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In einem ersten Aspekt richtet sich die folgende Erfindung auf ein Verfahren zum Messen von mindestens einem Biomarker zum Bestimmen des physiologischen Belastungszustandes in einem Individuum basierend auf der Menge an Hitzeschockproteinen durch Bestimmung einer positiven Differenz emittierter Strahlung einer Probe inkubiert mit einem Inhibitor des Hitzeschockproteins und ATP im Vergleich zu der Probe inkubiert mit ATP ohne Inhibitor. Die entsprechende Strahlung wird dann durch Quantenpunkte emittiert. Eine positive Differenz zwischen der Probe mit Inhibitor und der gleichen Probe ohne Inhibitor mit ggf. Korrelation dieser Differenz mit einer Vergleichskurve von Proben enthaltend das Hitzeschockprotein in vorbestimmter Konzentration erlaubt eine entsprechende Bestimmung der Menge an Hitzeschockproteinen und damit ein Bestimmen des physiologischen Belastungszustandes in einem Individuum. In einem weiteren Aspekt wird eine entsprechende Vorrichtung zum Messen dieser Biomarker zum Bestimmen des physiologischen Belastungszustandes in einem Individuum bereitgestellt.
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Stand der Technik
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Physiologische Belastungszustände spielen in verschiedenen Bereichen eine Rolle. Insbesondere im Sportbereich und bei medizinischen Fragestellungen ist die Bestimmung des physiologischen Belastungszustandes eines Individuum, insbesondere eines Menschen, von großem Interesse. Dies gilt nicht nur bei der Beurteilung der Belastungszustände bei Erkrankungen oder im Alltag, sondern insbesondere auch physiologische Belastungszustände und sich daraus ergebende Regeneration im Spitzensportbereich. Diagnostische Verfahren mittels Biomarker sind im Kontext zahlreicher Erkrankungen, wie zum Beispiel bei Tumorerkrankungen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen wichtig und finden immer mehr Beachtung. Auch zum Monitoren physiologischer Zustände, wie physischen oder psychischen Stresszuständen, werden im Biomarker als objektivierbare Parameter immer bedeutender.
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Im Zusammenhang mit Leistungs- , Freizeit- und Gesundheitssport werden seit Jahren unterschiedliche selektive Biomarker erforscht und diskutiert, diese Biomarker sollen dabei begleitend vor dem Hintergrund der individuellen Steuerung von Belastungen, Trainingsprozessen und der Regeneration eingesetzt werden können, siehe Belaya B., et al., Oxidative medicine and cellular longevity, 2018, 2894247. Objektivierbare Parameter sollen z. B. im Sportbereich den Sportler und seinen Betreuern helfen, Trainingsprozesse besser zu monitoren, um Überlastungen und insuffiziente Trainingsreize zu vermeiden. Entsprechend müssen die Bestimmungen der zugrundeliegenden Parameter durch Messungen mit hoher Genauigkeit und Präzession durchgeführt werden. Allerdings weisen einige aktuelle genutzte Biomarker im Bereich des Sports entscheidende Einschränkungen auf, siehe z. B. Halson S. L. Sports Medicine, 44 suppl. 2,S 139 bis 147, 2014. Ein häufig in der Sportpraxis verwendeter Biomarker ist das muskuläre Enzym Creatinkinase (CK), das einen muskulären Integrationsverlust reflektieren solle. Die Messungen dieses Biomarkers zeigen jedoch große intraindividuelle und interindividuelle Variabilitäten und es besteht ein eingeschränkter zeitlicher Zusammenhang mit der Muskelregeneration, z. B.Saw A. E., et al., 2016, British Journal of Sports Medicine 50, 281 bis 291.
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Darüber hinaus weisen biochemische, hormonelle und immunologische Biomarker, wie Blutlaktat, Troponin des Herzens, Cortisol oder C-reaktives Protein eine große Schwankungsbreite auf, werden teilweise tagesrhythmisch reguliert und können somit als nicht zuverlässig und valide zur Bestimmung des physiologischen Belastungszustandes und der Regeneration herangezogen werden. Zu berücksichtigen sind weitere zahlreiche, ergebnisverändernde Einflussvariablen, wie Alter, Geschlecht, Tagesform und Trainingsstatus. Tatsächlich konnte bisher nicht etabliert werden, dass einzelne Parameter einen angemessenen sensitiven und reproduzierbaren Ermüdungs- / Erholungsstatus von Sportlern darstellen können und somit eine solide Trainingssteuerung möglich ist, siehe Hacksteden A., et al., PloS1 11, e0148810, 2016. Bei Kombination mehrerer Biomarker konnte gezeigt werden, dass ein höherer prädiktiver Wert für das Monitoring von Ermüdungs- / Erholungsprozessen möglich ist.
