CN1293760A - 白细胞计数法及白细胞计数装置 - Google Patents

Abstract

一种白细胞计数方法,包括使样品中粒细胞释放弹性蛋白酶、将抗粒细胞弹性蛋白酶抗体添加到该弹性蛋白酶上、通过测定结合于弹性蛋白酶上的抗体测定弹性蛋白酶浓度、由该浓度并使用白细胞数与弹性蛋白酶浓度的已知比例计算上述样品中的白细胞数。按照该计数法,如图1所示与以前的自动血细胞计数仪相比,能够同样准确地测定白细胞数,而且简便、成本低。

Description

白细胞计数法及白细胞计数装置

技术领域

本发明涉及一种样品中白细胞的计数的方法以及用于该计数方法的计数装置。

技术背景

在血液检查中，一般要进行白细胞计数，其临床意义重大。例如，通过红细胞数能够检查有无贫血或贫血的程度，也可以诊断由于组织缺氧而引起的各种各样的症状。另一方面，白细胞是肌体防御功能即免疫功能的核心，能够抵御侵入体内的细菌和病毒。特别是粒细胞或白细胞在细菌和异体蛋白质侵入体内时，具有受其刺激释放弹性蛋白酶等蛋白质分解酶发挥作用的功能。在很多疾病状况下，白细胞数出现增多或减少，因此，白细胞计数对疾病的筛选很重要，在疾病需要进行紧急诊断和治疗时，成为很重要的一项检查项目。另外，由于白细胞数随年龄、昼夜、季节等因素而变化，希望在日常的诊断和治疗中，能够适时、准确地进行计数。

目前，白细胞计数法可大致分为目测计数法和自动计数法两种。上述目测计数法是在计数板上用镜检进行计数的方法。其中，有不经处理直接进行计数和先用染色剂将血细胞细胞核染色再进行计数两种情况。上述自动计数法是将血液稀释到一定浓度后，使其通过极细的流路，用电阻或散射光检出血细胞，计算血细胞数的方法。一般使用专用血细胞计数装置进行。这些计数法虽然依人的视觉或是仪器的不同测定结果有差别，但它是一种实际计算血细胞数的方法。然而，在这些计数法中，存在以下问题。

发明公开

上述目测法，由于红细胞溶血不完全或血细胞凝集导致的细胞误认、细胞在计数板上分散不均匀以及检测人员的熟练程度等会产生计数误差。另外，目测法因为成红细胞等白细胞以外的有核细胞也被作为白细胞计数，所以，当白细胞以外的有核细胞进入到末梢血中时，有必要涂抹染色标本、测定白细胞和其他细胞的比例，进行校正。并且，目测法的计数是用手进行，计数时花费时间长。

上述自动计数法由于成红细胞的出现、血纤维蛋白的析出、血小板凝集、红细胞溶血不全等原因，有时得不到正确的计数值。此外，依测定装置种类的不同，有的通过粒度分布的测定功能和类型认知，能够分类计数结果，如果使用这种装置，易于发现疾病，但是，这种装置不但价格高，而且体积也大。不仅是这种特殊装置，用于上述自动计数法的血细胞计数装置也存在体积大、昂贵，清洗复杂的液体流路等机器维护工作烦杂等问题，用于大医院检验室和检验中心等处理大量检品的地方能发挥效率，但对于检品少的中小医院和私人开业诊所等就成为很重的负担。

因此，本发明的目的在于提供一种能够将所用装置小型化，正确、简单并且成本低地白细胞计数方法以及用于该计数方法的计数装置。

为达到上述目的，本发明的白细胞计数法通过以下步骤计算出样品中的白细胞数。其中包括使样品内白细胞中的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞(以下将这些血细胞称作“粒细胞”)释放出内部的弹性蛋白酶，将抗粒细胞弹性蛋白酶抗体加到这种弹性蛋白酶上，通过测定结合到上述弹性蛋白酶上的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体，测定弹性蛋白酶浓度，由该浓度及白细胞数、粒细胞数或嗜中性粒细胞数与弹性蛋白酶浓度的已知比例，计算出样品中的白细胞数。

