Patienten gegen Nickel allergisch waren, wurde bei allen Personen ein Pflastertest durchgeführt. Vor dem Testen der Kontrollgruppe mit Pflastern wurden Blutproben für eine ELISpot-Analyse genommen, um einen Einfluss des Pflastertests auf die ELISpot-Analyse zu vermeiden. Epikutane Pflastertests unter Verwendung von 5 % NiSO₄ in Vaseline wurden für 48 Stunden angewandt, worauf die Reaktionsstellen untersucht wurden. Keine der Kontrollen reagierte positiv. Alle ACD-Patienten wurden auf der Basis von vorhergehenden Pflastertests ausgewählt, die Bewertungen von 2+ oder 3+ ergaben, wobei 3+ als höchste Bewertung erhalten wurde. Die Ergebnisse des Pflastertests sind in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1. IL-4 ELISpot-Reaktionen auf NiCl₂ in Personen, die bezüglich Nickel allergisch und nicht-allergisch sind

Gruppe	Person	Alter	Geschlecht	Reaktivität im Pflastertest	Gesamt-IgE (kU/l)	Proliferation (SI) (50 μM NiCl₂)	IL-4-erzeugende Zellen/200000 PBMC nach der Stimulation mit 0, 50 oder 100 μM NiCl₂
Gruppe	Person	Alter	Geschlecht	Reaktivität im Pflastertest	Gesamt-IgE (kU/l)	Proliferation (SI) (50 μM NiCl₂)	0	50	100	50-0	100-0
Allergisch	MU	48	F	+++	9,3	15,9	3	137	nd	134	nd
	CT	35	F	++	2	8,4	1	48	nd	47	nd
	PL	41	F	++	4,0	15,4	2	19	21	17	19
	EE	29	F	+++	48	16,2	5	26	28	21	23
	NH	–	F	+++	47	11,8	9	127	122	118	113
	SJ	28	F	++	3,4	24,9	2	27	30	25	28
	SH	52	F	++	8,6	11,0	5	60	63	55	58
	KE	35	F	++	3,5	31,6	4	9	16	5	12
	VL	45	F	++	90	44,8	1	8	18	7	17
	MG	51	F	++	32	10,1	1	13	24	12	23
	MF	35	F	++	46	92,2	3	23	28	21	25

Nicht-allergisch	GG	42	F	–	13	3,1	2	3	nd	1	nd
	IE	53	F	–	63	0,9	2	4	5	2	3
	BW	51	F	–	8,5	3,1	5	9	8	4	3
	AKA	54	F	–	19	1,2	3	3	4	0	1
	CO	40	F	–	19	2,0	9	7	14	0	5
	CJ	43	F	–	22	3,3	2	1	4	0	2
	EJ	46	F	–	2,0	6,8	2	2	1	0	0
	LL	–	F	–	37	5,1	4	4	8	0	4
	MBH	49	F	–	8,4	8,2	5	2	6	0	1

