JP2006275668A

JP2006275668A - 生体用金属材料の生体適合性評価方法

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Publication number: JP2006275668A
Application number: JP2005093271A
Authority: JP
Inventors: Yasuko Numata; 泰子沼田; Fumiyoshi Shudo; 文榮首藤; Masahiko Chiba; 晶彦千葉
Original assignee: Iwate University
Current assignee: Iwate University
Priority date: 2005-03-28
Filing date: 2005-03-28
Publication date: 2006-10-12

Abstract

【課題】より簡便、低コストで迅速な分析を可能とし、しかもＮｉの遊離形態に基づいて、Ｎｉ含有の各種の生体用金属材料を、Ｎｉアレルギーの観点からの評価をも可能とする、新しい生体適合性の評価方法を提供する。
【解決手段】Ｎｉ含有金属材料の生体適合性評価の方法であって、Ｎｉ含有金属粒子を血清タンパク質でインキュベートした後に紫外可視吸収スペクトルのＮｉによる吸光度の変化から、
＜Ａ＞Ｎｉの遊離形態
＜Ｂ＞タンパク質の立体構造の変化
を検知する。
【選択図】図１

Description

現在、バイオマテリアルとして金属材料、セラミックス材料、高分子材料等が使用されている。中でも、金属材料は強度、延性、弾性、靱性および剛性などの機械的特性と塑性加工性に優れている。そのためボーンプレート、スクリュー等の骨折固定材、歯冠、義歯床等の歯科分野、ステント動脈瘤、クリップ等の循環器分野および人工関節等の整形外科分野など、多岐にわたる医療目的に使用されている。

しかし、金属材料は他の材料とは異なり、生体になじみにくい材料であるため、生体内で腐食、摩耗、破損を生じ、その結果生体はアレルギー、癌、奇形等を起こすといったことが問題とされている。現在、生体内においては比較的耐食性に優れた金属および合金が使用されているが、問題解決の域までには至っていない。

バイオマテリアルは、生体内環境において使用されるため生体に無害な材料でなければならず、広範囲の物理的特性、化学特性、生物学特性を兼ね備えた材料の開発が求められている。

このようなことから、医療用等の金属材料についてはその生体適合性の簡便で、かつ的確な評価のための方法が必要とされているところであるが、現状においては、たとえば血清タンパクとの結合性による血栓形成性や、細胞毒性、あるいは金属アレルギーの判定、評価の方法等は必ずしも適切なものとして確立されていないのが実情である。このような状況は、医療用等の生体適合性金属材料の開発や改良にとっての大きな制約要因となっている。

たとえば、高い弾性率を有し、硬く、強度も大きくて耐食性にも優れていることから、長期にわたる生体内での安定性の高いインプラントとして利用されているＣｏ−Ｃｕ−Ｍｏ合金材においては、伸び、強度および加工性を向上させるために、鋳造合金では１％、加工材では１０％以上のＮｉが添加されている。しかしながら、Ｎｉは、それ自身ではアレルギー性を示さないが、腐食などによりＮｉ²⁺として生体内に溶出し、タンパク質と結合することでアレルギー反応を起こすことが問題とされている（非特許文献１−２）。そこで、Ｎｉのアレルギー性が指摘されてから、鋳造用VitalliumではＮｉが１％未満の合金の開発が行われるようになった（非特許文献３）。しかし、加工用Vitalliumでは、依然としてＮｉを多く含んでいるという点、１％未満のＮｉでも生体内で溶出しアレルゲンとなり、アレルギーを引き起こすなど、問題解決までには至っていない。

ただ、このＮｉアレルギーについては、アレルギーの成立機構が必ずしも明らかでなく、その理由の一つは、アレルギーの発生を予想するための判定、評価に係わる方法そのものに問題があることが指摘される。

既存技術はＪＩＳ規格に基づく細胞毒性評価であり、判定に２週間以上を要すること、細胞培養に高度の専門的技術と多額の経費を必要とすること、これらの判定を行っても個体レベルでのＮｉのアレルゲン性を評価できないこと、などの問題点があった。また、文献的に報告されているＮｉのアレルゲン性の評価法では、多くの動物と長期の検査期間を必要とする。

そして、Ｎｉがアレルゲンになるためには、生体高分子との結合、タンパク質の立体構造の変化や複合体の形成などの過程が予想されるが、たとえば、これまでのＮｉアレルギーの検査方法では、Ｎｉ粒子に血清を加え、ＩＣＰ発光分光分析によってＮｉイオンが溶出するか否かをもって判定、評価しているが、計測精度の問題があるだけでなく、生体適合性の評価方法としての妥当性に問題が残されていた。

