CN103748464A - 用于测量α1-抗胰蛋白酶活性的固相结合的弹性蛋白酶结合测试 - Google Patents

用于测量α1-抗胰蛋白酶活性的固相结合的弹性蛋白酶结合测试 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种测量样品中活性α1-蛋白酶抑制剂（A1PI）的方法，包括以下步骤：将弹性蛋白酶结合到固相支持体上，使得样品中包含的A1PI结合到固相结合的弹性蛋白酶上，然后用检测试剂检测固相结合的A1PI。

Description

用于测量α1-抗胰蛋白酶活性的固相结合的弹性蛋白酶结合测试
技术领域
本发明涉及一种测量样品中活性α1-蛋白酶抑制剂（A1PI）的方法，包括以下步骤：将弹性蛋白酶结合到固相支持体上，使得样品中包含的A1PI结合到与固相结合的弹性蛋白酶上，然后用检测试剂检测固相结合的A1PI。
背景技术
人类α1-蛋白酶抑制剂（A1PI；也称为：α-1-抗胰蛋白酶）在血清水平上的循环浓度为20至48μM。该51千道尔顿大小的糖蛋白由394个氨基酸组成，具有3个连接到天冬酰胺46、83和247位点的复合型N-聚糖。不同的N-聚糖分支和N端的截短导致特有的等电聚焦模式。此外，最近已经描述了一种C端截短形式的A1PI，该A1PI通过基本羧肽酶裂解后缺失了C端赖氨酸。A1PI是丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins:serine proteinase inhibitors）超级家族中的一员。它的抗蛋白酶活性绝对需要活性位点Met358-Ser359。该位点占据了分子中暴露的环并和中性白细胞弹性蛋白酶或其他丝氨酸蛋白酶的活性区域紧密结合，所述其他丝氨酸蛋白酶包括胰蛋白酶、组织蛋白酶G、血纤维蛋白溶酶、凝血酶和组织激肽释放酶。A1PI对中性白细胞弹性蛋白酶发挥优先的灭活功能，因为A1PI/中性白细胞弹性蛋白酶复合物的结合速率常数比测量的A1PI/其他丝氨酸蛋白酶结合速率常数要高出25倍。A1PI从血浆扩散到肺中，其中它负责保护下呼吸道中90%以上的抗弹性蛋白酶。A1PI的缺乏导致血浆中浓度低于20μM，使得肺部保护不力并极易受到渐进的肺损伤。治疗针对血浆中A1PI的更换或增加。A1PI中性白细胞弹性蛋白酶抑制剂活性的检测早在1974年即基本成为可能，当时已经描述了显色底物N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸-p-硝基苯胺（Suc(Ala)3-pNA）的合成。该底物对弹性蛋白酶具有高选择性。例如当在与弹性蛋白酶相同的浓度下测量、并且将弹性蛋白酶获得的水解速率设定为100时，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的水解速率分别为0.007和0.014。在pH为8.0、温度为25℃的条件下，对于弹性蛋白酶而言，底物Suc(Ala)3-pNA的动力学常数Km和Kcat分别为1.15mM和18.6s-1。它的选择性和在水中良好的可溶性是1981年首次描述的A1PI弹性蛋白酶抑制测试的基础。该试验基于A1PI样品中残余弹性蛋白酶的活性的检测，所述样品和过量的弹性蛋白酶一起温育。简而言之，在添加显色底物之前，样品和适量的猪弹性蛋白酶一起温育限定的时间。光学监测pNA的释放量，并且用于计算弹性蛋白酶的残基活性，弹性蛋白酶本身和样品中A1PI活性成反比。采用显色方法的标准测试模式对活性A1PI的定量有一个相当高的限制：大约3微克/毫升。虽然该类测试模式的灵敏度可以通过使用荧光底物而被提高，用于检测残余弹性蛋白酶，但是它们仍然局限于这样的事实：只能检测过量的一方反应试剂，例如弹性蛋白酶，而不是反应产物。
因此，存在提供一种灵敏度提高的用于测定样品中A1PI活性的新型测试方法的强烈需求。
该需求可以通过在权利要求中表征的实施方式来满足。
发明内容
本发明描述了固相结合的弹性蛋白酶用于测量样品中A1PI抗弹性蛋白酶的抑制活性的用途。通过用检测试剂来检测弹性蛋白酶复合的、被板结合的A1PI，而不是测量残余弹性蛋白酶活性，来直接测量形成的弹性蛋白酶-A1PI复合物的量。该检测模式有利于将测试的灵敏度提高1,000倍。该测试的优异选择性取决于弹性蛋白酶-A1PI复合物形成的特异性，该特异性在弹性蛋白酶和固相支持体结合后不会改变，并取决于检测试剂的特异性。