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Es besteht daher nach wie vor ein Bedarf von geeigneten Biomarker und Biomarkerkombinationen um verschiedene Aspekte der Gesundheit und Leistungsfähigkeit von Individuen zu identifizieren, die universeller und mit besserer Vorhersagbarkeit einsetzbar sind. Auf Basis dieser können dann mittels algorithmierter Plattformen Grenzwerte für Belastungen sowie individuelle Regulationsvorgänge valide und solide aufgezeichnet werden.
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Allerdings tauchen hier weitere Probleme auf, von technischer Seite stellen Nachweisgrenzen und Sensitivität der Messungen sowie Kreuzreaktivitäten aber auch entsprechende Beeinflussung durch Fremdverbindungen, wie z. B. bei Albuminen im Blut, ein wesentliches Problem dar. Die bisherigen hochempfindlichen Methoden zur Quantifizierung von Biomarkern schließen immunologische Verfahren, wie Immunoblot und ELISA ein aber auch andere Messverfahren wie Massenspektrometrie, SPR (Oberflächenresonanzspektrometrie) oder Protein-Microarrays. Die immunologischen Messverfahren, wie ELISA und verwandte Systeme, verwenden die Affinität von Antikörpern oder Aptameren als Detektionssensoren, wenn das Signal elektrisch oder optisch verstärkt und selektiert wird. Diese Technologien erlauben den Nachweis von Biomarkern im Picogrammbereichen. Mittlerweile gibt es auch Systeme, die mobil eingesetzt werden können, um physiologische und einfach zu analysierende Biomarker auf DNA, mIRNA, Protein, Peptid oder anderer kleiner Moleküle nachzuweisen.
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Es gibt von der FDA benannte und in Gesundheitsdienstleistungen und zur Kostensenkung geeignete 646 nicht invasive molekulare Biomarker und 592 potentiell minimal invasive molekulare Biomarker im Blut, die für monitoring in der Diagnostik oder Therapie verfügbar sind, siehe Qin C., et all, Sci Rep. 2015;5:17854.
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Physiologische Biomarker im Sport setzen bisher die Blutabnahme und den Transport in ein Analyselabor voraus. Ein Schnelltest vor Ort von spezifischen Markerproteinen und Biomarkern im Allgemeinen steht bisher nicht zur Verfügung.
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Für die Hitzeschockproteine 70/90 wurde eine im Belastungsbereich aber auch in der Immunologie zugewiesen und ihr diagnostisches Potential z. B. im Bereich vom Sport diskutiert, siehe Krüger K., et al., Appl. Physiol. (1985). 2019, 126(4):916-927.doi: 10.1152/japplphysiol.01052.2018. In diesem Übersichtsartikel wird die Rolle von HSP70 und HSP90 in der Trainingsphysiologie und der Immunologie diskutiert, insbesondere unter Bezug auf Entzündungs- und Belastungsstress. Es wird weiterhin diskutiert, dass HSP70 und HSP90 Schlüsselfaktoren nach Stress darstellen, z. B. werden beide nach Belastung in Antwort auf inhärente physiologische Veränderungen exprimiert. Es konnte eine Korrelation zwischen dem Niveau an Plasma HSP70/90 während der Belastung in Abhängigkeit von der Intensität oder Dauer gezeigt werden. Beide Hitzeschockproteine werden daher als potentielle Biomarkerfür den Belastungsbereich angesehen.
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Geeignete schnelle Diagnoseverfahren und Vorrichtungen zur Bestimmung von diesen Hitzeschockproteinen sind allerdings bisher nicht beschrieben.
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Mohammadi-Ostad-Kalayeh S. et al., Bioorganic & Medicinial Chemistry, 2017, 25, 6345-6352, beschreibt die Entwicklung eines Microarray basierten Assays zum effizienten Testen von neuen HSP70-DNACAR Inhibitoren. Dabei wird ein Microarraysensor zur Bestimmung von Nitrocellulosemembranen fixierten Hitzeschockproteinen mit Farbstoff markierten ATP unter Anwesenheit von Inhibitoren beschrieben.
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Es besteht daher ein Bedarf, Konzentrationen geeigneter Biomarker, nämlich der Hitzeschockproteine, möglichst unmittelbar und mobil objektiv messbar zu machen, um die Belastung und Regenerationsvorgänge aufzuzeigen. An solchen schnellen und mobilen Systemen und Verfahren zur Bestimmung dieser Biomarker in Proben der Individuen fehlt es allerdings.
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Es besteht ein Bedarf robuste und valide Testverfahren zur Bestimmung des physiologischen Belastungszustandes in einem Individuum bereitzustellen, wobei diese schnell, einfach anwendbar und mobil erfolgt.