それと言うのも、本発明の発明者らの検討によれば、Ｎｉイオンの溶出の有無だけではなく、Ｎｉアレルギーについての判定、評価では、生体に作用するＮｉの遊離形態そのものが検証されねばならないと考えられるからである。このＮｉの遊離形態に基づく判定、評価の方法が確立される場合には、Ｎｉを含有する各種の医療用金属材料について生体適合性の判定、評価はより合理的で信頼性の高いものとなることが期待される。
筏義人：金属系バイオマテリアルの基礎と応用、アイシーピー、2000 植木厚：環境汚染物質の生体への影響３ニッケル、東京化学同人、1997 Annual Book of ASTM standards, vol 13.01, Medical device, Emergency Medical Service, 1998

本発明は、以上のとおりの背景から、より簡便、低コストで迅速な分析を可能とし、しかもＮｉの遊離形態に基づいて、Ｎｉ含有の各種の生体用金属材料を、Ｎｉアレルギーの観点からの評価をも可能とする、新しい生体適合性の評価方法を提供することを課題としている。

本発明は、上記の課題を解決するものとして、以下の方法を提供する。

第１：Ｎｉ含有金属材料の生体適合性評価の方法であって、Ｎｉ含有金属粒子を血清タンパク質でインキュベートした後に紫外可視吸収スペクトルのＮｉによる吸光度の変化から、
＜Ａ＞Ｎｉの遊離形態
＜Ｂ＞タンパク質の立体構造の変化
を検知することを特徴とするＮｉ含有の生体用金属材料の生体適合性評価方法。

第２：インキュベーションの条件は、温度条件が３５℃から４０℃の範囲であり、時間条件が１５分から２５分の範囲であることを特徴とする上記の生体適合性評価方法。

上記のとおりの本発明によれば、従来に比べてより簡便、低コストで迅速な分析を可能とし、しかもＮｉの遊離形態に基づいて、Ｎｉ含有の各種の生体用金属材料を、Ｎｉアレルギーの観点からの評価をも可能とする、新しい生体適合性の評価方法が提供される。

本発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、以下にその実施の形態について説明する。

本発明は、Ｎｉ粒子と血清タンパク質との接触において、溶出するＮｉイオンとＮｉ粒子は各々の遊離形態による異なる様式でタン白質の構造変化を引き起こし、このことは、紫外可視吸収スペクトルの変化として検出することができるとの、これまでに知られていない全く新しい知見に基づいている。

生体内においては、Ｎｉまず、Ｎｉイオンまたは小さいＮｉ粒子として溶出する。そして、その溶出したＮｉイオンまたはＮｉ粒子がそれぞれ異なる様式でタンパク質と接触し、結合することでタンパク質の立体構造を変化させ、タンパク質複合体を形成すると思われる。立体構造の変化したタンパク質は、生体内で異物（アレルゲン）として認識され、アレルギーを引き起こすことが考えられる。

そこで、Ｎｉによるインキュベーション後の紫外可視光吸収スペクトルを観察することによって、各種のＮｉを含有する医療用、生体用の金属材料についてＮｉアレルギーを発現させる可能性を検知し、評価することが可能となる。

対象としての金属材料は、Ｎｉを含有しているものであれば各種のものであってよく、細片、粒子として試験のための試料とすることができる。血清とのインキュベーションについては、好適には、３５℃〜４０℃で、１５分〜２５分の範囲とすることが考慮される。

そこで、以下により詳しく本発明について、Ｎｉを対象とした場合として説明する。
＜試料＞
プラズマ回転電極(Plasma Rotating Electrode Process；PREP)により作製された、平均３００〜５００μｍのＮｉ粒子を用いた。血清は牛の血清（コスモ）を使用した。
＜紫外可視吸収スペクトル＞
１）Ｎｉ粒子処理血清
Ｎｉ粒子（０．１ｇ，０．２ｇ，０．５ｇ）に、牛の血清１．１ｍｌをそれぞれの量のＮｉ粒子に加え、３７℃で０分，２０分または４０分間インキュベートし、測定に用いた。