特别地，本发明涉及一种测量样品中的活性α1-蛋白酶抑制剂（A1PI）的方法，包括以下步骤：将弹性蛋白酶结合到固相上；将固相与样品共同温育；将固相与结合到A1PI的检测试剂共同温育；测定结合到固相的检测试剂的量；以及测定样品中活性A1PI的量。
具体实施方式
一方面，本发明涉及一种测量样品中活性α1-蛋白酶抑制剂（A1PI）的方法，包括以下步骤：
（a）将弹性蛋白酶结合到固相上；
（b）将固相与样品共同温育；
（c）将固相与结合到A1PI的检测试剂共同温育；
（d）测定结合到固相中的检测试剂的量；以及
（e）测定样品中活性A1PI的量。
在上下文中，此处所用的术语“测量样品中的活性A1PI”是指测定样品中含有的活性A1PI的量和/或浓度。进一步地，此处所用的术语“活性A1PI”是指能够展示其天然功能（即能够结合和灭活弹性蛋白酶和其他丝氨酸蛋白酶）的A1PI。
本发明方法中用到的弹性蛋白酶没有特别限定，可以是例如人或猪弹性蛋白酶。将弹性蛋白酶结合到固相的方法在本领域是已知的，并且没有任何特别限定。包括例如将固相支持体和弹性蛋白酶在合适的缓冲液例如磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，在合适的温度例如+4℃下，共同温育一段合适的时间，例如过夜。其他合适的缓冲液和温育参数在本领域都是已知的。
在其上进行本发明方法的固相没有特别限定。而且，合适的固相在本领域是已知的。在一个优选的实施方式中，所述固相为微孔板，例如带有吸附表面的微孔板，例如NUNCTMMaxisorp板。
在本发明的上下文中，弹性蛋白酶能够通过吸附而附接到固相上，它是通过疏水作用力而保留在固相上的。可选地，固相的表面可以通过引起弹性蛋白酶和支持体之间的共价连接这一化学过程而被激活。
如果固相为硅或玻璃，则该表面一般必须在连接弹性蛋白酶之前被激活。激活的硅烷化合物例如三乙氧基氨丙基硅烷（triethoxy amino propyl silane）、三乙氧基乙烯基硅烷（triethoxy vinyl silane）、和（3-巯基-丙基）-三甲氧基硅烷（（3-mercapto-propyl）-trimethoxysilane）可以用于分别引入反应基团例如氨基、乙烯基、和硫醇基。这些激活的表面可以用于直接结合弹性蛋白酶（在引入氨基和硫醇基的情况下），或激活的表面可以用于进一步和连接剂反应以将弹性蛋白酶从表面分离，所述连接剂例如为戊二醛、双（琥珀酰亚胺酯）辛二酸酯、SPPD（3-[2-吡啶二硫代]丙酸琥珀酰亚胺酯）、SMCC（4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯）、SLAB（[4-碘乙酰]氨基苯甲酸琥珀酰亚胺酯）、和SMPB（4-[1-马来酰亚胺基苯基]丁酸琥珀酰亚胺酯）。乙烯基可以被氧化以提供一种共价结合的手段。乙烯基可以作为用于多种聚合物的聚合作用的锚定基团，所述聚合物例如为聚丙烯酸，它可以为弹性蛋白酶提供多种结合位点。氨基可以和分子量不同的氧化的葡聚糖反应，以提供大小和容量不同的亲水性连接剂。可氧化的葡聚糖的例子包括葡聚糖T-40（分子量为40,000道尔顿）、葡聚糖T-110（分子量为110,000道尔顿）、葡聚糖T-500（分子量为500,000道尔顿）、葡聚糖T-2M（分子量为2,000,000道尔顿）、或聚蔗糖（分子量为70,000道尔顿）。此外，聚合电解质之间的相互作用可以用于将弹性蛋白酶固定到固相上。