Beispiel 2: Abtrennung von einkernigen Zellen von peripherem Blut
Blut von ACD-Patienten oder Kontrollpersonen wurde durch eine Venenpunktion erhalten und in sterilen, heparinisierten Glasfläschen gesammelt. Einkernige Zellen von peripherem Blut (PBMC) wurden über Ficoll-Hypaque mittels Dichtegradientenzentrifugation abgetrennt. Nach der Abtrennung wurden PBMC zweimal in Medium (RPMI 1640, das Glutamin, Hepes, Penicillin/Streptomycin und 10 % fetales Kälberserum (FCS) enthielt) gewaschen und für Experimente frisch verwendet. Alternativ wurde PBMC in 90 % FCS und 10 % Dimethylsulfoxid eingefroren und bis zum Testen in flüssigem Stickstoff gehalten. Vor dem Testen wurden gefrorene Zellen bei 37°C aufgetaut und Medium wurde tropfenweise zugesetzt, worauf die Zellen zweimal mit Medium gewaschen wurden. Der Vergleich der Verwendung von fri schen und gefrorenen Zellen in ELISpot bezüglich der Cytokinreaktionen auf NiCl₂ oder andere Reize führte zu einer vergleichbaren Anzahl von Flecken.
Beispiel 3: Stimulation von PBMC
Die PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen an NiCl₂ stimuliert und sowohl proliferative Reaktionen als auch Cytokinreaktionen wurden analysiert. NiCl₂ bei einer Vorratskonzentration von 50 mM wurde mit Medium gemischt und mehr als 5 min vor dem Zusetzen zu Zellen inkubiert. PBMC, die auf eine Zellenkonzentration von 4 bis 6 × 10⁶ Zellen/ml verdünnt worden sind, wurden mit einem gleichen Volumen von NiCl₂, das in Medium so verdünnt worden ist, dass eine Endkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml und NiCl₂ in Konzentrationen im Bereich von 10 bis 100 μM resultierten, gemischt. Die Zellsuspensionen wurden 4 Stunden bei 37°C in einem befeuchteten Inkubator in Kunststofffläschen inkubiert. Parallel zur Inkubation von PBMC mit NiCl₂ wurden PBMC in der gleichen Konzentration mit Mitogen (1 μg Phytohämagglutinin (PHA)/ml), Kontrollantigene (10 μg Tetanustoxoid (TT) oder gereinigtes Proteinderivat (PPD)/ml) oder in der Abwesenheit eines Reizes inkubiert. Ein Vergleich von ELISpot Cytokinreaktionen, die durch NiCl₂ und NiSO₄ in einer begrenzten Anzahl von Personen induziert worden sind, führte zu ähnlichen Reaktionen.
Die proliferativen Reaktionen sind in der Tabelle 1 als Stimulationsindizes (SEQ ID NO.) angegeben, die den cpm-Werten, die durch eine Stimulation von PBMC mit 50 μM NiCl₂ erhalten worden sind, dividiert durch die Proliferation von Zellen in der Abwesenheit von Reizen entsprechen.
Die mittleren proliferativen Reaktionen auf 50 μM NiCl₂ waren in der Gruppe allergischer Personen höher (Tabelle 1) und die Differenz war statistisch signifikant (Mann-Whitney; p < 0,0002). Es gab jedoch nur eine geringe Differenz zwischen den Personen mit der geringsten Reaktion in der allergischen Gruppe und den Personen mit der stärksten Reaktion in der nicht-allergischen Gruppe.
Beispiel 4: ELISpot-Test
Abgestimmte Paare von monoklonalen Antikörpern (mAb) gegen menschliches IL-4, IL-5 oder IL-13 wurden für die ELISpot-Tests verwendet (Mabtech AB, Stockholm, Schweden). Für jedes Paar wurde ein mAb als Einfang-mAb verwendet: 82,4 (IL-4), TRFK5 (IL-5) und IL13-I (IL-13), und der andere zum Nachweis verwendet, 12,1 (IL-4), 5A10 (IL-5) und IL13-II (IL-13). MAb's, die zum Nachweis verwendet wurden, waren biotinyliert.
Platten mit 96 Vertiefungen mit Polyvinylidendifluorid-Membranen (MAIPS45-10, Millipore) wurden mit 100 μl 70 %igem EtOH für 2 bis 10 min behandelt, worauf sechs Waschvorgänge mit 200 μl sterilem entionisierten H₂O durchgeführt wurden. Jeder Vertiefung wurden 100 μl Einfang-mAb bei einer Konzentration von 15 μg/ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zugesetzt und es wurde bei +4°C über Nacht inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit 200 μl steriler PBS und dreimal mit 200 μl Medium, das 2 % FCS enthielt, gewaschen. PBMC, die 4 Stunden mit oder ohne Stimuli in Reagenzgläsern inkubiert worden sind, wurden suspendiert und 100 μl Zellsuspension (2 × 10⁵ Zellen) wurden jeder Vertiefung zugesetzt. Nach einer zusätzlichen Inkubation von 44 Stunden wurden die Vertiefungen geleert und sechsmal mit 200 μl PBS gewaschen. Biotinylierter Nachweis-mAb bei 1 μg/ml in PBS, die 0,5 % FCS enthielt, wurde in einem Volumen von 1 μl zugesetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, worauf die Vertiefungen sechsmal mit PBS gewaschen wurden. Anschließend wurden 100 μl SA-ALP (Streptavidin-alkalische Phosphatase, Mabtech) bei 50 ng/ml in PBS mit 0,5 % FCS jeder Vertiefung zugesetzt und 1 Stunde inkubiert, worauf sechsmal in PBS gewaschen wurde, bevor die Vertiefungen mit 100 μl Nitroblau-Tetraxolium (NBT)/5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP)-Substrat (Sigma) für etwa 1 Stunde entwickelt wurden. Nach dem Spülen der Platten mit Leitungswasser wurden die Platten getrocknet und Flecken wurden unter Verwendung eines Lichtmikroskops gezählt.
