DE69931613T2

DE69931613T2 - Verfahren zum Zählen von Leukozyten und Leukozytenzähler

Info

Publication number: DE69931613T2
Application number: DE69931613T
Authority: DE
Inventors: Arkray Akio Kyoto-shi OKUBO; Arkray Shigeki Kyoto-shi YAMADA
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1998-03-13
Filing date: 1999-03-11
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2019-03-12
Also published as: JPH11258231A; US6743591B1; KR20010034577A; EP1065505A1; EP1065505A4; CN1174249C; WO1999046599A1; KR100376243B1; US20040171088A1; JP3298824B2; CN1293760A; DE69931613D1; EP1065505B1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Zählen in einer Probe enthaltener Leukozyten und einen dafür verwendeten Leukozytenzähler.
Stand der Technik
Bei einem Bluttest wird häufig eine Blutzellenzählung ausgeführt, und ihre klinische Bedeutung ist groß. Beispielsweise ermöglicht die Erythrozytenzahl das Untersuchen des Vorhandenseins und des Grads einer Anämie und weiter eine klinische Diagnose verschiedener Fälle, die durch Sauerstoffmangel im Gewebe hervorgerufen werden. Andererseits spielen Leukozyten eine wichtige Rolle bei einer Abwehrfunktion zum Bekämpfen in den Körper eindringender Bakterien oder Viren, d.h. bei einer immunologischen Funktion. Insbesondere haben Granulozyten oder Leukozyten eine Funktion, Protease, wie Elastase usw., ansprechend auf die Stimulation durch Bakterien oder Fremdproteine, die in den Körper eindringen, freizusetzen, und eine Funktion zum Ermöglichen von Elastase usw. ansprechend auf die Stimulation durch Bakterien oder Fremdproteine.
In US-A-5 464 739 und in EP-A-0 661 280 ist die Bestimmung von Leukozyten durch Messen der Elastaseaktivität, d.h. durch ein enzymatisches Verfahren, offenbart. In US-A-5 464 739 kann die Probe ein Probenmuster, beispielsweise Urin, sein, und die Elastaseaktivität wird mit der Leukozytenkonzentration korreliert. Die Lehren von EP-A-0 661 280 sind ähnlich. Antikörper für Elastase werden weder verwendet noch offenbart.
In EP-A-0 038 935 ist die Bestimmung von Elastase in einer Probe, beispielsweise Blut, offenbart. Hier wird die Elastase des komplexen Elastase-α₁-Proteinaseinhibitors, der beispielsweise in Plasma vorhanden ist, bestimmt. Zu diesem Zweck wird ein Antikörper zu Elastase verwendet. Die in Leukozyten enthaltene Elastase wird nicht bestimmt, und Leukozyten werden weder gezählt noch lysiert.
Weil die Leukozytenzahl bei vielen Krankheiten erhöht oder verringert ist, ist es wichtig, Leukozyten bei einer Durchmusterung auf Krankheiten zu zählen. Bei Krankheiten, die eine frühe Bestimmung oder Heilung erfordern, ist die Leukozytenzahl ein besonders wichtiger Untersuchungsgegenstand. Weil die Leukozytenzahl weiterhin entsprechend dem Alter von Personen, der Tages- oder Nachtzeit, entsprechend der Jahreszeit und entsprechend anderer Faktoren schwankt, ist es erwünscht, dass die Leukozytenzahl bei routinemäßigen medizinischen Behandlungen geeignet und genau bestimmt wird.
Gegenwärtig lässt sich ein Verfahren zum Zählen von Blutzellen grob in zwei Typen klassifizieren, nämlich ein visuelles Zählverfahren und ein automatisches Zählverfahren. Bei dem visuellen Zählverfahren werden Blutzellen durch mikroskopische Untersuchung auf einer Rechentafel gezählt. Das visuelle Zählverfahren umfasst eine Technik zum Zählen von Blutzellen ohne jede Behandlung und eine Technik zum Zählen von Blutzellen nach einem Beflecken von Kernen von Blutzellen mit einem Farbstoff. Beim automatischen Zählverfahren wird Blut bis zu einem bestimmten Maße verdünnt und dann durch einen dünnen Flussdurchgang hindurchtreten gelassen, um Blutzellen unter Verwendung des elektrischen Widerstands oder unter Verwendung von Streulicht zu detektieren und zu zählen. Bei diesem Verfahren wird im Allgemeinen ein spezifischer Blutzellenzähler verwendet. Bei diesen Zählverfahren werden die Blutzellen selbst entweder von menschlichen Augen oder unter Verwendung eines Zählers tatsächlich gezählt. Bei diesen Verfahren treten jedoch die nachstehend erwähnten Probleme auf.
Ein Elastasezähler ist in Hafner G. u.a.: "DETERMINATION OF HUMAN GRANULOCYTE ELASTASE BY THE IMMUNOACTIVATION METHOD ON THE HITACHI 717 AUTOMATED ANALYZER", EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL CHEMISTRY AND CLINICAL BIOCHEMISTRY, Band 29, Nr. 3, 1991, S. 179–184, ISSN:0939-4974, XP001038070 beschrieben.
In EP 0 519 720 A1 ist ein Verfahren zum Bestimmen der Menge menschlicher Granulozytenelastase in einer Probe unter Verwendung eines Antikörpers für menschliche Granulozytenelastase in einer Immunprobe offenbart.
Ein Verfahren zum Beobachten der Granulozyten-Chemotoxis durch Analysieren von Elastase ist in Pelz G. u.a. "Granulocyte Chemotoxis Measured in a Boyden Chamber Assay by Quantification of Neutrophil Elastase", European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry, Band 31, 1993, S. 651–655, XP009017186 beschrieben.