固相可以是任何合适的材料，所述材料具有与弹性蛋白酶结合足够的表面亲和性。有用的固相支持体包括：天然高分子碳水化合物和它们的合成的改性的、交联的、或取代的衍生物，例如琼脂、琼脂糖、交联的海藻酸、取代的和交联的瓜尔豆胶、纤维素酯，特别是混合有硝酸和羧酸的纤维素酯、混合型纤维素酯、和纤维素酯；含氮的天然的聚合物，例如蛋白质和衍生物，包括交联的或改性的明胶；天然的碳氢化合物聚合物，例如乳胶和橡胶；合成的聚合物，例如乙烯基聚合物，包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯和它们部分水解的衍生物、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、上述缩聚物的共聚物和三元共聚物，例如聚酯、聚酰胺、和其他聚合物，例如聚氨酯或聚环氧化物；无机材料例如碱土金属和镁的硫酸盐或碳酸盐，包括硫酸钡、硫酸钙、碳酸钙、碱和碱土金属、铝和镁的硅酸盐；和铝或硅的氧化物或氢氧化物，例如粘土、氧化铝、云母、高岭土、沸石、硅胶、或玻璃（这些材料和上述聚合材料可以用作滤芯）；上述种类的混合物或共聚物，例如通过对现存天然聚合物和合成聚合物启动聚合作用而获得的接枝共聚物。也可以使用硝化纤维和尼龙。所有这些材料都可以适合的形状使用，例如薄膜、薄片、管、微粒或板，或者它们可以被涂覆、结合或层积到合适的惰性支持体例如纸、玻璃、塑料薄膜、纤维等上。
可选地，固相可以构成微粒。本领域技术人员可以从合适的颗粒材料类型中选择合适的微粒，所述微粒材料包括由聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯、乳胶、聚四氟乙烯、聚丙烯腈、聚碳酸酯、或类似材料组成的微粒材料。进一步地，微粒可以是有磁性的或顺磁性的微粒，以有利于在磁场中操纵微粒。
微粒可以悬浮在试剂和样品的混合物中，或者可以通过支持体材料被保留和固定。在后一情况中，支持体材料内部或表面的微粒基本不能移动以到达支持体材料的其他位置。可选地，微粒可以从试剂和样品的混合物中通过沉淀和离心而分离出来。当微粒是磁性的或顺磁性时，微粒可以从试剂和样品的混合物中通过磁场分离出来。
根据本发明所述的固相与样品共同温育可以在合适的温度下处理合适时间，例如室温下处理60分钟。更合适的时间/温度的组合对于本领域技术人员是已知的。
在一个优选的实施方式中，为了降低A1PI或其他样品成分对固相的非特异性吸附，在步骤（b）中的固相与样品共同温育之前封闭所述固相。合适的封闭试剂对于本领域技术人员是已知的，并且没有特别限定。它们包括例如溶于合适缓冲液的牛血清白蛋白（BSA）、甲基化的BSA、人血清白蛋白、酪蛋白、水解酪蛋白、脱脂奶粉、明胶或奶粉。合适的封闭液例如可以是包含0.05%聚山梨醇酯20和10毫克/毫升BSA的PBS溶液。封闭可以在合适的温度下处理合适的时间、例如室温下60分钟来进行。更合适的时间/温度的组合对于本领域技术人员是已知的。
在另一个优选的实施方式中，样品在进行步骤（b）中的与固相共同温育之前稀释所述样品。合适的稀释比例取决于样品中预测的A1PI浓度，这对于本领域技术人员是已知的。此外，更合适的稀释缓冲液对于本领域技术人员是已知的，并且没有特别限定。它们包括例如PBS。
可用于本发明方法中的合适的检测试剂在本领域是已知的，并且没有特别限定。它们包括例如化合物、组合物或能够特异地或基本特异地（即没有限定的交叉反应）结合到A1PI表位的分子。这些试剂（或配体）一般为抗体，例如单克隆抗体，或它们的衍生物或类似物，但是也包括而不限于：Fv片段；单链Fv（scFv）片段；F（ab’）2片段；人源化抗体和抗体片段；骆驼化（camelized）抗体和抗体片段；嵌合抗体；和上述的多价类型。可以使用的多价捕获试剂，视情况而定，包括但不限于：单特异性抗体或双特异性抗体；例如二硫键稳定的Fv片段。这些捕获试剂也包括但不限于：适配子、合成肽、结合分子、核酸等和本领域已知的试剂。可用于本发明方法中检测试剂的合适标签没有特别限定，并在本领域是已知的。它们包括例如过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素和荧光分子。在一个优选的实施方式中，检测试剂是共轭于过氧化物酶的抗人类A1PI抗体。
固相和检测试剂的温育在合适的温度处理合适的时间例如室温下60分钟进行。更合适的时间/温度的组合对本领域技术人员是已知的。进一步地，合适的稀释比例和用于在温育之前稀释检测试剂的缓冲液在本领域是已知的，并可以很容易确定。
在一个优选的实施方式中，固相在进行步骤（c）中的与检测试剂共同温育之前和之后都要进行洗涤。合适的洗涤缓冲液在本领域是已知的，并且没有特别限定。它们包括例如包含0.05%聚山梨醇酯20的PBS。