またＮｉ粒子２．５ｇとＰＢＳにより５倍、２０倍および６００倍に希釈した血清を同様に反応させ、３７℃で２０分間インキュベートし、測定に用いた。

ＰＢＳおよびＨ₂ＯとＮｉ粒子２．５ｇを接触させ、その溶出液に血清を加え、測定を行った。

２）Ｎｉ標準液処理血清
Ｎｉ標準液は、Ｎｉ（ＮＨ₃）₂１０００ｐｐｍを使用した。Ｎｉ標準液にＨ₂Ｏを加え、１００ｐｐｍ，１０ｐｐｍ，１ｐｐｍ，０．１ｐｍｍ，０．０１ｐｐｍとした。原液または調製したＮｉ標準液と稀釈した血清（×１，×２０，×６００）９００を混合し、Ｎｉの終濃度が１００ｐｐｍ，１０ｐｐｍ，１ｐｐｍ，０．１ｐｍｍ，０．０１ｐｐｍ，０．００１ｐｐｍになるようにＮｉ標準液処理血清を調製し、３７℃で２０分間インキュベートした後、測定に用いた。

同様に、Ｎｉ濃度０．１ｐｍｍ，０．３ｐｐｍ，１ｐｐｍ，３ｐｐｍ，１０ｐｐｍとし、５倍に稀釈した血清を加え、３７℃で２０分間インキュベートし、測定に用いた。

３）スペクトル観察
Ｎｉ標準液による血清タンパク質のスペクトル変化より、Ｎｉイオンは血清タンパク質と接触すると、血清タンパク質の４１０ｎｍ，２８０ｎｍおよび２１０ｎｍ付近の吸光度を大きく上昇させることが確認される。また、その変化はＮｉイオン濃度に依存しており、Ｎｉ濃度増加とほぼ比例して吸光度上昇が起こっていた。波長４００〜４１０ｎｍは鉄、ヘム鉄、２８０ｎｍ付近はトリプトファン（２８０ｎｍ）、チロシン（２７５ｎｍ）等のクロムホア、２１０ｎｍ付近はα−ヘリックスの吸収地帯である。すなわち、血清タンパク質の４１０ｎｍ，２８０ｎｍおよび２１０ｎｍ付近の吸光度の変化は、Ｎｉが血清タンパク質に結合し、ヘム鉄、クロムホアおよびα−ヘリックスの分子内環境に影響を与え、タンパク質の立体構造を変化させたため起こったものと考えられる。

一方、Ｎｉ粒子による血清タンパク質のスペクトル変化より、Ｎｉ粒子は血清タンパク質の４１０ｎｍ，２８０ｎｍおよび２１０ｎｍ付近の吸光度を大きく低下させた。また、吸光度の変化はインキュベートする時間が長いほど、すなわちＮｉ粒子との接触時間が長いほど、大きくなり、Ｎｉ粒子量にも依存していた。

吸光度低下の要因としては、Ｎｉ粒子へのタンパク質吸着も考えられるが、測定に用いた血清の量（１．１ｍｌ）に含まれるタンパク質の量では、大幅な吸光度変化は考えにくい。

図１は、上記のＮｉイオンとＮｉ粒子の場合の吸収スペクトルと差スペクトルを例示したものである。

Ｎｉ粒子と血清タンパク質が接触すると、Ｎｉが血清に溶出する。ＮｉイオンとＮｉ粒子はそれぞれ異なる様式でタンパク質の構造変化を引き起こし、これによって、Ｎｉイオンは血清タンパク質の４１０ｎｍ，２８０ｎｍおよび２１０ｎｍ付近の吸光度を大きく上昇させる。一方、Ｎｉ粒子は、血清タンパク質の４１０ｎｍ，２８０ｎｍおよび２１０ｎｍ付近の吸光度を大きく低下させる。

生体内においては、Ｎｉはまず、Ｎｉイオンまたは小さいＮｉ粒子として溶出する。そして、その溶出したＮｉイオンまたはＮｉ粒子がそれぞれ異なる様式でタンパク質と接触し、結合することでタンパク質の立体構造を変化させ、タンパク質複合体を形成すると思われる。立体構造の変化したタンパク質は、生体内で異物（アレルゲン）として認識され、アレルギーを引き起こすと考えられる。

紫外可視光吸収スペクトルの例を示したものである。

Claims

Ｎｉ含有金属材料の生体適合性評価の方法であって、Ｎｉ含有金属粒子を血清タンパク質でインキュベートした後に紫外可視吸収スペクトルのＮｉによる吸光度の変化から、
＜Ａ＞Ｎｉの遊離形態
＜Ｂ＞タンパク質の立体構造の変化
を検知することを特徴とするＮｉ含有の生体用金属材料の生体適合性評価方法。
インキュベーションの条件は、温度条件が３５℃から４０℃の範囲であり、時間条件が１５分から２５分の範囲であることを特徴とする請求項１の生体適合性評価方法。