Die Messungen von PBMC-Reaktionen auf NiCl₂ mittels ELISpot wurden durchgeführt, um die Anzahl von Zellen, die IL-4 erzeugen, zu ermitteln (Tabelle 1). Eine geringe Häufigkeit von Zellen, die IL-4 spontan erzeugen, wurde in beiden Gruppen festgestellt, wobei 1 bis 9 Flecken/200000 Zellen in der allergischen Gruppe und 2 bis 9 Flecken/200000 Zellen in der nicht-allergischen Gruppe festgestellt wurden. Im Gegensatz dazu war die Anzahl von Zellen, die IL-4 als Reaktion auf NiCl₂ erzeugten, in der allergischen Gruppe erhöht, wohingegen in der Kontrollgruppe keine solche Zunahme festgestellt wurde. Wenn die Anzahl der NiCl₂-induzierten Flecken in den zwei Gruppen nach der Subtraktion der spontanen Flecken verglichen wurde, war die Anzahl der Flecken in allen allergischen Personen höher (Tabelle 1, die letzten zwei Spalten). Dies ergab sich bei der Verwendung entweder von 50 μM oder von 100 μM NiCl₂ und obwohl die Differenz bei der höheren Konzentration deutlicher war, war die Zunahme in beiden Fällen statistisch signifikant (Mann-Whitney, p < 0,0002 bei 50 mM und p < 0,0005 bei 100 mM). Eine Stimulation mit 10 μM NiCl₂ führte auch zu höheren Mittelwerten für die allergische Gruppe, obwohl die Differenz zwischen den Gruppen gering war (Daten nicht gezeigt).
Um die Anzahl der Zellen von den zwei Gruppen, die andere Cytokine als Reaktion auf NiCl₂ erzeugten, zu vergleichen, wurden PBMC von einigen der Personen bezüglich IL-5 und IL-13 in dem ELISpot ebenfalls analysiert (1). Entsprechend der IL-4-Reaktion wurde gezeigt, dass PBMC von allergischen Personen (n = 8) IL-5 und IL-13 als Reaktion auf NiCl₂ erzeugten, während dies in nicht-allergischen Personen (n = 7) nicht festgestellt wurde. In dem Fall von IL-4 wurde gefunden, dass eine sehr geringe Anzahl von Zellen IL-5 spontan erzeugte. Die spontane Erzeugung von IL-13 war geringfügig höher, unterschied sich zwischen den zwei Gruppen jedoch nicht signifikant. Wenn die Anzahl von NiCl₂-induzierten II-4, IL-5- und IL-13-Flecken in den zwei Gruppen verglichen wurde, war die Reaktion der allergischen Gruppe für alle drei Cytokine stärker (Mann-Whitney; p = 0,0032, p = 0,0078 bzw. p = 0,0038). Es gab auch einen klaren Zusammenhang zwischen der Anzahl von IL-4- und IL-5-Flecken sowie zwischen der Anzahl von IL-4- und IL-13-Flecken (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 5: Messung der IgE-Gesamtkonzentrationen im Plasma
Plasma von allen Personen, die an der Studie teilnahmen, wurde bezüglich des IgE-Gesamtgehalts untersucht. Der verwendete Test war ein käuflicher Test und der Test wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die IgE-Plasmagesamtkonzentrationen (Tabelle 1) waren in beiden Testgruppen ähnlich und lagen im Bereich von 2 bis 90 kU/Liter in der allergischen Gruppe und von 2 bis 63 kU/Liter in der nicht-allergischen Gruppe. Dies legt nahe, dass die Cytokinreaktionen auf NiCl₂ allergenspezifisch sind und keinen allgemeinen unausgewogenen TH2-Typ der mitogenen Aktivierung wiedergeben.
Beispiel 6: Kathon-Allergietesten
Personen, die gegen die Konservierungsmittelverbindung Kathon (Methylisothiazolinon) als allergisch definiert sind, wurden ausgewählt. Kontrollpersonen wiesen kein vorbekanntes Problem mit einer Kathonallergie auf. Alle Personen haben nach dem Erhalten einer Einverständniserklärung an der Studie teilgenommen und das Projekt wurde von der örtlichen Ethikkommission geprüft und akzeptiert.
Einkernige Zellen von peripherem Blut (PBMC) wurden von Kathon-Allergiepatienten oder Kontrollpersonen so erhalten, wie es im Beispiel 2 beschrieben worden ist.
Die PBMC wurden mit Kathon stimuliert und Cytokinreaktionen wurden analysiert.
Abgestimmte Paare von monoklonalen Antikörpern (mAb) gegen menschliches IL-4, IL-5 IL-13 oder INF-γ wurden für die ELISpot-Tests verwendet (Mabtech AB, Stockholm, Schweden). Wie im vorstehenden Beispiel 4 wurde für jedes Paar ein mAb als Einfang-mAb und der andere zum Nachweis verwendet. MAb's, die zum Nachweis verwendet wurden, waren biotinyliert.
Platten mit 96 Vertiefungen mit Polyvinylidendifluorid-Membranen (MAIPS45-10, Millipore) wurden mit 100 μl 70 %igem EtOH für 2 bis 10 min behandelt, worauf sechs Waschvorgänge mit 200 μl sterilem entionisierten H₂O durchgeführt wurden. Jeder Vertiefung wurden 100 μl Einfang-mAb bei einer Konzentration von 15 μg/ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zugesetzt und es wurde bei +4°C über Nacht inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit 200 μl steriler PBS und dreimal mit 200 μl Medium, das 2 % FCS enthielt, gewaschen. PBMC, die 4 Stunden mit oder ohne Stimuli in Reagenzgläsern inkubiert worden sind, wurden suspendiert und 100 μl Zellsuspension (2 × 10⁵ Zellen) wurden jeder Vertiefung zugesetzt. Nach einer zusätzlichen Inkubation von 44 Stunden wurden die Vertiefungen geleert und sechsmal mit 200 μl PBS gewaschen. Biotinylierter Nachweis-mAb bei 1 μg/ml in PBS, die 0,5 % FCS enthielt, wurde in einem Volumen von 1 μl zugesetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, worauf die Vertiefungen sechsmal mit PBS gewaschen wurden. Anschließend wurden 100 μl SA-ALP (Streptavidin-alkalische Phosphatase, Mabtech) bei 50 ng/ml in PBS mit 0,5 % FCS jeder Vertiefung zugesetzt und 1 Stunde inkubiert, worauf sechsmal in PBS gewaschen wurde, bevor die Vertiefungen mit 100 μl Nitroblau-Tetraxolium (NBT)/5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP)-Substrat (Sigma) für etwa 1 Stunde entwickelt wurden. Nach dem Spülen der Platten mit Leitungswasser wurden die Platten getrocknet und Flecken wurden unter Verwendung eines Lichtmikroskops gezählt.