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Beschreibung der Erfindung
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Diese Aufgabe konnte mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß Anspruch 1 und einer erfindungsgemäßen Vorrichtung gemäß Anspruch 12 realisiert werden.
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In einem ersten Aspekt wird ein Verfahren zum Messen Verfahren zum Messen von mindestens einem Biomarker zum Bestimmen des physiologischen Belastungszustandes in einem Individuum bereitgestellt, umfassend:
- a) Bereitstellen einer Probe erhalten von dem zu untersuchenden Individuum;
- b) Inkubieren i) eines ersten Anteils der Probe gemäß Schritt a) mit einem Inhibitor für ein Hitzeschockprotein und ii) eines zweiten Anteils der Probe ohne Inhibitor für das Hitzeschockprotein, mit einem zweiten Bindungspartner spezifisch für einen ersten Bindungspartner, wobei der zweite Bindungspartner ATP gebunden hat zur Bindung von ATP an das Hitzeschockprotein;
- c1) Bereitstellen eines Trägers mit an der Oberfläche vorliegenden Quantenpunkten, wobei diese Quantenpunkte einen ersten Bindungspartner spezifisch für den zweiten Bindungspartner gemäß b) an ihrer Oberfläche gebunden haben;
- d1) Inkubieren des ersten Anteils der Probe und des zweiten Anteils der Probe gemäß Schritt b) mit dem Träger mit an der Oberfläche vorliegenden Quantenpunkten, wobei diese Quantenpunkte den ersten Bindungspartner an ihrer Oberfläche gebunden haben, unter Ausbildung von spezifischen Bindungspaaren aus dem ersten Bindungspartner und dem zweiten Bindungspartner; oder alternativ,
- c2) Separates Aufbringen der beiden Anteile der Probe gemäß Schritt b) auf einen Träger;
- d2) Inkubieren der beiden auf dem Träger vorliegenden Anteile mit einem ersten Bindungspartner mit gebundenen Quantenpunkten und Ausbildung von spezifischen Bindungspaaren aus dem ersten Bindungspartner und dem zweiten Bindungspartner.
- e) Anregen der Quantenpunkte mit einer Strahlenquelle;
- f) Bestimmen der durch die Quantenpunkte emittierten Strahlung;
- g) Bestimmen der Menge an Hitzeschockprotein in der Probe durch Bestimmen der positiven Differenz der emittierten Strahlung des ersten Anteils der Probe mit Inhibitor und des zweiten Anteils der Probe ohne Inhibitor und gegebenenfalls Korrelation dieser Differenz mit einer Vergleichskurve von Proben enthaltend das Hitzeschockprotein in vorbestimmter Konzentration.
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Es konnte überraschend gezeigt werden, dass durch Einsatz von Quantenpunkten eine einfache, schnelle und vor allem mobile Messung von Biomarkern und damit einhergehend eine gute Bestimmung des physiologischen Belastungszustandes in einem Individuum erreicht werden.
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Quantenpunkte sind Nanokristalle, in denen sogenannte Quanteneffekte auftreten. Meist bestehen diese Quantenpunkte aus Halbleitermaterialien und weisen eine Größe von etwa 1 bis 100 nm auf. Die auftretenden Quanteneffekte sorgen dafür, dass die Nanokristalle auch optische, magnetische und auch elektronische Eigenschaften besitzen und unter anderem mit Hilfe von Licht fluoreszieren. Quantenpunkte werden vielfältig eingesetzt, unter anderem als Farbstoff für Marker in der Fluoreszenzmikroskopie und der Durchflusszytometrie aber auch im Bereich der Einzelelektronentransistoren, LEDs und Displays allgemein usw. Quantenpunkte, im Folgenden auch als Q-Dot bezeichnet, eignen sich durch eine entsprechende Emission zur Bestimmung von Markern, insbesondere durch Bestimmung der emittierten Fluoreszenz. Verschiedene Emissionswellenlängen sind mit unterschiedlichen Q-Dots möglich.
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Es wurde festgestellt, dass durch die Kombination von Quantenpunkten bei der Bestimmung von Hitzeschockproteinen ein Verfahren zur Bestimmung des physiologischen Belastungszustandes eines Individuums bereitgestellt werden kann, das mobil verwendbar, einfach handhabbar und schnell verwendbar ist.