Offenbarung der Erfindung
Bei dem vorstehend erwähnten visuellen Zählverfahren tritt ein Fehler des Zählwerts wegen eines Fehlers in Bezug auf die Art der Zellen auf, der dadurch, dass es bei der Hämolyse an Erythrozyten mangelt, oder durch die Hämagglutination von Blutzellen, durch eine homogene Verbreiterung von Leukozyten auf der Rechentafel oder durch die Fähigkeiten von Labortechnikern hervorgerufen wird. Überdies wird bei dem visuellen Zählverfahren eine von einem Leukozyten verschiedene nukleierte Zelle, beispielsweise eine Erythroblastenzelle usw., als ein Leukozyt gezählt. Wenn daher die von einem Leukozyten verschiedene nukleierte Zelle in dem peripheren Blut vorhanden ist, ist es erforderlich, das Verhältnis der Leukozyten zu den anderen Zellen unter Verwendung einer Blutabstrichpräparation zu analysieren und den Zählwert zu korrigieren. Weiterhin ist das visuelle Zählverfahren ein manuelles Verfahren, und es ist daher eine lange Zeit erforderlich, um Zellen zu zählen.
Bei dem automatischen Zählverfahren kann der genaue Zählwert wegen des Auftretens von Erythroblastenzellen, einer Fibrinablagerung, einer Thrombozytenagglutination, eines Mangels einer Hämolyse von Erythrozyten und dergleichen möglicherweise nicht erhalten werden. Weiterhin ermöglichen einige Messvorrichtungen das Klassifizieren des Zählergebnisses durch eine Korngrößenverteilungs-Messfunktion oder eine Mustererkennung. Solche Vorrichtungen ermöglichen es, Krankheiten leicht zu erkennen. Sie sind jedoch kost spielig und groß. Nicht nur diese speziellen Vorrichtungen, sondern auch allgemeine Vorrichtungen, die für das Zählen von Blutzellen beim automatischen Zählverfahren verwendet werden, sind groß und kostspielig. Weiterhin ist die Wartung kompliziert, wobei beispielsweise das Reinigen eines Flüssigkeitsströmungsdurchgangs usw. komplex ist. Daher sind solche Vorrichtungen für Institute, wie Laboratorien in großen Krankenhäusern oder Untersuchungszentren usw., die eine große Anzahl von Proben handhaben, wirksam. Für Krankenhäuser mittlerer Größe oder praktische Ärzte usw., welche eine kleine Anzahl von Proben handhaben, sind die Verwendung und die Wartung der großen Vorrichtung jedoch eine schwere Last.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein Verfahren zum Zählen von Leukozyten bereitzustellen, wodurch es möglich ist, Leukozyten unter Verwendung einer kleinen und kostengünstigen Vorrichtung genau und bequem zu zählen.
Zum Lösen der vorstehend erwähnten Aufgabe ist vorgesehen: ein Verfahren zum Zählen von Leukozyten, umfassend: Freisetzen von Elastase aus Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen (nachstehend werden diese drei Blutzellen als "Granulozyten" bezeichnet) in Leukozyten, die in einer Probe enthalten sind, Zugeben eines Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers zu der so freigesetzten Elastase, Messen des Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers, der an die Elastase gebunden ist, um so die Konzentration der Elastase zu bestimmen, und Berechnen der Anzahl an Leukozyten, die in der Probe enthalten sind, aus der so bestimmten Konzentration an Elastase unter Verwendung eines bekannten Verhältnisses der Leukozytenzahl, der Granulozytenzahl oder der Neutrophilenzahl zur Konzentration an Elastase.
Demgemäß ist das Zählverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum indirekten Berechnen der Anzahl der Leukozyten durch Messen der Konzentration in dem Granulozyten enthaltener Elastase, statt Leukozyten tatsächlich zu zählen.
Es gibt fünf Klassen von Leukozyten, nämlich Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Monozyten und Lymphozyten. Drei Zellen, d.h. Neutrophile, Eosinophile und Basophile, werden insgesamt als Granulozyten bezeichnet. Weiterhin sind die Leukozytenzahl und der Prozentsatz jeder Leukozytenklasse (eine differenzielle Leukozytenzahl) in Blut zwischen den Geschlechtern nicht verschieden und im Wesentlichen konstant, wenngleich der Prozentsatz jeder Leukozytenklasse zwischen Kindern und alten Menschen etwas verschieden ist. Beispielsweise beträgt die Leukozytenzahl in Blut eines Erwachsenen etwa 6700 Zellen/μl und der durchschnittliche Prozentsatz jeder Leukozytenklasse bei Neutrophilen 55,3 %, bei Eosinophilen 3,5 %, bei Basophilen 0,5 %, bei Monozyten 5,0 % und bei Lymphozyten 36,6 %. Weiterhin ist die Anzahl der Granulozyten unter den Leukozyten am größten und weist intern eine große Menge Elastase auf. Granulozytenelastase wird freigesetzt, wenn der Granulozyt einer Stimulation oder einer Beschädigung durch Phagozyten oder eine Entzündung ausgesetzt wird, wodurch auf die Läsion reagiert wird. In Blut ist die erwähnte Elastase in ihrem deaktivierten Zustand durch Binden an einen Proteaseinhibitor, wie α1-Antitrypsin oder dergleichen, vorhanden.