测定结合到固相上的检测试剂的量的方法在本领域是已知的，并且没有特别限定。在过氧化物酶标记的抗体共轭物的例子中，它们包括例如将固相和合适的显色过氧化物酶底物例如即用的三甲基联苯胺过氧化物酶试剂SureBlue（KPL）在合适的温度例如室温下共同温育足够的时间以形成颜色。随后，例如通过添加1.5M硫酸来停止形成颜色，形成的颜色用例如ELISA在450纳米下测定。更合适的显色底物、温育时间和温度、以及测定所形成的颜色对本领域技术人员是已知的。放大系统在本领域广泛被使用，包括生物素-亲和素系统，都可以被用于本发明。
最终，测定样品中活性A1PI的量的方法在本领域是已知的，并且没有特别限定。它们包括例如样品数据和合适的校正曲线之间的相关性，所述校正曲线例如是用已知的A1PI浓度建立的。
附图说明
图1显示了代表性6点校正曲线，其通过在一天之内制备的三个曲线的平均值获得。
图2显示了不同纯度的两种A1PI制品的剂量-响应曲线。
图3显示了聚集的A1PI制品的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。
图4显示了聚集的A1PI制品的高效排阻色谱。
图5显示了用HP-SEC测定的A1PI单体水平之间的相关性，和测量的含有不同浓度A1PI聚集物的样品两种不同活性测试的结果。
图6显示了通过绘制两种不同活性测试法的结果而获得的回归曲线。
图7显示了通过固相结合的弹性蛋白酶A1PI活性测试法所获得的浓度-响应曲线，该测试法用于纯化的A1PI浓缩物、人类参照血浆制品和氧化的A1PI制品。
图8显示了用血浆蛋白抑制剂形成的弹性蛋白酶-复合物。插入图提供了不同的抑制剂在四个稀释度下（以测量的相对A1PI百分比形式提供）测定的相对信号强度。
本发明会进一步在下述实施方式中进行说明，而非对其进行任何限制。
实施例
实施例1：6点测试校正曲线的制作和特征
测试校正曲线是由工作标准制品的六个系列1+1倍稀释组成的，覆盖的A1PI活性浓度范围在110纳克/毫升至3.5纳克/毫升之间。曲线通过下述方法获得：
猪弹性蛋白酶（罗氏，11027905001；50毫克/毫升）用磷酸盐缓冲盐水（PBS；8克/升NaCl；0.2克/升KCl；0.2克/升KH2PO4；1.26克/升Na2HPO4x2H2O；天然pH）稀释至50微克/毫升，并在NUNC Maxisorp F96平板孔中在4℃下温育过夜（100微升/孔）。然后用含0.05%的聚山梨醇酯20的PBS溶液（洗涤缓冲液）洗涤平板，该平板和每孔200微升的洗涤缓冲液（稀释缓冲液；DB）共同在37℃下温育60分钟以灭活，所述洗涤缓冲液包含10毫克/毫升的牛血清白蛋白。每孔添加100微升的稀释缓冲液、预稀释标准、对照或样品，连续地直接对平板进行梯度稀释。孔B11和B12只包含稀释缓冲液并作为空白对照。该平板然后在室温下（RT；20至25℃）温育60分钟后洗涤。然后，将在DB中以1/1,000的比例稀释的羊抗人A1PI过氧化物酶（结合位点）以100微升/孔施加于孔中，在室温下温育60分钟后，通过洗涤步骤去除。洗涤后的平板然后和即用型三甲基联苯胺过氧化物酶试剂SureBlue（KPL；100微升/孔）共同温育，在室温下温育直至形成合适的颜色。然后用100微升/孔的1.5M的硫酸终止反应。在60分钟内，该平板用酶标仪在450纳米下测量，参考波长在620纳米下测量。
用于测试校正的标准制品为纯化的A1PI制品，用经过验证的显色弹性蛋白酶抑制测试来校正A1PI的实际WHO标准值。因此，工作标准的浓度指定为每毫升22.1毫克活性A1PI。最终稀释系列准备两份，由范围从1/200,000至1/6,400,000的6个稀释比例构成，导致A1PI活性范围为从110纳克/毫升至3.5纳克/毫升。最终通过使用测量的空白校正的光学密度（ODs）的log-log调整和测试校正仪的A1PI活性浓度获得校正曲线。
图1显示了代表性6点校正曲线，其通过在一天之内制备的三个曲线的平均值而获得。该校正曲线的斜率特征、y-截距和相关系数在全部三个曲线的平均值之间是非常类似的。该曲线的准确度和精密度是非常真实的。该校正曲线符合准确、精密和线性可接受的要求，因此对于推断样品可以视为是合适的。信号和A1PI活性浓度之间的线性关系范围低至3.5纳克/毫升。因此，该试验灵敏度比依赖残余弹性蛋白酶活性测量的弹性蛋白酶抑制测试的显色标准高出1000倍。