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Ein Nachweis erfolgt in kurzer Zeit, wobei durch die bereitgestellte Lösung, nämlich die Bestimmung der Differenz an emittierter Strahlung zwischen einer ersten Probe mit Inhibitor und einer zweiten Probe ohne Inhibitor eine verbesserte Quantifizierung möglich ist. Erfindungsgemäß wird hierbei Gebrauch gemacht von der Tatsache, dass in Anwesenheit des Inhibitors, der spezifisch für das Hitzeschockprotein ist, im Vergleich zu dessen Abwesenheit die Bindung des ATPs an das Hitzeschockprotein ein Quenchen der Fluoreszenz gemessen werden kann. Mit anderen Worten: das Fluoreszenzsignal ist stärker, wenn keine Bindung des Hitzeschockproteins an die Quantenpunkte erfolgt. Bei Bindung des Hitzeschockproteins an die Quantenpunkte wird das Fluoreszenzsignal abgeschwächt. Die Bindung des Hitzeschockproteins (HSP) erfolgt durch die Bindung des ATPs an das HSP, wobei hier eine nicht kovalente Bindung vorliegt. Das ATP ist mit einem zweiten Bindungspartner verknüpft, z. B. Biotin. Biotin bindet spezifisch z. B. an Streptavidin. Streptavidin als erster Bindungspartner ist an die Quantenpunkte gebunden. Entsprechend findet bei Ausbildung eines spezifischen Bildungspaares aus dem zweiten Bindungspartner und dem ersten Bindungspartner, z. B. Biotin-Bindung an Streptavidin, ein Quenchen des Fluoreszenzsignals emittiert durch die Quantenpunkte statt. Hingegen bewirkt das Vorhandensein des Inhibitors, dass kein ATP an das Hitzeschockprotein gebunden wird. Entsprechend ist dann das emittierte Fluoreszenzsignal der Quantenpunkte stärker. Diese Differenz erlaubt die quantitative bzw. semiquantitative Bestimmung des Hitzeschockproteins. Wie ausgeführt, ist dabei Grundlage dieses Verfahrens ein Quenchen des Signals, und nicht wie bei üblichen immunologischen Verfahren, die Verstärkung eines Fluoreszenzsignals.
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In einer Ausführungsform ist dabei das erfindungsgemäße Verfahren eines, bei dem eine Probe des zu untersuchenden Individuums bereitgestellt wird. Diese Probe wird dann aufgeteilt in einen ersten Anteil und einen ersten Anteil, der erste Anteil wird mit Inhibitor, der zweite Anteil ohne Inhibitor inkubiert. Eine Inkubation mit ATP in Anwesenheit oder Abwesenheit des Inhibitors findet bei üblichen Verfahrensbedingungen statt. Das eingesetzte ATP ist dabei eines, das an einen zweiten Bindungspartner gebunden ist. Entsprechend bilden sich HSP-ATP-Moleküle aus, bzw. HSP-Inhibitor-Moleküle.
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Nach entsprechender Behandlung dieser inkubierten Proben zum Abtrennen ungebundenen ATPs und Inhibitor-Moleküle, werden diese Proben dann in eine Ausführungsform auf einen Träger aufgebracht. Diese Träger weisen dabei auf einer Oberfläche vorliegende Quantenpunkte auf. Diese Quantenpunkte sind dabei solche, die einen ersten Bindungspartner an ihrer Oberfläche gebunden haben. Bei Aufbringen des ersten und zweiten Anteils der obigen inkubierten Probe kann dann an HSP gebundenes ATP mit zweitem Bindungspartner ein Bindungspaar mit dem ersten Bindungspartner gebunden an den Quantenpunkten spezifisch ausbilden. Nach entsprechenden weiteren Zwischenschritten, wie waschen, etc., erfolgt ein Anregen der Quantenpunkte mit einer Strahlenquelle und Bestimmen der durch die Quantenpunkte emittierten Strahlung. Hierdurch ist die Bestimmung der Menge an Hitzeschockproteinen in der Probe möglich, nämlich durch Bestimmen der positiven Differenz der emittierten Strahlung des ersten Anteils der Probe mit Inhibitor und des zweiten Anteils der Probe ohne Inhibitor. Eine Quantifizierung kann ggf. durch Korrelation dieser Differenz mit einer Vergleichskurve von Proben enthaltend das Hitzeschockprotein in vorbestimmter Konzentration erfolgen. Bei dieser Vergleichskurve mit Proben enthaltend das Hitzeschockprotein in vorbestimmter Konzentration erfolgt ebenfalls einer Aufteilung in zwei Anteile, die entsprechend wie die zu untersuchende Probe mit und ohne Inhibitor inkubiert werden.