因此，本发明的计数法并非实际计算白细胞数，而是通过测定粒细胞内的弹性蛋白酶浓度，间接地计算出白细胞数的一种方法。

在白细胞中有嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞5种，上述嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性细胞3种合称粒细胞。而且，血液中白细胞数和各级分的比例在小孩和老年人中略有不同，但无性别差异，几乎保持一定的值。例如，成人血液中的白细胞数约为6700个／μl，其级分的平均比例为嗜中性粒细胞55．3％、嗜酸性粒细胞3．5％、嗜碱性粒细胞0．5％、单核细胞5．0％、淋巴细胞36．6％。另外，粒细胞在白细胞中数量最多，其内部有大量的弹性蛋白酶。粒细胞弹性蛋白酶是在粒细胞受到吞噬细胞和炎症的刺激或受到损伤时释放出的物质，因此与病变相对应。在血液中，上述弹性蛋白酶与α1-抗胰蛋白酶等蛋白酶抑制剂结合处于失活状态，其平均对流时间约10小时左右，一经排出到组织或尿液中，就不再返回到循环血中。一般情况下，血浆中弹性蛋白酶的浓度是粒细胞中的几百分之一，基本上可以忽略不记。进而，粒细胞弹性蛋白酶与胰腺弹性蛋白酶不同，其抗体也与胰腺弹性蛋白酶无任何交叉反应。本发明利用这些性质。即，使粒细胞溶血，释放其内部弹性蛋白酶，若使用免疫学方法进行测定，样品即便是血液，也能够正确地测定其浓度，然后，由该浓度及白细胞数等与弹性蛋白酶浓度两者的已知比例，计算出样品中的白细胞数。这样，由于是根据粒细胞内弹性蛋白酶的浓度计算白细胞数，所以不受成红细胞等白细胞以外的有核细胞、血纤维蛋白析出、血小板凝集以及红细胞溶血等的干扰，而且所用装置也能够小型化，降低了计数费用，并且由于使用免疫学方法进行测定，其结果也不受检测人员熟练程度的影响。

另外，在本发明中，所述的白细胞含有两种意义，即嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞中的各种白细胞与总白细胞。因此，在本发明中被计数的白细胞数既可以是包含嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞3种的粒细胞等构成白细胞的各种白细胞数，也可以是总白细胞数。

在本发明中，优选使用一种与样品内蛋白酶抑制剂相同的蛋白酶抑制剂，使之结合于被释放的弹性蛋白酶上，然后在上述样品中加入抗粒细胞弹性蛋白酶抗体。这是因为血液等样品中含有蛋白酶抑制剂时，可以排除其影响。因此，当样品为全血时，蛋白酶抑制剂理想为α1-抗胰蛋白酶。因为α1-抗胰蛋白酶在血液内的蛋白酶抑制剂中含量最多(90％)。

在本发明计数法中，作为免疫学方法优选采用乳胶凝集免疫测定法。即，优选将抗体粒子与粒细胞释放的弹性蛋白酶进行抗原抗体反应，通过测定上述乳胶粒子的凝集度，测定结合到上述弹性蛋白酶上的上述抗粒细胞弹性蛋白酶抗体。其中，上述抗体粒子是将抗粒细胞弹性蛋白酶抗体结合到乳胶粒子上形成的。乳胶凝集免疫测定法，由于抗原抗体反应快，而且是一种不需要进行B／F分离(结合型／游离型)的匀相免疫测定法，因此，该方法能够以较少的工序、简单的操作及低成本加以实施。此外，也可以先将抗粒细胞弹性蛋白酶抗体预先结合到固相上，再将被释放的弹性蛋白酶结合于该抗粒细胞弹性蛋白酶抗体，在此状态下，再加入标记的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体，测定结合于弹性蛋白酶上的上述标记抗粒细胞弹性蛋白酶抗体。免疫学测定法根据标记方式的不同，有酶免疫法、放射免疫法、荧光免疫法等。

在本发明的计数法中，已知比例优选使用下面的第一种比例或者第二种比例。

上述第一种比例是白细胞数或粒细胞数与弹性蛋白酶浓度的统计学比例。该统计学比例例如有回归方程式，该方程式系通过分别测定血液等样品中弹性蛋白酶浓度和白细胞数，再由这两个数值求得。上述回归方程式，例如有弹性蛋白酶浓度与粒细胞数的线形回归方程式、弹性蛋白酶浓度与总白细胞数的线形回归方程式等。