Die durchschnittliche Retentionszeit in Blut beträgt etwa 10 Stunden. Sobald die Elastase in das Gewebe oder Urin ausgeschieden wurde, kehrt sie nicht wieder in das umlaufende Blut zurück. Weiterhin beträgt die Elastasekonzentration im Plasma im Allgemeinen etwa ein bis mehrere Hundertstel der Elastasekonzentration in Granulozyten und ist im Wesentlichen vernachlässigbar. Weiterhin ist die Granulozytenelastase von einer von der Pankreas abgeleiteten Elastase verschieden, und ein Antikörper für die Granulozytenelastase führt keine Kreuzreaktion mit der von der Pankreas abgeleiteten Elastase aus. Die vorliegende Erfindung verwendet diese Prinzipien. Insbesondere werden Granulozyten lysiert, um die Elastase von den Granulozyten freizusetzen, und die Konzentration der freigesetzten Elastase wird dann durch eine immunologische Technik gemessen. Folglich kann die Konzentration selbst dann, wenn die Probe Blut ist, genau gemessen werden. Anhand des Messwerts kann die Anzahl der Leukozyten in der Probe auf der Grundlage eines bekannten Verhältnisses zwischen der Leukozytenzahl usw. und der Elastasekonzentration berechnet werden. Weil die Leukozyten unter Verwendung der Elastasekonzentration in Granulozyten gezählt werden, wird das Zählverfahren daher nicht durch eine andere nukleierte Zelle als einen Leukozyten, beispielsweise eine Erythroblastenzelle usw., die Ablagerung von Fibrin, eine Thrombozytenagglutination und einen Mangel von Erythrozyten bei der Hämolyse beeinträchtigt. Weiterhin kann der für das Verfahren verwendete Zähler miniaturisiert werden, können die Kosten für das Zählen verringert werden und wird der Zählwert weiterhin nicht durch die Geschicklichkeit eines Labortechnikers beeinflusst, weil die immunologischen Techniken verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bezeichnen die Leukozyten sowohl einzelne Leukozyten, d.h. Neutrophile, Eosinophile, Basophile, Monozyten und Lymphozyten, als auch ganze Leukozyten. Daher können gemäß der vorliegenden Erfindung die Anzahl der Leukozyten bildenden einzelnen Blutzellen, wie Neutrophil, Eosinophil und Basophil usw. aufweisende Granulozyten, und die Anzahl der ganzen Leukozyten gezählt werden.
Es ist bevorzugt, dass das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung das Binden des gleichen Proteaseinhibitors wie ein in der Probe enthaltener Proteaseinhibitor an die freigesetzte Elastase und das anschließende Zugeben eines Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers zu der Probe aufweist. Wenn bei einer solchen bevorzugten Ausführungsform ein Proteaseinhibitor in der Probe, wie Blut usw., enthalten ist, kann die Wirkung durch den Proteaseinhibitor beseitigt werden. Daher ist es bevorzugt, dass, wenn die Probe Vollblut ist, der Proteaseinhibitor α1-Antitrypsin ist, weil α1-Antitrypsin unter den Proteaseinhibitoren im Blut den größten Anteil aufweist (etwa 90 %).
Bei dem Zählverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass eine Latexagglutinations-Immunprobe als immunologische Technik verwendet wird. Insbesondere ist es bevorzugt, dass das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst: das Bewirken einer Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen einem Antikörperteilchen, in dem der Anti-Granulozytenelastase-Antikörper an ein Latexteilchen gebunden ist, und der aus den Granulozyten freigesetzten Elastase und Bestimmen des Grads der Agglutination des Latexteilchens, um so den an die Elastase gebundenen Anti-Granulozytenelastase-Antikörper zu messen. Die Latexagglutinations-Immunprobe ist bevorzugt, weil es sich dabei um eine homogene Immunprobe handelt, bei der eine Antigen-Antikörper-Reaktion schnell abläuft und keine B/F-(Bindung/Frei)-Trennung erforderlich ist, weshalb sie nur wenige Schritte aufweist, so dass sie sich bequem und zu geringen Kosten ausführen lässt. Zusätzlich kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen: Binden der von den Granulozyten freigesetzten Elastase an den Anti-Granulozytenelastase-Antikörper, der an eine feste Phase gebunden ist, Zugeben eines markierten Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers dazu und Messen des an die Elastase gebundenen markierten Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers. Abhängig von den Markierungen, kann die immunologische Technik eine Enzym-Immunprobe, eine Radio-Immunprobe, eine Fluoreszenz-Immunprobe und dergleichen sein.
Bei dem Zählverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden als die bekannten Verhältnisse beispielsweise das folgende erste und zweite Verhältnis bevorzugt verwendet.
Das erste Verhältnis ist ein statistisches Verhältnis zwischen der Leukozytenzahl oder der Granulozytenzahl und der Elastasekonzentration. Das statistische Verhältnis umfasst beispielsweise einen linearen Regressionsausdruck usw., der durch getrennt gemessene Werte der Elastasekonzentration und die Anzahl der Leukozyten usw. in der Probe, wie Blut, erhalten wird. Der lineare Regressionsausdruck umfasst einen linearen Regressionsausdruck zwischen der Elastasekonzentration und der Granulozyten zahl, einen linearen Regressionsausdruck zwischen der Elastasekonzentration und der Anzahl der ganzen Leukozyten und dergleichen.
Das zweite Verhältnis ist die Elastasekonzentration in Bezug auf eine Granulozytenzelle. Anhand dieses Verhältnisses kann die Anzahl der in der Probe enthaltenen Granulozyten berechnet werden. Die Elastasekonzentration in Bezug auf eine Granulozytenzelle beträgt im Allgemeinen 1 bis 5 ng/ml, vorzugsweise 2 bis 2, 5 ng/ml. Daher kann die Anzahl der ganzen Leukozyten in der Probe anhand der Anzahl der Granulozyten unter Verwendung eines bekannten Verhältnisses zwischen einer Granulozytenzahl und der Anzahl der ganzen Leukozyten berechnet werden.
