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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Fachgebiete Medizin,
Biologie und Biochemie. Ihre Anwendungen betreffen Bereiche der
Human- und Veterinärmedizin.
Ganz besonders beschreibt die Erfindung neue Verfahren, welche die
Feststellung des Vorhandenseins und/oder die Ermittlung der Menge
an Proteinen oder Glycoproteinen mittels quantitativer Bestimmung
in den Nasensekreten erlauben. Spezifischer beschreibt die Erfindung
Verfahren, die besonders für
die quantitative Bestimmung des Vorhandenseins von Immunglobulinen,
insbesondere von Typ E Immunglobulinen (IgE), in Nasensekreten zweckdienlich
sind. Die vorliegende Erfindung beschreibt ebenfalls Materialien
und Kits für
die Durchführung
dieser Verfahren, sowie ihre Anwendungen, zum Beispiel bei der Erkennung
oder Charakterisierung des allergischen Potenzials von Personen.
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Die
Durchführung
einer quantitativen Bestimmung von Proteinen oder Glycoproteinen,
wie IgE, aus Tränenflüssigkeiten
ist bekannt. So beschreibt die französische Patentanmeldung, Nr.
FR 9015200 , eine quantitative
Bestimmung von Proteinen in Tränen
mit Hilfe eines Streifens, auf dem die IgE adsorbieren, und einer
anschließenden
immunologischen Anzeige der vorhandenen IgE. Obwohl dieses Verfahren
sehr effizient ist, weist es jedoch bestimmte Beschränkungen
auf. Es ist nämlich
bekannt, dass das Auge aus immunologischer Sicht ein relativ isoliertes
Organ ist, so dass die gemessenen IgE in den Tränen eine im Wesentlichen lokale
Sensibilität
widerspiegeln (d.h. das mögliche
Vorliegen von Allergien, die das Auge betreffen), aber wenig über den
eher allgemeinen Zustand eines Patienten oder über weitere lokale allergische
Sensibilisierungen aussagen.
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Die
anderen gegenwärtig
verfügbaren
Verfahren für
die quantitative Bestimmung von Immunglobulinen, wie die IgE, basieren
im Wesentlichen auf der Messung der IgE-Gehalte im Blut oder Serum. Diese
Techniken erfordern eine Blutentnahme beim Patienten. Andererseits
erlauben die quantitativen Serumbestimmungen nicht immer eine zuverlässige oder
vollständige
Aussage über
den allgemeinen allergischen Zustand einer Person in dem Maße, wo die Sensibilität einer
Person nicht nur von den zirkulierenden IgE sondern ebenfalls von
den in Gewebe und/oder an Zellen gebundenen IgE abhängig ist. Insbesondere
erlauben diese quantitativen Bestimmungen allein nicht, die Gesamtheit
der sich entwickelnden allergischen Phänomene bei einer Person zu
erkennen.
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Es
besteht folglich ein tatsächlicher
Bedarf in der gegenwärtigen
Technik an weiteren einfachen und wirksamen Verfahren, welche die
quantitative Bestimmung von Proteinen, wie IgE, erlauben.
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Der
Nachweis der IgE in Nasensekreten hat sich bis heute aufgrund der
spontanen Variationen des Abflusses besagter Sekrete und der komplizierten
Entnahmeverfahren (Absaugung, Spülung,
Ausstrich und Biopsie) als schwierig durchzuführen erwiesen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Lösung dieser Probleme bereit.
Die Erfindung beschreibt nämlich
neue Verfahren und Zusammensetzungen für die quantitative Bestimmung
von Proteinen und Glycoproteinen. Diese Verfahren basieren in erster Linie
auf dem biologischen Material, das für die quantitative Bestimmung
der Proteine genutzt wird, d.h. den Nasensekreten. Die vorliegende
Erfindung zeigt nämlich,
dass es möglich
ist, in den Nasensekreten das Vorhandensein von Proteinen oder Glycoproteinen,
insbesondere von Immunglobulinen, besonders des Typs E, nachzuweisen
und dass diese Proteine auf eine einfache und wirksame Weise quantitativ
bestimmt werden können.