上述第二种比例是每个粒细胞中所含的弹性蛋白酶浓度。使用该比例能计算出样品中粒细胞数。上述每个粒细胞中所含的弹性蛋白酶浓度，一般为1-5ng／ml，优选为2-2．5ng／ml。因此，求样品中总白细胞数时，由该粒细胞数并使用粒细胞总数和嗜中性粒细胞对总白细胞的已知比例即可求出。

另外，涉及本发明的白细胞数和弹性蛋白酶的已知比例，既可以使用历来公认的比例，也可以使用按照样品种类予先求出的比例。上述白细胞数的计算，也可以按照上述目测法或者自动化测量法中的任意一种进行。另外，对于上述弹性蛋白酶浓度的测定也不作特别限制，但是优选使用本发明中所用的免疫学的方法。

其次，本发明的白细胞计数装置是用于实施本发明白细胞计数法的一种装置，具有计算上述样品中白细胞数的功能，其中，白细胞数的计算由检品中粒细胞内释放的弹性蛋白酶浓度，并使用白细胞数、粒细胞数或者嗜中性粒细胞数与弹性蛋白酶的已知比例进行的。

上述白细胞计数器优选具有以下手段：使样品中粒细胞释放弹性蛋白酶的手段、在该弹性蛋白酶上添加抗粒细胞弹性蛋白酶抗体的手段、通过测定结合于上述弹性蛋白酶上的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体测定上述弹性蛋白酶浓度的手段、由该浓度及白细胞数与弹性蛋白酶浓度的已知比例，计算出样品中白细胞数的手段。

其次，本发明的试剂盒是用于实施本发明白细胞计数法的试剂盒，含有抗粒细胞弹性蛋白酶抗体。

用于上述适用乳胶凝集免疫测定法的本发明计数法的本发明试剂盒含有将抗粒细胞弹性蛋白酶抗体结合于乳胶粒子上的抗体粒子。

用于上述利用标记抗体的本发明计数法的本发明试剂盒含有标记的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体以及结合于固相上的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体。上述标记的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体优选酶标记的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体。

本发明的试剂盒优选含有蛋白酶抑制剂，且该蛋白酶抑制剂与待测样品中的蛋白酶抑制剂相同。另外，待测样品是全血的情况下，上述蛋白酶抑制剂理想为α1-抗胰蛋白酶。此外，本发明的试剂盒优选含有溶血剂。

图面简单说明

图1表示在本发明计数法的一个实施例中，按照本发明计数法算出的白细胞数与按照自动血细胞计数装置算出的白细胞之间的相关图。

实施本发明的最佳方式

在本发明计数法中，首先要使粒细胞溶血。溶血方法无特定的限制，能使用现有的公知方法，例如有使用超声波的物理方法、使用渗透压差的方法以及使用表面活性剂的化学方法等。其中，由于操作上的原因，优选的方法是将样品浸渍到表面活性剂水溶液中。上述表面活性剂，例如有十二烷基三甲铵溴化物、十二烷基三甲铵氯化物、皂甙、卵磷脂、胆汁酸、十二烷基硫酸钠、3-[(胆胺丙基)二甲铵]-2-羟基-1-丙磺酸、聚氧乙烯辛基苯基醚、聚氧乙烯山梨醇酯等。表面活性剂水溶液的浓度无特别的限制，一般为0．001-5重量％，优选0．05-1重量％。

其次，使用免疫学方法测定粒细胞中释放的弹性蛋白酶。

如前所述，样品是全血时，优选在进行该测定之前，先在上述样品中添加蛋白酶抑制剂。这是因为，在血浆中，粒细胞内的弹性蛋白酶是以与蛋白酶抑制剂结合的复合体形式存在。而粒细胞中释放的弹性蛋白酶是游离型的，作为测定对象优选复合体型的，因此将游离型弹性蛋白酶与蛋白酶抑制剂结合成复合体。作为上述蛋白酶抑制剂，除α1-抗胰蛋白酶之外，还有α2-巨球蛋白等。另外，蛋白酶抑制剂的添加比例可根据样品浓度等适当确定，一般为粒细胞弹性蛋白酶重量的5-10倍，优选8-12倍。

上述免疫学方法，如前所述例如有乳胶凝集免疫法、酶免疫法、放射免疫法及荧光免疫法。

在本发明中使用的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体，能够按常规方法，通过从用粒细胞弹性蛋白酶进行特异性免疫的动物血清中分离而进行制备。该抗体也可以按照普通的杂交细胞瘤法进行制备。用于制备上述抗体的动物例如有羊、兔等，但在本发明中不限于此。