Weiterhin kann als das bekannte Verhältnis zwischen der Leukozytenzahl und der Elastasekonzentration gemäß der vorliegenden Erfindung das herkömmlich bekannte Verhältnis verwendet werden, oder es kann ein Verhältnis verwendet werden, das vorab entsprechend den Probenarten berechnet wurde. Weiterhin kann das Zählen von Leukozyten entweder durch das vorstehend erwähnte visuelle Verfahren oder das automatische Zählverfahren ausgeführt werden. Weiterhin ist das Verfahren zum Messen der Elastasekonzentration nicht besonders beschränkt, es ist jedoch bevorzugt, die in der vorliegenden Erfindung verwendeten immunologischen Techniken zu verwenden.
Als nächstes kann ein Leukozytenzähler verwendet werden, um das Verfahren zum Zählen von Leukozyten gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwirklichen, und das Verfahren umfasst ein Mittel zum Berechnen der Anzahl der Leukozyten in der Probe anhand der Konzentration der von Granulozyten in der Probe freigesetzten Elastase unter Verwendung eines bekannten Verhältnisses zwischen einer Leukozytenzahl, einer Granulozytenzahl oder einer Neutrophilenzahl und einer Elastasekonzentration auf.
Es ist bevorzugt, dass der vorstehend erwähnte Leukozytenzähler aufweist: Mittel zum Freisetzen von Elastase aus Granulozyten in der Probe, Mittel zum Zugeben eines Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers zu der so freigesetzten Elastase, Mittel zum Messen des an die Elastase gebundenen Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers, um so die Elastasekonzentration zu bestimmen, und Mittel zum Berechnen der Anzahl der in der Probe enthaltenen Leukozyten anhand der bestimmten Elastasekonzentration unter Verwendung eines bekannten Verhältnisses zwischen einer Leukozytenzahl, einer Granulozytenzahl oder einer Neutrophilenzahl und der Elastasekonzentration.
Ein Reagenssatz, der einen Anti-Granulozytenelastase-Antikörper aufweist, kann zum Durchführen des Verfahrens zum Zählen von Leukozyten verwendet werden.
Ein Reagenssatz, der ein Antikörperteilchen aufweist, bei dem ein Anti-Granulozytenelastase-Antikörper an ein Latexteilchen gebunden ist, kann für das Verfahren zum Zählen von Leukozyten verwendet werden, bei dem die Latexagglutinations-Immunprobe verwendet wird.
Ein Reagenssatz, der einen Anti-Granulozytenelastase-Antikörper aufweist, welcher an einen markierten Anti-Granulozytenelastase-Antikörper und an eine feste Phase gebunden ist, kann für das Zählverfahren unter Verwendung eines markierten Antikörpers verwendet werden. Es ist bevorzugt, dass der markierte Anti-Granulozytenelastase-Antikörper ein enzymmarkierter Anti-Granulozytenelastase-Antikörper ist.
Es ist bevorzugt, dass der Reagenssatz den gleichen Proteaseinhibitor wie der in einer zu bestimmenden Probe enthaltene Proteaseinhibitor aufweist. Weiterhin ist der Proteaseinhibitor vorzugsweise ein α1-Antitrypsin, wenn die vorliegende Probe Vollblut ist. Weiterhin kann der Reagenssatz eine lysierende Substanz aufweisen.
Kurzbeschreibung der Zeichnung
1 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der durch das Zählverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmten Leukozytenzahl und der unter Verwendung eines automatischen Blutzellenzählers gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bestimmten Leukozytenzahl zeigt.
Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
Beim Zählverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung werden zuerst Granulozyten lysiert. Das Lysierverfahren ist nicht besonders beschränkt, und es können die herkömmlich bekannten Verfahren verwendet werden. Beispiele solcher Verfahren umfassen ein physikalisches Verfahren unter Verwendung von Ultraschallwellen usw., ein Verfahren, bei dem die Differenz des osmotischen Drucks verwendet wird, ein chemisches Verfahren unter Verwendung eines oberflächenaktiven Mittels usw. und dergleichen. Vor allem ist in Hinblick auf die Bedienbarkeit usw. ein Verfahren zum Eintauchen einer Probe in eine wässrige Lösung eines oberflächenaktiven Mittels bevorzugt. Beispiele für das oberflächenaktive Mittel umfassen Dodecyltrimethylammoniumbromid, Dodecyltrimethylammoniumchlorid, Saponin, Lecithin, Cholsäure, Natriumdodecylsulfat, 3-[(Cholamidpropyl)-dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propansulfonsäure, Polyoxyethylenoctylphenylether, Polyoxyethylensorbitolester und dergleichen. Die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels ist nicht besonders beschränkt und beträgt im Allgemeinen 0,001 bis 5 Gew.-%, vorzugsweise 0,05 bis 1 Gew.-%.
Als nächstes wird die von Granulozyten freigesetzte Elastase durch eine immunologische Technik gemessen.
Weiterhin ist es, wie vorstehend erwähnt wurde, bevorzugt, dass, wenn die Probe Vollblut ist, vor dieser Messung ein Proteaseinhibitor zu der Probe hinzugefügt wird, um eine von den Granulozyten freigesetzte Elastase im freien Zustand zu einem Komplex der Protease und der Elastase zu formen. Dies liegt daran, dass sich die von den Granulozyten freigesetzte Elastase in einem freien Zustand befindet und als ein Komplex existiert, der an den Proteaseinhibitor in dem Plasma gebunden ist, und weil ein zu messender Gegenstand vorzugsweise ein Komplex ist. Beispiele des Proteaseinhibitors umfassen zusätzlich zu α1-Antitrypsin α2-Macroglobulin und dergleichen. Weiterhin wird die Zugaberate des Proteaseinhibitors, abhängig von der Konzentration der Probe und dergleichen, geeignet festgelegt, sie ist jedoch im Allgemeinen das 5 bis 10Fache, vorzugsweise das 8 bis 12Fache des Gewichts der Granulozytenelastase.