实施例2：测量人类血浆中的A1PI活性
血浆中除了A1PI还包括若干其他蛋白酶抑制剂，它们在理论上可以和弹性蛋白酶相互作用。然而，已经报道A1PI-弹性蛋白酶复合物的结合常数比其他被测量的蛋白酶抑制剂高出25倍。因此，A1PI对弹性蛋白酶展示出更优选的抑制效应。
然而，纯化的A1PI制品的剂量-响应曲线，被用作一种试验标准，并和人类参照血浆制品进行比较。检测后一制品的稀释系列，包括六个系列的1+1倍稀释，范围从1/20,000至1/640,000。图2显示了不同纯度的两种制品的剂量-响应曲线。两种剂量-响应曲线非常相似，正如它们的斜率之间的区别少于0.5%所示。这些发现表明将弹性蛋白酶固定到固相支持体不会改变它结合A1PI的选择性。
实施例3：测量包含聚集的A1PI的样品
通过在60℃加热浓度为20毫克/毫升的纯化的A1PI溶液15分钟，获得聚集的A1PI制品。该溶液然后和天然A1PI以不同比例混合。天然A1PI中包含10至90%加热-聚集的A1PI的若干混合物，是由天然的和加热-聚集的A1PI制备的，并通过天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE；参见图3）和高效排阻色谱（HP-SEC；参见图4）进行分析。
显示不同样品的图3中所示凝胶上部的数字以百分比给出了样品混合物中加热-聚集的A1PI的相对含量，其中星号表示相应的A1PI单体条带。以样品相同的蛋白浓度加载并用Coomassie染色的样品在A1PI单体条带的密度方面明显不同，其和样品中加热-聚集的A1PI的相对含量成反比。另一方面，高分子量样品化合物随着混合物中加热-聚集的A1PI的相对含量而增加。因此，天然PAGE清晰地证实了A1PI的加热诱导的聚集。该发现也通过HP-SEC分析数据证实，其中在混合物中加热-聚集的A1PI的较高相对含量和聚集的A1PI较高的相对峰面积以及A1PI单体较低的相对峰面积是相关联的。
图5显示了用HP-SEC测定的A1PI单体水平之间的相关性，和测量的含有不同浓度A1PI聚集物的样品两种不同活性测试的结果。样品使用显色弹性蛋白酶抑制测试和本发明的固相结合弹性蛋白酶A1PI活性测试来测量这些样品的A1PI活性。用显色弹性蛋白酶抑制测试测量的A1PI活性显然和由回归曲线所示的A1PI单体的相对水平有关，由回归曲线可知相关系数的平方为R2=0.9932。这是可以被预料的，因为A1PI聚集物的形成主要涉及A1PI的活性位点，这对于它的抑制活性是绝对必须的。当采用本发明所述的固相结合的弹性蛋白酶A1PI活性测试来测量样品中的A1PI活性时，也发现了相同的高相关性。此外，两个回归曲线表明它们的斜率类似，其区别仅为1%。
这些数据证实了用本发明所述的固相结合的弹性蛋白酶A1PI测试可测量A1PI的弹性蛋白酶抑制活性。它们进一步证明即使是高浓度的灭活性，聚集的A1PI也不会干扰本发明的固相结合的弹性蛋白酶A1PI活性测试。显然地，这些数据表明，板结合的弹性蛋白酶A1PI活性测试仅测量了有活性的A1PI，即能够抑制弹性蛋白酶的A1PI。
实施例4：显色弹性蛋白酶抑制测试和固相结合的弹性蛋白酶A1PI活性测试之间的相关 性
用显色弹性蛋白酶抑制测试法测量包含限定的、加热-聚集的A1PI水平增加的A1PI样品，其依赖于将A1PI样品和过量的猪弹性蛋白酶共同温育，然后用显色底物Suc-{Ala}3-pNA测量残余弹性蛋白酶。弹性蛋白酶使显色底物分离并释放pNA，光学检测pNA。光密度直接和弹性蛋白酶浓度成比例，而在限定的范围内和A1PI活性成反比。此外，样品用本发明所述的固相结合的弹性蛋白酶A1PI活性测试法测量这些样品。图6显示了通过绘制两种活性测试的结果获得的回归曲线。
用两种测试法测量的A1PI活性浓度在研究的活性范围内相关性很好，所述活性范围为每毫升含2至20毫克活性A1PI，正如相关系数平方值R2=0.98所示。这些数据表明了本发明所述的固相结合的弹性蛋白酶A1PI活性和显色弹性蛋白酶抑制测试是等价的，因为所研究的A1PI浓度之间的区别反映的是分析随机引起的变化、而非系统性的变化。显示了两种测试法都可具体地测量活性A1PI。特别地，高出10倍的灭活A1PI浓度显示出不会干扰两种测试。