Die vorliegende Erfindung zeigt außerdem, dass diese quantitative
Bestimmung, auf IgE angewandt, besonders empfindlich ist und eine
zuverlässige
Aussage (und eine zu bestehenden Techniken ergänzende Aussage) über den allergischen
Zustand einer Person erlaubt. Insbesondere erlauben die Zusammensetzungen
und Verfahren der Erfindung vorteilhafterweise das Erkennen der
allergischen Bereiche bei einer Person, gleich ob es sich um lokale
Allergien (zum Beispiel Allergien des Nasenrachenraums) oder um
allgemeine Allergien handelt.
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Ein
erster Gegenstand der Erfindung beruht auf einem Verfahren zum Nachweis
von IgE, umfassend:
- – das Inkontaktbringen eines
Nasensekrets mit einem Material, das die Adsorption der IgE erlaubt, und
- – den
Nachweis aus besagtem Material des Vorhandenseins der IgE mit Hilfe
einer Reaktion immunologischer Art.
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Ein
weiterer Gegenstand der Erfindung beruht auf einem Verfahren zur
quantitativen Bestimmung von IgE, umfassend:
- – das Inkontaktbringen
eines Nasensekrets mit einem Material, das die Adsorption der IgE
erlaubt, und
- – die
quantitative Bestimmung der an diesem Material adsorbierten IgE
mit Hilfe einer Reaktion immunologischer Art.
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Diese
Anwendungsform umfasst vorteilhafterweise einen Schritt der Ermittlung
der Menge (oder der Konzentration) des betreffenden Proteins oder Glycoproteins.
In dieser Hinsicht umfasst der obere Schritt der quantitativen Bestimmung
bevorzugter die Bestimmung der Menge des betreffenden Proteins oder
Glycoproteins, das an besagtem Material adsorbiert ist, wobei die
gemessene Menge mit einer Eichkurve verglichen wird, die zuvor oder
gleichzeitig erstellt wird. Diese Ermittlung erlaubt die Bestimmung der
tatsächlichen
Konzentration des betreffenden Proteins oder Glycoproteins im Nasensekret.
Die Eichkurve ist vorzugsweise eine Kurve, die aus Referenzlösungen erstellt
wird, die das betreffende Protein oder Glycoprotein in definierten
Konzentrationen enthalten, die nach demselben Protokoll quantitativ bestimmt
werden.
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Die
vorliegende Erfindung beschreibt und betrifft daher jedes beliebige
qualitative und quantitative Verfahren zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung
von biologischen Molekülen
aus Nasensekreten.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck Nasensekret
jede Substanz, die im Bereich der Nase oder Nasennebenhöhle (wie zum
Beispiel der Schleim) gebildet wird, insbesondere jede Substanz,
die von den Schleimhäuten
der Nase oder der Nasennebenhöhlen
freigesetzt oder sezerniert wird. Es handelt sich hauptsächlich um
Absonderungen, die beim Schnupfen, Nießen, bei allergischen Zuständen oder
allergieartigen Zuständen beobachtet
werden, Schleim, Hydrorrhoea oder um jede andere Substanz oder Sekret,
die/das in einem normalen oder pathologischen physiologischen Zustand,
wie er bei allergischen Zuständen
vorkommt, freigesetzt wird. Bevorzugter bezeichnet der Ausdruck
Nasensekret den Schleim.
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Die
Untersuchung der Nasensekrete ist Gegenstand mehrerer vielschichtiger
Arbeiten gewesen, die sich entweder auf die Biochemie (pH oder biochemische
Zusammensetzung des Schleims) oder auf die zellulären Faktoren
(lokale Eosinophilie) oder auf dynamische Tests (Provokationstests)
konzentrieren. Die Erfindung zeigt jetzt, dass biologische Substanzen,
wie Immunglobuline, aus dem Schleim oder anderen Sekreten der Nase
oder Nasennebenhöhlen
auf eine einfache, empfindliche und reproduzierbare Weise direkt
nachgewiesen oder quantitativ bestimmt werden können.