Die Messungen von PBMC-Reaktionen auf Kathon mittels ELISpot wurden durchgeführt, um die Anzahl von Zellen, die IL-4, IL-5, IL-13 und INF-γ erzeugen, zu ermitteln (Tabelle 2). Um die Anzahl der Zellen von den zwei Gruppen, die andere Cytokine als Reaktion auf NiCl₂ erzeugten, zu vergleichen, wurden PBMC von einigen der Personen bezüglich IL-5 und IL-13 in dem ELISpot ebenfalls analysiert (1). Entsprechend der IL-4-Reaktion wurde gezeigt, dass PBMC von allergischen Personen (n = 8) IL-5 und IL-13 als Reaktion auf NiCl₂ erzeugten, während dies in nicht-allergischen Personen (n = 7) nicht festgestellt wurde. In dem Fall von IL-4 wurde gefunden, dass eine sehr geringe Anzahl von Zellen IL-5 spontan erzeugte. Die spontane Erzeugung von IL-13 war geringfügig höher, unterschied sich zwischen den zwei Gruppen jedoch nicht signifikant. Wenn die Anzahl von NiCl₂-induzierten II-4, IL-5- und IL-13-Flecken in den zwei Gruppen verglichen wurde, war die Reaktion der allergischen Gruppe für alle drei Cytokine stärker (Mann-Whitney; p = 0,0032, p = 0,0078 bzw. p = 0,0038). Es gab auch einen klaren Zusammenhang zwischen der Anzahl von IL-4- und IL-5-Flecken sowie zwischen der Anzahl von IL-4- und IL-13-Flecken (Daten nicht gezeigt). Tabelle 2. ELISpot-Test von Personen, die gegen Kathon allergisch sind, und von nicht-allergischen Personen