实施例5：测量氧化的A1PI
A1PI蛋白酶抑制活性绝对需要活性位点Met358-Ser359。该位点占据了分子中暴露的环，并和中性白细胞弹性蛋白酶的活性区域紧密结合。Met358对氧化非常灵敏，导致了A1PI的灭活，导致它抑制弹性蛋白酶活性的丧失。
通过检测氧化的A1PI，显示了本发明所述的固相结合的弹性蛋白酶A1PI活性测试的特异性，所述氧化的A1PI通过下述步骤获得。简而言之，1.5毫升纯化的、全活性的A1PI制品，其A1PI浓度为20毫克/毫升，用13.5毫升50mM、pH为5.0的KH2PO4缓冲液（其含100mM KCl和1mM MgCl2）稀释，添加5.1毫升H2O2以引起氧化。反应混合物在室温下温育2小时，然后用磷酸缓冲盐水在4℃下透析过夜。制备多份，并存储在零下20℃。表1提供了分析的结果。特别地，A1PI蛋白用ELISA检测。而且，用显色弹性蛋白酶抑制测试和本发明所述的固相板-结合弹性蛋白酶A1PI活性测试法测量A1PI活性。
表1：氧化的A1PI制品的分析
Figure BDA0000422465140000101
用ELISA检测A1PI蛋白导致A1PI蛋白浓度为1.55毫克/毫升，当把操作步骤引起的稀释考虑在内时，这和预期结果是相吻合的。相反，显色弹性蛋白酶抑制测试没有检测出活性A1PI，并且测量出氧化的A1PI的浓度低于0.009毫克/毫升。这相当于低于0.6%的原始活性。这些数据和本发明所述的固相结合的弹性蛋白酶测试是一致的，其中该制品发现只有原始活性的0.2%。总而言之，这些数据进一步证明了本发明所述的固相结合弹性蛋白酶A1PI活性测试的特异性和显色弹性蛋白酶抑制测试的特异性是相似的。氧化的A1PI，正如ELISA数据显示具备完全免疫反应性，无论采用显色弹性蛋白酶测试或是固相结合弹性蛋白酶测试，都没有展现出较高的活性。图7显示了固相结合的弹性蛋白酶A1PI活性测试获得的浓度-响应曲线，其中采用纯化的A1PI浓缩物，人类参照血浆制品和氧化的A1PI制品。该浓度-响应曲线清晰地表明本发明的固相结合的弹性蛋白酶A1PI活性测试仅可测量活性A1PI，因为氧化的A1PI给出的信号非常低，这可以表明很低水平的天然A1PI存在。
实施例6：测量弹性蛋白酶-A1PI复合物
A1PI对弹性蛋白酶的抑制导致形成稳定的A1PI-弹性蛋白酶复合物，并且在和弹性蛋白酶结合之后，A1PI失去了它的抑制活性。结果，A1PI-弹性蛋白酶复合物不应该被检测出或者干扰A1PI活性测试。因此，将纯化的A1PI制品和不同含量的纯化的人弹性蛋白酶制品共同温育，以获得包括含量不同的A1PI-弹性蛋白酶复合物的样品。
简而言之，纯化的A1PI制品用pH为8.2、包含10毫克/毫升的人血清白蛋白的20mMTris-HCl稀释至浓度为400微克/毫升，并和人中性白细胞弹性蛋白酶（ICN,191337;500pg/mL）以不同摩尔比在室温下共同温育45分钟。特别地，制备并进一步分析A1PI和弹性蛋白酶之间的摩尔比为1：0.26、1：0.52、1：1.02和1：2.55的样品。表2显示了用本发明所述的固相结合的弹性蛋白酶A1PI活性测试法测量的A1PI活性的结果。
表2：包含A1PI-弹性蛋白酶复合物的样品的固相结合的弹性蛋白酶A1PI活性测试
将纯化的A1PI制品和浓度增加的中性白细胞弹性蛋白酶共同温育可以降低A1PI活性，所述A1PI活性用本发明所述的固相结合的弹性蛋白酶A1PI活性测试法测量。该混合物包括等摩尔浓度的A1PI和弹性蛋白酶，表明没有可测量的活性。相反，A1PI和弹性蛋白酶之间的摩尔比为1：0.51和1：0.26的样品，仍然具有A1PI活性，经测量其相应地占形成复合物之前的样品浓度的53.2%和76.6%。这和由添加的弹性蛋白酶引起的活性损失预期结果是非常匹配的。这些发现还表明，本发明所述的固相结合的弹性蛋白酶A1PI活性测试具备测量A1PI的弹性蛋白酶抑制活性的能力。
实施例7：固相板结合的弹性蛋白酶的酰胺分解活性