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Für die Durchführung des
Verfahrens der Erfindung kann das Inkontaktbringen des Materials
mit den Nasensekreten entweder durch direktes Inkontakbringen des
Adsorptionsmaterials mit den Nasenschleimhäuten oder durch Gewinnen der
Nasensekrete und Herstellen eines Kontakts in einer geeigneten Vorrichtung
(Plättchen,
Röhrchen,
Schale, Schiffchen, etc.) erfolgen. Vorzugsweise erfolgt das Inkontaktbringen
des Materials mit den Nasensekreten, indem das Material direkt mit
den Nasenschleimhäuten der
Person in Kontakt gebracht wird. Dies erfolgt üblicherweise durch manuelles
Einführen
des Adsorptionsmaterials (oder eines Teils davon) in ein Nasenloch
der Person.
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Der
Kontakt zwischen dem Nasensekret und dem Material erfolgt vorzugsweise
während
eines Zeitraums, der hinreichend ist, um die Adsorption von Proteinen
oder Glycoproteinen an diesem Material zu erlauben. Wenn eine quantitative
Bestimmung durchgeführt
wird, wird der Kontakt vorzugsweise aufrechterhalten, bis ein Gleichgewicht
zwischen der Menge an Proteinen oder Glycoproteinen, die an dem
Material adsorbiert sind, und ihrer Konzentration in den Nasensekreten
der Person erreicht wird. Im Allgemeinen kann dieser Kontakt einen
Zeitraum aufrechterhalten werden, der zwischen einigen Sekunden
bis zu mehreren Minuten, üblicherweise
1 bis 5 Minuten, zum Beispiel 1 bis 3 Minuten, dauert. Es versteht sich,
dass dieser Zeitraum ohne weiteres vom Durchführenden in Abhängigkeit
der allgemeinen oder lokalen Bedingungen, von der Art des untersuchten Proteins
oder Glycoproteins und dem verfolgten Ziel (Nachweis, quantitative
Bestimmung, etc.) angepasst werden kann.
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Das
im Rahmen der Erfindung für
die Adsorption der Proteine und/oder Glycoproteine verwendete Material
kann jeder beliebige, vorzugsweise flache Träger sein, der mit den Nasensekreten
in Kontakt gebracht werden kann, der insbesondere in das Nasenloch,
ohne es zu verletzen, eingeführt
werden kann. Dieses Material kann verschiedene Formen einnehmen,
wie zum Beispiel in Form eines Fadens, einer Pastille oder Scheibe,
eines chirurgischen Schwamms, einer Spitze, eines Stäbchens oder
Streifens etc. vorliegen. Das Material, das die Adsorption erlaubt,
umfasst vorzugsweise wenigstens einen Teil, der aus einem Adsorptionsmaterial besteht,
vorzugsweise einem die Person nicht belastenden oder toxischen Material,
wenn das Inkontaktbringen mit den Nasenschleimhäuten direkt durchgeführt wird.
Es kann sich insbesondere um ein Cellulose-Material (zum Beispiel
mit einer geringen Dichte), Polymere, Makromolekülkomplexe, natürlichen
oder synthetischen Ursprungs, allein oder in Kombination, handeln.
Vorzugsweise handelt es sich um ein Cellulose-Material.
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In
einer bevorzugten Anwendungsform der Erfindung und besonders für die Ermittlung
der IgE besteht das Adsorptionsmaterial aus Streifen, die wenigstens
einen Teil aus Cellulosepapier geringer Dichte, mit gelegten oder
nicht gelegten Fasern, umfassen. Als besondere Beispiele kann man
insbesondere die Streifen für
den Schirmer-Test der Laboratoires Faure (Annonay, Frankreich) (Papiertyp
Whatman Nr. 1) oder Streifen nennen, die aus Papier Nr. 2312 von
Schleicher & Schuell
(Dassel, Deutschland) hergestellt sind. Die Papiere Nr. 566 und
1573 der gleichen Herkunft eignen sich ebenfalls. Trotz einer weniger
guten Empfindlichkeit kann man ebenfalls vom gleichen Lieferanten
die Papiere Nr. 1577, 1575, 1506, 1507, 903, 589/2, 589/3, 589/5,
589/6, 572 und 512 anführen.
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Die
Streifen können
vorteilhafterweise Abmessungen in der Größenordnung von 55 mm × 5 mm besitzen.
Bei der Probennahme lässt
man zum Beispiel ungefähr
die ersten 15 mm des Streifens vollsaugen, wobei einige Minuten
hierfür
ausreichen.