	Anzahl von reagierenden Zellen (Flecken) pro 200000 Zellen
	IL-4	IL-5	IL-13	IFN-gamma
Allergische Personen
Patient 1	14	3	51	39
Patient 2	21	5	50	113
Patient 3*	0	0	0	0
Patient 4	3	2	19	21
Nicht-allergische Kontrollen
Kontrolle 1	0	0	0	4
Kontrolle 2	0	0	0	0
Kontrolle 3	0	0	0	0
Kontrolle 4	1	0	0	ND

* Der Patient 3 wurde als allergisch ausgewählt, jedoch im Pflastertest negativ getestet.

Die Daten in der Tabelle 2 repräsentieren die Anzahl von Zellen, die spezifisch auf Kathon reagieren. Folglich wurden dann, wenn jedwede spontane Flecken (d.h. ohne Stimuli) festgestellt wurden, diese subtrahiert. In dem Fall von IL-4, IL-5 und IL-13 war die Anzahl solcher spontanen Flecken einheitlich niedrig, wohingegen die spontane Erzeugung von IFN γ eine größere individuelle Variation zeigte.
Um zu bestätigen, dass die Gruppe der nicht-allergischen Kontrollen keine potenziell allergischen Personen umfasste und dass die Patienten gegen Kathon allergisch waren, wurde bei allen Personen ein Pflastertest durchgeführt. Vor dem Testen der Kontrollgruppe mit Pflastern wurden Blutproben für eine ELISpot-Analyse genommen, um einen Einfluss des Pflastertests auf die ELISpot-Analyse zu vermeiden. Epikutane Pflastertests wurden für 48 Stunden angewandt, worauf die Reaktionsstellen untersucht wurden. Keine der Kontrollen reagierte positiv. Die Patienten 1, 2 und 4 reagierten in dem Pflastertest positiv. Der Patient Nr. 3, der als gegen Kathon allergisch ausgewählt worden ist, war in dem Pflastertest negativ. Dieser Patient ergab auch in dem ELISpot-Test ein negatives Ergebnis (vgl. die Tabelle 2).

Claims

In vitro-Verfahren zum Diagnostizieren einer Kontaktallergie in einem Lebewesen, wobei das Verfahren umfasst: (i) Bereitstellen (a) eines Kontaktallergens, (b) von T-Zellen von dem Lebewesen, und (c) einer Oberfläche, an der ein erstes spezifisch bindendes Mittel, das spezifisch an ein Cytokin binden kann, das von einer T-Zelle als Reaktion auf das Allergen freigesetzt worden ist, immobilisiert ist, (ii) Inkontaktbringen der T-Zellen mit dem Allergen und der Oberfläche unter Bedingungen, die geeignet sind für (a) eine Freisetzung des Cytokins durch T-Zellen, die in vivo bezüglich des Allergens vorsensibilisiert worden sind, und (b) das Binden des Cytokins an das erste spezifisch bindende Mittel, und (iii) Nachweisen des Bindens des Cytokins an das erste spezifisch bindende Mittel, wodurch Allergen-spezifische T-Zellen auf einem Einzelzellniveau nachgewiesen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Allergie eine Metallallergie ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Allergie eine Nickelallergie ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem das Kontaktallergen als eine Lösung, die aus NiCl₂ und NiSO₄ ausgewählt ist, bereitgestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Kontaktallergie eine nicht-Metallallergie ist.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die nicht-Metallallergie eine Kathon-Allergie ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Cytokin ein Th2-Typ-Reaktion-assoziiertes Cytokin ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Cytokin aus IL-2, IL-4, IL-5, IL-13 und IFN γ ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Binden der Substanz an das erste spezifisch bindende Mittel unter Verwendung eines zweiten spezifisch bindenden Mittels, das spezifisch an das Cytokin bindet, nachgewiesen wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das erste spezifisch bindende Mittel ein erster Antikörper ist und/oder das zweite spezifisch bindende Mittel ein zweiter Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, bei dem das zweite spezifisch bindende Mittel markiert ist.