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In einer alternativen Ausführungsform wird nach Bereitstellen der Probe von dem zu untersuchenden Individuums die Inkubation dieser Probe aufgeteilt in einen ersten Anteil und einen zweiten Anteil durchgeführt, wobei einer dieser Anteile ein Inhibitor für das Hitzeschockprotein enthält. Die Inkubation erfolgt mit ATP gebunden an den zweiten Bindungspartner, wie oben beschrieben. Diese beiden Anteile der Probe werden dann separat auf einen Träger aufgebracht, um auf diesen Träger zu binden. Nach dem Aufbringen der Anteile der Probe und dem Binden des Hitzeschockproteins an den Träger werden die gebundenen Anteile mit einem ersten Bindungspartner mit gebundenen Quantenpunkten inkubiert unter Ausbildung von spezifischen Bindungspaaren aus dem ersten Bindungspartner und dem zweiten Bindungspartner und sich dadurch ergebend spezifische Bindungen der Quantenpunkte an an HSP gebundenen ATP. Nach Inkubation und ggf. unter entsprechenden Zwischenschritten zur Entstehung von nicht gebundenen Quantenpunkten, erfolgt ein Anregen der gebundenen Quantenpunkte mit einer Strahlenquelle und das Bestimmen der durch die Quantenpunkte emittierten Strahlung. Die Bestimmung der Menge an Hitzeschockproteinen in der Probe erfolgt durch das Bestimmen der positiven Differenz der emittierten Strahlung des ersten Anteils der Probe mit Inhibitor und des zweiten Anteils der Probe ohne Inhibitor. Ggf. kann eine Korrelation dieses Differenzwertes mit einer Vergleichskurve von Proben enthaltend das Hitzeschockprotein in Form bestimmter Konzentrationen und inkubiert mit und ohne Inhibitor entsprechend den Anteilen, der zu untersuchenden Probe bestimmt werden.
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Dem Fachmann sind die entsprechenden notwendigen Verfahrensschritte bekannt, insbesondere die geeigneten Inkubationspuffer, Waschpuffer und ggf. notwendige Absättigungspuffer. In einer Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren das Abtrennen von nicht gebundenen zweiten Bindungspartnern mit ATP und ggf. des Inhibitors des Hitzeschockproteins nach Schritt b) durch geeignete Waschpuffer mit den entsprechenden Verfahrensschritten. In einer weiteren Ausführungsform ist eine solche Abtrennung nicht notwendig, da nur die gebundenen Kandidatenmoleküle über die Q-dots markiert sind. Aus der Differenz des Signals Biotin-ATP zu nicht gebundenem Biotin-ATP über nicht markiertes ATP oder Hsp90/70 Inhibitoren entsteht ein Differenzsignal. Man kann also Biotin-ATP und Streptavidin - Qdots in die eine Probe einbringen und den identischen Ansatz mit Inhibitor, dann auf eine Oberfläche auftragen und dann die Fluoreszenz bestimmen oder die Streptavidin - QDots vorher auf eine Oberfläche aufbringen und dann die Inkubation wie oben zuvor geschildert durchführen. Hierbei ist vorteilhaft, dass kaum freies ungebundenes Biotin-ATP >1 nM bei beispielsweise ab 80 nM QDot vorliegt.
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Bein einen Separationsverfahren kann eine Oberflächen mit einem Antikörper/Aptamer beschichtet werden und dann ungebunden im Vergleich zu gebunden mittels Streptavidin -ATP nachweisen und den optischen Nachweis über die Streptavidin - Qdots führen.
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In einer Ausführungsform bei der die Anteile der Probe mit dem ATP in Anwesenheit oder Abwesenheit des Inhibitors inkubiert wurden, werden diese Gemische auf den Träger aufgebracht, z. B. durch Tropfen, und dann getrocknet. Anschließend wird der Träger mit geeigneten Verbindungen, wie BSA, oder mit einem Glycinpuffer abgesättigt, mit geeigneten Spüllösungen gespült und dann mit Q-Dots mit ersten Bindungspartnern, wie Streptavidin, inkubiert. Ungebundene Q-Dots werden dann entsprechend mit Waschpuffer abgewaschen und die Intensität der Bindung als Emission gemessen.
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In einer Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Verfahren eines, bei dem das Hitzeschockprotein HSP90 bestimmt wird. In einer Ausführungsform werden beide Hitzeschockproteine, die ATP binden, bestimmt.
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Unter dem Ausdruck Hitzeschockprotein wird vorliegend verstanden ein Protein das unter Stress (Temperatur, Schwermetalle, Salze, Osmotische Änderungen, ROS, pH etc.) vermehrt synthetisiert wird. Hitzeschockproteine binden ATP und anti-Hsp Inhibitoren binden entsprechend an HSP. Vertreter bei dem Mensch sind HSP70 und HSP90.
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Geeignete Inhibitoren für die HSP schließen ein Radicicol, und andere Inhibitoren, die an der ATP-Bindestelle ATP verdrängen wie 17AAG, Geldanamycin, Reblastatin- und Derivate, Gambogic acid (CAS 2752-65-0), AUY922, VER155008.