Als die vorstehend erwähnte immunologische Technik stehen beispielsweise die Latexagglutinations-Immunprobe, die Enzym-Immunprobe, eine Radio-Immunprobe, die Fluoreszenz-Immunprobe und dergleichen zur Verfügung.
Der gemäß der vorliegenden Erfindung verwendete Anti-Granulozytenelastase-Antikörper kann durch Abtrennen vom Blutserum eines spezifisch immunisierten Tiers unter Verwendung von Granulozytenelastase durch ein übliches Verfahren präpariert werden. Weiterhin kann er durch ein gewöhnliches Hybridomaverfahren präpariert werden. Das zum Präparieren des Antikörpers verwendete Tier ist beispielsweise ein Schaf, ein Kaninchen usw. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
Das Latexagglutinationsverfahren verwendet einen an Latexteilchen gebundenen Anti-Granulozytenelastase-Antikörper. Dieses Verfahren bestimmt die Elastasekonzentration durch Messen des Agglutinationsgrads, ohne eine B/F-Trennung auszuführen, weil die Latexteilchen agglutiniert sind, so dass eine B/F-Trennung nicht erforderlich ist. Bei der Bestimmung des Agglutinationsgrads wird im Allgemeinen ein Spektrophotometer verwendet, und das durchgelassene Licht wird als Trübheit bestimmt. Wenn der Agglutinationsgrad erhöht wird, wird die Lichtstreuung erhöht, wodurch das durchgelassene Licht verringert wird und die Trübheit vergrößert wird. Weiterhin beträgt die Messwellenlänge im Allgemeinen 400 bis 1500 nm, vorzugsweise 500 bis 800 nm. Überdies wird die Zugaberate des an Latexteilchen gebundenen Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers entspre chend den Probenarten oder der Konzentration usw. geeignet festgelegt. Wenn die Probe Vollblut ist, beträgt die Zugaberate im Allgemeinen 0,1 bis 5 mg/ml, vorzugsweise 1 bis 3 mg/ml. Weiterhin kann der Agglutinationsgrad unter Verwendung von Nephelometrie bestimmt werden. Weiterhin kann der Agglutinationsgrad visuell bestimmt werden. In diesem Fall ermöglicht die Verwendung des kommerziell verfügbaren Reagens für die visuelle Bestimmung die sehr genaue Bestimmung.
Der an Latexteilchen gebundene Anti-Granulozytenelastase-Antikörper kann durch gewöhnliche Verfahren präpariert werden. Beispielsweise kann der Antikörper bei einer Rate von 200 g/cm² physikalisch von Latexteilchen adsorbiert oder kovalent mit diesen verbunden werden. Die Latexteilchen haben eine durchschnittliche Teilchengröße von 0,1 bis 0,2 μm und weisen Polyethylen auf, das zu Polystyren Pfropf-copolymerisiert wird. Weiterhin können als die an Latexteilchen gebundenen Anti-Granulozytenelastase-Antikörper im Handel erhältliche Produkte verwendet werden.
Wie vorstehend erwähnt wurde, umfasst die Enzym-Immunprobe: zuerst Binden von Granulozyten freigesetzter Elastase an einen Anti-Granulozytenelastase-Antikörper, der an einer festen Phase immobilisiert ist, weiter Zugeben des mit einem Enzym in diesem Zustand markierten Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers, Trennen des ungebundenen Antikörpers durch Waschen usw. und dadurch Messen des an die Elastase durch die Reaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat gebundenen enzymmarkierten Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers.
Als Kombination des Enzyms und des Substrats ist die Kombination bevorzugt, die in der Lage ist, durch eine Reaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat detektierbare Produkte zu erzeugen. Beispiele von Kombinationen umfassen eine Kombination von Peroxidase, Wasserstoffperoxid und Orthophenylendiamin und eine Kombination von Alkalinphosphatase und 4-Nitrophenylphosphat. In einem Fall, in dem die Kombination von Peroxidase, Wasserstoffperoxid und Orthophenylendiamin verwendet wird, entwickelt Orthophenylendiamin durch die enzymatische Reaktion Farbe. Demgemäß wird die Farbe bei der Wellenlänge 492 nm analysiert.
Weiterhin kann der an der festen Phase immobilisierte Antikörper durch gewöhnliche Verfahren präpariert werden. Beispielsweise kann der Antikörper durch eine Säurebehandlung, eine Wärmebehandlung und dergleichen an der festen Phase immobilisiert werden. Weiterhin kann der enzymmarkierte Antikörper durch gewöhnliche Verfahren präpariert werden. Für diese Antikörper können kommerzielle Produkte verwendet werden.
Weiterhin können die Rate des immobilisierten Antikörpers und die Zugaberate des enzymmarkierten Antikörpers entsprechend den Probenarten, der Konzentration und dergleichen geeignet festgelegt werden. Weiterhin umfassen Beispiele der festen Phase eine Oberfläche von Kügelchen, eine Röhrchenoberfläche und dergleichen.
Die Radio-Immunprobe verwendet einen Anti-Granulozytenelastase-Antikörper, der mit einer radioaktiven Substanz an Stelle des Enzyms markiert ist. Die Radio-Immunprobe wird in der gleichen Weise ausgeführt wie die Enzym-Immunprobe, abgesehen davon, dass die radioaktiven Substanzen analysiert werden. Ein Beispiel der radioaktiven Substanz ist 126I-Na.