本发明方法依赖于板结合的弹性蛋白酶与A1PI之间形成的复合物。因此板结合的弹性蛋白酶保留它的活性是必须的，只有活性酶才会攻击A1PI的反应中心环，导致复合物形成。显色底物Suc-(Ala)3-pNA在包被步骤之后被用于测量弹性蛋白酶溶液，并用于检测微孔板上被包被的孔中活性弹性蛋白酶的存在。因此，在包被步骤之后，回收的溶液中弹性蛋白酶的活性经检测为18.8微克/毫升。与包被前（20微克/毫升）的浓度差异暗示每孔中结合了120纳克的弹性蛋白酶，这相当于每平方毫米的密度为1.3纳克。对于表面吸附的IgG的一个合理评估为0.4纳克/平方毫米。当显色底物添加到被包被和洗涤的孔中时，发现所有的孔都显示出具有弹性蛋白酶活性，这导致了显色底物的水解。这些数据证实和A1PI温育之后看到的复合物形成确实是基于对弹性蛋白酶的蛋白水解攻击作用。通过测量游离的弹性蛋白酶获得的校正曲线可以外推出空白校正的ODs，发现每孔中的弹性蛋白酶活性为82.3纳克。这意味着在包被步骤之后50%以上的弹性蛋白酶仍然保持活性。
实施例8：与其他抑制剂形成的复合物
人的血浆包含若干种蛋白质，它们能够和弹性蛋白酶形成复合物。虽然A1PI和弹性蛋白酶形成复合物的速率常数要比其他丝氨酸蛋白酶高出25倍，但还是研究了这些其他抑制剂的存在是否会影响A1PI的检测。然而，血浆和纯化的A1PI制品的剂量-响应曲线没有表明这些抑制剂有任何效应，因为它们的斜率都是类似的。特别地，检测α1-抗胰凝乳蛋白酶（ACh）、α2-抗纤维蛋白溶酶（AP）、抗凝血酶（AT）、α2-抗巨球蛋白（AM）、C1-抑制剂（C1-inh）和间-α-胰蛋白酶抑制剂（ITI）与固相板结合的弹性蛋白酶形成大量复合物的能力，所述能力会影响A1PI的检测。作为额外的阴性对照，采用IgG作为非特异性标记蛋白通过固相板结合的弹性蛋白酶测定结合到孔中的非特性水平，其中A1PI的结合可以用作阳性参照。表3提供了人类参照血浆制品1R31003稀释系列的空白对照校正平均值ODs。稀释系列包括12个范围从1/100至1/204,800的稀释梯度，它们和固相板结合的弹性蛋白酶共同温育。然后用对各自的抑制剂特异的抗体过氧化物酶共轭物检测有可能形成的复合物。这些数据也见于图8，其中直接比较稀释倍数和OD值曲线。
表3：与血浆蛋白抑制剂形成的弹性蛋白酶-复合物
稀释倍数 A1PI ACh AP AT AM C1-inh ITI IgG
100 2.214 0.151 0.111 0.016 0.150 0.027 0.000 0.210
200 2.121 0.107 0.038 0.008 0.137 0.005 0.000 0.113
400 1.839 0.086 0.000 0.003 0.129 0.000 0.000 0.058
800 1.614 0.072 0.000 0.001 0.119 0.000 0.000 0.030
1600 1.385 0.062 0.000 0.000 0.104 0.000 0.000 0.011
3200 1.203 0.044 0.000 0.002 0.092 0.000 0.000 0.002
6400 0.959 0.058 0.000 0.000 0.083 0.000 0.000 0.000
12800 0.779 0.029 0.000 0.004 0.059 0.000 0.000 0.000
25600 0.567 0.017 0.000 0.000 0.038 0.000 0.000 0.000
51200 0.391 0.017 0.000 0.000 0.022 0.000 0.000 0.000
102400 0.239 0.012 0.000 0.000 0.011 0.000 0.000 0.000
204800 0.141 0.005 0.000 0.000 0.006 0.000 0.000 0.000