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In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Bestimmung einer Vergleichskurve von Proben enthaltend HSP in vorbestimmter Konzentration durch Verwendung dieser Vergleichskurve. Alternativ können Verdünnungsreihen der Q-Dots aufgetragen werden, um eine Messskala für konzentrationsabhängiges Binden zu erzielen. Das heißt, ein geringer Anteil an Biomarkerproteinen, sprich HSP, führt zur vorzeitigen Absättigung der Bindungsplätze, sodass keine freien Plätze an den Q-Dots bleiben und ein starkes Signal zu messen ist. Ein starkes Signal bedeutet keine Bindung, ein geringes Signal bedeutet Bindung. Aus dem Grad der Verdrängung des Fluoreszenzsignals kann auf die spezifische Anwesenheit des Biomarkers geschlossen werden. Dadurch ist eine entsprechende Miniaturisierung des Verfahrens und Verwendung dieser für diagnostische Zwecke möglich.
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Insbesondere können die in einer Ausführungsform verwendeten Träger mit gebundenen Q-Dots mit dem ersten Bindungsträger als Teststreifen lagerfähig bereitgestellt werden.
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Geeignete Trägermaterialien schließen ein Nitrocellulose (NC) die als NC-Arrays oder NC-Chips bereitgestellt werden können und entsprechend Teststreifen darstellen. Andere geeignete Trägermaterialien sind Glas, Silizium, PFTE, Aluminium, Gold, Iridium, Silber oder Platin. Insbesondere Nitrozellulose ist ein geeigneter Träger, auf dem die Q-Dots aber auch, in der alternativen Ausführungsform, die in der Probe vorliegenden Moleküle ggf. gebunden mit ATP mit zweitem Bindungspartner gebunden werden können.
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In einer Ausführungsform werden mehrere Wiederholungen, wie 5 bis 10 Wiederholungen, durchgeführt, sodass eine hohe statistische Absicherung der Messwerte erfolgen kann.
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In einer Ausführungsform sind die Bindungspartner dabei Streptavidin / Biotin. Dem Fachmann sind andere geeignete Bindungspartner bekannt, z. B. andere Bindungspartner des Biotin.
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Wie ausgeführt, kann in einer Ausführungsform Proben mit vorbestimmten Mengen an HSP zur Kalibrierung des Verfahrens eingesetzt und gemessen werden. In einer Ausführungsform erfolgt dabei die Messung jeder Probe mindestens dreifach unter Bestimmung des Durchschnittswerts dieser Probe.
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In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Bestimmung des physiologischen Belastungszustandes durch Messen des Biomarkers, HSP, in einer Probe ausgewählt Blut, Urin, Sputum, Gewebe, wie Tumorgewebe, Schweiß, Zellen oder Organoide. Insbesondere eignet sich ein Bestimmen aus Blut, das als Vollblut, Serum oder Plasma verwendet werden kann.
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In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin den Schritt eines Vergleichs der bestimmten Menge an HSP mit einer bestimmten Menge des HSP in dem Individuum zu einem früheren Zeitpunkt.
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Durch diesen Vergleich ist es möglich, die Belastungszustände des Individuums über einen längeren Zeitpunkt zu beobachten und insbesondere Trainingserfolge und Trainingsmaßnahmen zu bestimmen.
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In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt dabei der Vergleich der bestimmten HSP Konzentrationen durch Abgleich mit in einer Datenbank hinterlegten Werten.
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Unter dem Ausdruck Individuum wird vorliegend insbesondere ein Mensch verstanden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere ein in vitro Verfahren.
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In einem weiteren Aspekt wird eine Vorrichtung bereitgestellt, wobei diese Vorrichtung geeignet ist zum Messen von mindestens einem Biomarker zum Bestimmen des physiologischen Belastungszustandes in einem Individuum. Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist dabei eine Einrichtung zur Aufnahme eines Trägers auf. Dieser Träger ist dabei in einer Ausführungsform einer, der an der Oberfläche vorliegende Quantenpunkte aufweist, wobei diese Quantenpunkte einen ersten Bindungspartner an ihrer Oberfläche gebunden haben. In einer alternativen Ausführungsform ist der Träger einer zum Binden von Bestandteilen einer zu untersuchenden Probe. Weiterhin weist die Vorrichtung Reaktionsräume zur Inkubation einer Probe mit Reaktanten auf. Diese Reaktanten sind insbesondere solche Reaktanten wie oben beschrieben. Die Vorrichtung weist weiterhin Einrichtungen zur Bereitstellung und Aufnahme von Liquiden und Einrichtungen zum Fördern von Liquiden auf. Diese Einrichtungen zur Bereitstellung und Aufnahme von Liquiden können dabei herausnehmbar ausgestaltet sein, um die entsprechenden Liquide wie Proben, Lösungen enthaltend ATP mit zweitem Bindungspartner, Inhibitor aber auch Waschpuffer, Sättigungspuffer, etc., einzubringen. Darüber hinaus können entsprechend verwendete, verbrauchte Liquide aus dem System entfernt werden. Weiterhin weist die Vorrichtung eine Strahlenquelle zur Anregung von Quantenpunkten auf. Darüber hinaus ist ein Detektor zur Erfassung von durch die Quantenpunkte emittierter Strahlung vorhanden. Die Vorrichtung weist daneben eine Recheneinheit zur Bestimmung der mit dem Detektor erfassten Strahlung und Bestimmung der Menge an Hitzeschockproteinen auf sowie eine Ausgabeeinheit dieser bestimmten Werte.