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Die
Streifen können
für ein
Abtrennen des mit den Schleimhäuten
in Kontakt gebrachten Endes von dem restlichen Streifen vorgesehen
sein. Aber man kann in der Tat nach einer Probennahme den Streifen,
einschließlich
während
der weiteren Schritte, ganz lassen. Der Streifen kann dann nach
der Probennahme mehrere Wochen vor dem Schritt der Anzeige oder
der quantitativen Bestimmung aufbewahrt werden.
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Der
Schritt des Nachweises oder der quantitativen Bestimmung kann mit
jeder beliebigen, dem Fachmann bekannten immunchemischen Technik durchgeführt werden,
die auf der Verwendung von spezifischen Antikörpern und/oder Antigenen beruht, allein
oder in Kombinationen, die markiert sein können und gemäß verschiedenen
Strategien angezeigt werden können
(kolorimetrische, enzymatische, fluoreszierende, radioaktive Markierungen,
Markierungen des Typs Avidin-Biotin, etc.).
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Insbesondere
kann man beim immunologischen Schritt des Nachweises oder der quantitativen Bestimmung
Antikörper
einsetzen, die gegen das betreffende Protein/Glycoprotein gerichtet
sind, um dieses einzufangen und anschließend für den Nachweis oder die quantitative Bestimmung
der folglich gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe zu sorgen. Dieses
Verfahren ist vorzugsweise ein „Sandwich"-Verfahren, das in der Veröffentlichung
von E. BLOCH-MICHEL und L. HELLEBOID, Revue française des Laboratoires Nr.
207, Mai 1990, Seiten 43 bis 46, beschrieben ist. Nach dieser Anwendungsform wird
das Adsorptionsmaterial (oder der Teil des Adsorptionsmaterials,
der mit den Nasensekreten in Kontakt gewesen ist) in eine Lösung verbracht,
die in einem Röhrchen
oder ähnlichem
(Platte, Schale, Kolben, Ampulle, etc.) enthalten ist und zwei Antikörper-Typen
umfasst, die gegen das betreffende Protein/Glycoprotein gerichtet
sind: einerseits freie markierte Antikörper und andererseits an einer
festen Phase gebundene Antikörper
(die im Allgemeinen nicht markiert sind). Die Proteine schwimmen
in der Lösung
und binden an die markierten Antikörper. Jeder so erhaltene Komplex
wird an einen Antikörper an
der festen Phase gebunden. Das Vorhandensein oder die Menge an betreffendem
Protein oder Glycoprotein kann nun durch Nachweis oder Messung der Intensität der im
Röhrchen
gebundenen Markierung bestimmt werden.
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Die
Antikörper
können
monoklonale oder polyklonale Antikörper sein. Die Antikörper an
der festen Phase können
Antikörper
sein, die an einer festen Phase, wie insbesondere Papierscheibe,
Kügelchen, etc.
immobilisiert sind, oder die direkt an der Innenseite des Kunststoffröhrchens
immobilisiert sind (an der Innenwand gebundene Antikörper) und
als Empfänger
für den
Reaktionskomplex etc. dienen. Die Fixierung der Antikörper an
den festen Träger
kann mit jeder dem Fachmann bekannten Technik (mittels Adsorption,
kovalenter Bindung, etc.) erfolgen.
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Für das immunchemische
Verfahren können, unter
den für
die Antikörper
weiter oben beschriebenen Bedingungen, ebenfalls Reaktionen von
Antigenen, wie Allergenen, mit Antikörpern genutzt werden, besonders
in einer „Sandwich"-artigen Reaktion,
wie sie oben angeführt
ist, in diesem Fall verwendet man vorteilhafterweise einen Antikörper und
ein Antigen, wobei ein Partner markiert und frei ist und der andere Partner
an einer festen Phase immobilisiert ist.
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Zusätzlich zu
diesen „Sandwich"-artigen Reaktionen
kann die vorliegende Erfindung ebenfalls jedes andere Verfahren
für den
Nachweis oder für
die quantitative Bestimmung von Antigenen in einer Lösung nutzen.
In dieser Hinsicht kann man besonders verschiedene immunenzymatische
Techniken (des Typs ELISA, etc.) oder radioimmunologische Techniken
(des Typs RIA, etc.) nennen.