Die Fluoreszenz-Immunprobe verwendet einen Anti-Granulozytenelastase-Antikörper, der mit einer fluoreszenten Substanz an Stelle des Enzyms markiert ist. Die Fluoreszenz-Immunprobe wird in der gleichen Weise wie die Enzym-Immunprobe ausgeführt, abgesehen davon, dass die fluoreszenten Substanzen analysiert werden. Ein Beispiel der fluoreszenten Substanz umfasst Rhodamin, Fluoreszein, Cumarin und dergleichen.
Als nächstes wird anhand der durch die vorstehend erwähnten immunologischen Techniken erhaltenen Konzentration der Elastase die Anzahl der Leukozyten in der Probe unter Verwendung eines bekannten Verhältnisses zwischen der Leukozytenzahl und der Konzentration von Granulozytenelastase berechnet. Als das bekannte Verhältnis kann beispielsweise das statistische Verhältnis oder die Konzentration von Elastase zu einer Granulozytenzelle verwendet werden. Weiterhin ist es bevorzugt, dass das Verhältnis entsprechend den Probenarten geeignet festgelegt wird. Wenn die Probe beispielsweise Vollblut eines Erwachsenen, Vollblut eines Kinds oder einer alten Person ist, können jeweilige Verhältnisse verwendet werden.
Als nächstes sei bemerkt, dass es bevorzugt ist, dass der Leukozytenzähler, der zum Ausführen des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, folgendes aufweist: Mittel zum Freisetzen von Elastase aus Granulozyten in der Probe, Mittel zum Zugeben eines Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers zu der so freigesetzten Elastase, Mittel zum Messen des an die Elastase gebundenen Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers, um so die Elastasekonzentration zu bestimmen, und Mittel zum Berechnen der Anzahl der in der Probe enthaltenen Leukozyten anhand der bestimmten Elastasekonzentration unter Verwendung eines bekannten Verhältnisses zwischen einer Leukozytenzahl, einer Granulozytenzahl oder einer Neutrophilenzahl und der Elastasekonzentration. Mit diesem Zähler kann die Anzahl der Leukozyten vollautomatisch berechnet werden.
Die Mittel zum Freisetzen von Elastase und die Mittel zum Zugeben des Antikörpers umfassen solche Elemente, wie eine Pumpe zur geteilten Injektion usw. des Reagens, ein Ventil, eine Düse, ein Rührwerk, einen Behälter, einen Mechanismus zum Einstellen der Temperatur usw. Überdies umfassen die Mittel zum Messen der Elastasekonzentration beispielsweise ein optisches Messsystem usw. zusätzlich zu den vorstehend erwähnten Elementen. Überdies umfassen die Berechnungsmittel beispielsweise einen Berechnungsmechanismus, der so programmiert ist, dass die Anzahl der Granulozyten oder die Anzahl der ganzen Leukozyten in der Probe anhand der Elastasekonzentration und des vorstehend erwähnten bekannten Verhältnisses berechnet werden kann, und einen Mechanismus (Anzeige, Drucker usw.) zum Anzeigen der berechneten Ergebnisse.
Auf diese Weise kann der Zähler zum Ausführen des Zählverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung auch mit der Größe eines A4-Papiers versehen werden. Der Zähler kann, verglichen mit demjenigen des herkömmlichen automatischen Zählverfahrens, sehr klein und kostengünstig sein.
Der Zähler zum Zählen von Leukozyten weist mindestens ein Mittel zum Berechnen der Anzahl der Leukozyten anhand der Konzentration der von Granulozyten in der Probe freigesetzten Elastase unter Verwendung des bekannten Verhältnisses zwischen einer Leukozytenzahl, einer Granulozytenzahl oder einer Neutrophilenzahl und der Elastasekonzentration auf. Andere Mittel sind nicht immer notwendig. Beispielsweise kann das Reagens oder der Antikörper von Hand hinzugefügt werden. Weiterhin kann die Elastasekonzentration unter Verwendung des optischen Messsystems gemessen oder visuell gemessen werden.
Als nächstes können für den Reagenssatz die in den Zählverfahren beispielhaft angegebenen Reagenzien verwendet werden.
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung anhand Beispielen und Vergleichsbeispielen beschrieben.
Beispiel 1
Eine Probe wurde durch Verdünnen von Vollblut eines Erwachsenen mit phosphatgepufferter Salzlösung (pH-Wert 7,4) zu verschiedenen Konzentrationen (5 Typen) präpariert. Jede dieser Proben wurde zu 0,1 Gew.-% wässriger Lösung von Dodecyltrimethylammoniumchlorid zugegeben, um Leukozyten zu lysieren. Jede von ihnen wurde mit 0,01 Gew.-% Polyoxyethylensorbitolester verdünnt, der α1-Antitrypsin enthielt, um mehrere Testflüssigkeiten zu präparieren. Die Elastasekonzentration von 100 μl jeder Testflüssigkeit wurde durch die vorstehend erwähnte Technik (die Enzym-Immunprobe) unter Verwendung eines immobilisierten Antikörpers (anti-menschlicher Granulozytenelastase-Maus-monoklonaler Antikörper) und eines enzymmarkierten Antikörpers (peroxidasemarkierter anti-menschlicher Granulozytenelastase-Schaf-polyklonaler Antikörper) gemessen.
Insbesondere wurden zuerst 100 μl jeder Testflüssigkeit in einer Reaktionslösung an den immobilisierten Antikörper gebunden und davon gewaschen. Dann wurde der enzymmarkierte Antikörper zugegeben und davon gewaschen. Schließlich wurden Wasserstoffperoxid und Orthophenylendiamin zu der Reaktionslösung hinzugefügt. Die durch die Enzymreaktion entwickelte Farbe wurde durch die Absorption bei der Wellenlänge 492 nm bestimmt, und die Elastasekonzentration wurde unter Verwendung einer Kalibrierungskurve berechnet, die vorab erzeugt worden ist.