上述乳胶酶凝集法是一种使用结合了乳胶粒子抗粒细胞弹性蛋白酶抗体的方法，是当上述抗体结合于粒细胞弹性蛋白酶时，引起乳胶凝集，不需B／F分离，通过测定上述凝集度测定弹性蛋白酶浓度。上述凝集度的测定，一般使用分光光度计进行，作为浊度，测定其透光。随凝集度的增大、散射光增加，透光减少，上述浊度上升。另外，测定波长一般为400-1500nm，优选500-800nm。另外，结合了上述乳胶粒子的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体的添加比例根据样品种类和浓度等适当确定，但是，当样品为全血时，这一添加比例一般为0．1-5mg／ml，优选1-3mg／ml。上述凝集度的测定，也可以用测量散射光的比浊法进行。并且，上述凝集度也可以用目测法进行测定。这种情况下，使用目测法用的市售试剂，能够高精度地进行测定。

结合了上述乳胶粒子的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体能够按常法制备。例如，将聚乙烯接枝共聚于聚苯乙烯上形成0．1-0．2μm的乳胶粒子，既可以按约200ng／cm²的比例，将抗体物理性地吸附于该乳胶粒子上，也可以通过共价键结合。另外，上述结合了乳胶粒子的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体也可以使用市售品。

上述酶免疫法，是一种通过酶和底物反应，而测定酶标记抗粒细胞弹性蛋白酶抗体的方法。该测定法为：先将粒细胞内释放的弹性蛋白酶结合到预先固定在固相上的粒细胞弹性蛋白酶抗体上，在这种状态下再添加酶标记的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体，并采用清洗等手段分离未结合的上述抗体，测定结合在弹性蛋白酶上的酶标记抗粒细胞弹性蛋白酶抗体。

作为上述酶和底物的组合，优选通过上述酶和底物的反应生成能够检出的产物，例如，有过氧化酶、过氧化氢与邻苯二胺的组合、碱性磷酸酯酶与4-硝基苯酚的组合等。使用上述过氧化酶、过氧化氢与邻苯二胺的组合时，经酶反应邻苯二胺显色，在492nm处对其进行测定即可。

另外，固定于上述固相上的抗体可以按一般方法进行制备。例如，经过酸处理或热处理等，将抗体固定于固相上。另外，上述酶标记抗体能够按一般方法进行制备。这些也可以使用市售品。

另外，上述固定于固相上的抗体及上述酶标记抗体的添加比例，依样品的种类和浓度可以适当确定。作为固定相，例如有玻璃多孔表面和管状表面等。

上述放射免疫法是使用用放射性物质代替上述酶标记的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体的一种测定方法。除测定上述放射性物质之外，其他都按上述酶免疫法同样的方法实施。上述放射性物质，例如126I-Na。

前记的荧光免疫法是使用以荧光物质代替上述酶标记的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体的一种测定方法。其中，除测定荧光物之外，其他都按上述酶免疫法同样的方法实施。作为荧光物质，例如：罗丹明、荧光素、香豆素等。

其次，由采用上述免疫学方法测得的弹性蛋白酶浓度，并使用白细胞数和粒细胞弹性蛋白酶浓度的已知比例，计算上述样品中的白细胞数。上述已知比例，可以使用前述的统计学比例或每个粒细胞中的弹性蛋白酶浓度。另外，上述比例优选按照样品的种类适当决定。例如，样品是成人全血、小孩全血或老年人全血时，可以使用各自的比例。

再次，本发明的白细胞计数装置优选具有下述手段：使样品中粒细胞内部的弹性蛋白酶释放的手段、在该弹性蛋白酶上添加抗粒细胞弹性蛋白酶抗体的手段、通过测定结合到上述弹性蛋白酶上的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体测定上述弹性蛋白酶浓度的手段、自该浓度并且使用白细胞数、粒细胞数及嗜中性粒细胞数与粒细胞弹性蛋白酶浓度的已知比例计算上述样品中白细胞数的手段。该装置可以全自动地计算白细胞数。