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Vorzugsweise
werden während
des Nachweis- oder Bestimmungsschrittes die Reaktionsröhrchen (oder
andere Reaktionsbehälter)
geschüttelt, um
die Empfindlichkeit zu erhöhen,
d.h. die Messung sehr geringer Mengen zu erlauben.
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Wie
oben angegeben, werden für
eine quantitative Bestimmung von Proteinen oder Glycoproteinen die
erhaltenen Ergebnisse im Allgemeinen mit einer Eichkurve verglichen,
die aus Referenzlösungen erstellt
ist, die nach demselben Protokoll bestimmt werden. Diese Referenzlösungen können mittels Verdünnung (oder
Verdünnungsreihen)
des reinen Proteins oder Glycoproteins künstlich hergestellte Lösungen sein.
Es kann sich ebenfalls um biologische Proben, wie zum Beispiel eine
Probe von Tränen
oder Blut (oder Serum) handeln. In dieser Hinsicht umfasst das Verfahren
der Erfindung in einer besonderen Anwendungsform einen zusätzlichen Schritt
des Vergleichs der Mengen, die in den Nasensekreten gemessen werden,
mit den Mengen, die in einer anderen biologischen Probe, wie Tränen, Blut oder
Serum, gemessen werden.
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Die
Verfahren der Erfindung können
für einen
Nachweis oder eine quantitative Bestimmung verschiedener Protein-
oder Glycoproteinarten angewandt werden. Es kann sich insbesondere
um Immunglobuline (IgG, IgM, IgE, etc.), Entzündungsproteine oder um andere
Proteine oder Glycoproteine, die an physiologischen oder physiopathologischen Phänomenen
beteiligt sind, oder um Markierungen handeln, die für die Durchführung diagnostischer
Bestimmungen zweckdienlich sind. Bevorzugt handelt es sich um Immunglobuline,
noch bevorzugter um Typ E Immunglobuline (IgE). Die in den Beispielen angeführten Ergebnisse
zeigen nämlich,
dass die IgE in den Nasensekreten nachgewiesen werden können und
dass die quantitativen Bestimmungen der Erfindung eine hohe Empfindlichkeit
bieten, was den Nachweis von Mengenschwankungen von IgE erlaubt,
die mit einem lokalen oder allgemeinen allergischen Zustand korreliert
sind.
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In
dieser Hinsicht beruht ein besonderer Gegenstand der Erfindung auf
einem Verfahren zur Erkennung, Verfolgung oder Charakterisierung
einer Allergie bei einer Person, dadurch gekennzeichnet, dass das
Verfahren einen Schritt des Nachweises und/oder der quantitativen
Bestimmung der in den Nasensekreten vorhandenen IgE umfasst.
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Dieser
Nachweis oder diese quantitative Bestimmung wird vorteilhafterweise
unter den oben beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
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Der
Nachweis zeigt an, dass der allergische Charakter der betreffenden
Person noch nicht bekannt oder aufgezeigt ist oder sich in einem
noch nicht bestätigten
frühen
Stadium befindet. Das Verfahren der Erfindung ist ebenfalls für die Verfolgung und/oder
für die
Charakterisierung einer Allergie anwendbar, d.h. für eine Untersuchung
der Entwicklung des allergischen Stadiums einer Person oder für die Bestimmung
des gezeigten Allergietyps, besonders seines lokalen oder allgemeinen
Charakters.
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Das
Verfahren der Erfindung kann zur gleichzeitigen quantitativen Bestimmung
mehrerer Proteine oder Glycoproteine von Interesse oder mehrerer Protein-
oder Glycoproteinarten von Interesse angewandt werden. Es kann sich
insbesondere um Gesamt-IgE oder auch um bestimmte IgE handeln, die für bestimmte
Antigene (Allergene) spezifisch sind. Gemäß einer bevorzugten Anwendung
umfasst das Verfahren der Erfindung einen Nachweis oder eine quantitative
Bestimmung der in Nasensekreten vorhandenen IgE ohne Differenzierung
der Antigenspezifität
(Gesamt-IgE).
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Das
Verfahren kann folglich nicht nur für die quantitative Bestimmung
der nasalen Gesamt-IgE sondern auch für die quantitative Bestimmung
spezifischer IgE, insbesondere bei geringen Konzentrationen, anwendbar
sein. Um so mehr kann man eine quantitative Bestimmung der spezifischen
IgE durchführen.