Andererseits wurde ein linearer Regressionsausdruck zwischen der Anzahl der ganzen Leukozyten und der Elastasekonzentration in Bezug auf das Vollblut eines anderen Erwachsenen gebildet. Die Anzahl der ganzen Leukozyten wurde unter Verwendung eines automatischen Blutzellenzählers gezählt (K-4500, hergestellt von TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.). Weiterhin wurde die Konzentration von Granulozytenelastase in der gleichen Weise wie durch die vorstehend erwähnte Enzym-Immunprobe gemessen. Der lineare Regressionsausdruck (1) ist nachstehend dargestellt. Die Anzahl der ganzen Leukozyten in jeder Probe wurde anhand der Elastasekonzentration unter Verwendung dieses linearen Regressionsausdrucks (1) berechnet. Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Y = 2132. 9897X-245. 6519 (1)

X:: Konzentration von Granulozytenelastase (μg/ml)
Y:: Anzahl der ganzen Leukozyten (Zelle/μl)

Weiterhin wurde zur Kontrolle die Anzahl der Leukozyten in jeder Probe unter Verwendung des automatischen Blutzellenzählers (K-4500, hergestellt von TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) gezählt. Die Ergebnisse sind auch in Tabelle 1 dargestellt.
Beispiel 2
Die Anzahl der ganzen Leukozyten wurde unter Verwendung der Elastasekonzentration in Bezug auf eine neutrophile Zelle, d.h. 0,9084 ng/ml, und des Verhältnisses der Neutrophilenzahl zur Anzahl der ganzen Leukozyten, d.h. 55,3 %, berechnet. Die Elastasekonzentration in Bezug auf eine neutrophile Zelle wurde nur anhand der durch das gewöhnliche Verfahren (das visuelle Verfahren) berechneten Neutrophilen und der durch dieselbe Technik wie in Beispiel 1 (die Enzym-Immunprobe), abgesehen davon, dass in Beispiel 1 kein linearer Regressionsausdruck verwendet wurde, gemessenen Elastasekonzentration berechnet. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse.
Vergleichsbeispiel
Fünf Arten der Testflüssigkeit wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 präpariert. 10 μl jeder Testflüssigkeit wurden zu 250 μl Goodscher Pufferlösung (HEPES, pH-Wert 7,5) hinzugefügt und 3 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Zu dieser Testflüssigkeit wurden 4 mg/ml einer wässrigen Lösung von AAPV (Methoxysuccinyl-Ala-Ala-Pro-Val-nitro-anilid) hinzugefügt, gerührt und 6 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Absorption der Reaktionslösung bei der Wellenlänge 405 nm gemessen und die Elastaseaktivität bestimmt. Weiterhin wurde zur Kontrolle, ähnlich Beispiel 1, die Anzahl der ganzen Leukozyten unter Verwendung des automatischen Blutzellenzählers (K-4500, hergestellt von TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) gezählt. Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse. (Tabelle 1) Beispiel 1
(Tabelle 2) Beispiel 2
(Tabelle 3) Vergleichsbeispiel

Anzahl der Kontroll-Leukozyten (Zellen/μl) Elastaseaktivität (U/ml)

730 4,3

1090 24,8

1540 7,8

1970 52,8

2670 33,4
Wie in den Tabellen 1 und 2 in den Beispielen 1 und 2 dargestellt ist, waren die Anzahl der anhand der Elastasekonzentration berechneten ganzen Leukozyten und die Anzahl der unter Verwendung des automatischen Blutzellenzählers gezählten ganzen Leukozyten stark korreliert (Korrelationskoeffizient r = 0,986). Andererseits war in dem Vergleichsbeispiel die Korrelation zwischen der Elastasekonzentration (der Enzymaktivität) und der Anzahl der unter Verwendung des automatischen Blutzellenzählers gezählten ganzen Leukozyten gering (Korrelationskoeffizient r = 0,6268). Es wird angenommen, dass dies darauf zurückzuführen ist, dass in dem Vergleichsbeispiel die Elastaseaktivität durch den Proteaseinhibitor (α1-Antitrypsin usw.) in der Probe gehemmt war, weil die Elastasekonzentration durch die Enzymprobe gemessen wurde.
Beispiel 3
Fünf Probenarten wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 präpariert. Die Elastasekonzentration von jeder dieser 5 Proben wurde durch die nachstehend erwähnte Latexagglutinations-Immunprobe gemessen. Insbesondere wurde zuerst jede der vorstehend erwähnten Proben zu 0,1 Gew.-% wässriger Saponinlösung hinzugefügt, um Leukozyten zu lysieren. Diese wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 verdünnt, um die Testflüssigkeit zu präparieren. 10 μl dieser Testflüssigkeit wurden zu 250 μl phosphatgepufferter Salzlösung (pH-Wert 7,4) hinzugefügt, und es wurden dann 50 μl Latexsuspension (Konzentration: 2,0 mg/ml), die durch anti-menschliche Granulozytenelastase-Antikörper sensibilisiert worden war, zu der Testflüssigkeit hinzugefügt und 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Latexsuspension wurde durch physikalisches Adsorbieren des vorstehend erwähnten Antikörpers an den Latexteilchen mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von 0,1 bis 0,2 μm präpariert, wobei Polyethylen bei einer Rate von etwa 200 ng/cm² zu Polystyren pfropfcopolymerisiert wurde. Anschließend wurde die Absorption (Trübheit) dieser Pufferlösung bei der Wellenlänge 660 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers bestimmt, und die Elastasekonzentration wurde gemessen. Anhand des Zahlenwerts wurde die Anzahl der Leukozyten in der Probe in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 berechnet. Weiterhin wurde zur Kontrolle die Anzahl der Leukozyten in jeder Probe unter Verwendung des automatischen Blutzellenzählers (K-4500, TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) gezählt. Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse.