上述释放弹性蛋白酶的手段以及添加抗体的手段由各要素构成。例如有用于分注样品等的泵、阀门、喷嘴、搅拌器、容器、温度调节结构等。另外，测定弹性蛋白酶浓度的手段，在上述各要素基础上，由光学测定系统等构成。另外，上述记算功能由被程序化的计算器以及表示该结果的手段(显示器或打印机等)共同构成。其中，该程序能够从弹性蛋白酶浓度及上述已知比例，计算出样品中粒细胞数或白细胞数等。

这样，实施本发明计数法的装置，其占用的面积与A4纸张大小相同，与以前的自动测定装置相比，是一种非常小型、廉价的装置。

上述本发明的白细胞计数装置只要至少具有从样品中粒细胞内部释放的弹性蛋白酶浓度及白细胞数、粒细胞数或嗜中性粒细胞数与弹性蛋白酶浓度的已知比例计算出样品中白细胞数的手段即可。此外，也可以手工添加试剂和抗体。另外，弹性蛋白酶浓度的测定既可以通过光学测定系统，也可以通过目测进行。

其次，在本发明的试剂盒中，能够使用在上述计数法中列举的试剂。

其次，就实施例结合比较例加以说明。

(实施例1)

用磷酸缓冲生理盐水(pH7．4)将成人全血稀释成各种浓度(5种)，作为样品。将这些样品加入到0．1重量％十二烷基三甲铵氯化物水溶液内，使白细胞溶血。用含有α1抗胰蛋白酶的0．01重量％的聚氧乙烯山梨醇酯稀释上述样品，制备数种待检液。取各待检液100μl，使用固定化的抗体(抗人粒细胞弹性蛋白酶小鼠单克隆抗体)和酶标记抗体(过氧化酶标记抗人粒细胞弹性蛋白酶羊多克隆抗体)，按上述方法(酶免疫法)测定弹性蛋白酶浓度。

即，先将各待检液100μl结合到反应液中固定化的抗体上，清洗干净。其次，在添加上述酶标记抗体后，清洗干净。最后，在反应液中添加过氧化氢及邻苯二胺溶液。在波长492nm处，测定该酶反应导致的显色，按予先制成的标准曲线，计算弹性蛋白酶浓度。

另一方面，对于其他的成人全血样品，作出总白细胞数和弹性蛋白酶浓度的线性回归方程式。上述总白细胞数用自动血细胞计数仪(K-4500，东亚医用电子社制)进行计数、另外，粒细胞弹性蛋白酶浓度按上述酶免疫法同样的方法进行测定。该线性回归方程式(1)如下所示。使用该线性回归方程式(1)，从上述弹性蛋白酶浓度计算各样品中的总白细胞数。结果列于下述表1。

Y=2132．9897X-245．6519         (1)

X：粒细胞弹性蛋白酶浓度(μg／ml)

Y：总白细胞数(个／μl)

另外，作为对照，使用自动血细胞计数仪(K-4500，东亚医用电子社制)，对上述各样品的白细胞数进行计算。其结果也列于下述表1。

(实施例2)

在实施例1中，不使用线性回归方程式，而使用每个嗜中性粒细胞的弹性蛋白酶浓度0．9084ng／ml以及嗜中性粒细胞数与总白细胞数的比例55．3％，计算出总白细胞数。另外，上述每个嗜中性粒细胞中弹性蛋白酶浓度是取成人全血，按常规方法(目视法)只计算出嗜中性粒细胞数，并且按实施例1同样的方法(酶免疫法)，测定弹性蛋白酶浓度并计算出的数值。其结果列于下述表2。

(比较例)

按实施例1同样的方法，配成5种待检液。将各待检液10μl加入到250μlグッド缓冲液(HEPES，pH7．5)中，在37℃培养3分钟。再加入4mg／ml的AAPV(甲氧琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Val-硝基苯胺)水溶液、搅拌、在37℃培养6分钟。然后，测定反应液在波长405nm处的吸光度，测定弹性蛋白酶的活性。另外，作为对照，与实施例1同样的方法，使用自动血细胞计数装置(K-4500，东亚医用电子社制)计算总白细胞数。其结果见下述表3。

(表1)实施例1

对照白细胞数    弹性蛋白酶浓度    算出的白细胞数

(个／μl)         (μg／ml)          (个／μl)

1000                0．36               522

2100                1．51               2975

4200                2．02               4063

6300                2．99               6132

8400                4．01               8308

(表2)实施例2

对照白细胞数    弹性蛋白酶浓度    算出的白细胞数

(个／μl)          (μg／ml)         (个／μl)