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Für die spezifischen
IgE verwendet man vorteilhafterweise Allergene oder Reaktogene,
die, so wie es für
die Antikörper
beschrieben ist, unter Umständen
unlöslich
gemacht oder markiert sein können.
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Zudem
erlaubt das Verfahren gemäß der Erfindung
die Erstellung nicht nur von Diagnosen im Falle lokaler Allergien
(vom Typ Nasenrachenraumallergie) sondern ebenfalls im Falle allgemeiner
Allergien. Im letzteren Fall erlaubt die erhöhte Empfindlichkeit des Verfahrens
die Quantifizierung der IgE im Transsudat. In dieser Hinsicht kann
das Verfahren der Erfindung insbesondere für eine Erkennung oder eine
Verfolgung der Entwicklung von Allergien, wie von Asthma, Ekzemen,
Rhinitis, allergischer Sinusitis, etc., verwendet werden.
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Wie
oben angegeben, ist die Erfindung ebenfalls für eine quantitative Bestimmung
von Substanzen in der Nase, die einen entzündlichen oder pathologischen
Zustand wiedergeben, und insbesondere für Substanzen anwendbar, die
sich wahrscheinlich in den Nasensekreten in geringen und vorzugsweise ziemlich
kleinen Konzentrationsbereichen befinden.
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Die
Materialien und Verfahren der Erfindung können für den Nachweis oder die quantitative
Bestimmung der Proteine oder Glycoproteine in den Nasensekreten
eines jeden Menschen, egal ob Erwachsener oder Kind, gesund oder
eine Krankheit aufweisend, verwendet werden. Außerdem kann die Erfindung ebenfalls
für den
Nachweis oder die quantitative Bestimmung von Proteinen oder Glycoproteinen in
den Nasensekreten von beliebigen anderen Säugern (insbesondere Hunde,
Rinder, Schafe, Pferde, Schweine, etc.) Verwendung finden.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf Kits zur Durchführung der
oben beschriebenen Verfahren. Diese Kits umfassen vorteilhaft Lösungen,
welche die Durchführung
einer Immunreaktion erlauben, und insbesondere wenigstens einen anti-IgE-Antikörper. Dieser
Antikörper
kann ein polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sein, der markiert oder
nicht markiert sein kann. Bevorzugter umfassen die Kits der Erfindung
eine Vorrichtung zur Durchführung
der Immunreaktion, wie zum Beispiel ein Röhrchen, eine Vertiefung, Schale
oder ein Kolben. Zudem können
die Kits der Erfindung außerdem ein
Adsorptionsmaterial umfassen, das für die Durchführung der
Probennahme zweckdienlich ist.
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In
einer besonderen Anwendungsform umfassen die Kits der Erfindung
ein Röhrchen
(oder analoge Vorrichtung), das mit einem anti-IgE-Antikörper beschichtet
ist, und eine Lösung
eines anti-IgE-Antikörpers,
der an ein Enzym (zum Beispiel Peroxidase) gekoppelt ist. Bevorzugter
umfassen sie außerdem
ein Adsorptionsmaterial (insbesondere einen Streifen), das mit einem
IgE-Standard getränkt ist,
und/oder eine Waschlösung
und/oder ein chromogenes Substrat eines Enzyms (zum Beispiel OPD).
Diese Kits können
ohne weiteres für
den Nachweis oder die quantitative Bestimmung der IgE aus Nasensekreten
gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden.
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Ein
anderer Gegenstand der Erfindung beruht ebenfalls auf der Verwendung
eines Materials, das die Adsorption von Proteinen oder Glycoproteinen
erlaubt, für
den Nachweis oder die quantitative Bestimmung von Proteinen oder
Glycoproteinen aus einem Nasensekret einer Person durch direktes
Inkontaktbringen des besagten Materials mit einer Nasenschleimhaut
der besagten Person. Das Material ist vorzugsweise ein wie oben
definiertes Material und wird für den
Nachweis des Vorhandenseins oder die quantitative Bestimmung der
Immunglobuline verwendet.
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Ein
anderer Gegenstand der Erfindung beruht ebenfalls auf der Verwendung
eines Materials, das die Adsorption von Proteinen oder Glycoproteinen
erlaubt, für
die Herstellung eines Produkts oder Kits für die Durchführung eines
Verfahrens zur Diagnose, Erkennung, Verfolgung oder Charakterisierung einer
Allergie bei einer Person.