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Dem Fachmann sind geeignete Einrichtungen und Vorrichtungen bekannt. Insbesondere ist diese Vorrichtung eine mobile Vorrichtung.
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In einer Ausführungsform ist dabei die Strahlungsquelle ein Laser oder eine LED-Quelle.
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Dem Fachmann sind geeignete Strahlungsquellen, die in der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesetzt werden können, bekannt.
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In einer weiteren Ausführungsform weist die erfindungsgemäße Vorrichtung ein Mikrofluidsystem auf, um die entsprechenden Verfahrensschritte durchzuführen. Dem Fachmann sind geeignete Einrichtungen und geeignete Mikrofluidsysteme bekannt.
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Weiterhin ist die erfindungsgemäße Vorrichtung in einer Ausführungsform eine, die eine Einheit zur Probenaufbereitung aufweist. Die Probenaufbereitung kann z. B. eine sein zum Erhalt von Serum oder Plasma aus einer Vollblutprobe oder zur Verflüssigung von Gewebeproben, etc.
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In einer weiteren Ausführungsform ist die Vorrichtung eine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
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Unter Bezugnahme auf das Fließdiagramm gemäß 1 wird das erfindungsgemäße Verfahren noch einmal näher erläutert.
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In einem ersten Schritt 1 wird die zu untersuchende Probe des Individuums bereitgestellt.
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Die Probe wird dann in vitro in einem ersten Anteil 2a und einem zweiten Anteil 2b aufgeteilt. Der erste Anteil 2a wird mit Inhibitor für das HSP und dem zweiten Bindungspartner gebunden an ATP inkubiert. Der zweite Anteil 2b wird mit ATP aber ohne Inhibitor inkubiert. Diese inkubierten Proben 2a und 2b können entsprechenden Aufbereitungsschritten, wie Abtrennen des Inhibitors und des ATPs sowie Waschen der Probe unterworfen werden. Diese beiden Anteile werden dann in einer ersten Alternative entsprechend den Schritten c1) und d1) des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter prozessiert. Dabei wird im Schritt 3a ein Träger mit einer Oberfläche mit vorliegenden Quantenpunkten bereitgestellt. Diese Quantenpunkte haben einen ersten Bindungspartner an ihrer Oberfläche gebunden, wobei dieser erste Bindungspartner spezifisch mit dem zweiten Bindungspartner aus Schritt 2a und 2b ein spezifisches Bindungspaar bildet. 4a kennzeichnet den Schritt gemäß d1), umfassend das Inkubieren des ersten Anteils 2a und des zweiten Anteils 2b der Probe mit dem Träger mit an der Oberfläche vorliegenden Quantenpunkten und mit dem ersten Bindungspartner gebunden an der Oberfläche dieser Quantenpunkte. Dabei findet eine Ausbildung von spezifischen Bindungspaaren aus dem ersten Bindungspartner und dem zweiten Bindungspartner statt. Anschließend werden die Träger mit den spezifischen Bindungspaaren gewaschen und die Quantenpunkte werden mit einer Strahlenquelle angeregt 5. Die emittierte Strahlung der Quantenpunkte wird bestimmt, 6, und mit Hilfe hiervon wird die Menge ans Hitzeschockproteinen in der Probe bestimmt durch Bestimmen der positiven Differenz der emittierten Strahlung des ersten Anteils der Probe mit Inhibitor 2a und des zweiten Anteils der Probe ohne Inhibitor 2b ggf. mit Korrelation 8 dieser Differenz mit einer Vergleichskurve von Proben enthaltend das Hitzeschockprotein in vorbestimmter Konzentration.
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Auf Basis dieser Bestimmung an der Menge der Hitzeschockproteine kann der physiologische Belastungszustand bestimmt werden, 9. In einer Ausführungsform findet dabei ein Vergleich mit früher bestimmten Daten, 10, von Proben des Individuums statt, um Änderungen des physiologischen Belastungszustandes zu erkennen.