数据清晰地表明，和其他任何研究的抑制剂相比，A1PI和弹性蛋白酶更容易结合。然而，检测六种抑制剂中之两种的适度复合物形成：只有抑制剂α2-抗巨球蛋白（AM）和α1-抗胰凝乳蛋白酶与弹性蛋白酶形成的复合物表现出可测量的含量，其平均信号占弹性蛋白酶与A1PI形成的复合物测量到的平均信号的6.0%和3.9%。特别地，计算出稀释比例为1/12,800至1/102,400的平均值能够更好地评估从不同抑制剂中获得的信号。这些数据表明，在直接对比可能使用下述方法的前提下，超过90%的固相板结合的弹性蛋白酶和A1PI形成了复合物。其他血浆蛋白酶抑制剂中只有少量能够和A1PI竞争性结合固相板结合的弹性蛋白酶。这些数据与测定的血浆样品和纯化的A1PI制品的稀释-响应曲线是一致的。这些曲线是平行的，而且它们之间的斜率没有明显不同。相比之下，由除A1PI之外的抑制剂引起的固相板结合的弹性蛋白酶的有效竞争预期会降低能够与A1PI进行反应的弹性蛋白酶的浓度。结果，这将会导致依赖于所研究制品纯度的浓度-响应曲线的斜率不同。在第二种方法中，进一步详细研究了AM的影响。因此，制备纯化A1PI和AM的混合物，其包含恒定为192纳克/毫升的A1PI浓度和从0增至2000纳克/毫升的AM浓度。用本发明所述的方法检测这些样品，然后对比所得浓度-响应曲线。表4提供了稀释系列的空白对照校正的ODs值，它们用于计算log-log回归曲线。这些曲线进一步通过它们的斜率、y-截距和相关系数进行描述。斜率作为占测量的不包含AM的样品的百分比被给出。
表4：分析纯化的A1PI和AM的混合物
Figure BDA0000422465140000141
浓度-响应曲线因该混合物中增加的AM浓度仅稍受影响，这是由于它们的斜率和不含AM的样品的斜率相比其区别少于7%。然而，AM和弹性蛋白酶之间形成了复合物，但是形成的复合物的量不会影响A1PI的检测。AM质量高出A1PI质量10倍会导致大约等摩尔浓度，但是摩尔比的正确评估还需要考虑AM包含4个抑制活性位点，并且可能一个以上位点会参与结合板固定的弹性蛋白酶。这种相互作用也可能在显色试验期间发生，其中当用显色底物检测时，AM结合的弹性蛋白酶仍然保持活性，因此导致被检测样品的A1PI活性偏低。在这种情况下，AM用甲胺灭活能够改善这种情况。然而，使用本发明所述的方法获得的数据表明：样品的纯度不影响对功能活性的A1PI的测量，即使AM以等摩尔浓度存在。
实施例9：本发明方法的精密度和准确度
通过两个样品模型测定本发明方法的准确度和精密度。首先，用浓度为0.0002至0.01毫克/毫升的功能活性A1PI制备模仿蛋白总浓度不高于50微克/毫升的支气管肺泡灌洗（BAL）溶液的样品。通过用人类血清白蛋白稀释人类血浆参照血浆制品，获得A1PI浓度为0.01至0.8毫克/毫升的血浆样样品。相反通过添加纯化的A1PI，获得浓度为3毫克/毫升的样品。最终，还包括编码为05/162的目前的A1PI的第一WHO标准。名义上的A1PI浓度的回收率以百分比的形式代表准确度，用六个测量结果平均值的相对标准偏差代表精密度，均在一天之内（批间测试）或六天内（批内测试）完成。结果见下表5。
表5：本发明方法的精密度和准确度，功能活性A1PI的浓度范围在0.0002至12.4毫克/毫升之间
Figure BDA0000422465140000151
n.d.：未进行；BAL：支气管肺泡灌洗

Claims (7)

1.一种测量样品中活性α1-蛋白酶抑制剂（A1PI）的方法，包括以下步骤：
（a）将弹性蛋白酶结合到固相上；
（b）将固相与样品共同温育；
（c）将固相与结合到A1PI的检测试剂共同温育；
（d）测定结合到固相的检测试剂的量；以及
（e）测定样品中活性A1PI的量。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含在步骤（b）之前用牛血清白蛋白封闭所述固相的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含在步骤（b）中的与固相共同温育之前稀释所述样品的步骤。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含在步骤（c）之前和之后洗涤所述固相的步骤。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述弹性蛋白酶是猪弹性蛋白酶。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相是微孔板。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测试剂是共轭于过氧化物酶的抗人A1PI抗体。
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