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Weitere
Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden bei der Lektüre der nachfolgenden
Beispiele offensichtlich, die als Veranschaulichung und nicht als
Beschränkung
betrachtet werden sollen. Diese Beispiele veranschaulichen besonders
das Prinzip der quantitativen Bestimmung der Gesamt-IgE mit Hilfe
einer immunenzymatischen Technik in Nasensekreten, die mit Hilfe
eines Papierstreifens beprobt werden.
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1. Prinzip der quantitativen
Bestimmung
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Der
immunenzymatische Nachweis ist mit einer „Sandwich-Technik" unter Verwendung
zweier monoklonaler anti-IgE-Antikörper durchgeführt worden.
Die Reaktion läuft
in zwei Schritten ab:
- – Immunreaktion: die IgE, die
quantitativ zu bestimmen (oder nachzuweisen) sind, werden 3 h bei
18–25°C in Röhrchen in
Gegenwart zweier monoklonaler anti-IgE-Antikörper inkubiert, wobei einer
davon an der Innenwand der Röhrchen
gebunden ist und der andere, in der flüssigen Phase, mit Peroxidase
markiert ist. Der Inkubation folgt ein Waschen der Röhrchen.
- – enzymatische
Anzeige: man gibt in die Röhrchen
ein chromogenes OPD-Substrat (Orthophenylendiamin). Nach einer Inkubation
von 30 Minuten bei 18–25°C gibt man
ein Blockierungsmittel (Schwefelsäure) hinzu und liest die erhaltene
Farbe spektrophotometrisch ab.
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Im
Verlauf derselben Bestimmungsreihe führt man eine Leerreaktion (Röhrchen ohne
IgE), Standards (Röhrchen,
die bekannte IgE-Mengen enthalten) und eine Positivkontrolle durch.
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2. Beschreibung der Reagenzien (Kits zur
quantitativen Bestimmung)
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Die
folgenden Reagenzien werden bei der Durchführung des Verfahrens eingesetzt:
- – Papierstreifen
zur Durchführung
der Probennahme in der Nase,
- – Polystyrolröhrchen,
die mit anti-IgE-Antikörper beschichtet
sind,
- – Streifen,
mit IgE-Standard getränkt,
- – Streifen,
mit positiver Kontrolle getränkt,
- – Peroxidase-markierter
anti-IgE-Antikörper
in Lösung,
- – Waschlösung,
- – Chromogen
(OPD in Tablettenform mit Verdünnungsmittel)
- – Blockierungsmittel
(Schwefelsäure)
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3. Verfahrensweise
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Das
Verfahren wird folgendermaßen
durchgeführt.
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Für die Immunreaktion
werden die Streifen, die zuvor mit den Nasensekreten in Kontakt
gebracht worden sind, (oder die Standard- oder Kontroll-Streifen)
in die Röhrchen
verbracht (außer
dem Röhrchen der
Leerreaktion). 300 μl
Antikörper,
an Peroxidase konjugiert, werden zugegeben und die Röhrchen werden
unter Schütteln
mit einer Geschwindigkeit von 360 UpM 3 Stunden bei Raumtemperatur
gehalten. Das Reaktionsmedium in allen Röhrchen wird abgesaugt und die
Waschlösung
wird auf die Röhrchen
verteilt (2 ml pro Röhrchen)
und die Streifen werden aus den Röhrchen entfernt. Die Lösung wird erneut
abgesaugt und der Waschvorgang wird zweimal wiederholt. Die Lösungen werden
dann sorgfältig abgesaugt.
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Für die enzymatische
Anzeige werden 300 μl Anzeigelösung in
jedes Röhrchen
verteilt. Nach 30 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur und unter Lichtschutz
wird 1 ml Blockierungsmittel in jedes Röhrchen gegeben. Die Röhrchen werden
geschüttelt
(zum Beispiel auf einem Vortex-Schüttler).
Die gebildete Farbe wird bei 492 nm gegen die Leerreaktion abgelesen.