1000                0．36                717

2100                1．51                3006

4200                2．02                4021

6300                2．99                5952

8400                4．01                7983

(表3)比较例

对照白细胞数    弹性蛋白酶活性

(个／μl)         (μg／ml)

730                 4．3

1090                24．8

1540                7．8

1970                52．8

如前表1、2所示，在实施例1、2中，由弹性蛋白酶浓度计算出的总白细胞数与使用自动血细胞计数装置计算出的总白细胞数之间有很大的相关性(相关系数r=0．986)。与此相反，在比较例中，弹性蛋白酶浓度与使用自动血细胞计数装置计算出的总白细胞数之间的相关性很差(相关系数r=0．6268)。其原因认为是：在比较例中使用了酶测定法测定弹性蛋白酶浓度，结果样品中的蛋白酶抑制剂(α1-抗胰蛋白酶等)抑制了弹性蛋白酶的活性。

(实施例3)

按实施例1同样的方法，配成5种待检液。对于各待检液，按以下所示的乳胶凝集免疫测定法测定弹性蛋白酶浓度。即，先将上述样品加入到0．1重量％皂甙水溶液中，使白细胞溶血。按实施例1同样的方法，将此液稀释成待检液。将该待检液10μl加入到250μl磷酸缓冲生理盐水(pH7．9)中，在该液体中，再加入50μl致敏抗人粒细胞弹性蛋白酶抗体的乳胶混悬液(浓度：2．0mg／ml)，在37℃培养15分钟。上述乳胶混悬液是以200ng／cm²的比例，将上述抗体物理性吸附在平均粒径为0．1-0．2μm的乳胶粒子上制成。其中，该乳胶粒子是将聚乙烯与聚苯乙烯接枝共聚而成。并且，在660nm波长处，用分光光度计测定该缓冲液的吸收度(浊度)，用以测定弹性蛋白酶浓度。按实施例1相同的方法，由该值计算出样品中白细胞数。另外，作为对照，与实施例1一样，使用自动血细胞计数仪(K-4500，东亚医用电子社制)计算上述样品中的白细胞数。结果见下述表4。

(表4)实施例3

样品稀释倍数  对照白细胞数  弹性蛋白酶浓度  算出的白细胞数

               (个／μl)      (μg／ml)      (个／μl)

1／16            1100            0．4          1284

1／8             1600            1．70         1996

1／4             3300            3．04         2766

1／2             6600            9．53         6498

1                13200           21．32        13277

如表4所示，在实施例3中，由弹性蛋白酶浓度记算出的白细胞数与使用自动血细胞计数仪计算出的总白细胞数之间有很高的相关性(相关系数r=0．998)。

(实施例4)

用成人全血50例(n=50)作为样品，按上述实施例3同样的方法，算出样品中的总白细胞数。另外，作为对照，使用自动血细胞计数仪(K-4500，东亚医用电子社制)分别计算出上述各样品(n=50)中的总白细胞数。结果如图1所示。该图显示的是对于各样品(n=50)，使用本发明计数法测得的白细胞数和使用自动血细胞计数仪测得的总白细胞数两者之间的关系。

如图所示，对于各样品(n=50)，由弹性蛋白酶浓度算出的白细胞数与使用自动血细胞计数装置算出的总白细胞数两者之间呈现很高的相关性(相关系数r=0．973)。

产业上利用的可能性

如上所述本发明的白细胞计数法，使用免疫学方法测定粒细胞内弹性蛋白酶浓度，由此弹性蛋白酶浓度算出样品中白细胞数。按照此法，不受成红细胞等白细胞以外的有核细胞、血纤维蛋白析出、血小板凝集以及红细胞溶血不良的影响，而且，所用装置既可以小型化、又可以降低计数费用。并且，由于使用免疫学方法进行测定，所以测定结果不受检测人员熟练程度的影响。

Claims (22)

1．一种白细胞计数法，其中，该计数法包括：使样品内白细胞中的嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞(以下，将这3种血细胞称做“粒细胞”)内的弹性蛋白酶释放，在该弹性蛋白酶上添加抗粒细胞弹性蛋白酶抗体，通过测定结合到上述弹性蛋白酶上的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体测定弹性蛋白酶浓度，由该浓度并且使用白细胞数、粒细胞数或嗜中性粒细胞与弹性蛋白酶的已知比例，计算出上述样品内的白细胞数。