(Tabelle 4) Beispiel 3
Wie in Tabelle 4 in Beispiel 3 dargestellt ist, waren die Anzahl der anhand der Elastasekonzentration berechneten Leukozyten und die Anzahl der unter Verwendung des automatischen Blutzellenanalysators gezählten ganzen Leukozyten stark korreliert (Korrelationskoeffizient r = 0,998).
Beispiel 4
Die Anzahl der Leukozyten in der Probe wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 unter Verwendung von 50 Fällen Vollblut von Erwachsenen (n = 50) als Proben berechnet. Weiterhin wurde zur Kontrolle die Anzahl der Leukozyten von jeder der vorstehend erwähnten Proben (n 50) unter Verwendung des automatischen Blutzellenzählers (K-4500, hergestellt von TOA MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD.) gezählt. 1 zeigt die Ergebnisse. 1 ist eine Graphik, welche die Beziehung zwischen der Anzahl der durch das Zählverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gezählten Leukozyten und der Anzahl der unter Verwendung des in jeder Spezifikation betroffenen automatischen Blutzellenzählers gezählten Leukozyten dargestellt ist (n = 50).
Wie in 1 dargestellt ist, waren in jeder Probe (n = 50) die Anzahl der anhand der Elastasekonzentration berechneten Leukozyten und die Anzahl der unter Verwendung des automatischen Analysators gezählten ganzen Leukozyten stark korreliert (Korrelationskoeffizient r = 0,973).
Industrielle Anwendbarkeit
Wie vorstehend erwähnt wurde, wurde bei dem Verfahren zum Zählen von Leukozyten gemäß der vorliegenden Erfindung die Anzahl der Leukozyten in einer Probe anhand der Konzentration der in Granulozyten enthaltenen Elastase, die durch die immunologische Technik gemessen wurde, berechnet. Mit diesem Verfahren können Leukozyten gezählt werden, ohne durch nukleierte Zellen mit Ausnahme von Leukozyten, beispielsweise Erythroblastenzellen usw., eine Fibrinablagerung, eine Agglutination von Thrombozyten und Mängel in der Hämolyse von Erythrozyten, beeinträchtigt zu werden. Überdies können nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung der Zähler miniaturisiert werden und können die Zählkosten verringert werden. Weil dieses Verfahren weiterhin die immunologische Technik verwendet, wird es nicht durch die Geschicklichkeit von Labortechnikern beeinflusst.

Claims

Verfahren zum Zählen von Leukozyten, umfassend: Freisetzen von Elastase aus Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen (nachstehend werden diese drei Blutzellen als "Granulozyten" bezeichnet) in Leukozyten, die in einer Probe enthalten sind, Zugeben eines Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers zu der so freigesetzten Elastase, Messen des Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers, der an die Elastase gebunden ist, um so die Konzentration der Elastase zu bestimmen, und Berechnen der Anzahl an Leukozyten, die in der Probe enthalten sind, aus der so bestimmten Konzentration an Elastase unter Verwendung eines bekannten Verhältnisses der Leukozytenzahl, der Granulozytenzahl oder der Neutrophilenzahl zur Konzentration an Elastase.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend: Binden des gleichen Proteaseinhibitors wie ein in der Probe enthaltener Proteaseinhibitor an die freigesetzte Elastase und anschließendes Zugeben eines Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers zu der Elastase.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Probe Vollblut ist und der Proteaseinhibitor α₁-Antitrypsin ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei der Proteaseinhibitor im Bereich von dem 5- bis zum 10fachen des Gewichts der Granulozytenelastase zugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend das Bewirken einer Antigen-Antikörper-Reaktion zwischen einem Antikörperteilchen, in dem der Anti- Granulozytenelastase-Antikörper an ein Latexteilchen gebunden ist, und der aus den Granulozyten freigesetzten Elastase und Bestimmen des Grads der Agglutination des Latexteilchens, um so den an die Elastase gebundenen Anti-Granulozytenelastase-Antikörper zu messen.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Antikörperteilchen, in dem der Anti-Granulozytenelastase-Antikörper an das Latexteilchen gebunden ist, in einem Verhältnis von 0,1 bis 5 mg, bezogen auf 1 ml Probe, zugegeben wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend Binden der aus den Granulozyten freigesetzten Elastase an den Anti-Granulozytenelastase-Antikörper, der an eine feste Phase gebunden ist, Zugeben eines markierten Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers dazu und Messen des an die Elastase gebundenen markierten Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Markierung des markierten Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers mindestens eine Markierung ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Enzymmarkierung, einer radioaktiven Markierung und einer Fluoreszenzmarkierung.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Markierung des markierten Anti-Granulozytenelastase-Antikörpers ein Enzym ist und ein nachweisbares Produkt durch eine Umsetzung zwischen dem Enzym und seinem Substrat hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Enzym Peroxidase ist und sein Substrat Orthophenylendiamin und Wasserstoffperoxid ist bzw. sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das bekannte Verhältnis ein statistisches Verhältnis der Leukozytenzahl oder der Granulozytenzahl zur Elastasekonzentration ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das bekannte Verhältnis die Elastasekonzentration, bezogen auf eine Granulozytenzelle bzw. Granulozyte, ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Elastasekonzentration, bezogen auf eine Granulozytenzelle, im Bereich von 1 bis 5 ng/ml liegt.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Anzahl an gesamten bzw. vollständigen Leukozyten aus der Anzahl an Granulozyten unter Verwendung eines bekannten Verhältnisses einer Granulozytenzahl zur Anzahl an vollständigen Leukozyten berechnet wird.