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In einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Anteile der Proben 2a und 2b separat auf einen Träger aufgebracht, 3b. Nach Aufbringen und Binden der in den Anteilen vorhandenen Molekülen an den Trägern findet ggf. ein Waschen und Absättigen der Träger gemäß bekannten Verfahren statt. Im anschließenden Schritt 4b werden die auf dem Träger vorliegenden Anteile mit Quantenpunkten, die einen ersten Bindungspartner aufweisen, inkubiert, zur Ausbildung von spezifischen Bindungspaaren aus dem ersten Bindungspartner und dem zweiten Bindungspartner. Nach entsprechenden Waschschritten erfolgt dann die Anregung der Quantenpunkte mit einer Strahlenquelle 5 und die weiteren Schritte wie oben ausgeführt.
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Die 2 zeigt das Testprinzip auf einem Nitrocellulose-Microarray. Die Q-Dots mit Streptavidin sind an die Nitrocellulosemembran gebunden. Der Biomarker, HSP, wird über den Biotin Ligand als zweiten Bindungspartner an das Q-Dot Streptavidin gebunden. Der Biotin Ligand ist ein Biotin-ATP welches an HSP binden kann. Im Falle eines Inhibitors oder Antagonisten - die Begriffe Inhibitor und Antagonist werden in dieser Anmeldung synonym verwendet - findet keine Bindung des Biomarkers an die Q-Dot statt. Lediglich das Biotin mit Ligand bindet an das Streptavidin. Als Konsequenz ist die Fluoreszenzintensität bei Bindung des Biomarkers abgeschwächt.
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Wenn ein Inhibitor (Antagonist) die Bindung verhindert, ist ein stärkeres Fluoreszenzsignal messbar.
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Im Folgenden wird der Gegenstand der Erfindung näher erläutert, ohne dabei beschränkt zu sein:
- In (links) sind verschiedene Konzentrationsreihen d,h. 10 Spots pro Reihe an Q-dots aufgetragen, beginnend mit 100 nM (1), 80 nM (2) bis 20 nM (6). Bis 40 nM ist ein Fluoreszenzsignal zu erkennen. In (rechts) wurde überprüft wie stark das Signal durch eine Blockierungslösung reduziert wird. Nach Inkubation mit 50 µM oder 10 µM Ligand (Biotin-ATP) das Fluoreszenzsignal komplett reduziert wurde ( , u r). Daraus folgt, dass die Fluoreszenzlöschung zum Nachweis von gebundenem Biotin-ATP genutzt werden kann. Der Konzentrationsbereich Biotin-ATP ist so zu wählen, dass Biotin-ATP vollständig absorbiert ist bzw. der Anteil an freiem Biotin-ATP unter 1 bis max. 10 nM liegt bei einem Einsatz von ca. 100 nM QDots. Werden die Biomarkerproteine vorher mit einem Inhibitor belegt kann Biotin-ATP nicht binden und es kommt zu keiner Fluoreszenzlöschung. Aus der Differenz der Signalintensitäten mit und ohne Inhibitor kann die Menge des Stress-Biomarkers bestimmt werden.
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Die erfindungsgemäße Bestimmung von HSP erlaubt eine Bestimmung des physiologischen Belastungszustandes eines Individuums. Eine entsprechende Bestimmung ist wohl von medizinischer aber auch von sportmedizinischer Bedeutung. Die erfindungsgemäße Vorrichtung als mobile Vorrichtung erlaubt eine schnelle Bestimmung des Belastungszustandes und von Belastungsereignissen. Die erfindungsgemäße Vorrichtung und das erfindungsgemäße Verfahren können darüber hinaus aber auch in anderen Bereichen eingesetzt werden, um z. B. Stress bei chirurgischen Eingriffen zu verfolgen oder bei anderen medizinischen Anwendungen, wie Therapien usw.
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Andere Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst die Bestimmung von Stress bei Tieren. Stress bei Tieren (z.B. Schweinen vor der Schlachtung) hat einen Einfluss auf die Fleischqualität. Auch der Stress bei Pflanzen ist ein zentrales Problem und beeinflusst beispielsweise Schnittblumen, oder Pflanzen in der Nahrungsmittelproduktion. In der weißen Biotechnologie spielt Stress eine wichtige Rolle beispielsweise bei der Produktion von Insulin oder Antikörpern und kann die Produktionsqualität als auch die Margensicherheit beeinflussen. Um Stress frühzeitig zu erkennen, ist es wichtig ein diagnostisches Werkzeug wie die vorliegende Vorrichtung das das erfindungsgemäße Verfahren für die schnelle Diagnose zu haben.