2．权利要求1记载的计数法，其中，用与样品中蛋白酶抑制剂相同的蛋白酶抑制剂，使之与被释放的弹性蛋白酶结合后，在弹性蛋白酶上添加抗粒细胞弹性蛋白酶抗体。

3．权利要求2记载的计数法，其中，样品是全血，蛋白酶抑制剂是α1-抗胰蛋白酶。

4．权利要求2或3记载的计数法，其中，蛋白酶抑制剂的添加量是粒细胞弹性蛋白酶重量的5-10倍。

5．权利要求1-3中任意一项记载的计数法，其中，使抗体粒子与粒细胞内释放的弹性蛋白酶进行抗原抗体反应，并且该抗体粒子是将抗粒细胞弹性蛋白酶抗体结合于乳胶粒子上形成的，通过测定上述乳胶粒子的凝集程度，测定结合到上述弹性蛋白酶上的上述抗粒细胞弹性蛋白酶抗体。

6．权利要求5记载的计数法，其中，将抗粒细胞弹性蛋白酶抗体结合到乳胶粒子上形成的抗体粒子的添加比例为1ml样品加0．1-5mg。

7．权利要求1-3中任意一项记载的计数法，其中，包括：将粒细胞内释放的弹性蛋白酶结合到固定于固相上的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体上，在此状态下，加入经标记的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体，测定结合于上述弹性蛋白酶上的上述标记抗粒细胞弹性蛋白酶抗体。

8．权利要求7记载的计数法，其中，该标记抗粒细胞弹性蛋白酶抗体的标记是选自酶标记、放射标记以及荧光标记中的至少一种。

9．权利要求7记载的计数法，其中，标记抗粒细胞弹性蛋白酶抗体的标记是用酶进行的，通过上述酶和底物的反应，使之生成可以检出的生成物。

10．权利要求9记载的计数法，其中，酶是过氧化物酶，其底物是邻苯二胺及过氧化氢。

11．权利要求1-3中任意一项记载的计数法，其中，已知比例是白细胞数或粒细胞数与弹性蛋白酶浓度的统计学比例。

12．权利要求1-3中任意一项中记载的计数法，其中，已知比例是每个粒细胞中弹性蛋白酶浓度。

13．权利要求12记载的计数法，其中，每个粒细胞中弹性蛋白酶浓度在1-5ng／ml范围。

14．权利要求12记载的计数法，其中，用粒细胞数与总白细胞数的已知比例，由粒细胞数计算出样品中的总白细胞数。

15．一种用于实施权利要求1所述的白细胞计数法的白细胞计数装置，这种白细胞计数装置具有计算样品中白细胞数的手段，由样品中粒细胞内释放出的弹性蛋白酶浓度，并利用白细胞数、粒细胞数或嗜中性粒细胞数与弹性蛋白酶浓度的已知比例计算出样品中的白细胞数。

16．权利要求15记载的白细胞计数装置，其中，该装置具有以下手段：使样品中粒细胞释放弹性蛋白酶的手段、在该弹性蛋白酶上添加抗粒细胞弹性蛋白酶抗体的手段、通过测定结合于上述弹性蛋白酶上的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体测定上述弹性蛋白酶浓度的功能、从该浓度并使用白细胞数、粒细胞数或嗜中性粒细胞数与弹性蛋白酶浓度的已知比例计算出上述样品中白细胞数的功能。

17．一种用于实施权利要求1所述的白细胞计数法的试剂盒，这种试剂盒含有抗粒细胞弹性蛋白酶抗体。

18．一种用于实施权利要求5所述的白细胞计数法的试剂盒，这种试剂盒含有抗粒细胞弹性蛋白酶抗体结合于乳胶粒子上形成的抗体粒子。

19．一种用于实施权利要求7所述的白细胞计数法的试剂盒，这种试剂盒含有标记的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体和结合于固相上的抗粒细胞弹性蛋白酶抗体。

20．权利要求17-19中任意一项记载的试剂盒，其中，该试剂盒含有与待测样品中蛋白酶抑制剂相同的蛋白酶抑制剂。

21．权利要求20记载的试剂盒，其中，待测样品是全血，蛋白酶抑制剂是α1-抗胰蛋白酶。

22．权利要求17-19中任意一项中记载的试剂盒，其中，该试剂盒还含有溶血剂。

Images