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4. Ergebnisse
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Verschiedene
Vorversuche sind bei Menschen, in pathologischem oder gesundem Zustand, durchgeführt worden,
um die vorhandenen IgE in ihren Nasensekreten (einschließlich Sekrete
der Nasennebenhöhlen)
quantitativ zu bestimmen.
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Die
erhaltenen Ergebnisse können
folgendermaßen
zusammengefasst werden:
In einer ersten Versuchsreihe ist der
Test der nasalen IgE der Erfindung mit nasalen Provokationstests (thermisch
und eosinophil) bei etwa 50 Personen verglichen worden. Die erhaltenen
Ergebnisse zeigen, dass der Test der nasalen IgE der Erfindung empfindlicher
als der eosinophile Provokationstetst und selektiver als der thermische
Provokationstest ist.
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In
einer zweiten Versuchsreihe ist der Test der nasalen IgE der Erfindung
mit einem Hauttest bei 17 Personen verglichen worden, die wegen
Allergie auslösender
Manifestationen im Nasenrachenraum einen Arzt konsultiert hatten.
Während
der Hauttest negativ war, hat der Test der Erfindung bei 10 Personen
den Nachweis einer wesentlichen Erhöhung der IgE in den Nasensekreten
erlaubt. Diese Versuche scheinen anzuzeigen, dass die Tests der
Erfindung einen zuverlässigeren
Nachweis als die früheren Hauttests
erlauben. Diese Ergebnisse scheinen ebenfalls die Dominanz der lokalen
Hypersensibilität über die
allgemeine Hypersensibilität
zu bestätigen.
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Die
erhaltenen Ergebnisse zeigen außerdem,
dass die auf den Streifen gesammelten IgE direkt proportional zu
ihrer Konzentration in dem Bestimmungsmedium quantitativ bestimmt
werden können,
ohne dass die Ermittlung des Gewichts oder der gesammelten Menge
erforderlich ist. Dieses Phänomen
hat seinen Grund darin, dass sich sehr schnell (in einigen Minuten)
ein Gleichgewicht zwischen den IgE, die auf dem Papier adsorbieren,
und den IgE, die in Lösung
verbleiben, einstellt. Wenn das Papier mit der anti-IgE-Antikörperlösung inkubiert
wird, lösen dann
die IgE sich vom Papier und bilden einen Antigen-Antikörper-Komplex,
der nun quantitativ bestimmt werden kann.
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Die
quantitative Bestimmung gemäß der Erfindung
ist von Vorteil, da sie in einem Schritt durchgeführt werden
kann, und dass sie durch das Schütteln
der Röhrchen
die Bestimmung von sehr kleinen Proteinmengen (weniger als 2 kUI/l)
erlaubt.
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In
einer dritten Versuchsreihe wird der Test der nasalen IgE der Erfindung
bei einer Kontrollgruppe von 9 Menschen (5 Frauen und 4 Männer) im
Alter von 25 bis 55 Jahren und bei einer Gruppe von 17 Patienten
(7 Frauen und 10 Männer)
von 7 bis 61 Jahren praktiziert.
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Die
Kontrollgruppe besteht aus Personen, die weder Rhinitissymptome
noch allergische Symptome zeigen und keine persönliche oder familiäre medizinische
Vorgeschichte aufweisen. Die zweite Gruppe besteht aus Personen,
die aufgrund von Symptomen einer chronischen Rhinitis, die sich über einen
Zeitraum von mehr als 3 Monate gezeigt haben, einen Arzt konsultiert
haben.
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Die
Streifen sind mit dem Nasenschleimhäuten der Personen 60 Sekunden
in Kontakt gebracht worden, anschließend zur Analyse unter den
oben beschriebenen Bedingungen ins Laboratorium geschickt worden
(unter 15 Tage).
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Die
erhaltenen Ergebnisse zeigen in den Nasensekreten der Kontrollpersonen
eine mittlere optische Dichte von 0,136 und in den Nasensekreten
der Personen mit Symptomen eine mittlere optische Dichte von 1,752.
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Der
gemäß der Erfindung
praktizierte Test der nasalen IgE hat folglich erlaubt, eine signifikante Differenz
in der lokalen IgE-Sekretion zwischen der Kontrollgruppe und der
Patientengruppe nachzuweisen und folglich die allergischen Personen
von den gesunden Personen eindeutig zu unterscheiden.